CN116769911A - 一种血清外泌体中长链非编码rna作为非小细胞肺癌诊断标志物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血清外泌体中长链非编码RNA作为非小细胞肺癌诊断标志物的应用，特点是该长链非编码RNA为AL139294.1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；非小细胞肺癌诊断标志物在制备非小细胞肺癌分子靶向药物或非小细胞肺癌诊断试剂盒中的应用，其诊断试剂盒包括一对用于检测血清外泌体中lncRNA AL139294.1基因表达量的特异性扩增引物，具体核苷酸序列如下：上游扩增引物：5'‑TGTCACAGCAGATGCCACA T‑3'；下游扩增引物：5'‑CCCACTCGCTGCCTATAACA‑3'；优点是灵敏度和特异性高且与非小细胞肺癌的患病率呈正相关。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种血清外泌体中长链非编码RNA作为非小细胞肺癌诊断标志物的应用。
背景技术
2023年全球癌症数据显示，肺癌是死亡率最高的癌症类型。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要病理类型，约占肺癌病例的85％。据统计，NSCLC患者的五年生存率仅为20％-30％。因为NSCLC在早期阶段往往无症状或症状不明显，患者在首次诊断时已处于晚期，失去手术机会，同时NSCLC治疗方案有限，导致患者预后差。因此，肺癌的早期筛查对提高患者生存率和降低肺癌死亡率至关重要。
目前，早期肺癌非侵入性筛查可以基于低剂量计算机断层扫描(computedtomography，CT)和液体活检生物标志物。其中液体活检因其微创、实时监测和易获得的优点在早期筛查、测量治疗反应和预测肺癌预后方面具有优势。临床上液体活检常见的肿瘤标志物有神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、细胞角蛋白19片段、癌胚抗原和糖类抗原72-4(carbohydrate antigen 72-4，CA72-4)等。但它们的灵敏度和特异度都不够高，例如NSE虽然是小细胞肺癌的首选标志物，但只有60％左右的小细胞肺癌患者NSE水平会升高；CA72-4不仅对肺癌，对其它胃肠道癌、乳腺癌和卵巢癌也有不同程度的检出率。由此可见，探寻灵敏度和特异度更高的肺癌诊断标志物对提高肺癌早期筛查率至关重要。
外泌体是直径为40-200nm的细胞外囊泡，具有脂质双层膜结构。外泌体通过将其内容物，包括微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、环状RNA(circular RNA，circRNA)、信使RNA(messenger RNA，mRNA)、DNA以及蛋白转运并释放到受体细胞，介导细胞与细胞间的交流通讯，从而影响受体细胞的生理和病理功能。在肿瘤患者中体内，正常细胞和肿瘤细胞皆可分泌外泌体到血液循环中，其中肿瘤细胞是肿瘤患者血液循环中外泌体的主要来源，也是肿瘤发生发展的主要驱动者之一。在肿瘤发展的各个阶段，肿瘤细胞分泌的外泌体通过转运其内容物(miRNA、lncRNA、circRNA等)介导细胞间交流通讯，从而广泛参与肿瘤生长、血管生成、低氧驱动的上皮间质转化、肿瘤转移、免疫逃逸和耐药性等。因此，外泌体及其内容物有可能成为肺癌诊疗的新分子靶标。LncRNA是长度大于200nt的非编码RNA，其主要从表观遗传、转录和转录后三个层面实现对基因表达的调控作用，从而广泛参与机体的生理和病理过程，尤其是肿瘤的发生发展。大量研究表明，长链非编码RNA在癌症发生发展中起重要作用，可作为液体活检的非侵袭性生物标志物。例如，外泌体lncRNA Sox2ot在胰导管腺癌患者中高表达，与胰导管腺癌患者预后差密切相关。目前，国内外还没有公开任何关于血清外泌体lncRNAAL139294.1作为诊断非小细胞肺癌生物标志物的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度和特异性高且与非小细胞肺癌的患病率呈正相关的血清外泌体中长链非编码RNA作为非小细胞肺癌诊断标志物的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种血清外泌体中长链非编码RNA作为非小细胞肺癌诊断标志物的应用，所述的长链非编码RNA为AL139294.1基因。
进一步，所述的AL139294.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述的非小细胞肺癌诊断标志物在制备非小细胞肺癌分子靶向药物或非小细胞肺癌诊断试剂盒中的应用。
进一步，所述的非小细胞肺癌诊断试剂盒包括一对用于检测血清外泌体中lncRNAAL139294.1基因表达量的特异性扩增引物，具体核苷酸序列如下：上游扩增引物：5'-TGTCACAGCAGATGCCACAT-3'；下游扩增引物：5'-CCCACTCGCTGCCTATAACA-3'。
进一步，所述的诊断试剂盒还包括荧光定量PCR反应体系，其组成为：5μl的SYBRGreen，1μl cDNA模板，0.5μl浓度为10μM的上游引物，0.5μl浓度为10μM的下游引物，ddH2O补充到10μl，荧光定量PCR反应条件如下：95℃10min；95℃15s，60℃30s，72℃30s，循环40次；95℃15s，60℃1min，95℃，30s。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了血清外泌体中lncRNAAL139294.1在制备非小细胞肺癌诊断标志物的应用以及用于检测与非小细胞肺癌相关的长链非编码RNAlncRNA AL139294.1的试剂盒，其通过SYBR Green荧光定量PCR检测受试者血清外泌体中lncRNA AL139294.1和GAPDH的表达，通过计算比较外泌体中lncRNAAL139294.1在非小细胞肺癌患者样本、肺炎患者样本和正常样本中的表达，通过计算外泌体中lncRNA AL139294.1的相对表达量参数以用于辅助诊断非小细胞肺癌。相对传统非小细胞肺癌检测技术具有操作简单、灵敏性高、特异性强、周期短等特点，有利于非小细胞肺癌的早期诊断和治疗。
附图说明
图1非小细胞肺癌患者血清外泌体中高表达lncRNAs的筛选；
图2为在10例非小细胞肺癌患者血清外泌体中检测前45个上调最显著的lncRNAs；
图3为lncRNA AL139294.1在健康对照组(n＝40)、肺炎组(n＝49)和非小细胞肺癌组(n＝111)血清中的表达水平；
图4为受试者工作特征曲线分析血清外泌体中lncRNA AL139294.1区分非小细胞肺癌患者与健康人的灵敏度和特异性，曲线下面积为0.915；
图5为lncRNA AL139294.1在有无淋巴结转移(N0/N1-N3)，有无远处转移(M0/M1)和高低TNM分期(Ⅰ-Ⅱ/Ⅲ-Ⅳ)非小细胞肺癌患者中的表达水平。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例
1、在2019年至2022年期间，从宁波大学第一附属医院和宁波大学附属李惠利医院随机收集非小细胞肺癌(n＝111)和肺炎(n＝49)患者手术或任何治疗前的血清样本。从宁波康宁医院收集无任何癌症史的健康人(n＝40)的血清样本。每个受试者都提供了知情同意书，同意在本研究中使用他们的血清作为研究用途。所有受试者的临床特征(包括样本类型、年龄、性别、肿瘤大小、组织学亚型、TNM分期、淋巴结转移、远处转移等)列于表1。
患者入组标准包括，签署知情同意书，经病理明确诊断，未做放、化疗和生物治疗。排除妊娠或哺乳期妇女，做过放、化疗和生物治疗，患有肺癌之外的其它恶性肿瘤或其他严重疾病的患者。
健康人入组标准包括，签署知情同意书，年龄和患者组大体相近，近1年来体检证明未患任何肿瘤，主要脏器无疾病，精神状态良好。
表1本项目中样本类型及临床资料
2、血清外泌体提取
(1)取380μl血清加入1.5ml EP管，4℃，2000g，离心30min；
(2)取300μl上清液加入新的1.5ml EP管后，加入60μl外泌体提取试剂(赛默飞，4478360)，振荡混匀后4℃静置30min；
(3)室温，10000g，离心10min；
(4)弃上清，加300μl PBS缓冲液(PBS缓冲液预先经0.22μm过滤器过滤)重悬外泌体。
3、血清外泌体中RNA提取
(1)将上述300μl外泌体悬浮液经微型离心机低速离心后，转入2ml无酶EP管中，添加1.2ml Trizol溶液(总RNA抽提试剂)，将混合物充分振荡并在冰上裂解5min；
(2)加入240μl氯仿，并在冰上孵育5min(若EP管中分层需重新摇动混匀)，4℃，12000g离心15min；
(3)用100μl枪头吸取上清到新的2ml EP管中，注意不要吸入中间DNA层，于冰盒上操作；
(4)加600μl异丙醇，上下颠倒混匀，冰上10min，4℃，12000g离心10min；
(5)弃EP管中液体，加入1ml 75％乙醇，上下摇晃，4℃，8000g离心5min，弃乙醇；(6)重复上述操作一次；
(7)RNA半干燥后加入50μl DEPC水，溶解RNA。
4、长链非编码RNA lncRNA AL139294.1的筛选
(1)随机选取3个健康个体和3个非小细胞肺癌患者血清，按上述方法提取血清外泌体RNA；
(2)将分离的6个RNA样本用Arraystar人类LncRNA阵列(Arraystar,Rockville,MD,United States)上进行测序；
(3)根据P值小于0.05和差异倍数大于2为标准，绘制火山图，筛选出146个上调和350个下调的长链非编码RNA(图1)；
(4)选择上调最为显著的前45个长链非编码RNA，进一步在10例非小细胞肺癌患者血清外泌体中验证；
(5)如图2所示，相较于另外的44个长链非编码RNA，lncRNA AL139294.1的Ct值最小。因此，选择lncRNA AL139294.1的作为目标RNA，检测健康人，肺炎患者，非小细胞肺癌患者血清外泌体中lncRNA AL139294.1的水平。
5、逆转录反应
(1)采用TOYOBO逆转录试剂盒(ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNARemover，FSQ-301)，在4×DN Master Mix(440μL)中添加8.8μL gDNA 核酸清除剂，颠倒混匀；
(2)取5μl RNA模板放入0.2ml无酶EP管中，65℃热变性5min，立即4℃冷却；
(3)在冰上配置如下反应液：RNA模板4μl，4×DN Master Mix 2μl，DEPC水2μl；将反应液混匀后，37℃温育5min，4℃冷却；
(4)在冰上配置如下反应液：步骤3中的总反应液8μl，5×RT Master MixⅡ2μl，DEPC水10μl；将反应液混匀后，放置于PCR仪中进行逆转录反应，具体反应体系如下37℃15min，50℃5min，98℃5min，4℃冷却；PCR产物保存于-20℃冰箱保存。
6、荧光定量PCR反应
(1)根据血清外泌体中lncRNA AL139294.1基因，设计其上下游扩增引物，其中外泌体lncRNA AL139294.1基因具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：ACCCCATCCCCTTCATACACACCTCATTCCAAATGCTATCCTGTCACAGCAGATGCCACATCACTTTTGGGGTGGGCTAAGAGATCAAGGACATATGCCGTGCCCAAATTTCATCTAATAATTAAAAATACGGGAAGTGACACAAAAGGGAAAACACAGGATGCTCTGGAAACTTGTTATAGGCAGCGAGTGGGAAGGAGACCTAGAGTCAGAGGAAGCTACTACTGGAAAGAGGAGCAGAACTGAGCCAGGCAAATAGGAGAGAAAATGTATTTCAGGCAGAAGAAACAGCACTCTGGAAACCCAACATCTAGCCTTTGAGAATGTAAAATGAAGCCAGGATGACACTACCAATTCCAAGCTGTGTGTGTGTGCATGCATGTGCATGTATGTGTATATATATTAGATGTATATTTTAACATTCTGACTTAACATTAATATTAACATATTAATATTTATTTATTGAAATATTTAACGTGTATTTTAATATTAAATTCTGGATTTCCAAACCA；
上游扩增引物核苷酸序列如下：5'-TGTCACAGCAGATGCCACAT-3'；
下游扩增引物核苷酸序列如下：5'-CCCACTCGCTGCCTATAACA-3'；
(2)荧光定量PCR(RT-qPCR)检测外泌体中lncRNA AL139294.1相对表达量的反应体系如下：5μl的SYBR Green，1μl cDNA模板，0.5μl浓度为10μm的上游引物，0.5μl浓度为10μm的下游引物，ddH2O补充到10μl，取96孔板加入上述试剂，贴上96孔封板膜后放置于离心机中瞬时离心。随后放置于荧光定量PCR仪中进行反应，具体反应体系如下：95℃10min；95℃15s，60℃30s，72℃30s，循环40次；95℃15s，60℃1min，95℃，30s。
7、lncRNA AL139294.1在不同类型样本中的相对表达量计算本发明选择以内参基因作为标准进行相对定量，以GAPDH为内参基因，对目标lncRNA AL139294.1进行归一化处理，通过荧光定量PCR检测目标lncRNA AL139294.1在不同样本中的相对表达量。表达量倍数的变化的公式为：
△Ct＝Ct(lncRNA AL139294.1)-Ct(GAPDH)；
2-△Ct＝2-(Ct(lncRNA AL139294.1)-Ct(GAPDH))，
其中2-△Ct表示相对表达量，2-△Ct的值越高，代表外泌体中lncRNA AL139294.1的表达量越高，Ct(lncRNA AL139294.1)和Ct(GAPDH)分别代表荧光定量检测到的目标lncRNAAL139294.1和内参基因GAPDH的Ct值。定量实验中设置阴性对照组，每个样本进行三复孔重复，阴性对照中用DEPC水代替样本的cDNA模板，根据阴性对照孔的扩增情况判断是否存在污染。
8、结果分析
本实验SPSS 22.0软件对数据进行统计及分析，采用方差分析与Tukey's HSD检验比较不同组别(健康组、肺炎组和非小细胞肺癌组)之间的外泌体lncRNA AL139294.1的水平。通过RT-qPCR检测lncRNA AL139294.1在非小细胞肺癌患者血清外泌体中的表达，发现lncRNA AL139294.1在非小细胞肺癌患者血清外泌体中的表达显著高于健康对照组和肺炎组(P值均小于0.01，见图3)。同时lncRNA AL139294.1在肺炎患者血清外泌体中的表达高于健康对照组(P值小于0.05，见图3)。发明人为了评估lncRNA AL139294.1作为非小细胞肺癌生物标志物的诊断效能，进一步采用受试者工作特征曲线分析lncRNA AL139294.1区分健康人和非小细胞肺癌患者的灵敏度和特异性。受试者工作特征曲线下面积为0.915(图4)。提示检测外泌体lncRNA AL139294.1的相对表达量在非小细胞肺癌诊断方面具有较高价值。随后，我们分析了外泌体中lncRNA AL139294.1与非小细胞肺癌患者临床病理参数的关系，发现高水平的lncRNA AL139294.1与淋巴结转移(N1-3)、远处转移(M1)和非小细胞肺癌晚期(Ⅲ-Ⅳ)密切相关(图5)。
该发明通过检测lncRNA AL139294.1在非小细胞肺癌血清外泌体中的相对表达，结合统计学原理和现代生物学技术，提供操作简单、灵敏度高、特异性强、周期短和结果稳定的检测方法，为非小细胞肺癌患者的筛查及诊断提供科学依据。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种血清外泌体中长链非编码RNA作为非小细胞肺癌诊断标志物的应用，其特征在于：所述的长链非编码RNA为AL139294.1基因。
2.根据权利要求1所述的一种血清外泌体中长链非编码RNA作为非小细胞肺癌诊断标志物的应用，其特征在于：所述的AL139294.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的一种血清外泌体中长链非编码RNA作为非小细胞肺癌诊断标志物的应用，其特征在于：所述的非小细胞肺癌诊断标志物在制备非小细胞肺癌分子靶向药物或非小细胞肺癌诊断试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种血清外泌体中长链非编码RNA作为非小细胞肺癌诊断标志物的应用，其特征在于：所述的非小细胞肺癌诊断试剂盒包括一对用于检测血清外泌体中lncRNA AL139294.1基因表达量的特异性扩增引物，具体核苷酸序列如下：上游扩增引物：5'-TGTCACAGCAGATGCCACAT-3'；下游扩增引物：5'-CCCACTCGCTGCCTATAAC A-3'。
5.根据权利要求4所述的一种血清外泌体中长链非编码RNA作为非小细胞肺癌诊断标志物的应用，其特征在于：所述的诊断试剂盒还包括荧光定量PCR反应体系，其组成为：5μl的SYBR Green，1μl cDNA模板，0.5μl浓度为10μM的上游引物，0.5μl浓度为10μM的下游引物，ddH2O补充到10μl，荧光定量PCR反应条件如下：95℃10min；95℃15s，60℃30s，72℃30s，循环40次；95℃15s，60℃1min，95℃30s。
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