CN116626277A - 一种CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法及使用该方法的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种CRISPR/Cas12a酶驱动的OTA检测方法及使用该方法的试剂盒。利用了OTA与crRNA竞争性结合OTA核酸适配体的原理。待测样品中没有OTA时，crRNA与OTA核酸适配体通过互补序列结合，激活Cas12a酶的切割能力，对修饰了荧光信号分子的ssDNA(ssDNA‑FQ)进行剪切，ssDNA‑FQ被剪切后荧光基团被释放，产生荧光信号；待测样品中含有OTA时，OTA与crRNA竞争性结合OTA核酸适配体，导致剪切的荧光基团数量减少，荧光信号减弱；通过测量荧光信号减弱的程度，可实现对OTA浓度定量检测。本方法具有制备简单、试剂寿命长、易于保存、价格相对低廉、检测时间短、可重复性好、灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本公开涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法及使用该方法的试剂盒。
背景技术
赭曲霉毒素A(OchratoxinA,OTA)是一种2B类致癌物。作为一种剧毒物质，具有很强的肾毒性、肝毒性、免疫毒性和致癌性等，严重威胁着人类和动物的健康。OTA在生长、收获、储存和运输等过程中容易污染许多农产品，包括玉米、小麦、咖啡、大麦、大米、蔬菜、水果、肉类和葡萄酒等。虽然在食物中的存在微量，但由于其具有热稳定性，并且在人体内容易被吸收但难以排泄，会使它在靶器官中蓄积，最终导致毒性作用。因此，迫切需要开发高灵敏度的食品中OTA检测方法，以减少OTA的摄入，保护人畜健康。
传统的OTA检测方法包括薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)等，均符合一般检测要求，但需要昂贵的设备、熟练的操作人员和复杂的前处理过程，极大地阻碍了其在真实样品中的实际应用。酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)法因具有灵敏度高、选择性强、无需样品预处理纯化(或单纯纯化)、样品处理能力大等优点，是目前OTA快速批量检测的主要方法。但其所依赖的抗体识别元件存在制备困难、试剂寿命短、价格昂贵、检测时间长、可重复性差、灵敏度较差等缺陷这些都限制了其在样品检测中的应用。
发明内容
本公开提供了一种CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法及使用该方法的试剂盒，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题。
本申请提供了一种由CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法，所述方法包括：
向孔板的孔中加入链霉亲和素溶液，在3-5℃下孵育15-17h，洗板，得到链霉亲和素修饰的微孔板；
向链霉亲和素修饰的微孔板的板孔中加入90-110μL浓度为9-11mg/mL的牛血清蛋白溶液封闭板孔，洗板，得到牛血清蛋白溶液封闭的微孔板；
向牛血清蛋白溶液封闭的微孔板的板孔中加入生物素修饰的OTA核酸适配体，在20-26℃下摇匀，洗板，得到OTA核酸适配体包被的孔板；
在缓冲液中，将Cas12a和等量的crRNA在20-27℃条件下孵育9-11min，加入ssDNA-FQ报告基因，混匀，得到Cas12a-crRNA-ssDNA-FQ混合液；
将待测原料粉碎后溶解、离心，收集上清液作为样品原液，过滤，稀释8-11倍后获得样品待测液，向OTA核酸适配体包被的孔板的孔中分别加入90-110μL样品待测液以及OTA浓度为0pg/ml的对照品，孵育0.9-1.5h,洗板,得到孵育了样品待测液、OTA标准品和对照品的孔板；
向孵育了样品待测液、OTA标准品和对照品的孔板的孔中加入90-110μLCas12a-crRNA-ssDNA-FQ混合物，反应至90-110min后，得到目标检测物；
在λex＝590nm,λem＝620nm条件下，对目标检测物进行荧光检测，得到荧光信号；
通过对比样品待测液的荧光信号值与对照品的荧光信号值判断样品待测液内是否存在OTA。
在一可实施方式中，将所述样品待测液的荧光信号与对照品的荧光信号值进行比较，确定所述样品待测原料是否含有OTA，包括：
若所述荧光信号低于对照品的荧光信号值，确定所述待测原料中含有OTA；
若所述荧光信号不低于对照品的荧光信号值，确定所述待测原料中不含有OTA。
在一可实施方式中，所述检测方法还包括：OTA核酸适配体包被的孔板的孔中分别加入90-110μL样品待测液、多组浓度为0.2-1200pg/ml的OTA标准品、OTA浓度为0pg/ml的对照品，多组所述OTA标准品的浓度不同，用对照组的荧光信号值减去各OTA标准组的荧光信号值，得到各浓度标准组的荧光信号差值ΔI，绘制ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线；用对照组的荧光信号值减去样品待测液的荧光信号值，得到ΔI样品，将ΔI样品代入ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线，计算出样品待测液浓度的对数，求其反对数，再乘以8-11倍得到待测样品中的OTA浓度。
在一可实施方式中，所述链霉亲和素溶液的添加量为90-110μL，所述链霉亲和素溶液的浓度为1-20μg/mL；所述链霉亲和素溶液的溶剂为碳酸钾溶液，所述碳酸钾溶液的浓度为0.05-0.15mol/L，PH为9.5-9.7。
在一可实施方式中，所述洗板操作为：采用190-210μLPBS溶液进行洗板，所述PBS溶液的浓度为0.005-0.015mol/L，所述PBS溶液的pH为7.3-7.5。
在一可实施方式中，所述检测方法还包括：获得生物素修饰的OTA核酸适配体原液，加入0.005-0.015mol/L的PBS溶液进行稀释，得到浓度为10-500nmol/L的生物素修饰OTA核酸适配体；其中，所述PBS溶液的pH为7.3-7.5。
在一可实施方式中，所述检测方法还包括：所述向封闭板孔加入生物素修饰的OTA核酸适配体，包括：向封闭板孔的每一孔中加入90-110uL的所述生物素修饰的OTA核酸适配体；其中，所述OTA核酸适配体为激活Cas12a-crRNA切割ssDNA-FQ的ssDNA。
在一可实施方式中，所述CRISPR/Cas12a-crRNA-ssDNA-FQ的混合物在NEBr2.1缓冲液中制备，所述NEBr2.1缓冲液由40-60mmol/L的NaCl溶液、5-15mmol/L的Tris-HCl溶液、5-15mmol/L的MgCl2溶液和90-110μg/mL的重组白蛋白溶液构成，所述NEBr2.1缓冲液的PH为7.7-8.0。
在一可实施方式中，所述Cas12a和crRNA的浓度为10-150nmol/L，所述ssDNA-FQ报告基因为浓度为100-1000nmol/L。
在一可实施方式中，所述方法具体包括：向高结合96孔透明微孔板的孔中加入100μL浓度为5μg/mL的链霉亲和素溶液，所述链霉亲和素溶液的溶剂为浓度0.1mol/L且PH为9.6的碳酸钾溶液，将加入链霉亲和素溶液的96孔板在4℃孵育16h，采用200μL浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗板2次，加入100μL浓度为10mg/mL的牛血清蛋白溶液封闭板孔1h,向封闭板孔的每孔加入100μL生物素修饰的OTA核酸适配体，所述OTA核酸适配体的浓度为100nmol/L，在26℃下摇匀，采用200μL浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗板2次，得到OTA核酸适配体包被的微孔板，其中，所述PBS溶液的PH为7.4；
在NEBr2.1缓冲液中，将50nmol/LCas12a和等量的crRNA在26℃条件下孵育10min至Cas12a和crRNA结合，加入浓度为500nmol/L的ssDNA-FQ报告基因，混匀，得到CRISPR/Cas12a-crRNA-ssDNA-FQ混合液；
将待测原料粉碎后溶解在50％甲醇溶液中离心，收集上清液作为样品原液，过滤后用5％甲醇溶液稀释10倍获得样品待测液，向OTA核酸适配体包被的微孔板的孔中加入100μL样品待测液、浓度分别为0.5pg/ml、1pg/ml、10pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml的OTA标准品以及OTA浓度为为0pg/ml的对照组，孵育1h，用200μL浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗板2次，其中，所述PBS溶液的PH为7.4，向OTA核酸适配体包被的微孔板的孔中加入100μLCas12a-crRNA-ssDNA-FQ混合物，反应至100min，得到目标检测物；
在λex＝590nm,λem＝620nm条件下，对目标检测物进行荧光检测，得到荧光信号；
通过对比样品待测液的荧光信号值与对照品的荧光信号值判断样品待测液内是否存在OTA，
用对照组的荧光信号值减去各OTA标准组的荧光信号值，得到各浓度标准组的荧光信号差值ΔI，绘制ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线；用对照组的荧光信号值减去样品待测液的荧光信号值，得到ΔI样品，将ΔI样品代入ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线，计算出样品待测液浓度的对数，求其反对数，再乘以10倍得到待测样品中的OTA浓度。
一种使用CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法的试剂盒，其特征在于，包括上述任一一种可实施方式的检测方法。
本公开的一种CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法及使用该方法的试剂盒，Cas12a-crRNA可以高效切割任意非目标ssDNA(反式切割)。当加入的原料不具有OTA时，OTA核酸适配体与Cas12a-crRNA以及ssDNA-FQ混合后，此时Cas12a-crRNA识别OTA核酸适配体表面的激活序列并对其进行剪切，Cas12a-crRNA自身的非特异性DNA酶活性被激活，剪切ssDNA-FQ，ssDNA-FQ被剪断后荧光基团被释放，产生荧光信号；当加入的原料具有OTA时，OTA与crRNA竞争性结合OTA核酸适配体，导致剪切的荧光基团数量减少，荧光信号减弱，测量待测物引起的荧光信号减弱程度实现检测。与传统抗体不同的是，OTA核酸适配体可以直接从体外文库中选择，避免了复杂的动物实验，而且体积更小，更容易获得，合成重复性更好，化学性质更稳定，可保存更长的时间。在体外筛选靶分子方面也具有很高的特异性。本方法具有制备简单、试剂寿命长、易于保存、价格相对低廉、检测时间短、可重复性好、灵敏度高的优点。
应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本公开的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本公开的范围。本公开的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。
附图说明
通过参考附图阅读下文的详细描述，本公开示例性实施方式的上述以及其他目的、特征和优点将变得易于理解。在附图中，以示例性而非限制性的方式示出了本公开的若干实施方式，其中：
在附图中，相同或对应的标号表示相同或对应的部分。
图1示出了本公开实施例一种CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法的实现原理及流程示意图；
图2示出了荧光法验证CRISPR/Cas12a驱动的ELASA检测OTA的可行性；
图3示出了非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法验证CRISPR/Cas12a驱动的ELASA检测OTA的可行性；
图4示出了不同浓度OTA标准溶液的荧光强度随时间变化曲线；
图5示出了不同浓度OTA标准溶液的ΔI值随时间变化曲线；
图6示出了反应100min后的标准曲线；
图7示出了CRISPR/Cas12a驱动的ELASA的特异性测试；
图8示出了本申请的ELASA法和商用的ELISA试剂盒进行测试对比的检测结果。
具体实施方式
为使本公开的目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本公开实施例中的附图，对本公开实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而非全部实施例。基于本公开中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。
实施例一
一种CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法及使用该方法的试剂盒，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题。
根据本公开的第一方面，提供了一种由CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法，方法包括：
向高结合96孔透明微孔板的孔中加入100μL浓度为5μg/mL的链霉亲和素溶液，链霉亲和素溶液的溶剂为浓度0.1mol/L且PH为9.6的碳酸钾溶液，将加入链霉亲和素溶液的96孔板在4℃孵育16h，采用200μL浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗板2次，加入100μL浓度为10mg/mL的牛血清蛋白溶液封闭板孔1h,向封闭板孔的每孔加入100μL生物素修饰的OTA核酸适配体，OTA核酸适配体的浓度为100nmol/L，在26℃下摇匀，采用200μL浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗板2次，得到OTA核酸适配体包被的微孔板，其中，PBS溶液的PH为7.4；
在NEBr2.1缓冲液中，将50nmol/LCas12a和等量的crRNA在26℃条件下孵育10min至Cas12a和crRNA结合，加入浓度为500nmol/L的ssDNA-FQ报告基因，混匀，得到CRISPR/Cas12a-crRNA-ssDNA-FQ混合液；
将待测原料粉碎后溶解在50％甲醇溶液中离心，收集上清液作为样品原液，过滤后用5％甲醇溶液稀释10倍获得样品待测液。向OTA核酸适配体包被的微孔板的孔中加入100μL样品待测液、浓度分别为0.5pg/ml、1pg/ml、10pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml的OTA标准品以及OTA浓度为为0pg/ml的对照组，孵育1h，用200μL浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗板2次，其中，PBS溶液的PH为7.4，向OTA核酸适配体包被的微孔板的孔中加入100μLCas12a-crRNA-ssDNA-FQ混合物，反应至100min，得到目标检测物；
在λex＝590nm,λem＝620nm条件下，对目标检测物进行荧光检测，得到荧光信号；
将样品待测液的荧光信号与对照品的荧光信号值进行比较，确定样品待测原料是否含有OTA，包括：
若荧光信号低于对照品的荧光信号值，确定待测原料中含有OTA；
若荧光信号不低于对照品的荧光信号值，确定待测原料中不含有OTA。
用对照组的荧光信号值减去各OTA标准组的荧光信号值，得到各浓度标准组的荧光信号差值ΔI，绘制ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线；用对照组的荧光信号值减去样品待测液的荧光信号值，得到ΔI样品，将ΔI样品代入ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线，计算出样品待测液浓度的对数，求其反对数，再乘以10倍得到待测样品中的OTA浓度。
参照图1，当加入的样品待测液中不具有OTA时，将Cas12a-crRNA以及ssDNA-FQ加入OTA核酸适配体孵育的板孔后，Cas12a-crRNA识别OTA核酸适配体表面的激活序列并剪切，Cas12a-crRNA自身的非特异性DNA酶活性被激活，剪切ssDNA-FQ，ssDNA-FQ被剪断后荧光基团被释放，产生荧光信号；当加入的样品待测液中具有OTA时，OTA与crRNA竞争性结合OTA核酸适配体，导致剪切的荧光基团数量减少，荧光信号减弱，测量待测物引起的荧光信号减弱程度实现对OTA的定量检测。OTA核酸适配体的核酸序列为序列表中的序列1。ssDNA-FQ的核苷酸序列为序列表中的序列2。crRNA的核苷酸序列为序列表中的序列3。
链霉亲和素溶液的添加量为100μL，链霉亲和素溶液的浓度为5μg/mL；链霉亲和素溶液的溶剂为碳酸钾溶液，碳酸钾溶液的浓度为0.01mol/L，PH为9.6。
根据权利要求1的检测方法，其特征在于，洗板操作为：采用200μLPBS溶液进行洗板，PBS溶液的浓度为0.1mol/L，PBS溶液的pH为7.4。
检测方法还包括：
获得生物素修饰的OTA核酸适配体原液，OTA核酸适配体原液合成公司：生工生物工程(Shanghai,China)，加入0.1mol/L的PBS溶液进行稀释，得到浓度为100nmol/L的生物素修饰OTA核酸适配体；其中，PBS溶液的pH为7.4。
向封闭板孔加入生物素修饰的OTA核酸适配体，包括：向封闭板孔的孔中加入100uL的生物素修饰的OTA核酸适配体；其中，OTA核酸适配体为激活Cas12a-crRNA切割ssDNA-FQ的ssDNA。
缓冲液为NEBr2.1缓冲液中，NEBr2.1缓冲液包括：50mmol/L的NaCl溶液、10mmol/L的Tris-HCl溶液、10mmol/L的MgCl溶液和100μg/mL的重组白蛋白溶液，NEBr2.1缓冲液的PH为7.9。
根据权利要求1的检测方法，其特征在于，Cas12a和crRNA的浓度为50nmol/L，ssDNA-FQ报告基因为浓度为500nmol/L。
实施例二
一种由CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法，方法包括：
向高结合96孔透明微孔板的孔中加入90μL浓度为1μg/mL的链霉亲和素溶液，链霉亲和素溶液的溶剂为浓度0.05mol/L且PH为9.5的碳酸钾溶液，将加入链霉亲和素溶液的96孔板在3℃孵育15h，采用190μL浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗板1次，加入90μL浓度为9mg/mL的牛血清蛋白溶液封闭板孔0.9h,向封闭板孔的每孔加入90μL的生物素修饰的OTA核酸适配体，OTA核酸适配体的浓度为10nmol/L，在20℃下摇匀，采用190μL浓度为0.005mol/L的PBS溶液洗板1次，得到OTA核酸适配体包被的微孔板，其中，PBS溶液的PH为7.3；
在NEBr2.1缓冲液中，将10nmol/LCas12a和等量的crRNA在20℃条件下孵育9min至Cas12a和crRNA结合，加入浓度为100nmol/L的ssDNA-FQ报告基因，混匀，得到CRISPR/Cas12a-crRNA-ssDNA-FQ混合液，将制备好的CRISPR/Cas12a-crRNA-ssDNA-FQ的混合物在低温下保存备用；
将待测原料粉碎后溶解在40％甲醇溶液中离心，收集上清液作为样品原液，过滤后用4％甲醇溶液稀释8倍获得样品待测液。向OTA核酸适配体包被的微孔板的孔中加入90μL样品待测液、浓度分别为0.5pg/ml、1pg/ml、10pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml的OTA标准品以及OTA浓度为0pg/ml的对照组，孵育0.9h，用200μL浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗板2次，其中，PBS溶液的PH为7.3，向OTA核酸适配体包被的微孔板的孔中加入100μLCas12a-crRNA-ssDNA-FQ混合物，反应至90min，得到目标检测物；
在λex＝590nm,λem＝620nm条件下，对目标检测物进行荧光检测，得到荧光信号；
将样品待测液的荧光信号与对照品的荧光信号值进行比较，确定样品待测原料是否含有OTA，包括：
若荧光信号低于对照品的荧光信号值，确定待测原料中含有OTA；
若荧光信号不低于对照品的荧光信号值，确定待测原料中不含有OTA。
用对照组的荧光信号值减去各OTA标准组的荧光信号值，得到各浓度标准组的荧光信号差值ΔI，绘制ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线；用对照组的荧光信号值减去样品待测液的荧光信号值，得到ΔI样品，将ΔI样品代入ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线，计算出样品待测液浓度的对数，求其反对数，再乘以8倍得到待测样品中的OTA浓度。OTA核酸适配体的核酸序列为序列表中的序列1。ssDNA-FQ的核苷酸序列为序列表中的序列2。crRNA的核苷酸序列为序列表中的序列3。
链霉亲和素溶液的添加量为90μL，链霉亲和素溶液的浓度为1μg/mL；链霉亲和素溶液的溶剂为碳酸钾溶液，碳酸钾溶液的浓度为0.05mol/L，PH为9.5。
根据权利要求1的检测方法，其特征在于，洗板操作为：采用190μLPBS溶液进行洗板，PBS溶液的浓度为0.005mol/L，PBS溶液的pH为7.3。
检测方法还包括：获得生物素修饰的OTA核酸适配体原液，OTA核酸适配体原液合成公司：生工生物工程(Shanghai,China)，加入0.05mol/L的PBS溶液进行稀释，得到浓度为10nmol/L的生物素修饰OTA核酸适配体；其中，PBS溶液的pH为7.3。
向封闭板孔加入生物素修饰的OTA核酸适配体，包括：向封闭板孔的孔中加入90uL的生物素修饰的OTA核酸适配体；其中，OTA核酸适配体为激活Cas12a-crRNA切割ssDNA-FQ的ssDNA。
缓冲液为NEBr2.1缓冲液中，NEBr2.1缓冲液包括：40mmol/L的NaCl溶液、5mmol/L的Tris-HCl溶液、5mmol/L的MgCl2溶液和90μg/mL的重组白蛋白溶液，NEBr2.1缓冲液的PH为7.7。
根据权利要求1的检测方法，其特征在于，Cas12a和crRNA的浓度为10nmol/L，ssDNA-FQ报告基因为浓度为100nmol/L。
实施例三
一种由CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法，方法包括：
向高结合96孔透明微孔板的孔中加入110μL浓度为20μg/mL的链霉亲和素溶液，链霉亲和素溶液的溶剂为浓度0.15mol/L且PH为9.7的碳酸钾溶液，将加入链霉亲和素溶液的96孔板在5℃孵育17h，采用210μL浓度为0.015mol/L的PBS溶液洗板2次，加入110μL浓度为11mg/mL的牛血清蛋白溶液封闭板孔1.5h,向封闭板孔的每孔加入110μL生物素修饰的OTA核酸适配体，OTA核酸适配体的浓度为1000nmol/L，在26℃下摇匀，采用210μL浓度为0.015mol/L的PBS溶液洗板2次，得到OTA核酸适配体包被的微孔板，其中，PBS溶液的PH为7.5；
在NEBr2.1缓冲液中，将150nmol/LCas12a和等量的crRNA在26℃条件下孵育11min至Cas12a和crRNA结合，加入浓度为1000nmol/L的ssDNA-FQ报告基因，混匀，得到CRISPR/Cas12a-crRNA-ssDNA-FQ混合液；
将待测原料粉碎后溶解在50％甲醇溶液中离心，收集上清液作为样品原液，过滤后用5％甲醇溶液稀释11倍获得样品待测液。向OTA核酸适配体包被的微孔板的孔中加入100μL样品待测液、浓度分别为0.5pg/ml、1pg/ml、10pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml的OTA标准品以及OTA浓度为为0pg/ml的对照组，孵育1h，用210μL浓度为0.015mol/L的PBS溶液洗板2次，其中，PBS溶液的PH为7.4，向OTA核酸适配体包被的微孔板的孔中加入110μLCas12a-crRNA-ssDNA-FQ混合物，反应至110min，得到目标检测物；
在λex＝590nm,λem＝620nm条件下，对目标检测物进行荧光检测，得到荧光信号；
将样品待测液的荧光信号与对照品的荧光信号值进行比较，确定样品待测原料是否含有OTA，包括：
若荧光信号低于对照品的荧光信号值，确定待测原料中含有OTA；
若荧光信号不低于对照品的荧光信号值，确定待测原料中不含有OTA。
用对照组的荧光信号值减去各OTA标准组的荧光信号值，得到各浓度标准组的荧光信号差值ΔI，绘制ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线；用对照组的荧光信号值减去样品待测液的荧光信号值，得到ΔI样品，将ΔI样品代入ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线，计算出样品待测液浓度的对数，求其反对数，再乘以11倍得到待测样品中的OTA浓度。OTA核酸适配体的核酸序列为序列表中的序列1。ssDNA-FQ的核苷酸序列为序列表中的序列2。crRNA的核苷酸序列为序列表中的序列3。
链霉亲和素溶液的添加量为110μL，链霉亲和素溶液的浓度为20μg/mL；链霉亲和素溶液的溶剂为碳酸钾溶液，碳酸钾溶液的浓度为0.15mol/L，PH为9.7。
根据权利要求1的检测方法，其特征在于，洗板操作为：采用210μLPBS溶液进行洗板，PBS溶液的浓度为0.015mol/L，PBS溶液的pH为7.5。
检测方法还包括：获得生物素修饰的OTA核酸适配体原液，OTA核酸适配体原液合成公司：生工生物工程(中国上海)，加入0.015mol/L的PBS溶液进行稀释，得到浓度为500nmol/L的生物素修饰OTA核酸适配体；其中，PBS溶液的pH为7.5。
向封闭板孔加入生物素修饰的OTA核酸适配体，包括：向封闭板孔的孔中加入110uL的生物素修饰的OTA核酸适配体；其中，OTA核酸适配体为激活Cas12a-crRNA切割ssDNA-FQ的ssDNA。
缓冲液为NEBr2.1缓冲液中，NEBr2.1缓冲液包括：60mmol/L的NaCl溶液、15mmol/L的Tris-HCl溶液、15mmol/L的MgCl溶液和110μg/mL的重组白蛋白溶液，NEBr2.1缓冲液的PH为8.0。
根据权利要求1的检测方法，其特征在于，Cas12a和crRNA的浓度为150nmol/L，ssDNA-FQ报告基因为浓度为1000nmol/L。
一种使用CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法的试剂盒，其特征在于，包括上述任一一种可实施方式的检测方法。
实验例
实验用试剂如下：
碳酸钾、PBS溶液和牛血清蛋白均购自Sigma-Aldrich公司(中国上海)。
氯化钠(NaCl)、甲醇、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)和氯化镁(MgCl)2)购自国药化学试剂有限公司(中国上海)。
链霉亲和素、盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(三(羟甲基)HCl)和OTA均购自Aladdin(中国上海)。
核酸非变性聚丙烯酰胺凝胶试剂盒和凝胶红染料购自索莱宝(中国北京)。上样缓冲液购自生工生物工程(中国上海)。
高结合度96孔透明微孔板购自浙江百奥生物有限公司(中国杭州)。LbCas12a购自新英格兰生物实验室有限公司(中国北京)。
商用ELISA试剂盒购自中国诺维奇生物有限公司有限公司(中国北京)。
用蒸馏水(18.2MΩ·cm-1)制备所有水溶液。
用微孔板恒温振荡器(BE-9010，海门市麒麟贝尔实验仪器制造有限公司，中国)温育微孔板。
荧光信号用多功能酶标仪(SynergyH1平板阅读器，Biotek，美国)记录。使用凝胶成像系统(Tanon4200SF，中国上海)进行凝胶成像。
商用的OTA检测ELISA试剂盒(P1340)，购自中国北京索莱宝科技有限公司。
CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的ELASA用于OTA检测的可行性分析
具体步骤如下：分四组进行实验，第一组：Cas12a-crRNA+ssDNA-FQ；第二组：Cas12a-crRNA+ssDNA-FQ+OTA；第三组：Cas12a-crRNA+ssDNA-FQ+OTA核酸适配体+OTA；第四组：Cas12a-crRNA+ssDNA-FQ+OTA核酸适配体。在各孔板内分别按照实施例一中介绍的步骤加入优化后的以下试剂：
实验步骤如下：微孔板的制作：向96孔板的每孔中加入100μL 5μg/mL的链霉亲和素溶液，在4℃下孵育8-17h，然后用200μLPBS溶液洗板2次。加入100μL10mg/mL的牛血清蛋白溶液后，在室温下摇匀1h，然后用0.01mol/L的PBS溶液洗板2次，PBS溶液的PH为7.4；
向第三、四组微孔中加入100μL100nmol/L的生物素修饰的OTA核酸适配体，向第一、二组微孔中加入100μL0.01mol/LPBS溶液，PBS溶液的PH为7.4，在室温下摇匀1h，然后用0.01mol/L的PBS溶液洗板2次，PBS溶液的PH为7.4；
向第二、三组微孔中加入100μL5％甲醇稀释后的样品待测液，向第一、四组微孔中加入100μL5％甲醇，孵育1h，用0.01mol/L的PBS溶液洗板2次，PBS溶液的PH为7.4；
在NEBr2.1缓冲液中，将50nmol/L的Cas12a和等量的crRNA，在26℃条件下摇匀孵育10min以结合，随后加入500nmol/L的ssDNA-FQ，混匀，向微孔板各组的孔中加入100μLCas12a-crRNA-ssDNA-FQ混合物，并记录λex＝590nm,λem＝620nm下的荧光信号。
验证CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的ELASA用于OTA检测的可行性，关键是看OTA核酸适配体能否启动反应及其竞争性结合力的强弱。参照图2可以看出只有OTA核酸适配体存在时，荧光强度才发生明显变化，只有OTA但不加OTA核酸适配体时，没有明显的荧光强度变化，加入OTA核酸适配体后再加入OTA，会使荧光强度降低。这些结果表明，CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的ELASA用于OTA检测是可行的。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)验证可行性
实验步骤如下：首先制备15％的非变性聚丙烯酰胺凝胶液，静置凝固20min成凝胶后用于电泳分析。从上述CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的ELASA检测可行性的四组实验的微孔板内分别取5μL不同样品与1μL6×上样缓冲液混合均匀后，取5μL混合物加载于凝胶孔中。然后在200V恒电压下电泳1h，最后用凝胶红染料对凝胶进行染色40min。使用凝胶成像系统(Tanon4200SF)在紫外光下对染色后的凝胶进行成像。参照图3，条带1-4分别对应荧光强度检测的第一至第四组结果。可见条带1和2中没有ssDNA-FQ被切割后图像，条带3中未切割ssDNA-FQ颜色比条带4的深，被切割ssDNA-FQ颜色比条带4的浅，说明OTA的加入与crRNA竞争性结合OTA核酸适配体，抑制了对ssDNA-FQ的切割，从而进一步验证了本方案用于OTA检测的可行性。
生物传感技术用于OTA检测的灵敏度测试
采用CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的ELASA生物传感器对不同浓度OTA进行检测
用5％甲醇水溶液配制不同浓度的OTA标准溶液，第一组OTA标准溶液浓度：0.5pg/ml，第二组OTA标准溶液浓度：1pg/ml，第三组OTA标准溶液浓度：5pg/ml，第四组OTA标准溶液浓度：10pg/ml，第五组OTA标准溶液浓度：100pg/ml，第六组OTA标准溶液浓度：500pg/mL，第七组OTA标准溶液浓度：1000pg/mL。
实验步骤如下：OTA核酸适配体包被的微孔板的制作：向96孔板的每孔中加入100μL5μg/mL的链霉亲和素溶液，在4℃下孵育8-17h，然后用200μLPBS溶液洗板2次。加入100μL10mg/mL的牛血清蛋白溶液后，在室温下封闭板孔1h,再加入100μL100nmol/L的生物素修饰的OTA核酸适配体，在室温下摇匀1h，然后用0.01mol/L的PBS溶液洗板2次，PBS溶液的PH为7.4；
CRISPR/Cas12a-crRNA与ssDNA-FQ的混合物制作：在NEBr2.1缓冲液中，将50nmol/L的Cas12a和等量的crRNA，在26℃条件下摇匀孵育10min以结合，随后加入500nmol/L的ssDNA-FQ，混匀，将制备好的CRISPR/Cas12a-crRNA与ssDNA-FQ的混合物在低温下保存备用；
第一组至第七组的标准品溶液各100μL添加在OTA核酸适配体包被的微孔板的孔中，孵育1h，用PBS溶液洗涤2次。最后，OTA核酸适配体包被的微孔板的孔中加入100μLCas12a-crRNA与ssDNA-FQ混合物，并记录λex＝590nm,λem＝620nm下的荧光信号。
获得荧光强度随OTA浓度变化曲线。如图4所示，荧光信号随着OTA浓度的增加而降低。为了进一步考察分析性能，我们计算了不同浓度OTA标准溶液的荧光强度的ΔI值。图5展示了不同浓度OTA标准溶液的荧光强度的ΔI值随时间变化曲线。我们发现，ΔI值与OTA标准溶液浓度从0.5pg/mL到1ng/mL的对数值呈线性关系。取反应100min后的数据作图，线性相关方程可表示为y＝10979.17872x+6395.19391(R2＝0.999)。OTA的LOD值为0.39pg/mL。图6是反应100min后标准曲线。
OTA检测的生物传感器的特异性分析
为了评估所制备的生物传感器的特异性，选择赭曲霉毒素B(ochratoxinB,OTB)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(vomitoxin,DON)作为干扰物。
实验步骤如下：向96孔板的每孔中加入100μL5μg/mL链霉亲和素溶液，4℃孵育8-17h，然后用200μL0.01mol/LpH7.4的PBS溶液洗板2次。加入100μL10mg/mL牛血清蛋白溶液后在室温下封闭板孔1h，最后再加入100μL100nM生物素修饰的OTA核酸适配体，在室温下摇匀1h，然后用200μL0.01mol/LpH7.4的PBS溶液洗板2次。获得OTA核酸适配体修饰的微孔板。
每孔分别加入100uL100pg/mlOTA、1ug/mlOTB、1ug/mlZEN、1ug/mlDON在室温下摇匀1h，每个样品做三组平行对照，然后用PBS溶液(0.01M，pH7.4)洗板2次。
在NEBr2.1缓冲液中配制50nmol/LCas12a-crRNA,在26℃下摇匀混匀10min，再加入长度为30nt的浓度为500nmol/L的ssDNA-FQ,使用BiotekSynergyH1平板检测仪记录λex＝590nm,λem＝620nm下的荧光信号，如图7所示，该生物传感器对除OTA外其他各种真菌毒素进行测试时，未观察到荧光强度明显下降，说明OTA核酸适配体没有识别除OTA外的其他真菌毒素。综上，构建的生物传感器具有令人满意的特异性。
将本发明的ELASA法和商用的ELISA试剂盒进行测试对比：
如图8所示，其中通过实际样品(大米和燕麦样本)对本发明的ELASA与ELISA试剂盒的检测性能进行比对检测，从而对本发明的ELASA法检测性能进行全面评测。大米和燕麦样本在测试前稀释10倍，其中检测时取100μL，与OTA标准品采用相同的方法进行检测，并获得荧光信号。同时采用商用的ELISA试剂盒对样品进行检测，与ELASA的结果进行对比。结果表明，ELASA的检测结果与ELISA试剂盒的检测结果符合度良好。
应该理解，可以使用上面所示的各种形式的流程，重新排序、增加或删除步骤。例如，本发公开中记载的各步骤可以并行地执行也可以顺序地执行也可以不同的次序执行，只要能够实现本公开公开的技术方案所期望的结果，本文在此不进行限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种由CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法，其特征在于，所述OTA检测方法包括以下步骤：
向孔板的孔中加入链霉亲和素溶液，在3-5℃下孵育15-17h，洗板，得到链霉亲和素修饰的微孔板；
向链霉亲和素修饰的微孔板的板孔中加入90-110μL浓度为9-11mg/mL的牛血清蛋白溶液封闭板孔，洗板，得到牛血清蛋白溶液封闭的微孔板；
向牛血清蛋白溶液封闭的微孔板的板孔中加入生物素修饰的OTA核酸适配体，在20-26℃下摇匀，洗板，得到OTA核酸适配体包被的孔板；
在缓冲液中，将Cas12a和等量的crRNA在20-27℃条件下孵育9-11min，加入ssDNA-FQ报告基因，混匀，得到Cas12a-crRNA-ssDNA-FQ混合液；
将待测原料粉碎后溶解、离心，收集上清液作为样品原液，过滤，稀释8-11倍后获得样品待测液，向OTA核酸适配体包被的孔板的孔中分别加入90-110μL样品待测液和对照品，孵育0.9-1.5h，洗板，得到孵育了样品待测液和对照品的孔板；
向孵育了样品待测液和对照品的孔板的孔中加入90-110μLCas12a-crRNA-ssDNA-FQ混合物，反应至90-110min后，得到目标检测物；
在λex＝590nm,λem＝620nm条件下，对目标检测物进行荧光检测，得到荧光信号；
通过对比样品待测液的荧光信号值与对照品的荧光信号值判断样品待测液内是否存在OTA。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，将所述样品待测液的荧光信号与对照品的荧光信号值进行比较，确定所述样品待测原料是否含有OTA，包括：
若所述荧光信号低于对照品的荧光信号值，确定所述待测原料中含有OTA；
若所述荧光信号不低于对照品的荧光信号值，确定所述待测原料中不含有OTA。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，OTA核酸适配体包被的孔板的孔中分别加入90-110μL样品待测液、多组浓度为0.2-1200pg/ml的OTA标准品、OTA浓度为0pg/ml的对照品，多组所述OTA标准品的浓度不同，用对照组的荧光信号值减去各OTA标准组的荧光信号值，得到各浓度标准组的荧光信号差值ΔI，绘制ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线；用对照组的荧光信号值减去样品待测液的荧光信号值，得到ΔI样品，将ΔI样品代入ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线，计算出样品待测液浓度的对数，求其反对数，再乘以8-11倍得到待测样品中的OTA浓度。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述链霉亲和素溶液的添加量为90-110μL，所述链霉亲和素溶液的浓度为1-20μg/mL；所述链霉亲和素溶液的溶剂为碳酸钾溶液，所述碳酸钾溶液的浓度为0.05-0.15mol/L，PH为9.5-9.7。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述洗板操作为：采用190-210μLPBS溶液进行洗板，所述PBS溶液的浓度为0.005-0.015mol/L，所述PBS溶液的pH为7.3-7.5。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：获得生物素修饰的OTA核酸适配体原液，加入0.005-0.015mol/L的PBS溶液进行稀释，得到浓度为10-500nmol/L的生物素修饰OTA核酸适配体；其中，所述PBS溶液的pH为7.3-7.5。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述向封闭板孔加入生物素修饰的OTA核酸适配体，包括：向封闭板孔的孔中加入90-110μL的所述生物素修饰的OTA核酸适配体；其中，所述OTA核酸适配体为激活Cas12a-crRNA切割ssDNA-FQ的ssDNA。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述Cas12a和crRNA的浓度为10-150nmol/L，所述ssDNA-FQ报告基因浓度为100-1000nmol/L。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述方法具体包括：向高结合96孔透明微孔板的孔中加入100μL浓度为5μg/mL的链霉亲和素溶液，所述链霉亲和素溶液的溶剂为浓度0.1mol/L且PH为9.6的碳酸钾溶液，将加入链霉亲和素溶液的96孔板在4℃孵育16h，采用200μL浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗板2次，加入100μL浓度为10mg/mL的牛血清蛋白溶液封闭板孔1h,向封闭板孔的每孔加入100μL生物素修饰的OTA核酸适配体，所述OTA核酸适配体的浓度为100nmol/L，在26℃下摇匀，采用200μL浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗板2次，得到OTA核酸适配体包被的微孔板，其中，所述PBS溶液的PH为7.4；
在NEBr2.1缓冲液中，将50nmol/LCas12a和等量的crRNA在26℃条件下孵育10min至Cas12a和crRNA结合，加入浓度为500nmol/L的ssDNA-FQ，混匀，得到Cas12a-crRNA和ssDNA-FQ的混合液；
将待测原料粉碎后溶解在50％甲醇溶液中离心，收集上清液作为样品原液，过滤后用5％甲醇溶液稀释10倍获得样品待测液，向OTA核酸适配体包被的微孔板的孔中加入100μL样品待测液、浓度分别为0.5pg/ml、1pg/ml、10pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml的OTA标准品以及OTA浓度为为0pg/ml的对照组，孵育1h，用200μL浓度为0.01mol/L的PBS溶液洗板2次，其中，所述PBS溶液的PH为7.4，向OTA核酸适配体包被的微孔板的孔中加入100μLCas12a-crRNA和ssDNA-FQ的混合物，反应至100min，得到目标检测物；
在λex＝590nm,λem＝620nm条件下，对目标检测物进行荧光检测，得到荧光信号；
通过对比样品待测液的荧光信号值与对照品的荧光信号值判断样品待测液内是否存在OTA；
用对照组的荧光信号值减去各OTA标准组的荧光信号值，得到各浓度标准组的荧光信号差值ΔI，绘制ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线；用对照组的荧光信号值减去样品待测液的荧光信号值，得到ΔI样品，将ΔI样品代入ΔI与OTA标准品浓度对数的标准曲线，计算出样品待测液浓度的对数，求其反对数，再乘以10倍得到待测样品中的OTA浓度。
10.一种使用CRISPR/Cas12a-crRNA驱动的OTA检测方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：应用于包括权利要求1-9任一一项所述的检测方法。
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