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CN116601175A - 用于靶向疗法的前体蛋白和试剂盒 - Google Patents

用于靶向疗法的前体蛋白和试剂盒 Download PDF

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CN116601175A
CN116601175A CN202180084752.9A CN202180084752A CN116601175A CN 116601175 A CN116601175 A CN 116601175A CN 202180084752 A CN202180084752 A CN 202180084752A CN 116601175 A CN116601175 A CN 116601175A
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U·布林克曼
A·布乔茨克
C·布尔登
G·乔治斯
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F Hoffmann La Roche AG
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

本发明涉及包含失活的受体配体或酶的前体蛋白的组合以及其用于疗法的方法。

Description

用于靶向疗法的前体蛋白和试剂盒
技术领域
本发明涉及包含失活的受体配体或酶的前体蛋白的组合以及其用于疗法的方法。
背景技术
先前已经报道了用于靶向激活抗原结合位点的方法和多肽。WO2019086362和PCT/EP2020/061413报道了通过多肽链交换从两种前体蛋白形成抗CD3抗体结合位点。包含不稳定的CH3界面和所需抗CD3抗体的可变结构域之一的两种前体蛋白被描述为经历多肽链交换，从而组装成包含所需抗CD3抗体的蛋白质。
细胞因子是通过调节白细胞的存活、增殖、分化和效应功能来调节免疫应答的蛋白质(Dinarello CA,Eur J Immunol.2007；37(Suppl 1):S34–S45)。根据结构相似性，细胞因子可分为多个家族和亚家族。四-α-螺旋束家族包括白细胞介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-15、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、心肌营养素-1(CT-1)、制瘤素M(OSM)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及其他(Nicola NA和Hilton DJ,Adv.Protein Chem.1998；52:1-65)。IL-12家族包括异二聚体细胞因子，如IL-12、IL-23、IL-27和IL-35，其中各细胞因子的α链属于四-α-螺旋束家族(Vignali DAA和Kuchroo VJ,Nat Immunol.2012Aug；13(8):722–728)。IL-17的同源物总结在IL-17家族中(McGeachy MJ等人,Immunity.2019；50(4):892-906)。IL-1家族由IL-1和IL-18组成。半胱氨酸-结家族含有转化生长因子β(TGF-β)细胞因子(Sun PD和Davies DR,Annu Rev Biophys Biomol Struct.1995；24:269–291)。
迄今为止，细胞因子已应用于治疗各种疾病，包括自身免疫、病毒感染和癌症(T等人,J Pharm Sci.2015Feb；104(2):307-26)。多种细胞因子已被评估用于治疗癌症，包括白细胞介素(IL)-2、IL-12、IL-15、IL-21和I型干扰素(IFN)，如IFN-α(Ardolino M,Hsu J,Raulet DH,Oncotarget 2015 6:19346–19347)。此外，几种细胞因子产品已获准用于临床(T等人,J Pharm Sci.2015Feb；104(2):307-26)。
然而，单独使用细胞因子作为治疗剂通常会带来重大缺陷。为了在肿瘤组织中达到有效浓度，需要施用大量细胞因子，这反过来会导致严重的不良反应，包括发烧、低血压、疲劳、恶心、厌食或中性粒细胞减少。
细胞因子已用于癌症疗法(Waldmann TA,Cold Spring Harb PerspectBiol.2018Dec 3；10(12))。这个全身分布的问题可通过将细胞因子融合到肿瘤靶向抗体或抗体样分子来解决，从而使治疗剂优先在肿瘤部位积累。各种抗体-细胞因子融合物已显示出靶向癌症免疫疗法的可喜成果(Kiefer JD,Neri D,Immunol Rev.2016；270(1):178–192)。虽然细胞因子的抗原靶向递送可减少全身细胞因子负荷，但抗原特异性仍然是一个挑战。许多肿瘤抗原只是过度表达，而不是只在肿瘤细胞上表达(Vigneron N,Biomed ResInt.2015；2015:948501)。中靶的脱瘤靶向可导致健康组织的严重损伤。
因此，仍然需要基于细胞因子的癌症疗法的替代方法。
发明内容
本发明涉及一种第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中每种前体蛋白包含经由二聚化结构域彼此缔合的两个多肽，其中前体蛋白中的至少一种包含选自受体配体和酶的部分，其中所述部分是功能失活的，其中所述部分与二聚化结构域融合，其中当第一前体蛋白与第二前体蛋白之间进行多肽链交换时，形成活化的蛋白，其中活化的蛋白包含来自第一前体蛋白的一个多肽和来自第二前体蛋白的一个多肽，其中两个多肽经由其二聚化结构域彼此缔合，并且其中活化的蛋白包含所述部分，特征在于，活化的蛋白包含处于功能活性形式的所述部分。
在一个实施例中，第一前体蛋白或第二前体蛋白包含选自受体配体和酶的部分，其中部分与失活部分结合。当多肽链交换时，失活部分被移除，由此使部分成为功能活性形式。
在另一实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含选自受体配体和酶的部分的互补亚基。当多肽链交换时，所得活化的蛋白包含处于功能活性形式的部分，即包含两个互补亚基。
在又一实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含选自受体配体和酶的人工分割的部分(moiety)的互补部分(part)，其中互补部分中的一个是失活的。当多肽链交换时，所得活化的蛋白包含人工分割的部分的并非失活的两个部分，由此包含处于功能活性形式的部分。
在一个实施例中，二聚化结构域为CH3结构域。在一个实施例中，CH3结构域具有经修饰的界面以支持第一前体蛋白与第二前体蛋白之间的多肽链交换。
在一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白与靶细胞的抗原特异性结合。在一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含与靶细胞表面上的抗原特异性结合的抗体片段。
在一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含铰链区。在一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白在铰链区内不包含链间二硫键。
在一个实施例中，活化的蛋白包含与抗原特异性结合的VH结构域和VL结构域对，其中VH结构域包含在来自第一前体蛋白的多肽中并且VL结构域包含在来自第二前体蛋白的多肽中；或者，活化的蛋白包含与抗原特异性结合的VH结构域和VL结构域对，其中VL结构域包含在来自第一前体蛋白的多肽中并且VH结构域包含在来自第二前体蛋白的多肽中。
本发明的另一方面是用于疗法的本发明的组合。
本发明的另一方面是本发明的一种第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合用于生成选自受体配体和酶的所述部分的活化形式的用途。
本发明的另一方面是一种包括本发明的第一前体蛋白和第二前体蛋白的治疗性试剂盒。
本发明的另一方面是一种用于提供本发明的治疗性试剂盒的方法，其包括以下步骤：提供重组表达的第一前体蛋白和重组表达的第二前体蛋白，以及任选地与药用载体一起配制第一前体蛋白和第二前体蛋白，以提供治疗性试剂盒。
本发明的另一方面是一种蛋白质(活化的蛋白)，其包含选自受体配体和酶的部分的功能活性形式，该功能活性形式通过本发明的第一前体蛋白和第二前体蛋白之间的多肽链交换产生。
本发明的另一方面是一种用于提供活化的蛋白的方法，该活化的蛋白包含选自受体配体和酶的部分的功能活性形式，该方法包括以下步骤：将本发明的第一前体多肽和第二前体多肽组合，使得前体多肽经历多肽链交换以形成活化的蛋白。
根据本发明，通过多肽链交换从两个前体多肽形成功能活性的受体配体或酶。多肽链交换发生在两种前体蛋白在适当条件下结合时，例如，当两种前体蛋白非常接近时，如同当它们结合在靶细胞表面时。本发明允许在感兴趣的位点靶向激活疗法所需的功能部分，因此有利于疗法，例如，脱靶毒性降低。
附图说明
图1A：实例中示例性使用的前体多肽(R1，R2)的抗体核心的结构域排列。多肽链交换导致产物多肽(P1和P2)的形成。
图1B：包含人工分割的IL-4的实例1中描述的前体多肽的结构域排列。前体蛋白(R1，R2)之间的多肽链交换导致活化产物蛋白P1和失活产物蛋白P2的形成。
图2A：白细胞介素4的分割设计(蛋白质数据库2B8U)。IL-4的3+1分割。一个部分由白细胞介素4的N末端螺旋组成(浅灰色)，另一部分由剩余的蛋白质组成(深灰色)。
图2B：白细胞介素4的分割设计(蛋白质数据库2B8U)。IL-4的2+2分割。循环排布生成白细胞介素4DABC。一个部分由白细胞介素4DABC的两个N末端螺旋组成(浅灰色)，另一部分由剩余的蛋白质组成(深灰色)。
图3A：根据实例1包含人工分割的IL-4和活性产物(P1)蛋白的纯化的前体蛋白(R1，R2)的SDS-PAGE分析。通过从细胞培养上清液中进行Kappa Select提取然后进行离子交换色谱法来进行蛋白质制备。
图3B：如实例1中所述的纯化的分子R2的示例性SEC谱。谱的主峰代表感兴趣的蛋白质。
图4A：用TF-1细胞测量IL-4活性。TF-1增殖测定法检测IL-4信号传导功能的原理。IL-4与TF-1细胞上的IL-4受体结合并诱导增殖。
图4B：TF-1细胞上抗原表达(Her2、CD38、LeY、CD33)的流式细胞术分析。
图4C：在TF-1增殖测定法中测试构建体以比较IL-4和IL-4DABC活性。
图4D：用图4B中描绘的分子进行的TF-1增殖测定。IL-4DABC表现出与IL-4相似的活性。
图5A：用具有E9Q和R88Q突变的3+1分割IL-4前体蛋白进行的TF-1细胞增殖测定法。靶向CD38的分子，其在TF-1细胞上表达。
图5B：用具有E9Q和R88Q突变的3+1分割IL-4前体蛋白进行的TF-1细胞增殖测定法。靶向Her2的分子，其不在TF-1细胞上表达。
图5C：用具有E9Q和R88Q突变的3+1分割IL-4前体蛋白进行的TF-1细胞增殖测定法。靶向和非靶向多肽链交换的比较。
图6：用分割IL-4前体蛋白和靶向CD38的产物分子进行的TF-1细胞增殖测定法。
图7：用具有不同突变的100nM 3+1分割IL-4反应物分子进行的TF-1细胞增殖测定法。
图8A：用具有T6D E9A和R81E R88Q突变的2+2分割IL-4前体蛋白进行的TF-1细胞增殖测定法。靶向CD38的分子，其在TF-1细胞上表达。
图8B：用具有T6D E9A和R81E R88Q突变的2+2分割IL-4前体蛋白进行的TF-1细胞增殖测定法。靶向Her2的分子，其不在TF-1细胞上表达。
图8C：用具有T6D E9A和R81E R88Q突变的2+2分割IL-4前体蛋白进行的TF-1细胞增殖测定法。靶向和非靶向多肽链交换的直接比较。
图9A：表面等离子体共振(SPR)。SPR装置用于研究含IL-4的分子与IL-4受体α的相互作用。
图9B：表面等离子体共振(SPR)。由SPR测试的分子的数值结果。
图9C：表面等离子体共振(SPR)。由SPR测试的分子的图形结果。
图10A：实例2中使用的包含白细胞介素2的前体多肽的设计和模块化组成。
图10B：三种不同的前体蛋白适合作为图10A所示方法中的反应物和R1。IL-2v是指为降低与白细胞介素2受体α的结合而设计的IL-2变体；γc是指共同γ链的细胞外结构域；IL-2Rβ是指白细胞介素2受体β的细胞外结构域。
图11：纯化的前体蛋白R2、活性产物(P1)和三种不同的前体蛋白R1的SDS-PAGE分析。通过从细胞培养上清液中进行Kappa Select提取然后进行离子交换色谱法来进行蛋白质制备。
图12A：用CTLL-2细胞测量IL-2v活性。CTLL-2增殖测定法检测IL-2v信号传导功能的原理。IL-2v与CTLL-2细胞上的IL-2受体(由IL-2Rβ和γc组成)结合并诱导增殖。
图12B：用CTLL-2细胞测量IL-2v活性。CTLL-2增殖测定法如实例2中所述。
图13A：实例2中使用的包含白细胞介素12的前体多肽的设计和模块化组成。该方法利用了IL-12的p35和p40亚基。P35i和p40i是指p35和p40的失活版本。在这里，前体蛋白R2仅携带一个IL-12p40亚基，没有相邻的IL-12p35亚基。
图13B：实例2中使用的包含白细胞介素12的前体多肽的设计和模块化组成。在这里，前体蛋白R2携带IL-12p40亚基(IL-12p40)以及失活的IL-12p35亚基(IL-12p35i)。
图14：纯化产物P1和包含若干IL-12亚基的反应物R1分子的SDS-PAGE分析。通过从细胞培养上清液中进行Kappa Select提取然后进行离子交换色谱法来进行蛋白质制备。对于P1，SDS-PAGE表明所有多肽链都存在于制备物中。对于R1，两条重链具有相似的分子量，因此两条带重叠。然而，两种类型的重链的存在都通过质谱法得到证实。
图15：使用HEK-Blue IL-12报告细胞对图13A中描绘的分子进行IL-12活性测量。
图16：实例9中使用的包含分割萤光素酶的前体多肽的设计和模块化组成
图17：在存在或不存在表达CD38的TF-1细胞的情况下，50nM靶向CD38的分割萤光素酶前体多肽R1和R2及其组合的发光读数(实例10)
具体实施方式
1.定义
除非本文另有定义，否则与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。本公开的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行。通常，与本文所述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的术语和技术是本领域公知的和常用的。
除非上下文另外清楚指出，否则术语“一个”、“一种”、“所述”一般包含复数指代。
除非本文另有定义，否则术语“包括”应包括术语“由……组成”。
除非上下文另外清楚指出，否则使用术语“或者……或者”提供的两种替代方案表示相互排斥的替代方案。
如本文所用，术语“抗原结合区”是指与靶抗原特异性结合的部分。该术语包括抗体以及能够特异性地结合至靶抗原的其他天然(例如受体、配体)或合成(例如DARPin)分子。
术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用，术语“结合位点”或“抗原结合位点”表示抗原实际结合的抗原结合区的一个或多个区域。在抗原结合区是抗体的情况下，抗原结合位点包括抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)，或VH/VL对。衍生自特异性地结合至靶抗原的抗体的抗原结合位点可衍生自：a)特异性地结合至抗原的已知抗体；或b)新的抗体或抗体片段，这些抗体或抗体片段通过使用特别是抗原蛋白或核酸或其片段的重新免疫化方法或通过噬菌体展示方法获得的。
当衍生自抗体时，根据本发明的抗体的抗原结合位点可包含六个互补决定区(CDR)，这六个互补决定区在不同程度上有助于抗原结合位点的亲和力。有三个重链可变结构域CDR(CDRH1、CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)。CDR和框架区(FR)的范围通过与氨基酸序列的汇编数据库进行比较来确定，在该数据库中，已根据序列之间的变异性定义了那些区域。本发明范围内还包括由较少CDR组成的功能性抗原结合位点(即，结合特异性由三个、四个或五个CDR决定)。例如，少于完整的一组6个CDR对于结合可能是足够的。
如本文所用，术语“价”表示在抗体分子中存在指定数目的结合位点。例如，天然抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此，术语“三价”表示抗体分子中存在三个结合位点。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，该分子包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab、Fab-SH、F(ab)2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv、scFab)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“特异性”是指抗原结合区(例如，抗体)对于抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体为单特异性的。如本文所用，术语“单特异性抗体”表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点结合至相同抗原的相同表位。“多特异性抗体”结合两个或更多个不同的表位(例如，两个、三个、四个或更多个不同的表位)。表位可以在相同或不同的抗原上。多特异性抗体的一个示例是结合两个不同表位的“双特异性抗体”。当抗体具有不止一种特异性时，识别的表位可能与单一抗原或不止一种抗原缔合。
表位是被抗原结合区(例如，抗体)结合的抗原区域。术语“表位”包括能够特异性结合至抗体或抗原结合区的任何多肽决定簇。在某些实施例中，表位决定簇包括分子诸如氨基酸的化学活性表面基团、聚糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施例中，可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。
如本文所用，术语“结合”和“特异性结合”是指在体外测定法中，优选地在使用纯化的野生型抗原进行的等离子体共振测定法(GE-Healthcare Uppsala,Sweden)中，抗体或抗原结合区与抗原表位的结合。在某些实施例中，当抗体或抗原结合区优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原时，该抗体或抗原结合部分被称为特异性结合抗原。
抗体与抗原结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合速率常数)、kd(解离常数)和KD(kd/ka)定义。在一个实施例中，结合或其特异性地结合至是指10- 8mol/l或更小的结合亲和力(KD)，在一个实施例中为10-8M至10-13mol/l。因此，抗原结合区，特别是抗体结合位点，以10-8mol/l或更低的结合亲和力(KD)特异性结合其特异性的每种抗原，例如，结合亲和力(KD)为10-8mol/l至10-13mol/l。在一个实施例中，结合亲和力(KD)为10-9mol/l至10-13mol/l。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature352:624-628(1991)。
本申请内使用的术语“恒定结构域”或“恒定区”表示除可变区之外的抗体结构域的总和。恒定区不直接参与抗原的结合，但表现出多种效应子功能。
根据其重链的恒定区的氨基酸序列，将抗体分为以下“类别”：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类，诸如IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α，δ，ε，γ和μ。可以在所有五种抗体类别中找到的轻链恒定区(CL)称为κ(卡帕)和λ(兰姆达)。
如本文所用，“恒定结构域”优选地来自人源，其来自亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区。这种恒定结构域和区在现有技术中是众所周知的，并且由例如Kabat等人《免疫学兴趣蛋白质序列(第五版》(Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutesof Health,Bethesda,MD(1991))描述。
在野生型抗体中，“铰链区”是IgG和IgA免疫球蛋白类的重链中央部分中的柔性氨基酸段，它通过二硫键连接两条重链，即“链间二硫键”，因为这些二硫键在两条重链之间形成。人IgG1的铰链区通常定义为从人IgG1的约Glu216或约Cys226延伸至约Pro230(Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985))。通过使铰链区中的半胱氨酸残基缺失或将铰链区中的半胱氨酸残基取代为其他氨基酸诸如丝氨酸，避免了铰链区中二硫键的形成。
来自任何脊椎动物物种抗体的“轻链”基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以配属为两种不同的类型中的一种，这两种类型分别称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。野生型轻链通常包含两个免疫球蛋白结构域，通常是一个对于结合至抗原而言很重要的可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)。
存在几种不同类型的“重链”，它们定义了抗体的类别或同种型。野生型重链包含一系列免疫球蛋白结构域，通常具有一个对于结合至抗原而言很重要的可变结构域(VH)和几个恒定结构域(CH1、CH2、CH3等)。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
人IgG Fc区的“CH2结构域”通常从约231位的氨基酸残基延伸至约340位的氨基酸残基。多特异性抗体没有CH2结构域。“没有CH2结构域”是指根据本发明的抗体不包含CH2结构域。
“CH3结构域”包含Fc区中C末端至CH2结构域的一段残基(即，从IgG的约341位处的氨基酸残基到约447位处的氨基酸残基)。本文的“CH3结构域”是变体CH3结构域，其中天然CH3结构域的氨基酸序列经过至少一个不同的氨基酸取代(即，对CH3结构域的氨基酸序列的修饰)以促进多特异性抗体中彼此面对的两个CH3结构域的异二聚化。
通常，在本领域已知的异二聚化方法中，一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域均以互补方式工程化，使得包含一条工程化CH3结构域的重链不再与另一条重链相同结构的重链同二聚化。因此，包含一个工程化CH3结构域的重链被迫与包含以互补方式工程化的CH3结构域的另一条重链异二聚化。
本领域中已知的一种异二聚化方法是所谓的“杵入臼”技术，该技术在例如WO 96/027011；Ridgway,J.B.,等人，Protein Eng.9(1996)617-621；Merchant,A.M.,等人，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681和WO 98/050431中提供几个示例进行详细描述，这些文献在此引入作为参考。在“杵入臼”技术中，在抗体三级结构中的两个CH3结构域之间形成的界面内，每个CH3结构域上的特定氨基酸被工程化以分别产生位于一个CH3结构域中的突起(“杵”)和位于另一个CH3结构域中的空腔(“臼”)。在多特异性抗体的三级结构中，被引入一个CH3结构域中的突起可定位在被引入另一个CH3结构域中的空腔内。
结合根据杵入臼技术的取代，可以将额外的链间二硫键引入CH3结构域中以进一步稳定异源二聚化的多肽(Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16(1998)677-681)。例如，通过将以下氨基酸取代引入CH3结构域中来形成这样的链间二硫键：一个CH3结构域中的D399C和另一个CH3结构域中的K392C；一个CH3结构域中的Y349C和另一个CH3结构域中的S354C；一个CH3结构域中的Y349C和另一个CH3结构域中的E356C；一个CH3结构域中的Y349C和另一个CH3结构域中的E357C；一个CH3结构域中的L351C和另一个CH3结构域中的S354C；一个CH3结构域中的T394C和另一个CH3结构域中的V397C。如本文所用，“半胱氨酸突变”是指通过半胱氨酸对CH3结构域中的氨基酸进行的氨基酸取代，所述半胱氨酸能够与通过半胱氨酸对第二CH3结构域中的氨基酸进行的另一氨基酸取代匹配而形成链间二硫键。
术语“药物组合物”是指一种制剂，该制剂的形式允许该制剂中所含的活性成分的生物活性有效，并且该制剂不含对组合物将施用至的受试者具有不可接受的毒性的附加组分。本发明的药物组合物可通过本领域中已知的多种方法来施用。如本领域的技术人员将认识到的，施用途径和/或模式将根据所需结果而变化。为了通过某些施用途径施用根据本发明的抗体，可能需要用材料包被抗体或将抗体与材料共同施用以防止其失活。例如，异二聚体多肽可以在合适的载体例如脂质体或稀释剂中施用于受试者。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。
药物组合物包含有效量的本发明提供的异二聚体多肽。药剂(例如，异二聚体多肽)的“有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所希望的治疗或预防结果的量。特别地，“有效量”表述表示本发明的异二聚体多肽的量，当将其施用于受试者时，(i)治疗或预防特定疾病、病症或疾患，(ii)减弱、改善或消除特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状的发作。治疗有效量将依据所使用的异二聚体多肽分子、被治疗的疾病状态、被治疗疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康情况、施用途径和形式、主治医生或兽医从业人员的判断和其他因素而变。
“药用载体”是指药物制剂中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用载体包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一个优选的实施例中，载体适用于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。
根据本发明的药物组合物还可包含佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过上述灭菌程序并且通过加入各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)以确保无微生物存在。还可能希望在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置是根据Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号的。特别地，对于κ和λ同种型的可变结构域和轻链恒定结构域CL，使用Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版，Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991)的Kabat编号系统(参见第647-660页)，而对于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)，使用Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)。
多肽链内的氨基酸“取代”或“替换”或“突变”(所有术语在本文中可互换地使用)是通过将适当的核苷酸变化引入抗体DNA或通过核苷酸合成来制备的。但是，此类修饰只能在非常有限的范围内进行。例如，修饰不会改变上述抗体特征，诸如IgG同种型和抗原结合，但可以进一步提高重组生产的产率、蛋白质稳定性或促进纯化。在某些实施例中，提供了具有一或多个保守性氨基酸取代的抗体变体。如本文所指的“双突变”是指两个所指出的氨基酸取代存在于各自的多肽链中。
如本文所用的术语“氨基酸”表示具有位于羧基基团的α-位的氨基部分的有机分子。氨基酸的示例包括：精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸。在各种情况下采用的氨基酸任选地为L型氨基酸。术语“带正电”或“带负电”氨基酸是指在pH 7.4时氨基酸侧链的电荷。可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Tyr、Phe；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性或带负电荷：Asp、Glu；
(4)碱性或带正电荷：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro。
表–具有特定性质的氨基酸
当来自第一前体蛋白的两条多肽链解离并且来自第二前体蛋白的两条多肽链解离并且源自第一前体蛋白的多肽链与源自第二前体蛋白的多肽链配对时，两种蛋白质之间发生“多肽链交换”。结果，形成了包含来自第一前体多肽的多肽链和来自第二前体多肽的多肽链的“产物”蛋白。两条多肽链经由它们在产物蛋白中的二聚化结构域缔合。
本发明的前体蛋白包含“选自受体配体和酶的部分”。如本文所用，术语“部分”是指选自受体配体或酶的蛋白质；其片段；或受体配体、酶或其片段的取代变体。示例性受体配体为细胞因子。通常，受体配体和酶为由多个亚基组成的蛋白质复合物。因此，如本文所指的“亚基”为与其他多肽(“亚基”)组装以形成蛋白质复合物的单个多肽分子。
该部分因此具有生物学功能，即受体配体的生物学功能(即在配体与受体之间形成复合物)或酶的生物学功能(即生物催化活性)。如本文所用，术语“功能活性”是指所述部分在生理条件下表现出其生物学功能。如本文所用，术语“功能失活”是指所述部分的活性降低至对应功能活性全长受体配体或酶的活性的小于5％。优选地，“功能失活”部分没有生物学活性。
该部分包含在具有二聚化结构域的前体蛋白的多肽链中，优选经由肽接头。通常，肽连接体由柔性的氨基酸残基如甘氨酸和丝氨酸组成。因此，用于将该部分与多肽融合的典型肽连接体是甘氨酸-丝氨酸接头，即由甘氨酸和丝氨酸残基的模式组成的肽连接体。根据该部分的结构，前体蛋白包含所述部分的一个或两个片段，使得该部分是功能失活的，或者前体蛋白包含所述部分和与所述部分结合的失活部分，使得该部分是功能失活的。
2.本发明的实施方式
在第一方面，本发明涉及一种第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中每种前体蛋白包含经由二聚化结构域彼此缔合的两个多肽，其中前体蛋白中的至少一种包含选自受体配体和酶的部分，其中所述部分是功能失活的，其中所述部分与二聚化结构域融合，其中当第一前体蛋白与第二前体蛋白之间进行多肽链交换时，形成活化的蛋白，其中活化的蛋白包含来自第一前体蛋白的一个多肽和来自第二前体蛋白的一个多肽，其中两个多肽经由其二聚化结构域彼此缔合，并且其中活化的蛋白包含所述部分，特征在于，活化的蛋白包含处于功能活性形式的所述部分。
A)第一替代方案：与失活部分结合
在第一方面的第一实施例中，本发明涉及根据本发明的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中第一前体蛋白或第二前体蛋白包含选自受体配体和酶的部分，其中该部分与失活部分结合。在一个实施例中，该部分为受体配体，并且失活部分为对应的受体、其配体结合亚基或使该部分失活的另一蛋白质。在一个实施例中，受体配体为细胞因子，并且失活部分为对应的细胞因子受体或其细胞因子结合亚基。在一个实施例中，受体配体为IL-2v并且失活部分选自IL-2R的亚基，优选IL-2Rβ、IL-2Rγ-链、IL-2Rβ_γ-链。如本文所指的“对应受体”是指前体蛋白中包含的受体配体结合以便表现出受体配体的生物学功能的受体。例如，如果受体配体为细胞因子，例如，IL-2，对应的受体是所述细胞因子的细胞因子受体，例如，IL-2R。对应的受体的“配体结合亚基”是指所述受体的参与所述受体配体与所述受体结合的亚基。例如，如果受体配体为IL-2，则对应的受体是IL-2R并且配体结合亚基是IL-2Rβ。
B)第二替代方案：若干亚基
在第一方面的第二实施例中，本发明涉及根据本发明的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中第一前体蛋白和第二前体蛋白包含选自受体配体和酶的部分的互补亚基。在一个实施例中，第一前体蛋白包含该部分的第一未修饰的亚基和部分的第二亚基，其中第二亚基包含失活突变；并且其中第二前体蛋白包含该部分的第二未修饰的亚基。术语“未修饰的亚基”是指该部分的不包含任何消除其生物学功能的突变的蛋白质亚基。在一个实施例中，未修饰的亚基具有与部分的天然相应亚基的氨基酸序列相同的氨基酸序列。术语“失活突变”是指在所述部分的天然亚基的氨基酸序列中添加、取代或缺失氨基酸。包含具有失活突变的亚基的全长部分是功能失活的。
在一个实施例中，该部分为受体配体。在一个实施例中，受体配体为细胞因子，其中第一前体蛋白包含细胞因子的第一亚基和细胞因子的第二亚基，其中第二亚基包含失活突变；并且其中第二前体蛋白包含细胞因子的第二未修饰的亚基。在一个实施例中，第一前体蛋白包含含有失活突变的IL-12p35和IL-12p40；并且其中第二前体蛋白包含未修饰的IL-12p40。在一个实施例中，第一前体蛋白包含含有失活突变的IL-12p35和IL-12p40；并且其中第二前体蛋白包含未修饰的IL-12p40和包含失活突变的IL-12p35。
C)第三替代方案：分割的受体配体或酶
在第一方面的第三实施例中，本发明涉及根据本发明的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中第一前体蛋白和第二前体蛋白包含选自受体配体或酶的人工分割的部分的互补部分，其中互补部分中的一个是失活的。术语“人工分割的部分”是指分割成两个或更多个(优选两个)片段的功能活性蛋白质部分，在本文中称为“分割片段”。每个分割片段相对于功能活性部分的功能而言是失活的。当所有分割片段都缔合在一起时，功能活性部分的功能性就会恢复。前体蛋白的排列方式使得其包含人工分割的部分的一个功能的(例如未突变的)部分和一个失活的(例如突变的)部分。另一种前体蛋白的排列使得当两种前体蛋白之间进行多肽链交换时，导致形成功能活性部分的人工分割的部分的两个互补部分包含在活化的蛋白中。
在一个实施例中，该部分为受体配体。在一个实施例中，受体配体为细胞因子。在一个实施例中，人工分割的部分为分割细胞因子。“分割细胞因子”已在本领域中描述，例如，Venetz等人J Biol Chem.2016Aug 26；291(35):18139–18147。
在一个实施例中，受体配体为酶。在一个实施例中，人工分割的部分为分割酶。“分割酶”已在本领域中描述，例如，Littmann等人Scientific Reports第8卷,文章编号:17179(2018)。
D)前体蛋白
本发明的组合中包含的前体蛋白能够经历多肽链交换。此类前体蛋白对的一般结构域排列在之前已有描述，例如WO2019/077092、WO2019086362、PCT/EP2020/061412和PCT/EP2020/061413，其通过引用并入本文。在某些实施方案中，每个前体蛋白具有半抗体形状，即包含一个抗原结合位点(优选Fab片段)，其经由铰链区排列到一个基于二聚化Fc的区域。此类前体蛋白已有描述，例如WO2019/077092、WO2019086362、PCT/EP2020/061412和PCT/EP2020/061413。所述基于二聚化Fc的区域包含CH3结构域对，任选地进一步包含排列在所述CH3结构域的N末端的CH2结构域对(因此，前体蛋白的两个二聚化多肽包含从N末端到C末端的CH2-CH3的结构域排列)或排列在所述CH3结构域的N末端的VH和VL结构域对(因此，前体蛋白的一个多肽包含从N末端到C末端的VL-CH3的结构域排列，并且前体蛋白的另一多肽包含从N末端到C末端的VH-CH3结构域排列)。VH和VL结构域对也可排列在CH2结构域的N末端，它们与CH结构域的N末端融合(因此，前体蛋白的一种多肽包含从N末端到C末端的VL-CH2-CH3的结构域排列，并且前体蛋白的另一多肽包含从N末端到C末端的VH-CH2-CH3的结构域排列。为了支持前体蛋白的组装，包括使包含二聚化结构域的两个多肽二聚化并且还允许与另一个不同的前体蛋白进行多肽链交换，对前体蛋白中包含的二聚化结构域进行修饰。
a.二聚化结构域
在本发明的一个实施例中，二聚化结构域为CH3结构域。“CH3结构域”包含Fc区中C末端至CH2结构域的一段残基(即，从IgG的约341位处的氨基酸残基到约447位处的氨基酸残基)。本文的“CH3结构域”为变体CH3结构域，其中天然CH3结构域的氨基酸序列经受至少一个不同的氨基酸取代(即，对CH3结构域的氨基酸序列的修饰)以促进前体蛋白内彼此面对的两个CH3结构域的异二聚化。
在一个实施例中，每个前体蛋白包含CH3结构域，这些结构域具有杵臼结构修饰、半胱氨酸突变和去稳定化突变，如上文定义。
CH3结构域可以属于任何IgG同种型，但是两种前体蛋白的CH3结构域属于相同的IgG同种型。在一个实施例中，CH3结构域属于IgG1同种型。在一个实施例中，CH3结构域属于IgG3同种型。
杵入臼突变
在一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白各自包含两个包含CH3结构域的多肽，其中一个CH3结构域包含杵突变，而另一CH3结构域包含臼突变。根据该实施例，前体蛋白中包含的CH3结构域包含杵臼结构修饰。“杵臼结构”技术在本领域中是众所周知的并且被详细描述，在例如WO 96/027011；Ridgway,J.B.,等人，Protein Eng.9(1996)617-621；Merchant,A.M.,等人，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681和WO 98/050431中提供若干示例，这些文献通过引用并入本文。在“杵入臼”技术中，在抗体三级结构中的两个CH3结构域之间形成的界面内，每个CH3结构域上的特定氨基酸被工程化以分别产生位于一个CH3结构域中的突起(“杵”)和位于另一个CH3结构域中的空腔(“臼”)。在多特异性抗体的三级结构中，被引入一个CH3结构域中的突起可定位在被引入另一个CH3结构域中的空腔内。
在一个实施例中，包含在第一前体蛋白中的杵突变与包含在第二前体蛋白中的杵突变相同。在一个实施例中，杵突变是T366W。在一个实施例中，臼突变是T366S L368AY407V。
除了之前提到的“杵入臼”技术之外，用于修饰CH3结构域以执行异二聚化的其他技术是本领域已知的。这些技术，尤其是在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的技术，在本文中被认为是用于本发明提供的前体蛋白的“杵臼结构技术”的替代方案。所有这些技术都涉及以互补方式工程化CH3结构域，通过引入带相反电荷或具有不同侧链体积的氨基酸，从而支持异二聚化。
半胱氨酸突变
结合根据杵入臼技术的取代，可以将额外的链间二硫键引入CH3结构域中以进一步稳定异源二聚化的多肽(Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16(1998)677-681)。例如，通过将以下氨基酸取代引入CH3结构域中来形成这样的链间二硫键：一个CH3结构域中的D399C和另一个CH3结构域中的K392C；一个CH3结构域中的Y349C和另一个CH3结构域中的S354C；一个CH3结构域中的Y349C和另一个CH3结构域中的E356C；一个CH3结构域中的Y349C和另一个CH3结构域中的E357C；一个CH3结构域中的L351C和另一个CH3结构域中的S354C；一个CH3结构域中的T394C和另一个CH3结构域中的V397C。在一个实施例中，或者i)第一前体蛋白的包含杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且第二前体蛋白的包含臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，或者ii)其中第一前体蛋白的包含臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且第二前体蛋白的包含杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变。如本文所用，“半胱氨酸突变”是指通过半胱氨酸对CH3结构域中的氨基酸进行的氨基酸取代，所述半胱氨酸能够与通过半胱氨酸对第二CH3结构域中的氨基酸进行的另一氨基酸取代匹配而形成链间二硫键。
在本发明的一个实施例中，前体蛋白的CH3结构域包含第二种突变模式，即CH3/CH3界面中的不同氨基酸被半胱氨酸取代，以便允许在两个在相互作用位置处具有半胱氨酸取代的CH3结构域之间形成链间二硫键。
因此，在本发明的一个实施例中，或者i)第一前体蛋白的包含杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且第二前体蛋白的包含臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，或者ii)第一前体蛋白的包含臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且第二前体蛋白的包含杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变。换言之，在一个实施例中，或者i)在第一异二聚体多肽内，包含杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变并且包含臼突变的CH3结构域不包含半胱氨酸突变，而在第二异二聚体多肽内，包含杵突变的CH3结构域不包含半胱氨酸突变并且包含臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，或者ii)在第一异二聚体多肽内，包含杵突变的CH3结构域不包含半胱氨酸突变并且包含臼突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变，而在第二异二聚体多肽内，包含杵突变的CH3结构域包含半胱氨酸突变并且包含臼突变的CH3结构域不包含半胱氨酸突变。
在一个实施例中，或者i)第一前体蛋白的包含杵突变的CH3结构域包含第一半胱氨酸突变，并且第二前体蛋白的包含臼突变的CH3结构域包含第二半胱氨酸突变，或者ii)第一前体蛋白的包含臼突变的CH3结构域包含第一半胱氨酸突变，并且第二前体蛋白的包含杵突变的CH3结构域包含第二半胱氨酸突变，其中第一和第二半胱氨酸突变选自以下的对：
第一半胱氨酸突变 第二半胱氨酸突变
D399C K392C
Y349C S354C
Y349C E356C
Y349C E357C
L351C S354C
T394C V397C
在一个实施例中，第一半胱氨酸突变是Y349C并且第二半胱氨酸突变是S354C。
在本发明的一个实施例中，或者i)第一前体蛋白的包含杵突变的CH3结构域包含取代S354C，并且第二前体蛋白的包含臼突变的CH3结构域包含取代Y349C，或者ii)第一前体蛋白的包含臼突变的CH3结构域包含取代Y349C，并且第二前体蛋白的包含杵突变的CH3结构域包含取代S354C。
在本发明的一个实施例中，在第一前体蛋白内，包含杵突变的CH3结构域包含取代S354C，并且包含臼突变的CH3结构域包含位于位置349处的Y；并且其中在第二前体蛋白内，包含臼突变的CH3结构域包含取代Y349C，并且包含杵突变的CH3结构域包含位于位置354处的S。
在本发明的一个实施例中，或者i)第一前体蛋白的包含杵突变的CH3结构域包含取代T366W S354C，并且第二前体蛋白的包含臼突变的CH3结构域包含取代T366S L368AY407V Y349C，或者ii)第一前体蛋白的包含臼突变的CH3结构域包含取代T366S L368AY407V Y349C，并且第二前体蛋白的包含杵突变的CH3结构域包含取代T366W S354C。
在本发明的一个实施例中，在第一前体蛋白内，包含杵突变的CH3结构域包含取代T366W S354C，并且包含臼突变的CH3结构域包含位于位置349处的Y和取代T366S L368AY407V；并且其中在第二前体蛋白内，包含臼突变的CH3结构域包含取代T366S L368A Y407VY349C，并且包含杵突变的CH3结构域包含位于位置354处的S和取代T366W。
在本发明的一个实施例中，前体蛋白的CH3结构域不包含链间二硫键。
去稳定化突变
在一个实施例中，CH3结构域具有经修饰的界面以支持第一前体蛋白与第二前体蛋白之间的多肽链交换。本发明的前体蛋白仅在其CH3结构域的一个中包含“使CH3/CH3界面去稳定化”的氨基酸取代，本文中也称为“去稳定化突变”。就这些末端而言，氨基酸取代是指排列在异二聚体前体蛋白中缔合的CH3结构域的仅一个中。在所述CH3结构域中，一个或多个已知在CH3/CH3界面内相互作用的氨基酸位置，例如，如与上述CH3-异二聚化策略相关的现有技术中公开的，被具有另一种位点链特性的氨基酸替换。与异二聚化策略相反，其中缔合的CH3结构域中的一对相互作用氨基酸(即异二聚体中涉及的一个CH3结构域中的一个或多个氨基酸残基；以及异二聚体中涉及的另一CH3结构域中的一个或多个氨基酸残基)通常被取代，去稳定化突变排列在根据本发明的前体蛋白中所涉及的CH3结构域的仅一个中。使CH3/CH3界面不稳定的示例性氨基酸取代如下列出。本文具体公开的所有示例性氨基酸取代被布置成使得取代的氨基酸在一对所述CH3结构域内的CH3/CH3界面中相互作用。
在一个实施例中，或者i)包含杵突变的第一前体蛋白的CH3结构域和包含臼突变的第二前体蛋白的CH3结构域，或者ii)包含臼突变的第一前体蛋白的CH3结构域和包含杵突变的第二前体蛋白的CH3结构域，包含至少一个互补去稳定化突变，而第一和第二前体多肽的另外两个CH3结构域不包含去稳定化突变。
根据本发明，或者i)包含杵突变的第一前体蛋白的CH3结构域和包含臼突变的第二前体蛋白的CH3结构域，或者ii)包含臼突变的第一前体蛋白的CH3结构域和包含杵突变的第二前体蛋白的CH3结构域，包含一个或多个去稳定化突变。选择第一和第二前体蛋白内的一个或多个去稳定化突变，使得它们在由前体多肽之间的多肽链交换形成的产物多肽的CH3/CH3界面中相互作用。
在包含前体蛋白的杵突变的CH3结构域包含去稳定化突变的情况下，包含所述前体蛋白的臼突变的CH3结构域不包含去稳定化突变。当CH3结构域“不包含去稳定突变”时，它包含在相同类别的野生型免疫球蛋白CH3结构域中与包含在相应CH3结构域中的去稳定突变位置上的氨基酸残基相互作用的位置处的野生型氨基酸残基。
第1组突变(FORCE/PACE1.0突变)
第一组去稳定化突变已经在WO2019/077092和WO2019086362中公开。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，即，去稳定化突变，该至少一个氨基酸取代选自下组：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T；并且具有杵突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，即，去稳定化突变，该至少一个氨基酸取代选自下组：E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T。
在一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含在位置357或356处的至少一个氨基酸取代，即，去稳定化突变；并且具有杵突变的CH3结构域包含在位置370或439处的至少一个氨基酸取代，即，去稳定化突变。在一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含在位置356处的至少一个氨基酸取代，即，去稳定化突变；并且具有杵突变的CH3结构域包含在位置439处的至少一个氨基酸取代，即，去稳定化突变。在一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含在位置357处的至少一个氨基酸取代，即，去稳定化突变；并且具有杵突变的CH3结构域包含在位置370处的至少一个氨基酸取代，即，去稳定化突变。
在一个实施例中，一个(例如第一)前体蛋白的具有臼突变的CH3结构域包含D356K突变，而另一个(例如第二)前体蛋白的具有杵突变的CH3结构域包含K439E突变。在一个实施例中，一个(例如第一)前体蛋白的具有臼突变的CH3结构域包含E357K突变，而另一个(例如第二)前体蛋白的具有杵突变的CH3结构域包含K370E突变。
第2组突变(FORCE2.0突变)
第二组去稳定化突变已经在PCT/EP2020/061412中公开。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，即，去稳定化突变，该至少一个氨基酸取代选自下组：用疏水性氨基酸替换S354；用带正电荷的氨基酸替换D356；用带正电荷的氨基酸或用疏水性氨基酸替换E357；用带正电荷的氨基酸替换D356并且用带正电荷的氨基酸用疏水性氨基酸替换E357；用疏水性氨基酸替换S364；用疏水性氨基酸替换A368；用带负电荷的氨基酸替换K392；用疏水性氨基酸替换T394；用疏水性氨基酸替换D399并且用带正电荷的氨基酸替换S400；用疏水性氨基酸替换D399并且用带正电荷的氨基酸替换F405；用疏水性氨基酸替换V407；和用带负电荷的氨基酸替换K409；和用带负电荷的氨基酸替换K439；而具有杵突变的CH3结构域包含至少一个氨基酸取代，即，去稳定化突变，该至少一个氨基酸取代选自下组：用带正电荷的氨基酸替换Q347并且用带负电荷的氨基酸替换K360；用带负电荷的氨基酸替换Y349；用疏水性氨基酸替换L351并且用疏水性氨基酸替换E357；用疏水性氨基酸替换S364；用疏水性氨基酸替换W366并且用带负电荷的氨基酸替换K409；用疏水性氨基酸替换L368；用带负电荷的氨基酸替换K370；用带负电荷的氨基酸替换K370并且用带负电荷的氨基酸替换K439；用带负电荷的氨基酸替换E392；用疏水性氨基酸替换T394；用疏水性氨基酸替换V397；用带正电荷的氨基酸替换D399并且用带负电荷的氨基酸替换K409；用带正电荷的氨基酸替换S400；F405W；Y407W；和用带负电荷的氨基酸替换K439。
在一个实施例中，疏水性氨基酸选自正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Tyr和Phe。在一个实施例中，疏水性氨基酸选自Ala、Val、Leu、Ile和Tyr。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Val、Leu或Ile。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Leu或Ile。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Leu。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Tyr。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Phe。
在一个实施例中，带正电荷的氨基酸是His、Lys或Arg。在一个实施例中，带正电荷的氨基酸是Lys或Arg。在一个实施例中，带正电荷的氨基酸是Lys。
在一个实施例中，带负电荷的氨基酸是Asp或Glu。在一个实施例中，带负电荷的氨基酸是Asp。在一个实施例中，带负电荷的氨基酸是Glu。
发现，在CH3结构域中指定的氨基酸位置用具有各自侧链特性的氨基酸进行的氨基酸取代支持来自两个前体多肽的多肽链交换和形成产物多肽。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：S354V、S354I、S354L、D356K、D356R、E357K、E357R、E357F、S364L、S364I、A368F、K392D、K392E、T394L、T394I、V407Y、K409E、K409D、K439D、K439E和双突变D399A S400K、D399A S400R、D399A F405W；而具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：Y349E、Y349D、S364V、S364I、S364L、L368F、K370E、K370D、K392E、K392D、T394L、T394I、V397Y、S400K、S400R、F405W、Y407W、K349E、K439D和双突变Q347K K360E、Q347R K360E、Q347K K360D、Q347R K360D、L351F E357F、W366I K409E、W366L K409E、W366K K409D、W366LK409D、D399K K409E、D399R K409E、D399K K409D和D399K K409E。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：S354V、D356K、E357K、E357F、S364L、A368F、K392E、T394I、V407Y、K409E、K439E和双突变D399A S400K；而具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：Y349E、S364V、L368F、K370E、K392D、T394I、V397Y、S400K、F405W、Y407W、K349E和双突变Q347K K360E、L351F E357F、W366I K409E和D399K K409E。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：D356K、D356R、E357K、E357R、E357F、S364L、S364I、V407Y、K409E、K409D和双突变D399A S400K、D399A S400R；而具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：Y349E、Y349D、K370E、K370D、K392E、K392D、T394L、T394I、V397Y、F405W、Y407W、K349E、K439D和双突变Q347K K360E、Q347R K360E、Q347K K360D、Q347R K360D、W366IK409E、W366L K409E、W366K K409D、W366L K409D、D399K K409E、D399R K409E、D399K K409D和D399K K409E。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：D356K、E357K、E357F、S364L、V407Y、K409E和双突变D399A S400K；而具有杵突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：Y349E、K370E、K392D、T394I、V397Y、F405W、Y407W、K349E和双突变Q347K K360E、W366I K409E和D399K K409E。
在本发明的一个实施例中，包含去稳定化突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一：
为清楚起见，该表应理解为包含臼突变的CH3结构域包含如上表第一列所示的去稳定化突变，包含杵突变的CH3结构域包含上列右列中列出的去稳定化突变表，在同一行中指出。
在本发明的一个实施例中，包含去稳定化突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一：
包含臼突变的CH3结构域 包含杵突变的CH3结构域
V407Y K370E
V407Y K370E K439E
V407Y V397Y
S364L K439E
S364L W366I K409E
S364L K370E K439E
S364L D399K K409E
S364L T394I
S364L W366I K409E
S364L K370E K439E
S364L D399K K409E
S364L T394I
在本发明的一个实施例中，包含去稳定化突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一：
第3组突变(PACE2.0突变)
第三组去稳定化突变已经在PCT/EP2020/061413中公开。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代，即去稳定化突变：用带正电荷的氨基酸替换E357；用疏水性氨基酸替换S364；用疏水性氨基酸替换A368；和用疏水性氨基酸替换V407；而具有杵突变的CH3结构域或者不包含去稳定化突变，或者包含选自以下组的氨基酸取代，即去稳定化突变：用带负电荷的氨基酸替换K370；用带负电荷的氨基酸替换K370并且用带负电荷的氨基酸替换K439；用带负电荷的氨基酸替换K392；和用疏水性氨基酸替换V397。
在一个实施例中，疏水性氨基酸选自正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile、Trp、Tyr和Phe。在一个实施例中，疏水性氨基酸选自Ala、Val、Leu、Ile和Tyr。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Val、Leu或Ile。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Leu或Ile。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Leu。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Tyr。在一个实施例中，疏水性氨基酸是Phe。
在一个实施例中，带正电荷的氨基酸是His、Lys或Arg。在一个实施例中，带正电荷的氨基酸是Lys或Arg。在一个实施例中，带正电荷的氨基酸是Lys。
在一个实施例中，带负电荷的氨基酸是Asp或Glu。在一个实施例中，带负电荷的氨基酸是Asp。在一个实施例中，带负电荷的氨基酸是Glu。
发现，在CH3结构域中指定的氨基酸位置用具有各自侧链特性的氨基酸进行的氨基酸取代支持来自两个前体多肽的多肽链交换和形成产物多肽。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：E357K、E357R、S364L、S364I、V407Y、V407F和A368F；而具有杵突变的CH3结构域或者不包含去稳定化突变，或者包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：K370E、K370D、K392E、K392D、V397Y和双突变K370E K439E、K370D K439E、K370E K439D和K370D K439D。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：E357K、S364L、V407Y和A368F；而具有杵突变的CH3构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：K370E、K392D、V397Y和双突变K370E K439E。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：E357K、E357R、S364L、S364I、V407Y和V407F；而具有杵突变的CH3构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：K370E、K370D、K392E、K392D、V397Y和双突变K370E K439E、K370D K439E、K370E K439D和K370D K439D。
在本发明的一个实施例中，具有臼突变的CH3结构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：E357K、S364L和V407Y；而具有杵突变的CH3构域包含选自以下组的至少一个氨基酸取代：K370E、K392D、V397Y和双突变K370E K439E。
在本发明的一个实施例中，包含去稳定化突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一：
为清楚起见，该表应理解为包含臼突变的CH3结构域包含如上表第一列所示的去稳定化突变，包含杵突变的CH3结构域包含上列右列中列出的去稳定化突变表，在同一行中指出。
在本发明的一个实施例中，包含去稳定化突变的具有臼突变的CH3结构域和具有杵突变的CH3结构域包含选自下表所示组的氨基酸取代之一：
包含臼突变的CH3结构域 包含杵突变的CH3结构域
E357K V397Y
E357K K370E
E357K K392D
E357K K370E K439E
V407Y V397Y
V407Y K370E
S364L V397Y
S364L K370E
b.抗原结合位点
如上所述，本发明的第一前体蛋和第二前体蛋白能够经历多肽链交换。在某些实施例中，多肽链交换通过在溶液中提供两种前体蛋白而自发发生。在某些实施例中，当使两种前体蛋白非常接近时，支持本发明的第一前体蛋白和第二前体蛋白进行多肽链交换，例如，通过结合到同一细胞的表面。因此，在一个实施例中，前体蛋白当结合到细胞表面时能够经历多肽链交换。在一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白与靶细胞特异性结合。在一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白与靶细胞表面上的抗原特异性结合。在一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白与靶细胞表面上的不同抗原特异性结合。如本文所用，“靶细胞”是期望接受采用本发明蛋白质的疗法的细胞。在一个实施例中，靶细胞是癌细胞。
在一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含抗原结合区。抗体结合区可以排列在二聚化结构域的N末端或C末端。
在本发明的一个实施例中，抗原结合区包含VH结构域和VL结构域对，它们形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。
在一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含抗体片段。在一个实施例中，每个前体蛋白包含抗体片段，其可以是单链抗体片段或包含两个多肽的抗体片段。
在本发明的一个实施例中，包含在根据本发明的(前体)多肽中的抗体片段是选自下组的抗体片段：Fv、Fab、Fab、Fab-SH、F(ab)2、双体抗体、scFv和scFab。在一个实施例中，包含在根据本发明的(前体)多肽中的抗体片段是Fv或Fab。在本发明的一个实施例中，抗原结合区为Fab片段。在本发明的一个实施例中，第一抗原结合区为第一Fab片段并且第二抗原结合区为第二Fab片段。
在一个实施例中，在抗体片段是Fab片段的情况下，前体蛋白包含三个多肽：包含VL-CL结构域的抗体轻链、包含对应VH-CH1结构域以允许形成功能性Fab片段和CH3结构域的抗体重链样多肽、另一种包含对应CH3结构域的抗体重链样多肽。如上所述，可存在其他抗体结构域，如CH2结构域或VH/VL对。
在本发明的一个实施例中，第一Fab片段、第二Fab片段或两者、第一和第二Fab片段通过结构域交叉而改变，使得或者：
a)仅CH1和CL结构域彼此替换；
b)仅VH和VL结构域彼此替换；或者
c)CH1和CL结构域彼此替换，并且VH和VL结构域彼此替换。
在本发明的一个实施例中，抗原结合区为Fv片段。在本发明的一个实施例中，第一抗原结合区为第一Fv片段并且第二抗原结合区为第二Fv片段。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白的抗原结合区和第二前体蛋白的抗原结合区结合至相同抗原。在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白的抗原结合区和第二前体蛋白的抗原结合区为相同的抗原结合部分。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白的抗原结合区和第二前体蛋白的抗原结合区结合至不同抗原。在这种情况下，当两个前体蛋白之间的多肽链交换时，形成多特异性产物多肽，其包含源自第一前体蛋白的抗原结合区和源自第二前体蛋白的抗原结合区。
另外的抗原结合部分可存在于前体蛋白中，其可以融合到包含在前体蛋白中的多肽链的N末端或C末端以提供更高价的产物多肽。
这种另外的抗原结合部分通过合适的肽连接体融合至多肽链。在一个实施例中，肽连接体是甘氨酸-丝氨酸连接基。
在本发明的一个实施例中，在前体蛋白中，包含CH3结构域的多肽链中只有一条包含抗原结合区的至少一部分。在本发明的一个实施例中，在前体蛋白中，多肽链之一包含与靶抗原特异性结合的抗原结合位点的CH3结构域。在本发明的一个实施例中，在前体蛋白中，包含CH3结构域的多肽链之一在N末端至C末端方向上包含：铰链区、抗体可变结构域和CH3结构域，并且该多肽链不是与靶抗原特异性结合的抗原结合位点的一部分。在本发明的一个实施例中，在前体蛋白中，包含CH3结构域的多肽链之一在N末端至C末端方向上包含：铰链区、抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，并且该多肽链不是与靶抗原特异性结合的抗原结合位点的一部分。
c.前体蛋白的结构域排列
根据本发明的前体多肽适用于生成各种形式和具有各种结构域排列的产物蛋白。依据异二聚体前体蛋白中提供的结构域的选择和抗原结合区的数量，可生成具有不同抗原结合特征(例如特异性、效价)和不同效应子功能的产物多肽。
在一个实施例中，第一前体多肽和第二前体蛋白恰好包含两条包含CH3结构域的多肽链。因此，在第一前体蛋白和第二前体蛋白中可包含没有CH3结构域的另外的多肽链。
抗体片段
在本发明的一个实施例中，抗原结合部分包含VH结构域和VL结构域对，它们形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点；并且
a)第一前体蛋白包含：
-第一重链多肽，其包含CH3结构域和第一抗体可变结构域，
-第二重链多肽，其包含CH3结构域，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其包含第二抗体可变结构域，其中所述第一抗体可变结构域和所述第二抗体可变结构域一起形成与靶抗原特异性结合的第一抗原结合位点；并且其中
b)第二前体蛋白包含：
-第三重链多肽，其包含CH3结构域和第三抗体可变结构域，
-第四重链多肽，其包含CH3结构域，其中所述第三重链多肽和所述第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
-轻链多肽，其包含第四抗体可变结构域，其中所述第三抗体可变结构域和所述第四抗体可变结构域一起形成与靶抗原特异性结合的第二抗原结合位点；并且其中
c)或者i)所述第一重链多肽包含含有杵突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含含有臼突变的CH3结构域；或者ii)所述第一重链多肽包含含有臼突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含含有杵突变的CH3结构域。
包含CH2结构域的前体蛋白
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含至少两条包含CH2结构域和CH3结构域的多肽链。包含CH2结构域和CH3结构域的前体蛋白表现出有利的特性，如循环中的长半衰期和Fc介导的效应子功能的介导。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含至少两条从N末端到C末端方向包含CH2结构域和CH3结构域的多肽链。
在本发明的一个实施例中，或者i)第一前体蛋白包含一条包含VL结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中第二前体蛋白包含一条包含VH结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与VH结构域和VL结构域对缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合；或者ii)第一前体蛋白包含一条包含VH结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中第二前体蛋白包含一条包含VL结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与VH结构域和VL结构域对缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白没有CH2结构域。没有CH2结构域的前体蛋白可表现出有利的特性，如从循环中快速清除。
可活化的抗原结合位点
在某些实施例中，每个前体蛋白包含抗原结合区的一部分，其中所述抗原结合区在前体多肽中是无功能的，并且其中在由前体多肽之间的多肽链交换形成的产物多肽中，抗原结合区是有功能的并且与靶抗原特异性结合。在某些实施例中，本发明的前体蛋白包含一对额外的VH和VL结构域，其仅在前体蛋白之间进行多肽链交换后，即在活化的蛋白中才是功能活性的。之前已在WO2019086362、PCT/EP2020/061412和PCT/EP2020/061413中描述了通过多肽链交换激活抗原结合位点。简而言之，一种前体蛋白包含源自感兴趣抗体的VH结构域，该结构域与CH2结构域或来自不同抗体的VL结构域配对。在这两种情况下，都没有形成功能性结合位点。然而，另一前体蛋白包含源自感兴趣抗体的对应VL结构域，该结构域与CH2结构域或来自不同抗体的VH结构域配对。在多肽链交换后，感兴趣抗体的可变结构域VH和VL两者在活化的抗体内组合。在一个实施例中，感兴趣的抗体特异性结合至T细胞抗原，T细胞抗原在一个实施方案中为CD3。为此，两个可变结构域都必须排列在具有CH3结构域的多肽上，其中VH结构域排列在具有杵突变的CH3结构域上，而VL结构域排列在具有孔突变的CH3结构域上；或反之亦然(即CH3-孔多肽上的VH结构域和CH3-杵多肽上的VL)。因此，在一个实施例中，a)活化的蛋白包含与抗原特异性结合的VH结构域和VL结构域对，其中VH结构域包含在来自第一前体蛋白的多肽中并且VL结构域包含在来自第二前体蛋白的多肽中；或者b)活化的蛋白包含与抗原特异性结合的VH结构域和VL结构域对，其中VL结构域包含在来自第一前体蛋白的多肽中并且VH结构域包含在来自第二前体蛋白的多肽中。在一个实施例中，抗原为T细胞抗原，优选CD3。
在本发明的一个实施例中，所述抗原结合区为包含一对抗体可变结构域的抗原结合位点。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白包含一条包含VL结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中第二前体蛋白包含一条包含VH结构域和CH3结构域的多肽链，其中所述VL结构域和所述VH结构域在与VH结构域和VL结构域对缔合时与抗原特异性结合。在一个实施例中，被一对VH结构域和VL结构域特异性地结合的抗原是CD3。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白包含一条在N末端至C末端方向上包含VL结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中第二前体蛋白包含一条在N末端至C末端方向上包含VH结构域和CH3结构域的多肽链，其中所述VL结构域和所述VH结构域在与VH结构域和VL结构域对缔合时与抗原特异性结合。
在本发明的一个实施例中，
a)第一前体蛋白包含：
a)第一重链多肽，该第一重链多肽在N端至C端方向上包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域和CH3结构域，
b)第二重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第一重链多肽的所述第二抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域，和CH3结构域，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
c)轻链多肽，该轻链多肽在N端至C端方向上包含：第一VL结构域和CL结构域，其中第一VH结构域和第一VL结构域彼此缔合并形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点；并且其中
b)第二前体蛋白包含：
d)第三重链多肽，该第三重链多肽在N端至C端方向上包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域和CH3结构域，
e)第四重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第三重链多肽的所述第三抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域，和CH3结构域，其中所述第三重链多肽和所述第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
f)轻链多肽，该轻链多肽在N端至C端方向上包含：第二VL结构域和CL结构域，其中第二VH结构域和第二VL结构域彼此缔合并形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点；并且其中
c)或者i)所述第一重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域；或者ii)所述第一重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域；并且其中
d)第一重链多肽和第三重链多肽的可变结构域能够形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点。
在一个实施例中，第一重链多肽从N末端到C末端方向包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域、肽连接体和CH3结构域，并且第二重链多肽从N末端到C末端方向包含能够与第一重链多肽的第二抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、肽连接体和CH3结构域，其中第一重链多肽和第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；第三重链多肽从N末端到C末端方向包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域、肽连接体和CH3结构域，并且第四重链多肽从N末端到C末端方向包含能够与第三重链多肽的第三抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、肽连接体和CH3结构域，其中第三重链多肽和第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变。在一个实施例中，包含在第一重链多肽、第二重链多肽、第三重链多肽和第四重链多肽中的肽连接体是相同的。
在一个实施例中，在第一前体蛋白内，包含第一重链多肽的第二抗体可变结构域源自与第一靶抗原特异性结合的抗体，并且包含在第二重链多肽中的抗体可变结构域与第二个靶抗原特异性结合。两个可变结构域都能够相互缔合。因此，一个重链多肽包含VH结构域而另一个重链多肽包含VL结构域。VH结构域和VL结构域能够相互缔合。然而，形成了无功能的抗原结合位点。因此，本发明上下文中的术语“能够相互缔合的可变结构域”是指提供一对VH和VL结构域。在该实施例中，在第二前体蛋白内，包含第三重链多肽的第三抗体可变结构域源自与第一靶抗原特异性结合的抗体(即能够与包含在第一前体蛋白的第一重链多肽中的第二可变结构域形成功能性VH/VL对)，并且包含在第四重链多肽中的抗体可变结构域与另一个(例如第二)靶抗原特异性结合。包含在第一重链多肽和第三重链多肽中的可变结构域能够相互缔合，即一个可变结构域为VH结构域，并且另一个为VL结构域；并且包含在第一重链多肽和第三重链多肽中的可变结构域能够形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点，即两个可变结构域均源自与靶抗原(例如CD3)特异性结合的相同抗体。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含至少两条从N末端到C末端方向包含CH2结构域和CH3结构域的多肽链，其中第一前体蛋白包含一条从N末端到C末端方向包含VL结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中第二前体蛋白包含一条从N末端到C末端方向包含VH结构域、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，其中VL结构域和VH结构域能够形成与靶抗原特异性结合的抗原结合位点。
在本发明的一个实施例中，
a)第一前体蛋白包含：
a)第一重链多肽，其从N末端到C末端方向包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，
b)第二重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第一重链多肽的所述第二抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
c)轻链多肽，该轻链多肽在N端至C端方向上包含：第一VL结构域和CL结构域，其中第一VH结构域和第一VL结构域彼此缔合并形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点；并且其中
b)第二前体蛋白包含：
d)第三重链多肽，其从N末端到C末端方向包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，
e)第四重链多肽，其从N末端到C末端方向包含能够与所述第三重链多肽的所述第三抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、CH2结构域和CH3结构域，其中所述第三重链多肽和所述第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中所述CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；和
f)轻链多肽，该轻链多肽在N端至C端方向上包含：第二VL结构域和CL结构域，其中第二VH结构域和第二VL结构域彼此缔合并形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点；并且其中
c)或者i)所述第一重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域；或者ii)所述第一重链多肽包含具有臼突变的CH3结构域，并且所述第三重链多肽包含具有杵突变的CH3结构域；并且其中
d)第一重链多肽和第三重链多肽的可变结构域能够形成特异性地结合至靶抗原的抗原结合位点。
在一个实施例中，第一重链多肽从N末端到C末端方向包含第一VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第二抗体可变结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域，并且第二重链多肽从N末端到C末端方向包含能够与第一重链多肽的第二抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域，其中第一重链多肽和第二重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变；第三重链多肽从N末端到C末端方向包含第二VH结构域、CH1结构域、选自VH结构域和VL结构域的第三抗体可变结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域，并且第四重链多肽从N末端到C末端方向包含能够与第三重链多肽的第三抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域，其中第三重链多肽和第四重链多肽通过所述CH3结构域相互缔合并形成异二聚体，其中CH3结构域中的一个包含杵突变，并且另一个CH3结构域包含臼突变。在一个实施例中，包含在第一重链多肽、第二重链多肽、第三重链多肽和第四重链多肽中的肽连接体是相同的。
链间二硫键
由于本发明的前体蛋白具有基于抗体的结构，前体蛋白的各个多肽之间可能存在链间二硫化物。然而，经由链间二硫键连接的多肽之间的多肽链交换仅在二硫键还原后发生，这对于治疗用途而言是不希望的。因此，对于疗法，前体蛋白在包含二聚化结构域的多肽之间没有链间二硫键。为了实现这一点，通过本领域已知的合适的氨基酸突变(添加、缺失、取代)去除天然存在的二硫键。
铰链区
在一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含铰链区。在一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白在铰链区内不包含链间二硫键。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含至少两条从N末端到C末端方向包含铰链区和CH3结构域的多肽链。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含至少两条从N末端到C末端方向包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白在铰链区内不包含链间二硫键。具有没有链间二硫键的铰链区的前体蛋白能够在没有还原剂的情况下进行多肽链交换。因此，具有没有链间二硫键的铰链区的前体蛋白特别适用于不可能或不希望存在还原剂的应用。因此，那些前体蛋白可有利地用于疗法中。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含不形成链间二硫化物的天然铰链区。一个示例是衍生自IgG4同种型抗体的铰链区肽。
代替没有链间二硫键的铰链区，前体蛋白可包含肽连接体，其将抗原结合区(的一部分)与恒定抗体结构域(即CH2或CH3)连接起来。在本发明的一个实施例中，在第一和第二肽连接体之间没有形成链间二硫键。在本发明的一个实施例中，第一和第二肽连接体彼此相同。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含至少两条从N末端到C末端方向包含肽连接体和CH3结构域的多肽链。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含至少两条从N末端到C末端方向包含肽连接体、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白包含含有第一肽连接体、抗体可变结构域、任选地CH2结构域和CH3结构域的第一多肽链，以及含有第一肽连接体、能够与来自第一多肽链的抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域、任选地CH2结构域和CH3结构域的第二多肽链；并且第二前体蛋白包含含有第一肽连接体、抗体可变结构域、任选的CH2结构域和CH3结构域的第一多肽链，以及含有第一肽连接体、能够与来自第一多肽链的抗体可变结构域缔合的抗体可变结构域，任选地CH2结构域和CH3结构域的第二多肽链。
在本发明的一个实施例中，肽连接体是至少15个氨基酸的肽。在本发明的另一个实施例中，肽连接体是15-70个氨基酸的肽。在本发明的另一个实施例中，肽连接体是20-50个氨基酸的肽。在本发明的另一个实施例中，肽连接体是10-50个氨基酸的肽。根据例如要被可活化的结合位点结合的抗原类型，更短(或甚至更长)的肽连接体也可能适用于根据本发明的前体蛋白。
在本发明的又一实施例中，第一和第二肽连接体的长度大约为天然铰链区的长度(对于IgG1同种型的天然抗体分子，其长度约为15个氨基酸，而对于IgG3同种型，其长度约为62个氨基酸)。因此，在一个实施例中，其中第一前体蛋白和第二前体蛋白属于IgG1同种型，肽连接体是10-20个氨基酸的肽，在一个优选的实施例中是12-17个氨基酸的肽。在另一个实施例中，其中第一前体蛋白和第二前体蛋白属于IgG3同种型，肽连接体是55-70个氨基酸的肽，在一个优选的实施例中是60-65个氨基酸的肽。
在本发明的一个实施例中，肽连接体是甘氨酸-丝氨酸连接基。在本发明的一个实施例中，肽连接体是由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。在本发明的一个实施例中，甘氨酸-丝氨酸连接基具有以下结构
(GxS)n或(GxS)nGm
其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，x＝3或4，n＝2、3、4、5或6，并且
m＝0、1、2或3。
在一个实施例中，上述定义的甘氨酸-丝氨酸连接基中，x＝3，n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3；或者x＝4，n＝2、3、4或5，并且m＝0、1、2或3。在一个优选实施例中，x＝4且n＝2或3，并且m＝0。在又一优选实施例中，x＝4且n＝2。在一个实施例中，所述肽连接体是(G4S)4或(G4S)6。
在本发明的一个实施例中，或者i)第一前体蛋白包含一条包含VL结构域、肽连接体和CH3结构域的多肽链，并且其中第二前体蛋白包含一条包含VH结构域、肽连接体和CH3结构域的多肽链，其中当与VH结构域和VL结构域对缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合；或者ii)第一前体蛋白包含一条包含VH结构域、肽连接体和CH3结构域的多肽链，并且其中第二前体蛋白包含一条包含VL结构域、肽连接体和CH3结构域的多肽链，其中当与VH结构域和VL结构域对缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合。
在本发明的一个实施例中，或者i)第一前体蛋白包含一条包含VL结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中第二前体蛋白包含一条包含VH结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与VH结构域和VL结构域对缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合；或者ii)第一前体蛋白包含一条包含VH结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，并且其中第二前体蛋白包含一条包含VL结构域、肽连接体、CH2结构域和CH3结构域的多肽链，其中当与VH结构域和VL结构域对缔合时，所述VL结构域和所述VH结构域与抗原特异性结合。
抗体同种型
在本发明的一个实施例中，前体多肽包含一个或多个免疫球蛋白类别的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白类别包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种型，在IgG和IgA的情况下，还包括它们的亚型。在本发明的一个实施例中，前体多肽具有IgG型抗体的恒定结构域结构。
在本发明的一个实施例中，包含在前体多肽中的CH3结构域属于哺乳动物IgG类。在本发明的一个实施例中，包含在前体多肽中的CH3结构域属于哺乳动物IgG1亚类。在本发明的一个实施例中，包含在前体多肽中的CH3结构域属于哺乳动物IgG4亚类。
在本发明的一个实施例中，包含在前体多肽中的CH3结构域属于人IgG类。在本发明的一个实施例中，包含在前体多肽中的CH3结构域属于人IgG1亚类。在本发明的一个实施例中，包含在前体多肽中的CH3结构域属于人IgG4亚类。
在一个实施例中，根据本发明的前体多肽的恒定结构域属于人IgG类。在一个实施例中，根据本发明的前体多肽的恒定结构域属于人IgG1亚类。在一个实施例中，根据本发明的前体多肽的恒定结构域属于人IgG4亚类。
在一个实施例中，前体多肽没有CH4结构域。
在本发明的一个实施例中，根据本发明的前体多肽的恒定结构域属于相同的免疫球蛋白亚类。在本发明的一个实施例中，根据本发明的前体多肽的可变结构域和恒定结构域属于相同的免疫球蛋白亚类。
在本发明的一个实施例中，前体多肽是分离的前体多肽。在本发明的一个实施例中，产物多肽是分离的产物多肽。
在一个实施例中，包含包括CH3结构域的多肽链的前体蛋白或异二聚体产物多肽包括全长CH3结构域或CH3结构域，其中一个或两个C末端氨基酸残基(即G446和/或K447)不存在。
在一个实施例中，第一前体蛋白是单特异性的并且包含第二抗原结合位点的一部分；第二前体蛋白是单特异性的并且包含第二抗原结合位点的另一部分。在所述实施例中，异二聚体产物多肽是双特异性的或三特异性的。
在一个实施例中，第一前体蛋白是单特异性的并且包含第二抗原结合位点的一部分；第二前体蛋白是单特异性的并且包含第二抗原结合位点的另一部分。在所述实施例中，异二聚体产物多肽是三特异性的。
在一个实施例中，第一前体蛋白是双特异性的。在一个实施例中，第二前体蛋白是单特异性的。
在一个实施例中，第一前体蛋白是双特异性的。在一个实施例中，第二前体蛋白是双特异性的。
在一个实施例中，第一前体蛋白是单价的。在一个实施例中，第二前体蛋白是单价的。
在一个实施例中，第一前体蛋白是二价的。在一个实施例中，第二前体蛋白是二价的。
在一个实施例中，第一前体蛋白是三价的。在一个实施例中，第二前体蛋白是三价的。
在一个实施例中，异二聚体产物多肽是三价的。在一个实施例中，异二聚体产物多肽是四价的。
E)在疗法中的应用
在第二个方面，本发明涉及一种治疗性试剂盒，其包括如上文针对本发明的第一个方面所定义的第一前体蛋白和第二前体蛋白。在一个实施例中，治疗性试剂盒包括包含第一前体蛋白的第一药物组合物和包含第二前体蛋白的第二药物组合物。在一个实施例中，本发明的治疗性试剂盒用作药物。在一个实施例中，本发明的治疗性试剂盒包括具有特异性结合至CD3的可活化抗原结合位点的第一前体蛋白和第二前体蛋白，其中第一前体蛋白和第二前体蛋白包含与癌细胞上的抗原特异性结合的抗原结合区并且用作治疗癌症的药物。在一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含与癌细胞上的不同抗原结合的抗原结合区。
在第三个方面，本发明涉及如上文针对本发明的第一方面所定义的一种第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合用于生成部分的活化形式的用途。
在第四个方面，本发明涉及如上文针对本发明的第一方面所定义的一种第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合用于疗法的用途。在一个实施例中，疗法是癌症的治疗。
在第五个方面，本发明涉及一种用于提供根据本发明的第二个方面的治疗性试剂盒的方法，其包括以下步骤：提供重组表达的第一前体蛋白和重组表达的第二前体蛋白，以及任选地与药用载体一起配制第一前体蛋白和第二前体蛋白，以提供治疗性试剂盒。
根据本发明的蛋白质通过重组方式产生。蛋白质(例如抗体)的重组生产方法是现有技术中所熟知的，并且包括在原核和真核宿主细胞中表达蛋白质，随后分离出多肽，并且通常将其纯化至药用纯度。为了在宿主细胞中表达上述多肽，通过标准方法将编码相应多肽链的核酸插入表达载体中。在适当的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，并从细胞(裂解后的上清液或细胞)中回收多肽。用于重组生产多肽(例如抗体)的一般方法是现有技术中所熟知的，并且综述于以下论文中：Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.,et al.,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880。
F)生成活化的蛋白的方法
在第六个方面，本发明涉及一种用于生成活化的蛋白的方法，其包括以下步骤：a)提供重组表达的第一前体蛋白和重组表达的第二前体蛋白，以及b)在允许前体蛋白之间进行多肽链交换的条件下将第一前体蛋白和第二前体蛋白组合，使得形成活化的蛋白，其中活化的蛋白包含源自第一前体蛋白的多肽和源自第二前体蛋白的多肽。
在第六个方面的一个实施例中，本发明提供一种生成产物蛋白的方法，其方法包括使根据本发明的第一前体蛋白和第二前体蛋白接触以形成第三异二聚体多肽，第三异二聚体多肽包含至少一条包含来自第一前体蛋白的CH3结构域的多肽链，和至少一条包含来自第二异二聚体多肽的CH3结构域的多肽链。在本发明的一个实施例中，该方法包括回收第三异二聚体多肽的步骤。
在一个实施例中，使根据本发明的第一前体蛋白和第二前体蛋白接触以形成第三异二聚体多肽，其包含至少一条包含来自第一前体蛋白的CH3结构域的多肽链和至少一条包含来自第二异二聚体多肽的CH3结构域的多肽链，以及第四异二聚体多肽，其包含含有来自第一前体蛋白的CH3结构域的另一多肽和包含来自第二前体蛋白的CH3结构域的另一多肽。在一个实施例中，所述方法包括回收第四异二聚体产物多肽的步骤。
在本发明的一个实施例中，所述方法包括形成第三异二聚体产物多肽和第四异二聚体产物多肽，其中一个产物多肽(即第三异二聚体产物多肽或第四异二聚体产物多肽)不包含与抗原特异性结合的抗原结合位点。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白包含特异性结合至第一抗原的抗原结合部分并包含第二抗原结合位点的一部分，其中第二前体蛋白包含特异性结合至第三抗原的抗原结合部分并且包含第二抗原结合位点的另一部分，并且其中第三异二聚体多肽包含特异性结合至第一抗原的抗原结合部分、特异性结合至第二抗原的抗原结合部分和特异性结合至第三抗原的抗原结合部分。
在本发明的一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含不包含链间二硫键的铰链区。在这种情况下，多肽链交换可以在不存在还原剂的情况下发生。因此，在一个实施例中，第一前体蛋白和第二前体蛋白包含不包含链间二硫键的铰链区，并且第一前体蛋白和第二前体蛋白在不存在还原剂的情况下接触。
在本发明的一个实施例中，在包含第一异二聚体多肽和第二异二聚体多肽的CH3结构域的两条多肽链之间没有形成链间二硫键，并且在不存在还原剂的情况下进行接触。
在第七个方面，本发明涉及一种活化的蛋白，其通过根据本发明的第六个方面的方法产生。
本发明的一个方面是一种活化的蛋白，在一个实施例中是一种活化的异二聚体产物蛋白，其包含至少两条包含CH3结构域的多肽链，其中包含CH3结构域的两条多肽链不包含去稳定化突变。
因此，本发明的另一方面，生成产物多肽的方法的另一产物是优选地通过本发明的方法获得的产物多肽，其包含两条包含CH3结构域的多肽链，其中两个CH3结构域不包含去稳定化突变。
3.本发明的具体实施例
下面列出本发明的具体实施例。
1.一种第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，
其中每种前体蛋白包含经由二聚化结构域彼此缔合的两个多肽，
其中该前体蛋白中的至少一种包含选自受体配体和酶的部分，其中所述部分是功能失活的，其中所述部分与该二聚化结构域融合，
其中当该第一前体蛋白与该第二前体蛋白之间进行多肽链交换时，形成活化的蛋白，
其中该活化的蛋白包含来自该第一前体蛋白的一个多肽和来自该第二前体蛋白的一个多肽，其中两个多肽经由其二聚化结构域彼此缔合，并且其中该活化的蛋白包含所述部分，
其特征在于，该活化的蛋白包含处于功能活性形式的所述部分。
2.根据实施例1所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该第一前体蛋白或该第二前体蛋白包含选自受体配体和酶的该部分，其中该部分与失活部分结合。
3.根据实施例2所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该部分为受体配体并且该失活部分为对应受体或其配体结合亚基。
4.根据实施例3所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该受体配体为细胞因子并且该失活部分为对应细胞因子受体或其细胞因子结合亚基。
5.根据实施例3所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该受体配体为IL-2v并且该失活部分选自IL-2R的亚基，优选IL-2Rβ、IL-2Rγ-链、IL-2Rβ_γ-链。
6.根据实施例1所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该第一前体蛋白和该第二前体蛋白包含选自受体配体和酶的该部分的互补亚基。
7.根据实施例6所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该第一前体蛋白包含该部分的第一未修饰的亚基和该部分的第二亚基，其中该第二亚基包含失活突变；并且其中该第二前体蛋白包含所述部分的第二未修饰的亚基。
8.根据实施例7所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该部分为受体配体。
9.根据实施例8所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该受体配体为细胞因子，其中该第一前体蛋白包含该细胞因子的第一亚基和该细胞因子的第二亚基，其中该第二亚基包含失活突变；并且其中该第二前体蛋白包含该细胞因子的第二未修饰的亚基。
10.根据实施例9所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该第一前体蛋白包含含有失活突变的IL-12p35和IL-12p40；并且其中该第二前体蛋白包含未修饰的IL-12p40。
11.根据实施例10所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该第一前体蛋白包含含有失活突变的IL-12p35和IL-12p40；并且其中该第二前体蛋白包含未修饰的IL-12p40和包含失活突变的IL-12p35。
12.根据实施例1所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该第一前体蛋白和该第二前体蛋白包含选自受体配体和酶的人工分割的部分的互补部分，其中该互补部分中的一个是失活的。
13.根据实施例12所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该部分为受体配体。
14.根据实施例13所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该受体配体为细胞因子。
15.根据实施例14所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该人工分割的部分为分割细胞因子。
16.根据实施例15所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该受体配体为酶。
17.根据实施例16所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该人工分割的部分为分割酶。
18.根据实施例中任一项所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该二聚化结构域为CH3结构域。
19.根据实施例18所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该CH3结构域具有经修饰的界面以支持该第一前体蛋白与该第二前体蛋白之间的多肽链交换。
20.根据实施例18或19所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该第一前体蛋白和该第二前体蛋白各自包含两个包含CH3结构域的多肽，其中一个CH3结构域包含杵突变，而另一CH3结构域包含臼突变。
21.根据实施例20所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中或者i)该第一前体蛋白的包含该杵突变的该CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且该第二前体蛋白的包含该臼突变的该CH3结构域包含半胱氨酸突变，或者ii)其中该第一前体蛋白的包含该臼突变的该CH3结构域包含半胱氨酸突变，并且该第二前体蛋白的包含该杵突变的所述CH3结构域包含半胱氨酸突变。
22.根据实施例20或22所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中或者i)包含该杵突变的该第一前体蛋白的该CH3结构域和包含该臼突变的该第二前体蛋白的该CH3结构域，或者ii)包含该臼突变的该第一前体蛋白的该CH3结构域和包含该杵突变的该第二前体蛋白的该CH3结构域，包含至少一个互补去稳定化突变，而该第一前体多肽和该第二前体多肽的另外两个CH3结构域不包含去稳定化突变。
23.根据前述实施例中任一项所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该前体蛋白当结合至细胞表面时能够经历多肽链交换。
24.根据前述实施例中任一项所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该第一前体蛋白和该第二前体蛋白与靶细胞表面上的抗原特异性结合。
25.根据前述实施例中任一项所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该第一前体蛋白和该第二前体蛋白包含抗体结合区。
26.根据前述实施例中任一项所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该第一前体蛋白和该第二前体蛋白包含抗体片段。
27.根据前述实施例中任一项所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该第一前体蛋白和该第二前体蛋白包含铰链区。
28.根据实施例27所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该第一前体蛋白和该第二前体蛋白在该铰链区中不包含链间二硫键。
29.根据实施例中任一项该的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中
a)该活化的蛋白包含与抗原特异性结合的VH结构域和VL结构域对，其中该VH结构域包含在来自该第一前体蛋白的多肽中并且该VL结构域包含在来自该第二前体蛋白的多肽中；或者
b)该活化的蛋白包含与抗原特异性结合的VH结构域和VL结构域对，其中该VL结构域包含在来自该第一前体蛋白的多肽中并且该VH结构域包含在来自该第二前体蛋白的多肽中。
30.根据实施例29所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中该抗原为T细胞抗原，优选CD3。
31.一种治疗性试剂盒，其包括如前述实施例中的任一项定义的第一前体蛋白和第二前体蛋白。
32.如实施例1至30中任一项所定义的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合用于生成该部分的活化形式的用途。
33.如实施例1至30中任一项所定义的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合用于疗法的用途。
34.用于提供实施例31的治疗性试剂盒的方法，其包括以下步骤：提供重组表达的第一前体蛋白和重组表达的第二前体蛋白，以及任选地与药用载体一起配制该第一前体蛋白和该第二前体蛋白，以提供该治疗性试剂盒。
35.活化的蛋白，其通过如实施例1至30中任一项所定义的第一前体蛋白和第二前体蛋白之间的多肽链交换产生。
36.用于生成根据实施例35的活化的蛋白的方法，其包括以下步骤：在允许如实施例1至30中任一项所定义的第一前体蛋白和第二前体蛋白之间进行多肽链交换的条件下将该第一前体蛋白和该第二前体蛋白组合。
37.一种药物组合物，其包含根据实施例1至30中任一项所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白和药用载体。
38.一种治疗患有疾病的个体的方法，包括向个体施用有效量的根据实施例1至30中任一项所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白或根据实施例37所述的药物组合物。
39.根据实施例1至30中任一项所述的前体蛋白组合，其中在该第一异二聚体前体多肽和该异二聚体前体多肽中，B)中指示的该VH结构域和该VL结构域能够形成与CD3特异性结合的抗原结合位点，用于治疗癌症。
40.一种治疗患有癌症的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的根据实施例1至30中任一项的第一前体蛋白和第二前体蛋白，其中在该第一异二聚体前体多肽和该异二聚体前体多肽中，B)中指示的该VH结构域和该VL结构域能够形成与CD3特异性结合的抗原结合位点。
氨基酸序列的描述
实例
提供以下实例以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可对所阐述的程序进行修改。
实例中使用的分子的排列在下表中指示：
以下重组蛋白显示在指定的图中(根据下表1、2和3的蛋白质名称)：
实例1：
包含人工分割的IL-4的可活化的前体蛋白的设计
制备了图1所示的一般结构域排列的前体蛋白。两种前体蛋白(R1和R2)包含CH3结构域，带有杵和孔突变以及进一步的去稳定化突变。前体蛋白具有半IgG样形状，其中一对非功能性VH/VL结构域排列在CH3结构域的N末端。前体蛋白还包含与CD38或Her2特异性结合的Fab片段。
分割的IL-4的部分融合到每个多肽的C末端，如图1b所示。这两种前体蛋白包含功能失活的细胞因子部分，但当在一种产物蛋白(即活化蛋白)中进行多肽链交换时与活化的IL-4分子结合(图1b)。这是通过将活化的IL-4部分融合到R1的CH3(杵)多肽并将对应的活化的IL-4部分融合到R2的CH3(孔)多肽来实现的。
分割的IL-4分子的设计如下进行：人白细胞介素4由具有四个α-螺旋结构域(本文称为A、B、C和D)的单条多肽链组成。进行了IL-4的两种不同的分割设计。
-对于“3+1”分割设计，通过C3S和C128S突变去除一个二硫键。第一个螺旋(残基1-21)构成3+1分割IL-4的一部分(“A”)，而其余结构(残基22-130)构成3+1分割IL-4的另一部分(“BCD”)(图2a)。对于分割IL-4PACE方法，两个分割IL-4单元与柔性接头融合到前体蛋白的CH3结构域的C末端。每个分子(R1、R2、P1、P2)携带一个“BCD”单元和一个“A”单元。
-对于“2+2”分割设计，通过将IL-4的C末端和N末端与7-残基柔性接头连接并将新的C末端和N末端分别设置在P100和V101，循环排布IL-4。前两个螺旋构成2+2分割IL-4的一部分(“DA”)，而其余结构构成2+2分割IL-4的另一部分(“BC”)(图2b)。对于分割的IL-4PACE方法，两个分割IL-4单元与柔性接头融合到传统PACE分子的C末端。每个分子(R1、R2、P1、P2)携带一个“BC”单元和一个“DA”单元。
条件性细胞因子活性需要前体蛋白R1和R2中存在的“3+1”和“2+2”版本的IL-4失活。之前已经描述过突变E9Q和R88Q降低IL-4活性(Wan g Y,Shen BJ,Sebald W.,ProcNatl Acad Sci U S A.1997；94(5):1657–1662)。因此，融合到没有Fab片段的多肽链(“虚拟链”)的分割IL-4单元携带E9Q突变(前体蛋白R1)或R88Q突变(前体蛋白R2)。当R1和R2之间的多肽链交换时，失活的产物蛋白P2携带两个失活的单元，而活化的产物蛋白P1携带IL-4的两个野生型单元，从而形成功能活性的IL-4分子(图1b)。
实例2：
包含结合至失活部分的IL-2v的可活化的前体蛋白的设计
制备了图1所示的一般抗体结构域排列的前体蛋白。两种前体蛋白(R1和R2)包含CH3结构域，带有杵和孔突变以及进一步的去稳定化突变。前体蛋白具有半IgG样形状，其中一对非功能性VH/VL结构域排列在CH3结构域的N末端。前体蛋白还包含与LeY特异性结合的Fab片段。
对于该实验，使用了经工程化以减少IL-2受体α结合(IL-2v)的人白细胞介素2(Klein C等人,OncoImmunology,6:3)。IL-2v与柔性接头融合至前体蛋白的一条多肽链的C末端。
如图10a所示，在前体蛋白R1中，功能活性的IL-2v融合到一个CH3(杵)-多肽的C末端。CH3(孔)-多肽的C末端与IL-2受体亚基融合，从而使IL-2v分子的活性失活。IL-2v通过结合至细胞表面IL-2受体而发挥其活性，该受体由两个亚基IL-2Rβ和共有γ链(γc)组成。因此，尝试通过将IL-2Rβ的细胞外结构域或γc的细胞外结构域或IL-2Rβ与γc的融合物融合到CH3(孔)链来使IL-2v失活(图10b)。另一种前体蛋白R2不携带任何细胞因子结构域。因此，在一种产物蛋白质(即活化的蛋白质)中进行多肽链交换后(图10a)，仅包含功能活性的IL-2v。另一种失活的产物多肽仅包含IL-2受体亚基。
实例3：
包含IL-12的不同亚基的可活化的前体蛋白的设计
制备了图1所示的一般抗体结构域排列的前体蛋白。两种前体蛋白(R1和R2)包含CH3结构域，带有杵和孔突变以及进一步的去稳定化突变。前体蛋白具有半IgG样形状，其中一对非功能性VH/VL结构域排列在CH3结构域的N末端。前体蛋白还包含与LeY特异性结合的Fab片段。
白细胞介素12(IL-12)作为两个二硫键连接的亚基p35和p40的异二聚体显示出最高的信号传导活性(Sieburth D等人,Genomics.1992Sep；14(1):59-62)。为了提供用于靶向激活IL-12的前体蛋白，通过p35中的C73S突变和p40中的C177S突变去除两个亚基之间的分子间二硫键。
如图13a所示，在前体蛋白R1中，IL-12亚基p35经由柔性接头融合到一个CH3(杵)-多肽的C末端。CH3(孔)-多肽的C末端，IL-12亚基p40的失活的变体经由柔性接头融合，因此总体上IL-12异二聚体是功能失活的。如图13a所示，在前体蛋白R2中，功能活性的IL-12亚基p40经由柔性接头融合到CH3(孔)-多肽的C末端。
当R1与R2之间进行多肽链交换时，活化的产物蛋白P1携带没有失活单元的活性IL-12(图13a)。另一种失活的产物多肽仅包含IL-12亚基p40的失活的变体。
实例4：
前体蛋白的表达和纯化
实例1至3中描述的前体蛋白的表达是经由本领域的技术，通过将编码轻链、重链(具有杵或孔突变)和匹配的“虚拟”重链(即没有抗原结合片段的前体蛋白的重链样多肽；孔或杵)的质粒共转染到哺乳动物细胞(例如HEK 293)中来完成的。
更具体地，例如，为了通过瞬时转染(例如在HEK293细胞中)产生前体蛋白，应用了基于具有或不具有CMV-内含子A启动子的cDNA组织或基于具有CMV启动子的基因组组织的表达质粒。
除抗体表达盒外，质粒还包含：
-复制起点，其允许在大肠杆菌中进行该质粒的复制，以及
-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性。
每个抗体基因的转录单位由以下元件组成：
-来自人巨细胞病毒的即刻早期增强子和启动子，
-在cDNA组织的情况下，之后是内含子A序列，
-人抗体基因的5-非翻译区，
-免疫球蛋白重链信号序列，
-具有接头和细胞因子或分割细胞因子序列的抗体链，作为cDNA或在基因组组织中(维持免疫球蛋白外显子-内含子组织)，以及
-具有聚腺苷酸化信号序列的3-非翻译区，以及
通过PCR和/或基因合成生成包含重链和轻链的融合基因，并将该融合基因通过已知的重组方法和技术，通过例如使用相应质粒中的独特限制性位点连接相应的核酸区段来进行组装。通过DNA测序来验证亚克隆的核酸序列。为了进行瞬时转染，通过质粒制备从转化的大肠杆菌培养物制备较大量的质粒(HiSpeed Plasmid Maxi试剂盒，Qiagen)。
使用如在Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编辑)，John Wiley&Sons,Inc中所述的标准细胞培养技术。
根据制造商的说明，使用HEK293-F系统(Invitrogen)，通过瞬时转染相应的质粒来生成前体蛋白。简而言之，在摇瓶或搅拌发酵管中在无血清FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen)中悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)用相应表达质粒和293fectinTM、fectin(Invitrogen)或PEIpro(Polyplus)转染。对于2L摇瓶(Corning)，将HEK293-F细胞以1*106个细胞/mL的密度接种于600mL中并在120rpm、8％CO2下孵育。后一天，将细胞以约1.5*106个细胞/mL的细胞密度用约42mL的以下混合物转染：A)具有300μg总质粒DNA(0.5μg/mL)的20mL Opti-MEM(Invitrogen)和B)20ml Op ti-MEM+1.2mL 293fectin或fectin(2μL/mL)或750μl的PEIpro(1.25μL/mL)。根据葡萄糖消耗量，在发酵过程中添加葡萄糖溶液。正确组装的前体蛋白像标准IgG一样被分泌到培养物上清液中。5-10天后收获含有前体蛋白的上清液，直接从上清液中纯化前体蛋白，或者将上清液冷冻在-20℃并储存。
因为使用的前体蛋白含有κ轻链，所以它们通过应用标准κ轻链亲和色谱进行纯化。使用KappaSelect(GE Healthcare,Sweden)和Superdex 200体积排阻(GE Healthcare,Sweden)色谱或离子交换色谱，通过亲和色谱从细胞培养物上清液中纯化前体蛋白。
简而言之，将无菌过滤的细胞培养上清液捕获在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4、1mMKH2PO4、137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的KappaSelect树脂上，用平衡缓冲液洗涤并用pH 3.0的50mM柠檬酸钠、150mM NaCl洗脱。将洗脱的前体蛋白级分合并，并用2M Tris，pH9.0中和。通过体积排阻色谱或离子交换色谱进一步纯化前体蛋白库。对于体积排阻色谱，使用20mM组氨酸、140mM NaCl、pH 6.0平衡的SuperdexTM200pg Hi LoadTM16/600(GEHealthcare,Sweden)色谱柱。对于离子交换色谱，将从Ka ppaSelect纯化中获得的蛋白质样品在20mM组氨酸，pH 6.0中按1:10稀释，并加载到用缓冲液A(20mM组氨酸，pH值6.0)平衡的HiTrapTMS P HP离子交换(GE Healthcare,Sweden)色谱柱上。应用0-100％缓冲液B(20mM组氨酸，1M NaCl，pH 6.0)的梯度来洗脱不同的蛋白质物质。合并含有前体蛋白的级分，使用Vivaspin超滤装置(Sartorius Stedim Biotech S.A.,France)浓缩至所需浓度并存储在-80℃。
通过SDS-PAGE纯化后分析纯度和完整性。将蛋白质溶液(13μl)与5μl 4x NuPAGELDS样品缓冲液(Invitrogen)和2μl 10x NuPAGE样品还原剂(Invitrogen)混合并加热至95℃持续5分钟。将样品加载到NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上并根据制造商的说明使用Novex Mini-Cell(Invitrogen)和NuPAGE MES SDS运行缓冲液(LifeTechnologies)运行。凝胶使用InstantBlueTM考马斯蛋白质染色剂染色。此外，使用分析型体积排阻色谱分析蛋白质的完整性和均匀性。
可以高纯度产生如实例1中所述的前体蛋白，如图3a和3b所示的前体蛋白(R1，R2)和包含与CD38特异性结合的Fab片段的活化的产物蛋白(P1)。以类似的方式，包含与LeY特异性结合的Fab片段的蛋白质R1、R2和P1，以及包含与Her2特异性结合的Fab片段的蛋白质R1、R2和P1也可以高纯度产生(数据未显示)。如通过SDS-PAGE和分析型尺寸排阻色谱法分析的那样，成功产生了这些蛋白质。SDS-PAGE显示所有预期的多肽链都存在于制剂中(图3a)；分析型尺寸排阻确认了>90％的制剂纯度。关于用于评估例如抗体纯度的方法的综述，参见Flatman,S.等人，J.Chrom.B 848(2007)79-87。对于R1分子，制剂的产量约为0.2mg/L培养物，对于R2分子为0.5mg/L培养物，对于P1分子为2mg/L培养物。
可以高纯度产生如实例2中所述的前体蛋白，如图11所示的前体蛋白(R1，R2)和包含与LeY特异性结合的Fab片段的活化的产物蛋白(P1)。正如SDS-PAGE所分析的那样，蛋白质已成功产生，显示所有预期的多肽链都存在于制剂中(图11)。对于R1分子，蛋白质制剂的产量约为10mg/L培养物，对于R2分子为6mg/L培养物，对于P1分子为2mg/L培养物。
可以高纯度产生如实例3中所述的前体蛋白，如图14所示的前体蛋白(R1)和包含与LeY特异性结合的Fab片段的活化的产物蛋白(P1)。正如SD S-PAGE所分析的那样，这些分子已成功产生，显示所有预期的多肽链都存在于P1制剂中(图14)。对于R1，两条不同的重链具有非常相似的分子量，因此无法通过SDS-PAGE进行令人满意的区分。相反，质谱显示两条重链都存在于R1制剂中。制剂的产量为约5mg/L培养物。
实例5：
包含可活化的分割的IL-4的前体蛋白的细胞表面靶向生成活化的IL-4
使用TF-1细胞增殖测定法评估实例1的前体蛋白的白细胞介素4活性。
TF-1细胞(最初从Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH获得，随后适应Roche培养条件)是对白细胞介素4有反应并增殖增加的成红细胞(图4a)。细胞在RPMI-1640(Gibco，目录号A10491-01)、2ng/ml重组人GM-CSF(Abcam)、10％(v/v)胎牛血清中于37℃、5％CO2下培养。对于该测定法，TF-1细胞用不含重组人GM-CSF的培养基洗涤3次。将在不含重组人GM-CSF的培养基中的20000个TF-1细胞添加到96孔板的孔。以指定浓度添加前体蛋白，通常范围为从1μM至10fM。在37℃、5％CO2下孵育72–96小时后，根据制造商的方案使用刃天青细胞活力测定法(Abcam)评估细胞增殖。简而言之，将预温热的PBS中的2x刃天青试剂以1:1的体积比添加到96孔板中的细胞，并在37℃、5％CO2下孵育长达4小时。将100μl孔上清液转移至CorningTM96孔透明底部白色聚苯乙烯微孔板(Thermo Fisher Scientific)。使用Infinite 200Pro读板器(Tecan)在550nm激发和590nm发射处测量荧光。高荧光值对应于高增殖。为了进行分析，将对照样品(未添加蛋白质的TF-1细胞)的荧光值设置为0，并对其余样品进行相应调整。使用Prism7软件(GraphPad)分析数据。
为了比较IL-4和循环排布的IL-4DABC的活性，使用与全长IL-4或全长IL-4DABC融合的抗体进行TF-1增殖测定法(图4c)。
两种构建体的活性相似，表明IL-4的循环排布不会损害信号传导活性(图4d)。
为了证明由细胞表面靶向增强了前体蛋白之间的多肽链交换，使用TF-1活性测定法评估了单个前体蛋白、前体蛋白组合和活化的产物蛋白的IL4活性。
在此测定法中，活化以顺式发生，即多肽链交换和IL-4受体活化发生在TF-1细胞表面。评估多肽链交换的实验是在“靶向设置”中使用前体多肽进行的，每个前体多肽都包含与在TF-1细胞上表达的CD38特异性结合的Fab片段；并且作为比较在“非靶向设置”中使用前体多肽，每个前体多肽包含与不在TF-1细胞上表达的Her2特异性结合的Fab片段(图4b)。多肽链交换发生在两种情况下，如与单独存在R1或R2相反，当存在两种分割前体多肽“R1+R2”时TF-1增殖的增加所示(图5a、5b)。这也表明由E9Q(R1)和R88Q(R2)对分割IL-4的单侧失活是成功的。
在直接比较中，很明显靶向设置中的多肽链交换比非靶向设置中的多肽链交换更有效(图5c)。靶向多肽链交换已经发生在大约0.1nM(图5a)，而非靶向多肽链交换仅发生在大约10nM(图5b)。非靶向活性与靶向活性之间的这种100倍差异表明，从分割IL-4中有效生成功能性IL4取决于有效的细胞表面靶向。观察到的靶向对生产性多肽链交换的影响反映了靶向诱导的前体多肽积累，达到了能够实现有效多肽链交换的细胞上浓度。由于多肽链交换以浓度和链可及性依赖性方式发生，细胞表面靶抗原的组成、排列和密度需要被视为影响多肽链交换功效的因素。
包含前体多肽的分割的IL-4 3+1和2+2：
携带全长IL-4的可比蛋白和3+1分割IL-4活化产物蛋白P1显示出相似的活性，表明重建的3+1分割IL-4具有与全长细胞因子相似的效应子效力(图6a)。R1和R2的CD38靶向多肽链交换达到与P1或包含全长IL-4的可比蛋白相似的最大活性，表明3+1分割IL-4可在多肽链交换后重建完整的细胞因子活性(图6a)。
携带全长IL-4DABC的可比蛋白或2+2分割IL-4活化产物蛋白P1显示出相似的活性，表明重建的2+2分割IL-4具有与全长循环排布的细胞因子相似的效应子效力(图6b)。R1和R2的CD38靶向多肽链交换达到与P1或全长IL-4相似的最大活性，表明2+2分割IL-4可在多肽链交换后重建完整的细胞因子活性(图6b)。
分割的IL-4的替代版本：
为了进一步降低反应物活性，在R1的失活的IL-4部分中引入突变E9A、I5A E9Q、T6D E9Q和T6D E9A；并且将突变R88A、R81E R88Q、K84E R88Q、R88Q N89A和R88Q W91A引入R2的失活的IL-4部分。
虽然在R1的失活的IL-4部分中引入的突变E9A、I5A E9Q和T6D E9Q显示出降低的残余活性，但是当在R1的失活的IL-4部分中引入突变T6D E9A时没有显示出可检测的活性(图7)。在R2中存在的失活IL-4部分中，包含R88A和R88Q N89A取代的突变变体显示出降低的残留活性，而突变R81E R88Q和K84E R88Q显示出没有可检测的活性(图7)。
实例6：
包含可活化的分割的IL-4的前体蛋白的表面等离子共振生成活化的IL-4
白细胞介素4的信号传导活性需要与白细胞介素4受体结合。使用表面等离子共振(SPR)评估白细胞介素4受体α与蛋白质R1、R2、P1以及含有全长IL-4(P1)或白细胞介素4的分割的部分的R1和R2组合之间的相互作用的动力学特性。
抗组氨酸抗体(GE Healthcare 28-9980-56)以高密度(>10.000RU)固定在CM5传感器上。在CM5传感器芯片上捕获重组人IL-4R His标签蛋白(Abcam,ab167726)的5nM溶液45秒(捕获水平约55RU)。在7.4nM至600nM下，使用120s缔合时间和900s解离时间，在50μl/min的流速下，通过单循环动力学分析与测试蛋白质的相互作用。所有Biacore T200实验均在HBS-P+(GE Healthcare,Br-1008-27)pH 7.4运行缓冲液中于25℃进行。使用T200评估软件和1:1Langmuir结合模型确定动力学特性。
3+1和2+2活化的产物蛋白保留了与IL-4Rα的结合能力，但与全长IL-4对照分子相比具有较低的亲和力。携带E9Q或R88Q的3+1分割IL-4P ACE反应物分子显示与IL-4Rα的残留结合，而对于T6D E9A和R81E R88Q变体未检测到结合(图9b、9c)。这些结果与TF-1增殖测定法一致(图7)。
实例7：
包含结合至失活部分的IL-2v的可活化的前体蛋白的细胞表面靶向
使用CTLL-2细胞增殖测定法评估实例2的前体蛋白的白细胞介素2v活性。
CTLL-2细胞(最初从American Type Culture Collection获得，随后适应Roche培养条件)是对白细胞介素2v有反应并增殖增加的鼠细胞毒性T淋巴细胞(图12a)。细胞在RPMI-1640(Gibco，目录号A10491-01)、10％(v/v)胎牛血清、具有Con A(BectonDickinson)的10％(v/v)T细胞培养补充剂中于37℃、5％CO2条件下培养。对于该测定法，CTLL-2细胞用不含T细胞培养补充剂的培养基洗涤3次。将在不含T细胞培养补充剂的培养基中的30000个CTLL-2细胞添加到U型96孔板的孔。以所需浓度添加感兴趣的蛋白质，通常范围从1μM到10fM。在37℃、5％CO2下孵育48-72小时后，根据制造商的方案使用刃天青细胞活力测定法(Abcam)评估细胞增殖。简而言之，将预温热的PBS中的2x刃天青试剂以1:1的体积比添加到96孔板中的细胞，并在37℃、5％CO2下孵育长达4小时。将100μl孔上清液转移至CorningTM96孔透明底部白色聚苯乙烯微孔板(Thermo Fisher Scientific)。使用Infinite200Pro读板器(Tecan)在550nm激发和590nm发射处测量荧光。高荧光值对应于高增殖。为了进行分析，将对照样品(未添加蛋白质的CTLL-2细胞)的荧光值设置为0，并对其余样品进行相应调整。使用Prism7软件(GraphPad)分析数据。
与活化的产物蛋白P1相比，所有三种不同的前体蛋白R1(包含IL-2v与三种不同的失活结构域的组合)具有降低的IL-2v活性(图12b)。
实例8：
包含IL-12的不同亚基的可活化的前体蛋白的细胞表面靶向
根据制造商的说明(Invivogen)，使用HEK-BlueTM报告细胞测定法评估实例3的前体蛋白的白细胞介素12活性。HEK-BlueTMIL-12报告细胞(Invivo gen)在RPMI-1640(Gibco，目录号A10491-01)、10％(v/v)胎牛血清、30μg/ml杀稻瘟素、100μg/ml吉欧霉素于37℃、5％CO2培养。对于该测定法，HEK-BlueTMIL-12报告细胞用培养基洗涤3次。将培养基中的50000个HE K-BlueTMIL-12报告细胞添加到96孔板的孔。以所需浓度添加感兴趣的蛋白质，通常范围从1μM到10fM。在37℃、5％CO2下孵育20-24小时后，根据制造商的方案使用Quanti-BlueTM(Invivogen)评估IL-12信号传导活性。简而言之，将检测试剂溶解在预温热的无内毒素水中，并被指示在37℃孵育30分钟。将200μl检测溶液添加到CorningTM96孔透明底部白色聚苯乙烯微孔板(Thermo Fisher Scientific)的孔，并添加20μl细胞上清液。在37℃下孵育1-5小时后，使用Infinite 200Pro读板仪(Tecan)在640nm处测量吸光度。高吸光度值对应于高IL-12信号传导活性。为了进行分析，将对照样品(未添加蛋白质的HEK-BlueTMIL-12报告细胞)的荧光值设置为0，并对其余样品进行相应调整。使用Prism7软件(GraphPad)分析数据。
与相应的活化的产物蛋白P1相比，前体蛋白R1的IL-12活性降低至大约1/1000(图15)。
实例9：
包含人工分割的萤光素酶的可活化的前体蛋白的设计
是一种分割萤光素酶，由两个亚基LgBiT和SmBiT组成(Dixon AS等人,ACS Chem Biol.2016；11(2):400–408)。当两个亚基靠得很近时，它们会形成功能性酶，该功能性酶能够转化活细胞底物，从而生成发光信号。为了生成前体多肽，分别将LgBiT和SmBiT与柔性接头融合至前体蛋白R1的CH3(杵)多肽和前体蛋白R2的CH3(孔)多肽的C末端(图16)，遵循实例1中所示的前体蛋白的一般结构。在R1和R2重组后，产物分子P1携带LgBiT和SmBiT两者，重建萤光素酶活性(图16)。
实例10：
分割萤光素酶PACE前体的细胞表面靶向
使用活细胞测定系统(Promega)评估如实例9中所述的含有(Promega)萤光素酶的部分的蛋白质的活性。
表4：包含分割萤光素酶的可活化的前体蛋白的氨基酸序列
TF-1细胞在RPMI-1640(Gibco，目录号A10491-01)、2ng/ml重组人GM-CSF(Abcam)、10％(v/v)胎牛血清中于37℃、5％CO2下培养。对于该测定法，TF-1细胞用PBS洗涤2次。将I还原血清(Thermo Fisher Scientific)中的100000个TF-1细胞添加到CorningTM96孔透明底部白色聚苯乙烯微孔板(Thermo Fisher Scientific)的孔。准备了仅包含Opti-I还原血清的无细胞板，用于比较细胞上和溶液内PACE。以50nM添加感兴趣的蛋白质。根据制造商的方案，使用活细胞测定系统(P romega)评估萤光素酶活性。简而言之，以1:5的体积比添加活细胞试剂，并在37℃孵育1小时。使用Infinite 200Pro读板器(Tecan)测量发光。高发光值对应于高底物转化率。
前体蛋白显示低发光，而前体蛋白的组合显示高发光，表明产物分子P1成功形成(图17)。TF-1细胞上的靶向多肽链交换显示出比非靶向多肽链交换(无TF-1细胞)更高的发光(图17)。非靶向活性与靶向活性之间的这种差异表明，从分割萤光素酶PACE分子中有效生成功能性萤光素酶取决于有效的细胞表面靶向。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司(F. Hoffmann-La Roche AG)
<120> 用于靶向疗法的前体蛋白和试剂盒
<130> P36624-WO
<150> EP20215328.4
<151> 2020-12-18
<160> 45
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 474
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [LeY-VH_CH1_Dig-VH_CH3-杵]
<400> 1
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Asp Asp Ser Ser Ala Ala Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Ala Trp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
245 250 255
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
260 265 270
Asp Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
275 280 285
Trp Val Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp
290 295 300
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
305 310 315 320
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
325 330 335
Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr
340 345 350
Ser Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 2
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [LeY-VL_Ck]
<400> 2
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ile Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 3
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [Dig-VL_CH3-孔]-[接头]-[人白细胞介素-4]
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile
225 230 235 240
Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Ser Thr Leu Cys Thr Glu
245 250 255
Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys
260 265 270
Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His
275 280 285
His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His
290 295 300
Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu
305 310 315 320
Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln
325 330 335
Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu
340 345 350
Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser
355
<210> 4
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [Dig-VL_CH3-孔]-[接头]-[白细胞介素 4 DABC (循环排布)]
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn
225 230 235 240
Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys
245 250 255
Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser His Lys Cys Asp Ile Thr Leu
260 265 270
Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Ser Thr
275 280 285
Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn
290 295 300
Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln
305 310 315 320
Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala
325 330 335
Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu
340 345 350
Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro
355 360 365
<210> 5
<211> 600
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [CD38-VH_CH1_Dig-VH_CH3-杵]-[接头]-[分割白细胞介素 4
(BCD)]
<400> 5
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
245 250 255
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
260 265 270
Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys
275 280 285
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr
290 295 300
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
305 310 315 320
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
325 330 335
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys
340 345 350
Ala Tyr Tyr Ser Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Leu Cys Thr
485 490 495
Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu
500 505 510
Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser
515 520 525
His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe
530 535 540
His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn
545 550 555 560
Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn
565 570 575
Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg
580 585 590
Glu Lys Tyr Ser Lys Ser Ser Ser
595 600
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [CD38-VL_Ck]
<400> 6
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Thr Lys Gly
100 105 110
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 7
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [生物素-VL_CH3-孔-E357K]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (A) E9Q]
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gln Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser His Lys Ser Asp Ile Thr Leu Gln Gln Ile Ile
225 230 235 240
Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys
245 250
<210> 8
<211> 495
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [CD38-VH_CH1_Dig-VL_CH3-孔]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (A)]
<400> 8
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
245 250 255
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
260 265 270
Asp Ile Lys Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
275 280 285
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro
290 295 300
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
305 310 315 320
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
325 330 335
Ile Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
340 345 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
355 360 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
370 375 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385 390 395 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405 410 415
Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420 425 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435 440 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Lys Ser Asp Ile Thr
465 470 475 480
Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys
485 490 495
<210> 9
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [生物素-VH_CH3-杵-K370E]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (BCD)
R88Q]
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr
20 25 30
Phe Phe Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala
245 250 255
Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val
260 265 270
Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly
275 280 285
Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu
290 295 300
Lys Arg Leu Asp Gln Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys
305 310 315 320
Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg
325 330 335
Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Ser Ser Ser
340 345 350
<210> 10
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [Her2-VH_CH1_Dig-VH_CH3-杵]-[接头]-[分割白细胞介素 4
(BCD)]
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
245 250 255
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
260 265 270
Ser Asp Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
275 280 285
Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala
290 295 300
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
305 310 315 320
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
325 330 335
Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr
340 345 350
Tyr Ser Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
370 375 380
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
420 425 430
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
435 440 445
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
450 455 460
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Leu Cys Thr Glu Leu
485 490 495
Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu
500 505 510
Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His
515 520 525
Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg
530 535 540
His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp
545 550 555 560
Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser
565 570 575
Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys
580 585 590
Tyr Ser Lys Ser Ser Ser
595
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [Her2-VL_Ck]
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 12
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [Her2-VH_CH1_Dig-VL_CH3-孔]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (A)]
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
245 250 255
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile
260 265 270
Lys Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
275 280 285
Leu Leu Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg
290 295 300
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
305 310 315 320
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr
325 330 335
Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln
340 345 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
355 360 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
405 410 415
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
420 425 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Lys Ser Asp Ile Thr Leu Gln
465 470 475 480
Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys
485 490
<210> 13
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [CD38-VH_CH1_Dig-VH_CH3-杵]
<400> 13
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
245 250 255
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
260 265 270
Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys
275 280 285
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr
290 295 300
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
305 310 315 320
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
325 330 335
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys
340 345 350
Ala Tyr Tyr Ser Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210> 14
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [CD38-VH_CH1_Dig-VH_CH3-杵]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (BC)]
<400> 14
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
245 250 255
Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
260 265 270
Thr Phe Ser Asp Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys
275 280 285
Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr
290 295 300
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
305 310 315 320
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
325 330 335
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys
340 345 350
Ala Tyr Tyr Ser Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Leu Cys Thr
485 490 495
Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu
500 505 510
Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser
515 520 525
His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe
530 535 540
His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn
545 550 555 560
Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro
565 570
<210> 15
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [生物素-VL_CH3-孔-E357K]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (DA)
E9Q]
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gln Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn
225 230 235 240
Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys
245 250 255
Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser His Lys Cys Asp Ile Thr Leu
260 265 270
Gln Gln Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys
275 280 285
<210> 16
<211> 531
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [CD38-VH_CH1_Dig-VL_CH3-孔]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (DA)]
<400> 16
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
245 250 255
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
260 265 270
Asp Ile Lys Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
275 280 285
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro
290 295 300
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
305 310 315 320
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
325 330 335
Ile Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
340 345 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
355 360 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
370 375 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385 390 395 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405 410 415
Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420 425 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435 440 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Lys Glu Ala Asn Gln
465 470 475 480
Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu
485 490 495
Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser His Lys
500 505 510
Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr
515 520 525
Glu Gln Lys
530
<210> 17
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [生物素-VH_CH3-杵-K370E]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (BC)
R88Q]
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr
20 25 30
Phe Phe Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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Gly Ser Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala
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Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val
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275 280 285
Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu
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Lys Arg Leu Asp Gln Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys
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Pro
<210> 18
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [生物素-VL_CH3-孔-E357K]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (A)]
<400> 18
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 19
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<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
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Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<220>
<223> [生物素-VL_CH3-孔-E357K]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (A) T6D
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195 200 205
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210 215 220
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Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly
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Phe Phe Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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<213> 人工序列
<220>
<223> [生物素-VH_CH3-杵-K370E]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (BCD)
K84E R88Q]
<400> 25
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165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala
245 250 255
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Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly
275 280 285
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<220>
<223> [生物素-VH_CH3-杵-K370E]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (BCD)
R88Q N89A]
<400> 26
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala
245 250 255
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275 280 285
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Lys Arg Leu Asp Gln Ala Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys
305 310 315 320
Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg
325 330 335
Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Ser Ser Ser
340 345 350
<210> 27
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [生物素-VH_CH3-杵-K370E]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (BCD)
R88Q W91A]
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr
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Phe Phe Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
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Ala Arg Trp Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
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Leu Trp Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala
245 250 255
Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val
260 265 270
Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly
275 280 285
Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu
290 295 300
Lys Arg Leu Asp Gln Asn Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys
305 310 315 320
Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg
325 330 335
Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Ser Ser Ser
340 345 350
<210> 28
<211> 286
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [生物素-VL_CH3-孔-E357K]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (DA) T6D
E9A]
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gln Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn
225 230 235 240
Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys
245 250 255
Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser His Lys Cys Asp Ile Asp Leu
260 265 270
Gln Ala Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys
275 280 285
<210> 29
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [生物素-VH_CH3-杵-K370E]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (BC)
R81E R88Q]
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr
20 25 30
Phe Phe Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala
245 250 255
Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val
260 265 270
Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly
275 280 285
Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Glu Phe Leu
290 295 300
Lys Arg Leu Asp Gln Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys
305 310 315 320
Pro
<210> 30
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [Her2-VH_CH1_Dig-VH_CH3-杵]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (BC)]
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
245 250 255
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
260 265 270
Ser Asp Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
275 280 285
Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala
290 295 300
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
305 310 315 320
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
325 330 335
Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr
340 345 350
Tyr Ser Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
370 375 380
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
420 425 430
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
435 440 445
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
450 455 460
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Leu Cys Thr Glu Leu
485 490 495
Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu
500 505 510
Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His
515 520 525
Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg
530 535 540
His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp
545 550 555 560
Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro
565
<210> 31
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [Her2-VH_CH1_Dig-VL_CH3-孔]-[接头]-[分割白细胞介素 4 (DA)]
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
245 250 255
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile
260 265 270
Lys Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
275 280 285
Leu Leu Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg
290 295 300
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
305 310 315 320
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr
325 330 335
Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln
340 345 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
355 360 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
405 410 415
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
420 425 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr
465 470 475 480
Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr
485 490 495
Ser Lys Cys Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser His Lys Cys Asp
500 505 510
Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln
515 520 525
Lys
<210> 32
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [LeY-VH_CH1_Dig-VL_CH3-孔]
<400> 32
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Asp Asp Ser Ser Ala Ala Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Ala Trp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
245 250 255
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Lys
260 265 270
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
275 280 285
Leu Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
290 295 300
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile Thr Leu
325 330 335
Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 33
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [生物素-VH_CH3-杵-K370E]
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Phe Asn Asn Lys Asp Thr
20 25 30
Phe Phe Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Phe Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Thr Tyr Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 34
<211> 623
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [LeY-VH_CH1_Dig-VH_CH3-杵]-[接头]-[白细胞介素 2v]
<400> 34
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Asn Asp Asp Ser Ser Ala Ala Tyr Ser Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Leu Ala Trp Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly
210 215 220
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
245 250 255
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
260 265 270
Asp Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
275 280 285
Trp Val Ser Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp
290 295 300
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
305 310 315 320
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
325 330 335
Tyr Cys Ala Arg Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr
340 345 350
Ser Met Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
465 470 475 480
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr
485 490 495
Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met
500 505 510
Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Ser Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg
515 520 525
Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
530 535 540
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
545 550 555 560
Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
565 570 575
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
580 585 590
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
595 600 605
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
610 615 620
<210> 35
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [生物素-VL_CH3-孔-E357K]-[接头]-[IL-2R? 细胞外结构域
(A27 - D239)]
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gln Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Asn Gly Thr Ser Gln Phe Thr Cys Phe
225 230 235 240
Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly Ala
245 250 255
Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg Arg
260 265 270
Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp Ala
275 280 285
Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Thr Val
290 295 300
Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp Arg
305 310 315 320
Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu Met
325 330 335
Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu Thr His Arg Cys Asn
340 345 350
Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr Phe Glu Arg His Leu
355 360 365
Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu Ala
370 375 380
Pro Leu Leu Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu Thr
385 390 395 400
Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro Leu
405 410 415
Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala Phe
420 425 430
Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp
435 440
<210> 36
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [生物素-VL_CH3-孔-E357K]-[接头]-[共有 γ 链 (γ c)
细胞外结构域 (L23 - N254)]
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Lys Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Ser Ile Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gln Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Asn Thr Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly Asn
225 230 235 240
Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp Ser
245 250 255
Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val Phe
260 265 270
Asn Val Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro Gln
275 280 285
Pro Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Trp Tyr Lys Asn Ser Asp Asn Asp
290 295 300
Lys Val Gln Lys Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr Ser
305 310 315 320
Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe Val
325 330 335
Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln Met
340 345 350
Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr
355 360 365
Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg
370 375 380
Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp
385 390 395 400
Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser
405 410 415
Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser
420 425 430
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435 440 445
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435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Gly Tyr
485 490 495
Arg Leu Phe Glu Glu Ile Leu
500
<210> 43
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [NADA-VL_CH3-孔-E357K]
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Gly Ser Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Gly Ser Ala Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala Ser Gly Gly Ser
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gln Pro Arg Glu
100 105 110
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn
115 120 125
Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
130 135 140
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
145 150 155 160
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys
165 170 175
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
180 185 190
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
195 200 205
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210
<210> 44
<211> 633
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [CD38-VH_CH1_Dig-VL_CH3-孔]-[接头]-[LgBiT]
<400> 44
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
245 250 255
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
260 265 270
Asp Ile Lys Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
275 280 285
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ser Ser Thr Leu Leu Ser Gly Val Pro
290 295 300
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
305 310 315 320
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
325 330 335
Ile Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
340 345 350
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
355 360 365
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
370 375 380
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
385 390 395 400
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
405 410 415
Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
420 425 430
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
435 440 445
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Val Phe Thr Leu Glu
465 470 475 480
Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr Ala Ala Tyr Asn Leu Asp Gln
485 490 495
Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Leu Gln Asn Leu Ala Val
500 505 510
Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Arg Ser Gly Glu Asn Ala Leu
515 520 525
Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser Ala Asp
530 535 540
Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp
545 550 555 560
Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp
565 570 575
Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly
580 585 590
Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp
595 600 605
Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Thr Pro Asp Gly Ser
610 615 620
Met Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Ser
625 630
<210> 45
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> [NADA-VH_CH3-杵-K370E]
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ala Gly Thr
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Glu Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225

Claims (14)

1.一种第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，
其中每种前体蛋白包含经由二聚化结构域彼此缔合的两个多肽，
其中所述前体蛋白中的至少一种包含选自受体配体和酶的部分，其中所述部分是功能失活的，其中所述部分与所述二聚化结构域融合，
其中当所述第一前体蛋白与所述第二前体蛋白之间进行多肽链交换时，形成活化的蛋白，
其中所述活化的蛋白包含来自所述第一前体蛋白的一个多肽和来自所述第二前体蛋白的一个多肽，其中两个多肽经由其二聚化结构域彼此缔合，并且其中所述活化的蛋白包含所述部分，
其特征在于，所述活化的蛋白包含处于功能活性形式的所述部分。
2.根据权利要求1所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中所述第一前体蛋白或所述第二前体蛋白包含选自受体配体和酶的所述部分，其中所述部分与失活部分结合。
3.根据权利要求2所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中所述部分为受体配体并且所述失活部分为对应受体或其配体结合亚基。
4.根据权利要求1所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中所述第一前体蛋白和所述第二前体蛋白包含选自受体配体和酶的所述部分的互补亚基。
5.根据权利要求4所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中所述第一前体蛋白包含所述部分的第一未修饰的亚基和所述部分的第二亚基，其中所述第二亚基包含失活突变；并且其中所述第二前体蛋白包含所述部分的第二未修饰的亚基。
6.根据权利要求5所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中所述部分为受体配体。
7.根据权利要求6所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中所述受体配体为细胞因子，其中所述第一前体蛋白包含所述细胞因子的第一亚基和所述细胞因子的第二亚基，其中所述第二亚基包含失活突变；并且其中所述第二前体蛋白包含所述细胞因子的第二未修饰的亚基。
8.根据权利要求1所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中所述第一前体蛋白和所述第二前体蛋白包含选自受体配体和酶的人工分裂的部分的互补部分，其中所述互补部分中的一个是失活的。
9.根据权利要求8所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中所述部分为受体配体。
10.根据权利要求9所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中所述受体配体为细胞因子或酶。
11.根据前述权利要求中任一项所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中所述二聚化结构域为CH3结构域。
12.根据权利要求11所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中所述CH3结构域具有经修饰的界面以支持所述第一前体蛋白与所述第二前体蛋白之间的多肽链交换。
13.根据前述权利要求中任一项所述的第一前体蛋白和第二前体蛋白的组合，其中所述前体蛋白当结合至细胞表面时能够经历多肽链交换。
14.一种治疗性试剂盒，其包括如前述权利要求中任一项中所定义的第一前体蛋白和第二前体蛋白。
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