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CN116606821A - 一种植物抗盐碱蛋白GsSIE3及其编码基因与应用 - Google Patents

一种植物抗盐碱蛋白GsSIE3及其编码基因与应用 Download PDF

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CN116606821A
CN116606821A CN202310454129.9A CN202310454129A CN116606821A CN 116606821 A CN116606821 A CN 116606821A CN 202310454129 A CN202310454129 A CN 202310454129A CN 116606821 A CN116606821 A CN 116606821A
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CN
China
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gssie3
gssnrk1
protein
gene
vector
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Application number
CN202310454129.9A
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丁晓东
刘思妤
曹蕾
李强
肖佳雷
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Biotechnology Research Institute of CAAS
Northeast Agricultural University
Original Assignee
Biotechnology Research Institute of CAAS
Northeast Agricultural University
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Abstract

一种植物抗盐碱蛋白GsSIE3及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。为了提高大豆耐盐碱性，本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的GsSIE3蛋白及编码该蛋白的如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，通过实验证明，GsSIE3基因能应答盐碱胁迫反应，并且GsSIE3和GsSnRK1存在物理关联，GsSnRK1可以在T514位点磷酸化GsSIE3。在大豆毛根中共表达GsSnRK1和GsSIE3，发现GsSnRK1(wt)和GsSIE31(wt)的组合能显著增强大豆对盐碱胁迫的抗性，揭示了GsSnRK1和GsSIE3协同参与调控植物的耐盐碱性的分子机制。

Description

一种植物抗盐碱蛋白GsSIE3及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种植物抗盐碱蛋白GsSIE3及其编码基因与应用，属于生物技术领域。
背景技术
盐胁迫是影响世界很多地区农作物产量的环境胁迫因子之一。大豆(Glycinemax)作为我国广泛种植的重要农作物，在长期的人工选育过程中，丧失了很多抗盐基因，使得大豆对土壤中的盐胁迫较为敏感，而野生大豆(Glycine soja)作为栽培大豆的近缘种具有很强的环境适应性，是重要的种质资源。
近年来，通过基因工程挖掘耐盐的关键调控基因，通过基因工程技术分子育种改良作物耐盐性，进而提高作物产量已成为可能。然而，其实现的重要前提是挖掘耐盐关键调控基因。
发明内容
本发明为解决如何提高植物耐盐碱性的问题，提供了一种植物抗盐碱蛋白GsSIE3，所述植物抗盐碱蛋白GsSIE3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地限定，所述植物抗盐碱蛋白GsSIE3还包括在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。
进一步地限定，为了使氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白便于纯化，可在氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白的氨基末端或羧基末端连接上HA标签或Myc标签。
上述植物抗盐碱蛋白GsSIE3是具有下述氨基酸残基序列的蛋白质：自氨基酸残基序列SEQ ID NO.2的羧基端第477至522氨基酸残基序列为泛素连接酶活性区域RING-Ubox域，具有高度保守的C3HC4RING基序，其RING基序属于HC亚组，属RING-Ubox E3泛素连接酶。
上述植物抗盐碱蛋白GsSIE3的泛素连接酶活性结构域中自氨基酸残基序列SEQID NO.2的羧基端第477至522位氨基酸残基序列中的T514为其被磷酸化调控的位点。
本发明还提供了上述植物抗盐碱蛋白GsSIE3的编码序列，所述编码序列如SEQ IDNO.1所示。
进一步地限定，所述编码序列还包括以下任意一种：
1)如SEQ ID NO.1所示的cDNA分子或DNA分子；
2)与如SEQ ID NO.1所示编码序列具有75％以上的同一性且编码所述蛋白GsSIE3的cDNA分子或基因组DNA分子。
进一步地限定，所述编码序列还包括与上述1)或2)限定的编码序列杂交且编码所述蛋白GsSIE3的cDNA分子或基因组DNA分子。
进一步地限定，所述编码序列可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA，也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GsSIE3蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码GsSIE3蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GsSIE3蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
扩增编码上述GsSIE3蛋白的编码序列全长或其片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了与上述编码序列相关的生物材料，所述生物材料为以下材料中的任意一种：
A1)含有所述编码序列的表达盒；
A2)含有所述编码序列的重组载体；
A3)含有所述编码序列的重组微生物。
进一步地限定，上述生物材料还可以为以下材料中的任意一种：
A4)含有A1)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述表达盒的重组微生物；
A6)含有A2)所述重组载体的重组微生物。
进一步地限定，所述的生物材料还包括含有A4)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述生物材料中，A1)所述的含有编码GsSIE3蛋白的核酸分子的表达盒(GsSIE3基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GsSIE3蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动GsSIE3转录的启动子，还可包括终止GsSIE3转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S，来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶(“LAP”，Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)，来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7_硫代羟酸S-甲酯)诱导，西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)，热休克启动子(美国专利5187267)，四环素诱导型启动子(美国专利5057422)，种子特异性启动子(如谷子种子特异性启动子pF128(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin，oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：0dell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene，56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet，262:141；Proudfoot(1991)Cell，64:671；Sanfacon等人Genes Dev.，5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell，2:1261；Munroe等人(1990)Gene，91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.l7:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述GsSIE3基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠癭瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
本发明还提供了上述植物抗盐碱蛋白GsSIE3，上述编码序列或上述生物材料在提高大豆耐盐性中的应用。
进一步地限定，所述应用是在植物中过表达蛋白GsSIE3或共表达蛋白GsSIE3和GsSnRK1蛋白。
本发明还提供了上述植物抗盐碱蛋白GsSIE3，上述编码序列或上述生物材料在提高大豆耐碱性中的应用。
进一步地限定，所述应用是在植物中过表达蛋白GsSIE3或共表达蛋白GsSIE3和GsSnRK1蛋白。
本发明还提供了一种培育具有耐盐性的转基因大豆毛状根的方法，所述方法是将蛋白GsSIE3的编码基因导入大豆毛状根，或将蛋白GsSIE3的编码基因和GsSnRK1蛋白的编码基因导入大豆毛状根；所述蛋白GsSIE3编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地限定，所述大豆毛状根为通过发根农杆菌K599诱导获得的大豆毛状根。
本发明还提供了一种培育具有耐碱性的转基因大豆毛状根的方法，所述方法是将蛋白GsSIE3的编码基因导入大豆毛状根，或将蛋白GsSIE3的编码基因和GsSnRK1蛋白的编码基因导入大豆毛状根；所述蛋白GsSIE3编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地限定，所述大豆毛状根为通过发根农杆菌K599诱导获得的大豆毛状根。
在本发明的一种实施方式中，GsSIE3蛋白的编码基因即如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列通过含有GsSIE3蛋白的编码基因的表达盒的重组载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3及pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3导入发根农杆菌K599中。所述重组载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3及pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3为将核苷酸序列如SEQID NO.1所示的分子插入pPBEL-BiFC载体的EcoRI位点之间，且保持pPBEL-BiFC载体的其他序列不变得到的载体。所述重组载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3表达GsSnRK1蛋白和GsSIE3蛋白，PBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3表达GsSnRK1(K49M)蛋白和GsSIE3蛋白。
在本发明的一种实施方式中，所述转基因大豆毛状根可理解为将所述GsSIE3基因转化目的植物子叶得到的转基因毛状根。也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
本发明有益效果：
本发明发现了一种与植物盐碱胁迫相关的E3泛素连接酶GsSIE3，其对NaCl和NaHCO3敏感，并且通过qRT-PCR和RT-PCR分析表明GsSIE3基因在野生大豆根中显性表达，且GsSIE3受NaCl和NaHCO3胁迫诱导后表达量显著提高，能应答盐胁迫反应。通过酵母二元杂交验证、GST-pulldown验证和免疫共沉淀测定证实了GsSIE3和GsSnRK1的物理关联。此外，确定了GsSnRK1可以在T514位点磷酸化GsSIE3。使用瞬时转化技术以及HA-Ub抗体生化检测了GsSIE3的泛素连接酶活性，盐碱胁迫可以激活GsSnRK1，随后发现GsSnRK1对GsSIE3的磷酸化是其泛素连接酶活性所必需的。在大豆毛根中共表达GsSnRK1和GsSIE3，发现GsSnRK1(wt)和GsSIE3(wt)的组合能显著增强大豆对盐碱胁迫的抗性，揭示了GsSIE3的新功能及其对植物耐盐碱性的调控机制。然后，我们对多种转基因大豆植株在盐碱胁迫下的表型及生理指标进行分析，结果显示在盐碱胁迫作用下，单独过表达GsSnRK1及GsSIE3的转基因嵌合体大豆植株生长状态良好，共表达GsSnRK1(wt)和GsSIE3(wt)的转基因嵌合体大豆植株生长状态更优于单独过表达GsSnRK1及GsSIE3的转基因嵌合体大豆植株。这为GsSIE3的新功能及其对植物耐盐碱胁迫的调控机制提供了新的线索。
附图说明
图1为通过盐碱处理后qRT-PCR和RT-PCR分析GsSIE3基因在不同组织部位中的表达情况的结果图；其中，图1中的A为GsSIE3基因在3周龄野生大豆植株中各部位的表达量，图1中的B为通过不同胁迫溶液处理后GsSIE3基因的表达量，图1中的C为RT-PCR检测3周龄野生大豆植株不同组织部位的GsSIE3基因的表达量，图1中的D为RT-PCR检测不同胁迫溶液处理后3周龄野生大豆植株GsSIE3基因的表达量；
图2为GsSIE3家族蛋白氨基酸序列的多重比对结果图；
图3为GsSIE3 E3泛素连接酶功能结构域以及RING结构域图；其中，图3中的A为GsSIE3 E3泛素连接酶功能结构域图，图2中的B为GsSIE3 E3泛素连接酶RING结构域图；
图4为通过酵母二元杂交证实GsSIE3和GsSnRK1的物理关联结果图；
图5为GsSIE3亚细胞定位图；
图6为通过GST-Pulldown和Co-IP证实GsSIE3和GsSnRK1的互作关系的结果图；其中，图6中的A为体外蛋白互作图，图6中的B为Co-IP分析GsSnRK1和GsSIE3在植物细胞中的相互作用结果图；
图7为GsSIE3蛋白的泛素连接酶活性分析结果图；其中，图7中的A为GsSIE3自我泛素化图；图7中的B为GsSIE3自我泛素化位点图，图7中的C为GsSIE3多聚泛素化反应图；
图8为Phos-tagTM和Western blot检测GsSnRK1对GsSIE3磷酸化的结果图，其中，图8中的A为利用特异性磷酸化抗体进行体外磷酸化分析结果图，图8中的B为Phos-tag技术进行GsSIE3的体外磷酸化分析结果图；图8中的C为Phos-tag技术进行GsSIE3的体外磷酸化位点分析结果图，T514A为GsSIE3(T514A)，K49M为GsSnRK1(K49M)，图8中的D为Phos-tag技术进行再次验证GsSIE3的体外磷酸化位点分析结果图，图8中的E为利用特异性磷酸化抗体再次进行体外磷酸化位点分析结果图；
图9为磷酸化位点对泛素连接酶活性影响结果图；其中图9中的A为GsSnRK1突变位点对泛素连接酶活性影响结果图；图9中的B为GsSIE3磷酸化位点突变对泛素连接酶活性影响结果图；
图10为GsSnRK1影响GsSIE3的稳定性结果图；
图11为在大豆毛状根中GsSnRK1磷酸化GsSIE3的分析结果图；
图12为200mM NaCl和50mMNaHCO3处理后转基因嵌合体大豆的表型图；
图13为200mM NaCl和50mMNaHCO3处理后转基因嵌合体大豆的生理指标分析结果图；其中，图13中的A和B为生物量分析，图13中的C和D为根长分析；
图14为200mM NaCl和50mMNaHCO3处理后转基因嵌合体大豆的生理指标分析结果图；其中，图14中的A和D为叶绿素含量分析，图14中的B和E为丙二醛含量分析，图14中的C和F为脯氨酸含量分析；
图15为200mM NaCl处理后转基因嵌合体大豆的生理指标分析结果图；其中，图15中的A为台盼蓝染色分析结果图，图15中的B为DAB染色分析结果图，图15中的C为NBT染色分析结果图；
图16为50mM NaHCO3处理后转基因嵌合体大豆的生理指标分析结果图；其中，图16中的A为台盼蓝染色分析结果图，图16中的B为DAB染色分析结果图，图16中的C为NBT染色分析结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的野生大豆G07256种子，发根农杆菌K599，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH109，pET-32b、pGADT7及pGBKT7载体，pPBEL-BiFC载体，融合蛋白原核表达重组载体pGEX-4T-1-GsSnRK1.1、pET32b-Myc-GsSnRK1.1、pET32b-Flag-GsGRIK1及重组蛋白均公开于申请号为CN202210037002.2的专利中，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的大肠杆菌感受态Trans1-T1 Phage Resistant ChemicallyCompetent Cell是全式金公司的产品；下述实施例中的酿酒酵母感受态Y2HGoldChemically Competent Cell是上海唯地生物技术有限公司的产品。
下述实施例中涉及到的引物对应的核苷酸序列见表1。
表1实施例中涉及到的引物对应的核苷酸序列
实施例1：大豆E3泛素连接酶GsSIE3基因的克隆及其表达模式分析
一、植物材料的处理
选取饱满的野生大豆(Glycine soja)G07256种子，经浓HgSO4处理10min，灭菌水冲洗3-4次后置于湿滤纸上，在4℃下黑暗处理进行春化3d。在人工气候室中，用1/4Hoagland营养液培养野生大豆幼苗，培养3周，获得3周龄的幼苗。生长条件为：24℃，相对湿度60％，光照周期为16h光照，8h黑暗。
二、RNA提取
参见PlantRNAKit说明书提取野生大豆幼苗的总RNA，将提取的总RNA立即进行反转录或置于-80℃保存。
三、cDNA的获得
以上述步骤二获得的总RNA为模板，采用TransScript One-Step gDNARemovalandcDNASynthesis SuperMix试剂盒进行反转录得到cDNA。
四、PCR扩增
以步骤三获得的cDNA为模板，采用GsSIE3-Clone-F(SEQ ID NO.3)和GsSIE3-Clone-R(SEQ ID NO.4)引物及PrimeSTARMax DNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量略大于1kb的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，将其与pEASY-Blunt Simple CloningKit载体(TRANSGEN BIOTECH)连接，得到重组质粒，将其命名为pEASY-Blunt Simple-GsSIE3，并将其转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞后送交测序。
测序结果表明：PCR扩增得到大小为1569bp的扩增产物，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，将其命名为GsSIE3基因，ORF为SEQ ID NO.1的第1-1569位，GsSIE3基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1：
ATGCTTGCATATGGGGTACACTTGAACGAGTTGAATCTAAAATGTGTTCTTATGATCATATTGATGATGATATTACCCATCCTAGGGTTGTTTTTCTGGCTAGAGAACAAGTTGTCCCATAATTCCAGTGAGGCCAATCATTACTCCAAATGGAAGGAACATTTGCAGATCAGTGATGAAATAAATACCCTATTTTGTGAACAAGATGAGAACAGTACTAGTGCACACTGTGCTTGCTCCTTCTGTGGAAGATTAAGCAACATAGTCACGAGATGCTCACGCTGCAAAGCTGCTATATATTGCTCGAATGCTTGCCATGTTAAGCATTGGAGGATTTGCCATAAATATGAATGCGTTGAGAAAGAAGGGTCACAAGATCAGCAGGAATCACCGTTTCATGGAACCCATTGCCTTATCATGGAGCCTGAAAATGGTAAGTTCTCATTCAGTGAAGTTATTGAGCAGAGATCATATAAGGGAGATGTTTACTATGTCGAAGGAGGAGAAAACAGTGCTGAGGTCAGTGATGAAACAGCTCTAAAGTGTAACGATGGCTGTGCAGTGTGTGGCAATCCAAGCTCTAAAGTATGCTCAAGGTGCAAAGCCATAAAATATTGCTCACAAACATGCCAACATTTCGATTGGAGATCTGGGCATAAGTTTCAATGTCTTGTTGAGAAGGCAAATACAACTGAAAAAGCAATTGTCAATCAAGGAAGACCTGCAAACGGAAATGTTGTAAATCTCACGAATTCGGATGAGGTAGAAGATAATGCTCATTCATCTAGTCCTCTTCGCTTGGAATTTTACTCAGGAAACACCAGTTCCAAGGCCCTGACTCGAAGTTCTTTGTCTCTGGAAGCAACCAATAATGCTCAGAAGGAGATTCAAGATCAATTGACAAGCCTAGAAGAAGAATTGGCAAAGATAAAAGAGGAGAACATGTCATTACTATCAGAGCGCGACGCATGGGAAGTGCGAGCAAGGAATTCCATAGATAGACTTTATAGCTTCAGGAAAGAAAATGAGCACCAGCTGTTTATTTTGAAGCATGAAAATGAATTGATGTCAAATGCTGAGAAGCAATCACGTCAAATGGTTAATAGTTTATCTCAGAGGCTACACTGCTTGCAGATTGCAGTGGAAAGTGGAGTTGAAGAGAGGAAAAAACAAGAAGAATATATACATATGTTGCAGAATGAATGTGCTAAGGTTAAGATAGAGCTACAAGAACAGAACAAGTGCGTCGAAAGGCTTACAGTAGAGCTGGATAAGAACACTCAATTTCCTAGGAGAATAACTGAAGAAACAGGACAAATATTAGTCAATGCTTTAAGTGAAATTGCAGCTGTTGAATCCAATGCTAACTGTGCTGAGGTGTCCCTGCCAATTAGTTTGAGCAGAAATCCAACCTTTACAACACAGGGTTGTTCAATTTGCCTAGCCAATGAGAAGAACATGGCCTTTGGTTGTGGACACATGACTTGTTTAGAGTGTGGATCAAAAATTCGCAAGTGTCATATATGCCGAAGGAAGATCACCATTCGTATCAGATTGTTTCCTGATTAA
SEQ ID NO.2：
MLAYGVHLNELNLKCVLMIILMMILPILGLFFWLENKLSHNSSEANHYSKWKEHLQISDEINTLFCEQDENSTSAHCACSFCGRLSNIVTRCSRCKAAIYCSNACHVKHWRICHKYECVEKEGSQDQQESPFHGTHCLIMEPENGKFSFSEVIEQRSYKGDVYYVEGGENSAEVSDETALKCNDGCAVCGNPSSKVCSRCKAIKYCSQTCQHFDWRSGHKFQCLVEKANTTEKAIVNQGRPANGNVVNLTNSDEVEDNAHSSSPLRLEFYSGNTSSKALTRSSLSLEATNNAQKEIQDQLTSLEEELAKIKEENMSLLSERDAWEVRARNSIDRLYSFRKENEHQLFILKHENELMSNAEKQSRQMVNSLSQRLHCLQIAVESGVEERKKQEEYIHMLQNECAKVKIELQEQNKCVERLTVELDKNTQFPRRITEETGQILVNALSEIAAVESNANCAEVSLPISLSRNPTFTTQGCSICLANEKNMAFGCGHMTCLECGSKIRKCHICRRKITIRIRLFPD
五、实时荧光定量PCR分析GsSIE3的表达模式
利用引物GsSIE3-qPCR-F(SEQ ID NO.5)和GsSIE3-qPCR-R(SEQ ID NO.6)对3周龄的野生大豆幼苗各器官的cDNA和经200mM NaCl或50mMNaHCO3或15％PEG或10μMABA处理1h的3周龄的野生大豆幼苗的cDNA进行qRT-PCR扩增。
根据qRT-PCR结果可知GsSIE3基因在野生大豆植株的各个器官中均有表达，其中根部表达量相对较高，说明GsSIE3基因可能参与盐胁迫的响应(见图1中的A和C)。用NaCl和NaHCO3处理野生大豆植株1h后的结果表明，GsSIE3的表达能够受到NaCl和NaHCO3的诱导(见图1中的B和D)。
六、RT-PCR分析GsSIE3在NaCl和NaHCO3胁迫下的表达模式
3周龄的野生大豆幼苗分别经100mMNaCl与50mM NaHCO3处理1h后，在指定时间取样，结果表明GsSIE3的转录水平被NaCl和NaHCO3上调，GsSIE3表达增加了约2倍和3倍。
利用GeneDOC将GsSIE3蛋白与不同植物中的SIE3家族蛋白进行氨基酸序列比对发现，GsSIE3蛋白同大豆中的GmSIE3的相似性为100％，并且SIE3家族蛋白的C端高度保守，而N端具有多样性(见图2)。
根据SMART数据库，寻找GsSIE3的功能结构域以及结构域特征，结果如图3所示，GsSIE3蛋白包含四个功能域，其中最重要的是C端保守的RING-Ubox域氨基酸序列比对分析表明，GsSIE3包含1566bp的完整ORF，编码522个氨基酸，蛋白质分子量约为58KDa。GsSIE3具有与其他同源蛋白高度保守的C3HC4 RING基序，其RING基序属于HC亚组，并且RING域位于477至522位，靠近C端，E3泛素连接酶活性需要RING和Zn2+中保守的Cys和His残基。
实施例2：GsSnRK1与GsSIE3的互作
一、酵母二元杂交验证GsSnRK1与GsSIE3的互作
(一)pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-GsSIE3表达载体的构建
1、GsSnRK1基因的获得
以野生大豆总cDNA为模板，采用BD-GsSnRK1-SmaIF(SEQ ID NO.7)和BD-GsSnRK1-SalIR(SEQ ID NO.8)引物及PrimeSTAR Max DNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsSnRK1基因。
2、重组载体pGBKT7-GsSnRK1的构建
用限制性内切酶SmaI和SalI分别对pGBKT7载体和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pGBKT7-GsSnRK1重组载体，对pGBKT7-GsSnRK1重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pGBKT7-GsSnRK1重组载体为将pGBKT7载体的SmaI和SalI酶切位点间的DNA片段替换为GsSnRK1基因，且保持pGBKT7载体的其他序列不变得到的载体。pGBKT7-GsSnRK1重组载体表达GsSnRK1蛋白。
3、重组载体pGADT7-GsSIE3的构建
以pEASY-Blunt Simple-GsSIE3质粒为模板，采用AD-GsSIE3-SmaIF(SEQ IDNO.9)和AD-GsSIE3-SmaIR(SEQ ID NO.10)引物及PrimeSTARMax DNAPolymerase试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。用限制性内切酶SmaI对pGADT7载体进行酶切，通过PCR的方法在GsSIE3基因的上下游分别添加SmaI酶切位点以及与载体部分的同源臂。将pGADT7载体用SmaI进行单酶切，酶切产物经过胶回收纯化后，利用同源重组酶与上述PCR产物进行连接。鉴定正确后将所获得载体命名为pGADT7-GsSIE3。
测序结果表明：pGADT7-GsSIE3重组载体为将pGADT7载体的SmaI酶切位点通过同源重组插入GsSIE3基因，且保持pGADT7载体的其他序列不变得到的载体。pGADT7-GsSIE3重组载体表达GsSIE3蛋白。
(二)转化酵母菌Y2HGold
分别将pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-GsSIE3两个载体及pGBKT7空载体和pGADT7-GsSIE3两个载体及pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7两个载体及pGBKT7和pGADT7两个载体转化酵母菌Y2HGold，分别得到含质粒pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-GsSIE3、pGBKT7和pGADT7-GsSIE3、pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7、pGBKT7和pGADT7的酵母菌Y2HGold，转化酵母感受态细胞的具体步骤参见唯地生物Y2HGold Chemically Competent Cell转化的具体操作。
结果如图4所示，在SD/-Trp/-Leu/-His(含20mM 3-AT)培养基上，试验组含有pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7-GsSIE3重组载体的酵母菌株能够正常生长，而空白对照组pGBKT7和pGADT7及负对照组pGBKT7和pGADT7-GsSIE3、pGBKT7-GsSnRK1和pGADT7的酵母菌株均不能正常生长，X-α-gal染色的结果也进一步验证了这一结果，表明了GsSnRK1蛋白与GsSIE3蛋白的互作关系。
二、拟南芥原生质体验证GsSIE3的互作与定位
(一)pCAM3301-EGFP-GsSIE3载体的构建
1、GsSIE3基因的获得
以上述pEASY-Blunt Simple-GsSIE3质粒为模板，采用pCAM3301-EGFP-GsSIE3 F(SEQ ID NO.11)和pCAM3301-EGFP-GsSIE3 R(SEQ ID NO.12)引物及PrimeSTARMaxDNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsSIE3基因。
2、pCAM3301-EGFP-GsSIE3载体的构建
用限制性内切酶BamHI(New EnglandBiolabs)对pCAM3301-EGFP载体进行单酶切，连接，得到pCAM3301-EGFP-GsSIE3重组载体，对pCAM3301-EGFP-GsSIE3重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pCAM3301-EGFP-GsSIE3重组载体为将pCAM3301-EGFP载体的BamHI酶切位点后插入GsSIE3基因，且保持pCAM3301-EGFP载体的其他序列不变得到的载体。重组载体pCAM3301-EGFP-GsSIE3表达GsSIE3蛋白。
(二)拟南芥原生质体转化
采用聚乙二醇法将上述pCAM3301-EGFP-GsSIE3载体转化到拟南芥原生质体(具体方法参见中科瑞泰植物原生质体制备及转化试剂盒说明书)，选取转化过pCAM3301-EGFP-GsSIE3载体和pCAM3301-EGFP空载体的拟南芥原生质体，装片，利用激光共聚焦显微镜观察。结果如图5所示：GsSIE3蛋白定位在细胞质中。
(三)拟南芥原生质体蛋白的提取及Westernblot检测
将相关质粒在拟南芥原生质体中进行瞬时表达后提取总蛋白，采用Co-IP技术分析GsSnRK1与GsSIE3的互作关系。利用anti-HA从所有裂解物中免疫沉淀(即IP)出HA-GsSIE3，并通过anti-Myc抗体进行Western blot检测Myc-GsSnRK1蛋白；以及利用anti-Myc从所有裂解物中免疫沉淀出Myc-GsSnRK1，并通过anti-HA抗体进行Westernblot检测HA-GsSIE3蛋白。结果如图6中的B表明，GsSnRK1与GsSIE3之间都存在互作，并能形成蛋白复合物。
三、GsSnRK1与GsSIE3的体外互作
(一)蛋白表达载体的构建
1、重组载体pET32b-GsSnRK1的构建
1)GsSnRK1基因的获得
以上述pGBKT7-GsSnRK1质粒为模板，采用pET-HA-GsSnRK1-SalIF(SEQ ID NO.13)和pET-HA-GsSnRK1-XhoIR(SEQ ID NO.14)引物及PrimeSTARMax DNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsSnRK1基因。
2)重组载体pET32b-GsSnRK1的构建
用限制性内切酶SalI(New EnglandBiolabs)和XhoI(New EnglandBiolabs)分别对pET32b载体和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pET32b-GsSnRK1重组载体，对pET32b-GsSnRK1重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pET32b-GsSnRK1重组载体为将pET32b载体的SalI和XhoI酶切位点间的DNA片段替换为GsSnRK1基因，且保持pET32b载体的其他序列不变得到的载体。pET32b-GsSnRK1重组载体表达GsSnRK1蛋白。
2、重组载体pET32b-GsSIE3的构建
1)GsSIE3基因的获得
以上述pEASY-Blunt Simple-GsSIE3质粒为模板，采用pET-HA-GsSIE3-EcoRVF(SEQ ID NO.17)和pET-HA-GsSIE3-EcoRVR(SEQ ID NO.18)引物及PrimeSTAR MaxDNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsSIE3基因。
2)重组载体pET32b-GsSIE3的构建
采用限制性内切酶EcoRV(New EnglandBiolabs)对pET32b载体进行单酶切，然后利用同源重组酶将GsSIE3与酶切纯化后的载体进行连接，得到pET32b-HA-GsSIE3重组载体。
测序结果表明：pET32b-GsSIE3重组载体为将pET32b载体的EcoRV单酶切后，插入GsSIE3基因，且保持pET32b载体的其他序列不变得到的载体。pET32b-GsSIE3重组载体表达GsSIE3蛋白。
(二)GST-Pull down
将经原核表达后纯化的50μl GST-SnRK1蛋白与GST填料在PBS溶液中在4℃条件下孵育2h，然后与His-GsSIE3在4℃条件下共同孵育2h，随后使用PBS溶液清洗，通过Westernblot检测，结果如图6中的A所示，GsSIE3在体外能与GsSnRK1结合。
(三)GsSIE3泛素连接酶活性分析
1、GsSIE3连接酶连接方式的功能分析
为了确定多聚泛素链的连接方式，我们构建了Flag-Ub(WT)、Flag-Ub(K48)和Flag-Ub(K63)载体，并纯化用于体外泛素化测定，结果如图7中的A和7中的C所示，使用K48蛋白与使用WT蛋白的结果基本一致，而K63泛素连接酶活性几乎消失，并且在体内泛素化测定中获得了相同的结果。
2、GsSIE3的自身泛素化
构建了RING-Ubox结构域及其四个突变体(K9R、K26R、K29R、K36R)。结果如图7中的B所示，野生型RING-Ubox结构域及其突变体的添加导致E3-Ub的积累，并清楚地观察到高分子量带的形成。K29R和K36R突变体具有RING-Ubox结构域相似的活性。K9R和K26R突变体的泛素化作用比野生型RING-Ubox结构域弱。这些数据表明RING-Ubox结构域的K9和K26可能是GsSIE3的自身泛素化位点。
(四)GsSnRK与GsSIE3的磷酸化分析
GsSnRK1蛋白执行磷酸化功能及GsSIE3上GsSnRK1磷酸化位点的预测
通过在线工具(http://ppsp.biocuckoo.org)对GsSnRK1蛋白执行磷酸化功能及GsSIE3上GsSnRK1磷酸化位点进行预测。
结果显示GsSnRK1蛋白第49位氨基酸赖氨酸(K)为GsSnRK1执行磷酸化功能的重要氨基酸，GsSIE3蛋白第514位点处的苏氨酸(T)为GsSnRK1假定的磷酸化位点。
1、重组载体pET32b-GsSnRK1(K49M)的构建
1)GsSnRK1(K49M)基因的获得
我们将GsSnRK1基因序列上编码第49位氨基酸的碱基AAG替换为ATG，使GsSnRK1蛋白的第49位氨基酸由赖氨酸(K)突变为甲硫氨酸(M)，我们重新人工合成了突变过的GsSnRK1基因并命名为GsSnRK1(K49M)，GsSnRK1(K49M)基因编码的GsSnRK1(K49M)蛋白不具有磷酸化的功能。
以GsSnRK1(K49M)基因为模板，采用pET-HA-GsSnRK1(K49M)-SalIF(SEQ IDNO.15)和pET-HA-GsSnRK1(K49M)-XhoIR(SEQ ID NO.16)引物及PrimeSTARMaxDNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有酶切位点的GsSnRK1(K49M)基因。
2)重组载体pET32b-GsSnRK1(K49M)的构建
用限制性内切酶SalI(New EnglandBiolabs)和XhoI(New EnglandBiolabs)分别对pET32b载体和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pET32b-GsSnRK1(K49M)重组载体，对pET32b-GsSnRK1(K49M)重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pET32b-GsSnRK1(K49M)重组载体为将pET32b载体的SalI和XhoI酶切位点间的DNA片段替换为GsSnRK1(K49M)基因，且保持pET32b载体的其他序列不变得到的载体。pET32b-GsSnRK1(K49M)重组载体表达GsSnRK1(K49M)蛋白。
2、重组载体pET32b-GsSIE3(T514A)的构建
1)GsSIE3(T514A)基因的获得
我们将GsSIE3基因序列上编码第514位氨基酸的碱基ACC替换为GCC，使GsSIE3蛋白的第514位氨基酸由苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.23和SEQID NO.24所述的引物对PCR扩增出T514位点突变基因并命名为GsSIE3(T514A)，GsSIE3(T514A)基因编码的GsSIE3(T514A)蛋白不具有被GsSnRK1蛋白磷酸化的能力。
以GsSIE3(T514A)基因为模板，采用pET-HA-GsSIE3(T514A)-EcoRV(SEQ IDNO.19)和pET-HA-GsSIE3(T514A)-EcoRVR(SEQ ID NO.20)引物及PrimeSTARMaxDNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有酶切位点的GsSIE3(T514A)基因。
2)重组载体pET32b-GsSIE3(T514A)的构建
采用限制性内切酶EcoRV对pET32b载体进行单酶切，然后利用同源重组酶将GsSIE3(T514A)与酶切纯化后的载体进行连接，得到pET32b-HA-GsSIE3(T514A)重组载体。
测序结果表明：pET32b-GsSIE3(T514A)重组载体为将pET32b载体的EcoRV单酶切后，插入的GsSIE3(T514A)基因，且保持pET32b载体的其他序列不变得到的载体。pET32b-GsSIE3(T514A)重组载体表达GsSIE3(T514A)蛋白。
(五)蛋白的表达和纯化
将蛋白表达载体pET32b-GsSnRK1、pET32b-GsSnRK1(K49M)、pET32b-GsSIE3和pET32b-GsSIE3(T514A)分别转化大肠杆菌BL21感受态。分别获得含有pET32b-GsSnRK1、pET32b-GsSnRK1(K49M)、pET32b-GsSIE3和pET32b-GsSIE3(T514A)蛋白表达载体的BL21大肠杆菌并诱导蛋白表达。
分别对表达的GsSnRK1、GsSnRK1(K49M)、GsSIE3和GsSIE3(T514A)蛋白进行纯化，GsSnRK1和GsSnRK1(K49M)蛋白的纯化采用上海谷研实业有限公司提供的Myc融和蛋白纯化试剂盒进行纯化，具体步骤详见试剂盒说明书；GsSIE3和GsSIE3(T514A)蛋白的纯化采用康为世纪His-Tagged Pro tein Purifica tion Kit试剂盒进行纯化，具体步骤详见试剂盒说明书。
(六)Phos-tagTM检测GsSnRK1对GsSIE3的磷酸化
采用Phos-tagTM试剂盒分别检测GsSnRK1对GsSIE3、GsSnRK1对GsSIE3(T514A)的磷酸化水平，具体操作步骤详见Phos-tagTM试剂盒说明书。
结果如图8中的B，图8中的C和图8中的D所示：GsSnRK1对GsSIE3有磷酸化的作用，GsSnRK1对GsSIE3(T514A)没有磷酸化作用。证明了GsSnRK1蛋白对GsSIE3蛋白具有磷酸化作用，GsSIE3的第514位氨基酸T是GsSnRK1关键的磷酸化位点。
(七)Western blot检测GsSnRK1对GsSIE3的磷酸化
采用Westernblot分别检测GsSnRK1对GsSIE3、GsSnRK1对GsSIE3(T514A)、GsSnRK1(K49M)对GsSIE3(T514A)的磷酸化水平。采用pPKDsub抗体检测是否存在磷酸化，采用HA抗体检测GsSIE3和GsSIE3(T514A)的含量，采用Myc抗体检测GsSnRK1和GsSnRK1(K49M)的含量。
结果如图8中的A和图8中的E所示：采用pPKDsub抗体检测到GsSnRK1对GsSIE3有磷酸化的作用，而GsSnRK1对GsSIE3(T514A)及GsSnRK1(K49M)对GsSIE3均没有磷酸化作用。再一次证明了GsSnRK1蛋白对GsSIE3蛋白具有磷酸化作用，且GsSnRK1的第49位氨基酸K是GsSnRK1执行磷酸化功能的重要氨基酸，GsSIE3的第514位氨基酸T是GsSnRK1关键的磷酸化位点。
(八)GsSnRK1对GsSIE3泛素连接酶功能的调控
将磷酸化的GsSIE3与GsSnRK1及其GsSnRK1(K49M)分别孵育，进行泛素化实验。
结果如图9中的A所示，GsSIE3的磷酸化形式增强了其连接酶的活性。然后，还检测了GsSIE3磷酸化状态影响其E3连接酶活性的能力。纯化出了GsSIE3及其GsSIE3(T514A)、GsSIE3(T495A)和Flag-Ub，用于泛素化分析。结果如图9中的B所示，GsSIE3(T514A)的自身泛素化活性降低，抗Flag免疫印迹分析观察到了相似的结果。
(九)GsSnRK1对GsSIE3稳定性的调控
将不同的转基因毛状根粗蛋白提取物(WT、GsSnRK1、GsSnRK(K49M))与纯化的GsSIE3和GsSIE3(T514A)进行温育。
结果如图10所示，在存在ATP的情况下，野生型中GsSIE3的降解速度比GsSnRK1(K49M)和GsSIE3(T514A)快得多，但比GsSnRK1过表达植物慢。这些结果表明，GsSnRK1可能调节GsSIE3的稳定性，而GsSnRK1介导的GsSIE3磷酸化是其降解所必需的。为了进一步确认结果，我们在GsSIE3过表达背景中生成了GsSnRK1过表达和GsSnRK1(K49M)过表达转基因毛状根，并用环己酰亚胺(CHX)处理以抑制随后的蛋白质合成。结果如图10所示，GsSnRK1的过表达导致GsSIE3蛋白水平降低。相反，GsSnRK1(K49M)的过表达更为稳定。此外，在以GsSIE3(T514A)为背景的转基因毛状根中，GsSIE3的降解比野生型GsSIE3慢得多。MG132的添加可有效减少蛋白质降解。这些结果表明，GsSnRK1使GsSIE3磷酸化负调控其稳定性并使其被26S蛋白酶体降解。
实施例3：GsSIE3的遗传转化及在转基因大豆中的表达分析
一、发根农杆菌K599介导转基因大豆毛状根的遗传转化及植株在盐碱胁迫下的表型分析
1、pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3表达载体的构建
1)GsSnRK1(K49M)基因的获得以上述GsSnRK1(K49M)基因为模板，采用BiFC-GsSnRK1(K49M)-SmaIF(SEQ ID NO.21)和BiFC-GsSnRK1(K49M)-SmaIR(SEQ ID NO.22)引物及PrimeSTARMax DNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有酶切位点的GsSnRK1(K49M)基因。
2)pBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3载体的构建
用限制性内切酶SmaI和SalI分别对上述PBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3载体和上述GsSnRK1(K49M)基因的PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到PBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3重组载体，对PBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3重组载体为pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3载体的SmaI和SalI酶切位点间的GsSnRK1片段替换为GsSnRK1(K49M)基因，且保持pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3载体的其他序列不变。得到的载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3重组载体表达GsSnRK1(K49M)和GsSIE3蛋白。
2、pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3(T514A)表达载体的构建
1)GsSIE3(T514A)基因的获得以上述GsSIE3(T514A)基因为模板，采用BiFC-GsSIE3(T514A)-PmlIF(SEQ ID NO.27)和BiFC-GsSIE3(T514A)-PmlIR(SEQ ID NO.28)引物及PrimeSTARMax DNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即带有酶切位点的GsSIE3(T514A)基因。
2)PBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3(T514A)载体的构建
用限制性内切酶PmlI对上述PBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3载体进行单酶切，经同源重组酶连接，得到PBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3(T514A)重组载体，对PBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3(T514A)重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3(T514A)重组载体为将pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3载体的PmlI酶切位点间的GsSIE3片段替换为GsSIE3(T514A)基因，且保持pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3载体的其他序列不变。得到的载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3(T514A)重组载体表达GsSnRK1和GsSIE3(T514A)蛋白。
3、pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3表达载体的构建
1)GsSnRK1和GsSIE3基因的获取
分别采用BiFC-GsSnRK1-SmaIF和BiFC-GsSnRK1-SmaIR引物、BiFC-GsSIE3-PmlIF和GsSIE3-PmlIR引物及PrimeSTARMax DNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒，按照上述方法获得GsSnRK1和GsSIE3PCR产物。
2)pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3表达载体的构建
用限制性内切酶PmlI对上述PBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3载体进行单酶切，经同源重组酶连接，得到PBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3(T514A)重组载体，对PBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3重组载体为将pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3载体的PmlI酶切位点间的GsSIE3片段替换为GsSIE3基因，且保持pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3载体的其他序列不变。得到的载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3重组载体表达GsSnRK1和GsSIE3蛋白。
2、转基因大豆毛状根的获得
将大豆Williams82种子播于土壤中(土：蛭石＝1:1)约1-2cm深。置于恒温气候箱中，白天28℃/晚上20℃，每日浇水，取6d龄子叶尚未展开的幼苗用于K599侵染。用注射器将分别含有重组载体pPBEL-BiFC-GsSnRK1、PBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3、PBEL-BiFC-GsSIE3、PBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3(T514A)、pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3的K599发根农杆菌菌液及不含任何载体的K599发根农杆菌菌液注射到大豆子叶节中，侵染后覆膜。待长出毛状根后，将侵染位点及以下部分用蛭石埋住，使其保持湿润，28℃，14h光照/10h黑暗，白天28℃/晚上20℃，培养30d，保持潮湿环境。等到长出毛状根30d后，当毛状根长至约10cm时，将主根减去，将复合体植株埋入混合土中(营养土：蛭石＝1:1)，每3d浇一次水。等到长出毛状根45d后，用于鉴定及后续表型分析。
3、转基因大豆毛状根的鉴定
1)pPBEL-BiFC-GsSnRK1、PBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3、PBEL-BiFC-GsSIE3、PBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3(T514A)、pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3转基因大豆毛状根的鉴定
利用PCR的方法取长度为5mm大豆毛状根,放入离心管内并加入35μl LysisBufferA，95℃加热10min，静置后取上清液1μl作为PCR反应体系的模板。分别采用BiFC-FW(SEQ ID NO.25)和BIFC-RW(SEQ ID NO.26)引物及PrimeSTARMax DNAPolymerase(TaKaRa)试剂盒进行PCR扩增，通过PCR对pPBEL-BiFC-GsSnRK1、PBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3、PBEL-BiFC-GsSIE3、PBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3(T514A)、pBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3载体携带的特异性基因片段进行检测，得到PCR扩增产物。克隆出特异性片段，表明相关目的基因已经在转基因大豆毛状根中表达。
二、在转基因大豆毛状根中GsSnRK1磷酸化GsSIE3的分析
1、转基因大豆毛状根GsSnRK1体内磷酸化GsSIE3分析
利用含有上述相应质粒pPBEL-BiFC、pPBEL-BiFC-GsSnRK1、pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3、pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3、pPBEL-BiFC-GsSnRK1-GsSIE3(T514A)、pPBEL-BiFC-GsSnRK1(K49M)-GsSIE3(T514A)的发根农杆菌K599对Williams82大豆进行发根，长出毛状根30d后，减去主根，通过上述PCR方法对毛状根分别进行基因型鉴定，以确认目的基因整合到植物染色体中。等到长出毛状根45d后，将转基因嵌合体大豆植株经200mMNaCl处理2h后提取毛状根总蛋白。使用anti-Myc和anti-HA抗体分别来确认Myc-GsSnRK1和HA-GsSIE3在总蛋白中的表达。
结果如图11所示，Myc-GsSnRK1及其突变体和HA-GsSIE3及其突变体在相应毛状根中均有表达。将转基因大豆复合植物用200mM NaCl或50mM NaHCO3处理，并从转基因毛状根中提取蛋白质(+MG132)。已知GsSnRK1的活性通常是通过磷酸化激活的。为了确定盐胁迫是否激活了GsSnRK1，使用AMPKα(Thr172)抗体确定了大豆中GsSnRK1的磷酸化水平。Western印迹表明，GsSnRK1在200mM NaCl处理之前可以被磷酸化，在200mM NaCl处理后磷酸化程度增强了。同时，为了验证GsSnRK1在被激活后能否使下游泛素连接酶磷酸化，使用了PKD抗体来检测GsSIE3的磷酸化水平。通过200mMNaCl处理可以增强GsSnRK1的活性，从而导致磷酸化GsSIE3水平的升高，但不能磷酸化GsSIE3(T514A)，而GsSnRK1(K49M)也不能磷酸化GsSIE3。这些结果和体外磷酸化是一致的。这些结果表明，GsSnRK1可能充当磷酸GsSIE3的上游激酶，这对于大豆的耐盐性是必需的。
三、转基因大豆植株在盐碱胁迫下的表型及生理指标分析
1、转基因大豆植株的表型分析
分别将其置于霍格兰营养液或含有200mM NaCl的霍格兰营养液中培养10d后，对表型及相关生理数据进行分析。通过对根长、鲜重、干重、叶绿素含量、台盼蓝染色、NBT染色、DAB染色等生理指标进行统计，所有实验技术重复和生物学重复各3次。
如图11所示，正常情况下，各组植株的生长状态相似，而在盐处理后，过表达空载植株、共表达GsSnRK1(K49M)/GsSIE3(wt)、共表达GsSnRK1(wt)/GsSIE3(T514A)及共表达GsSnRK1(K49M)/GsSIE3(T514A)转基因嵌合体大豆植株生长出现停滞，表现出严重的叶片变黄和枯萎。生长状态最好的为共表达GsSnRK1(wt)/GsSIE3(wt)的转基因嵌合体大豆植株，单独过表达GsSnRK1及GsSIE3的转基因嵌合体大豆植株其生长状态介于两者之间。
如图12所示，在200mM NaCl处理下，GsSnRK1/GsSIE3具有更健康的叶片，表现出最高的耐盐性和最高的根长和生物量，而含有GsSnRK1(K49M)/GsSIE3或GsSnRK/GsSIE3(T514A)的突变体生长缓慢，叶片出现了严重的萎蔫，表现出了较低的植物抗性，这表明GsSnRK1可能对GsSIE3起上游激酶调控作用，感受到胁迫信号，继而磷酸化GsSIE3，从而对胁迫作出反应。如图13所示，与200mM NaCl处理相比，50mM NaHCO3处理使植物所表现出的表型、生物量的增加以及根长的增加都显著降低。值得注意的是，GsSIE3也表现出了一定的抗性，这表明GsSIE3赋予植物对大豆中盐胁迫的耐受性。总体而言，GsSnRK1的激酶活性对于GsSIE3发挥功能是必不可少的，GsSnRK1负调控GsSIE3蛋白质的稳定性，从而提高了植物对盐碱胁迫的抗性。叶绿素可以进行光合作用吸收光能，其含量的大小影响光合作用的强弱，一些不良的环境条件都会影响叶绿素的合成。如图14所示，在胁迫处理前，各组叶绿素含量基本一致。在用200mM NaCl和50mM NaHCO3处理后，复合体根部受到伤害，导致复合体叶片叶绿素含量降低，其中，GsSnRK1(K49M)/GsSIE3和GsSnRK1/GsSIE3(T514A)突变体叶绿素含量下降最快，而GsSnRK1/GsSIE3叶绿素下降的最少，从而可以看出，GsSnRK1/GsSIE3更耐盐，而GsSnRK1(K49M)/GsSIE3和GsSnRK1/GsSIE3(T514A)突变体对胁迫更敏感。丙二醛(MDA)是由于机体在衰老或在胁迫下受到损伤，其组织或器官膜脂过氧化作用而产生的，它的含量与机体衰老及胁迫伤害有密切关系，过氧化物含量越高，MDA含量越高，植物受到伤害越大。在胁迫处理前，各组MDA含量基本一致。在用200mM NaCl和50mM NaHCO3处理后，GsSnRK1(K49M)/GsSIE3和GsSnRK1/GsSIE3(T514A)突变体MDA含量最高，而GsSnRK1/GsSIE3MDA含量最低，这说明GsSnRK1/GsSIE3比GsSnRK1(K49M)/GsSIE3和GsSnRK1/GsSIE3(T514A)突变体更耐盐。脯氨酸(Pro)也在一定程度上反应了一定的抗逆性，Pro含量越高，植物抗性越强。如图14所示，在胁迫处理前，各组Pro含量基本一致。在用200mM NaCl和50mM NaHCO3处理后，GsSnRK1/GsSIE3 Pro含量最高，而GsSnRK1(K49M)/GsSIE3和GsSnRK1/GsSIE3(T514A)突变体Pro含量最低，这同样说明共表达复合体比突变体更耐盐。
在盐胁迫下，为了维持内部环境，细胞将活跃而有序地死亡，并产生H2O2和O2 -来调节各种生理和生化过程。如图15和图16所示，经过200mM NaCl处理后，台盼蓝、DAB和NBT染色表明GsSIE3和GsSnRK1与空载体相比，叶片部分死亡且被O2 -氧化，产生少量H2O2，但GsSnRK1(K49M)/GsSIE3和GsSnRK1/GsSIE3(T514A)突变体的大部分叶片死亡并被O2-氧化而产生大量H2O2。50mMNaHCO3处理产生了类似现象，这表明转基因的毛状根可能对地上部分有影响。通常，GsSIE3(T514A)可以抑制内源性GsSIE3的正常功能，并且GsSIE3中Thr514的磷酸化状态对该蛋白响应NaCl和NaHCO3胁迫的功能至关重要。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种植物抗盐碱蛋白GsSIE3，其特征在于，所述植物抗盐碱蛋白GsSIE3的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述植物抗盐碱蛋白GsSIE3的编码序列，其特征在于，所述编码序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种与权利要求2所述编码序列相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为以下材料中的任意一种：
A1)含有所述编码序列的表达盒；
A2)含有所述编码序列的重组载体；
A3)含有所述编码序列的重组微生物。
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料为以下材料中的任意一种：
A4)含有A1)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述表达盒的重组微生物；
A6)含有A2)所述重组载体的重组微生物。
5.权利要求1所述植物抗盐碱蛋白GsSIE3，权利要求2所述编码序列或权利要求3或4任意一项所述生物材料在提高大豆耐盐性中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是在植物中过表达蛋白GsSIE3或共表达蛋白GsSIE3和GsSnRK1蛋白。
7.权利要求1所述植物抗盐碱蛋白GsSIE3，权利要求2所述编码序列或权利要求3或4任意一项所述生物材料在提高大豆耐碱性中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是在植物中过表达蛋白GsSIE3或共表达蛋白GsSIE3和GsSnRK1蛋白。
9.一种培育具有耐盐性的转基因大豆毛状根的方法，其特征在于，所述方法是将蛋白GsSIE3的编码基因导入大豆毛状根，或将蛋白GsSIE3的编码基因和GsSnRK1蛋白的编码基因导入大豆毛状根；所述蛋白GsSIE3编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
10.一种培育具有耐碱性的转基因大豆毛状根的方法，其特征在于，所述方法是将蛋白GsSIE3的编码基因导入大豆毛状根，或将蛋白GsSIE3的编码基因和GsSnRK1蛋白的编码基因导入大豆毛状根；所述蛋白GsSIE3编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117778413A (zh) * 2023-12-28 2024-03-29 东北农业大学 一种提高大豆生物及非生物胁迫能力的glmfr1基因及其应用
CN118667832A (zh) * 2024-06-04 2024-09-20 南京农业大学 一种大豆耐盐相关基因GmRLP15及其编码蛋白质和应用

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