CN116568324A

CN116568324A - 融合蛋白和疫苗

Info

Publication number: CN116568324A
Application number: CN202180070737.9A
Authority: CN
Inventors: 吉冈靖雄
Original assignee: General Consortium Legal Person Osaka Macromicrobial Disease Research Association
Current assignee: General Consortium Legal Person Osaka Macromicrobial Disease Research Association
Priority date: 2020-10-19
Filing date: 2021-10-18
Publication date: 2023-08-08
Also published as: EP4230657A1; AU2021363921A1; WO2022085648A1; AU2021363921A9; JPWO2022085648A1; US20240091341A1; EP4230657A4; KR20230091094A

Abstract

本发明提供一种以SARS‑CoV‑2的受体结合域为目标，作为SARS‑CoV‑2疫苗抗原有用的新成分。包含SARS‑CoV‑2的受体结合域和血凝素的融合蛋白、以及包含该融合蛋白的疫苗。

Description

融合蛋白和疫苗

技术领域

本发明涉及一种针对由SARS-CoV-2等引起的感染症的作为疫苗抗原有用的融合蛋白以及使用其的疫苗。

背景技术

针对SARS-CoV-2的疫苗开发在全世界快速推进。迄至2020年10月批准的疫苗仅是由俄罗斯批准的卫星-V(Sputnik V)(非专利文献1)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：THE LANCET，VOLUME 396，ISSUE 10255，P887-897，SEPTEMBER 26，2020

发明内容

发明所要解决的技术问题

卫星-V仍然是实施临床试验的阶段，对安全性、有效性质疑声也提高。此外，即使假设开始接种疫苗，也依然存在效果小、或发现严重副作用的风险，不清楚是否成为抑制感染症流行的决定性手段。因此，对于针对SARS-CoV-2病毒的疫苗，期望进一步的选择项。

在针对SARS-CoV-2病毒的疫苗的开发中，认为将刺突蛋白中在感染中承担特别重要的作用的受体结合域(RBD)作为目标是有效的，但由于RBD无法单独地发挥抗体效价诱导特性，因此在进行疫苗化的情况下，伴随着需要佐剂的制剂上的限制。

因此，本发明的目的在于提供一种作为针对由SARS-CoV-2等引起的感染症的疫苗抗原有用的新成分。

用于解决技术问题的手段

本发明人进行了深入研究，结果发现，在SARS-CoV-2的受体结合域融合了人已经具有抗体的抗原，具体而言，融合了血凝素和/或神经氨酸酶(neuraminidase)的融合蛋白能够单独地发挥抗体效价诱导特性。即，发现通过使疫苗接种对象在体内具有抗体的抗原与病毒和/或细菌的抗原融合，能够发挥抗体效价诱导特性。本发明是基于该见解并进一步重复进行研究从而完成的发明。

即，本发明提供以下所示的方式的发明。

项1.一种融合蛋白，其包含SARS-CoV-2的受体结合域、以及血凝素和/或神经氨酸酶。

项2.根据项1所述的融合蛋白，其中，所述血凝素为H1型、H3型、H5型和/或H7型。

项3.根据项1或2所述的融合蛋白，其作为SARS-CoV-2的疫苗抗原使用。

项4.一种融合蛋白，其作为疫苗抗原使用，所述融合蛋白包含病毒和/或细菌的抗原、以及疫苗对象在体内具有抗体的抗原。

项5.一种疫苗，其包含项1～4中任一项所述的融合蛋白。

项6.根据项5所述的疫苗，其中，所述疫苗不包含佐剂。

项7.根据项5或6所述的疫苗，其给药于具有针对流感病毒的抗体的对象。

项8.根据项5～7中任一项所述的疫苗，其中，所述疫苗为注射给药。

项9.根据项5～7中任一项所述的疫苗，其中，所述疫苗为经鼻给药。

发明效果

根据本发明，提供一种作为SARS-CoV-2感染预防和/或发病预防对象的疫苗抗原有用的新成分以及使用其的疫苗。

附图说明

图1表示基于试验例1(皮下给药)的血浆中RBD特异性IgG的诱导结果。

图2A表示基于试验例2(经鼻给药)的血浆中RBD特异性IgG的诱导结果。

图2B表示基于试验例2(经鼻给药)的鼻腔清洗液中RBD特异性IgA的诱导结果。

图3表示基于试验例3(皮下给药)的血浆中RBD特异性IgG的诱导结果。

图4表示基于试验例4(皮下给药)的血浆中RBD特异性IgG的诱导结果。

图5表示评价基于试验例5(皮下给药)的血浆中的中和活性的结果。

图6表示基于试验例6(皮下给药)的小鼠的体重变动。

图7表示基于试验例7(皮下给药)的血浆中RBD特异性IgG的诱导结果。

图8表示基于试验例8(皮下给药)的血浆中RBD特异性IgG的诱导结果。

图9表示基于试验例9(经鼻给药)的血浆中RBD特异性IgG的诱导结果。

图10表示基于图9的血浆的中和活性。

图11表示基于试验例11(经鼻给药)的鼻腔清洗液中RBD特异性IgA的诱导结果。

图12表示基于试验例12(经鼻给药)的鼻腔清洗液中的SARS-CoV-2。

图13表示基于试验例13(经鼻给药)的鼻腔清洗液中RBD特异性IgA的诱导结果。

具体实施方式

1.融合蛋白

本发明的融合蛋白的特征在于，包含病毒和/或细菌的抗原以及作为疫苗接种对象者的人在体内具有的抗体。在本发明的融合蛋白的特别优选的方式中，其特征在于，包含SARS-CoV-2的受体结合域以及血凝素和/或神经氨酸酶。

作为构成本发明的融合蛋白的成为感染预防对象的病毒和/或细菌的抗原，可举出：冠状病毒的受体结合域(RBD)蛋白；源自肺炎球菌的PspA；源自RS病毒的F蛋白、G蛋白，源自HIV的env蛋白等，优选举出冠状病毒的受体结合域(RBD)蛋白。

在此，冠状病毒在形态学上是直径约为100～200nm的球形，在表面具有突起。在病毒学上，冠状病毒被分类为套式病毒目·冠状病毒亚科·冠状病毒科。在脂质双层膜的包膜中，存在卷绕于核衣壳蛋白(也称为核衣壳)的正链的单链RNA的基因组，在包膜的表面配置有刺突蛋白(spike protein)(以下也称为“刺突”)、包膜蛋白(以下也称为“包膜”)、膜蛋白。病毒基因组的大小在RNA病毒中为最长的约30kb。

冠状病毒根据遗传学特征分类为α、β、γ、δ的组。作为感染人的冠状病毒，已知有作为感冒的致病病毒的人冠状病毒229E、OC43、NL63、HKU-1这4种，以及引起重症肺炎的在2002年发生的重症急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒和2012年发生的中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒。在α冠状病毒属中分类为人冠状病毒229E和NL63，在β冠状病毒属中分类为人冠状病毒OC43、HKU-1、SARS冠状病毒和MERS冠状病毒。在本发明中，作为冠状病毒，优选举出属于β冠状病毒属的冠状病毒，更优选举出SARS冠状病毒。

SARS-CoV-2从初期的毒株反复进行突变，发现在英国检出的毒株、在南非检出的毒株、在印度检出的毒株等突变株。还可以考虑尚未检测出的突变株、今后新发生突变株的可能性。因此，在本发明中，SARS冠状病毒并不限定于上述SARS-CoV-2的毒株，也包含除此以外的今后新检测出的其他SARS-CoV-2突变株。

SARS-CoV-2的受体结合域(RBD)是SARS-CoV-2的刺突蛋白中在感染中承担着特别重要的作用的区域。

作为构成本发明的优选的融合蛋白的SARS-CoV-2的RBD，可举出以下的(1-1)～(1-3)。

(1-1)由序列号1的319～541位的氨基酸序列构成的多肽、

(1-2)在序列号1的319～541位的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸残基被替换、添加、插入和/或缺失而成的、与血管紧张素转化酶2(ACE2)形成复合体的多肽、以及

(1-3)与序列号1的319～541位的氨基酸序列的序列一致性为80％以上，与血管紧张素转化酶2(ACE2)形成复合体的多肽。

在上述(1-1)的多肽中，序列号1是作为NC_045512收录于NCBI的SARS-CoV-2(以下，也记载为“特定的SARS-Cov-2”)的刺突蛋白(YP_009724390.1)的氨基酸序列，其319～541位的氨基酸序列相当于RBD。

在上述(1-1)～(1-3)的多肽中，不仅包含人为替换而得到的多肽，还包含原本具有这样的氨基酸序列的多肽。

上述(1-2)和(1-3)的多肽只要具有与上述(1-1)的多肽相同的与ACE2的复合体形成能力，就允许与(1-1)的多肽相比氨基酸序列存在差异，也称为上述(1-1)的多肽的差异体。

上述(1-2)的多肽中的氨基酸的差异可以仅包含从替换、添加、插入和缺失中的1种差异(例如替换)，也可以包含2种以上的差异(例如，替换和插入)。所述(1-2)的多肽中，氨基酸的差异的数量只要为1个或数个即可，例如可举出1～15个、优选为1～10个、更优选为1～8个、进一步优选为1～7个或1～6个、更加优选为1～5个或1～4个、更进一步优选为1～3个、特别优选为1或2个、最优选为1个。

此外，上述(1-3)的多肽的氨基酸序列与上述(1-1)所示的氨基酸序列的序列一致性只要为80％以上即可，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上，更加优选为96％以上，更进一步优选为97％以上，特别优选为98％以上，最优选为99％以上。

另外，在上述(1-3)的多肽中，“序列一致性”表示基于BLASTPACKAGE[sgi32 bitedition，Version 2.0.12；可由National Center for Biotechnology Information(NCBI，美国国家生物技术信息中心)获得]的bl2seq program(Tatiana A.Tatsusova，Thomas L.Madden，FEMS Microbiol.Lett.，Vol.174，p247-250，1999)得到的氨基酸序列的一致性的值。参数设定为Gap insertion Cost value：11、Gap extension Cost value：1即可。

另外，认为在上述(1-2)和(1-3)的多肽中，序列号1所示的氨基酸序列中的第487位(天冬酰胺)、第493位(谷氨酰胺)、第498位(谷氨酰胺)和第505位(酪氨酸)有助于与ACE2受体的主要的热点氨基酸残基的相互作用，因此优选在这些部位不导入替换或缺失。

在对上述(1-2)和(1-3)的多肽导入氨基酸替换的情况下，作为氨基酸替换的方式，可举出保守性替换。即，在(1-2)和(1-3)的多肽中，作为对序列号1所示的氨基酸序列导入的氨基酸替换，例如可举出：如果替换前的氨基酸为非极性氨基酸，则替换为其他的非极性氨基酸；如果替换前的氨基酸为非带电性氨基酸，则替换为其他的非带电性氨基酸；如果替换前的氨基酸为酸性氨基酸，则替换为其他的酸性氨基酸；以及如果替换前的氨基酸为碱性氨基酸，则替换为其他的碱性氨基酸。

构成本发明的融合蛋白的疫苗接种对象在体内具有抗体的抗原通过与上述的成为感染预防和/或发病预防的对象的病毒和/或细菌的抗原融合，能够使本发明的融合蛋白具备或提高诱导针对成为感染预防和/或发病预防的对象的病毒和/或细菌的抗原的特异性抗体的特性。

作为疫苗接种对象在体内具有抗体的抗原，只要是通过过去的感染或疫苗接种而使该对象在体内保有的抗体的抗原即可。作为这样的抗原，只要是针对与应该预防该感染和/或发病的病毒和/或细菌不同的病毒和/或细菌的抗原即可，例如可举出CRM197(特别是在本发明的融合蛋白用于经皮给药型疫苗的疫苗抗原的情况)、在上呼吸道保有的IgA(特别是在本发明的融合蛋白用于经鼻给药型疫苗的疫苗抗原的情况)等。作为这样的抗原的优选例，可举出血凝素和神经氨酸酶。

构成本发明的优选的融合蛋白的血凝素和神经氨酸酶分别与上述的RBD融合，由此能够使本发明的融合蛋白具备或提高诱导针对SARS-CoV-2的RBD的特异性抗体的特性(以下，也记载为“RBD特异性抗体效价诱导特性”)。作为本发明的融合蛋白所使用的血凝素和/或神经氨酸酶，没有特别限定，可以从作为存在于病毒表面的糖蛋白已知的物质中选择1种或多种。从使本发明的融合蛋白具备更进一步提高的RBD特异性抗体诱导特性的观点出发，可举出优选为血凝素，更优选为源自流感病毒，进一步优选为源自甲型流感病毒的血凝素(H1型血凝素～H16型血凝素)，进一步优选可举出H1型、H3型、H5型或H7型血凝素，最优选可举出H1型血凝素。关于这些血凝素和神经氨酸酶的氨基酸序列，可以从官方数据库获得。

作为本发明的融合蛋白中使用的优选的血凝素的氨基酸序列，可举出以下的(2-1)～(2-3)。

(2-1)由序列号2的18～523位的氨基酸序列构成的多肽、

(2-2)在序列号2的18～523位的氨基酸序列中，1个或数个氨基酸残基被替换、添加、插入和/或缺失而成的、提高RBD特异性抗体效价诱导特性的多肽、和

(2-3)与序列号2的18～523位的氨基酸序列的序列一致性为80％以上，提高RBD特异性抗体效价诱导特性的多肽。

在上述(2-1)的多肽中，序列号2是在作为ACV82259.1收录于NCBI的、甲型H1N1流感(A/California/04/2009)的H1亚基的氨基酸序列，将除了其N末端部分的前导序列和C末端部分的胞外域以外的18～523位作为(2-1)的多肽的氨基酸序列使用。

在上述(2-1)～(2-3)的多肽中，不仅包含人为替换而得到的多肽，还包含原本具有这样的氨基酸序列的多肽。

上述(2-2)和(2-3)的多肽只要提高RBD特异性抗体效价诱导特性，就允许与(2-1)的多肽相比氨基酸序列存在差异，也称为上述(2-1)的多肽的差异体。“提高RBD特异性抗体效价诱导特性”是指，使上述的与RBD形成融合蛋白时的RBD特异性抗体效价高于该RBD单独时的RBD特异性抗体效价。作为“提高RBD特异性抗体效价诱导特性”的优选方式，可举出使上述的与RBD形成融合蛋白时的RBD特异性抗体效价为与上述(2-1)的多肽同等以上，更优选如果使上述(2-1)的多肽与RBD融合时诱导的RBD特异性抗体效价为100％，则为80％以上、进一步优选为90％以上、更加优选为95％以上、更进一步优选为100％以上。

上述(2-2)的多肽中的氨基酸的差异可以从替换、添加、插入和缺失中仅包含1种差异(例如替换)，也可以包含2种以上的差异(例如，替换和插入)。在所述(2-2)多肽中，氨基酸的差异的数量只要为1个或数个即可，例如可举出1～15个、优选为1～10个、更优选为1～8个、进一步优选为1～7个或1～6个、更加优选为1～5个或1～4个、更进一步优选为1～3个、特别优选为1或2个、最优选为1个。

另外，关于上述(2-3)中的序列一致性，与上述(1-3)中的序列一致性相同。

作为在上述(2-2)和(2-3)的多肽中导入氨基酸替换时的氨基酸替换的方式，也与在上述(1-2)和(1-3)的多肽中的氨基酸替换的方式相同。

本发明的融合蛋白除了上述的成为感染预防对象的病毒和/或细菌的抗原(优选上述RBD)以及上述的疫苗接种对象在体内具有抗体的抗原(优选血凝素和/或神经氨酸酶)以外，还可以具有其他结构。作为其他的结构，例如可举出结合上述的成为感染预防对象的病毒和/或细菌的抗原(上述RBD)和上述的疫苗接种对象在体内具有抗体的抗原(优选为血凝素或神经氨酸酶，特别优选为血凝素)的连接肽。作为连接肽的例子，可举出由以下的氨基酸序列构成的连接肽，优选举出如连接例1和连接例2那样的GS连接，更优选列举出连接例1，进一步优选举出连接例1的n＝1、m＝1的连接肽。

连接例1：[(G)nS]m n＝1～5、m＝1～5

连接例2：[(G)nS]mGG n＝1～5、m＝1～5

连接例3：(G)n n＝5～10

连接例4：(EAAAK)n n＝1～4

连接例5：(PA)n n＝2～34

如上所述，本发明的融合肽能够具备或提高针对成为感染预防对象的病毒和/或细菌的抗原诱导特异性抗体的特性，因此能够作为针对成为该感染预防对象的病毒和/或细菌的疫苗抗原使用。特别是，在本发明的融合蛋白是包含SARS-CoV-2的RBD和血凝素和/或神经氨酸酶的融合蛋白的情况下，能够具备或提高RBD特异性抗体效价诱导特性，因此可以作为SARS-CoV-2的疫苗抗原使用。

2.融合蛋白的制备方法

上述“1.融合蛋白”中所述的融合蛋白的制备方法包括：工序1，将编码成为感染预防和/或发病预防对象的病毒和/或细菌的抗原的DNA与编码疫苗接种对象在体内具有抗体的抗原的DNA导入宿主细胞，得到转化体；工序2，培养上述转化体；以及工序3，从培养的上述转化体中回收包含上述受体结合域与上述血凝素和/或神经氨酸酶的产物。

上述的融合蛋白的制备方法的优选方式包括：工序1，将编码SARS-CoV-2的受体结合域的DNA与编码血凝素和/或神经氨酸酶的DNA导入宿主细胞，得到转化体；工序2，培养上述转化体；以及工序3，从培养的上述转化体中回收包含上述受体结合域与上述血凝素和/或神经氨酸酶的产物。

在工序1中，编码成为感染预防对象的病毒和/或细菌的抗原的DNA、和编码疫苗接种对象在体内具有抗体的抗原的DNA(优选编码SARS-CoV-2的受体结合域(RBD)的DNA与编码血凝素和/或神经氨酸酶的DNA)可以通过以适当的方式插入表达载体，将得到的重组载体引入宿主细胞中而导入。优选可以制作包含编码RBD的DNA与编码血凝素和/或神经氨酸酶的DNA(优选包含编码RBD的DNA、编码连接肽的DNA以及编码血凝素和/或神经氨酸酶的DNA)的重组载体，导入宿主细胞。

在上述DNA的设计和合成的方法中，可以从公知的数据库(Gen Bank等)中取得目标的多肽，具体而言成为感染预防对象的病毒和/或细菌的抗原、和疫苗接种对象在体内具有抗体的抗原的各个基因的碱基序列信息(优选为编码RBD以及血凝素和/或神经氨酸酶的各个基因的碱基序列信息)，使用公知的方法克隆目标基因，进行碱基序列分析，由此取得碱基序列信息，基于所得到的碱基序列信息，从具有目标的成为感染预防对象的病毒和/或细菌的抗原、以及疫苗接种对象在体内具有抗体的抗原的各个微生物(优选具有RBD以及血凝素和/或神经氨酸酶的各个微生物)中提取核酸，使用PCR等公知的手段取得基因，制作将各个基因人工连接而成的融合基因(hybrid gene)。

另外，在目标的多肽具有突变的情况下，对编码多肽的基因导入突变。在碱基序列的特定部位导入特定的突变的方法是公知的，例如可以利用DNA的位点特异性突变导入法和位点特异性突变诱发法等(具体而言，Kunkel法、Gapped duplex法、大引物PCR(Megaprimer PCR)法等)。

上述DNA优选将密码子使用频率在宿主内进行了优化的DNA，更优选使密码子使用频率在哺乳类细胞内优化的DNA。作为表示密码子使用频率的指标，只要采用各密码子的宿主最优密码子使用频率的总计即可。最优密码子定义为与相同的氨基酸对应的密码子中使用频度最高的密码子。

重组载体可以通过将上述DNA利用限制性内切酶切断和连接等插入到适当的表达载体中来获得。作为表达载体，没有特别限定，优选由能够在宿主内自主增殖的噬菌体、质粒、或者病毒构建为基因重组用的载体。

重组载体中包含与上述DNA可工作地连接的启动子等控制因子。作为控制因子，代表性地可举出启动子，根据需要还可以包含增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI部位等转录要素。另外，可工作地连接是指调节上述DNA的启动子、增强子等各种控制因子和上述DNA以在宿主细胞中可工作的状态连接。

作为宿主，只要是重组载体稳定且能够自主增殖、能够表达外源基因的性状的宿主，就没有特别限制，例如，可举出属于大肠杆菌(Escherichia coli)等的埃希氏菌属、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等的芽孢杆菌属、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等的假单胞菌属等的细菌；酵母等作为优选的例子，另外，也可以是293细胞、293T细胞、Expi293F细胞、CHO细胞等动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等。其中，特别优选大肠杆菌。

为了得到转化体而向宿主细胞导入重组载体的条件根据宿主细胞的种类等适当设定即可。如果是在宿主细胞为细菌的情况下，例如可举出使用通过钙离子处理得到的感受态细胞的方法和电穿孔法等。如果是在宿主细胞为酵母的情况下，例如可举出电穿孔法(electroporation method)、原生质球法(spheroplast method)和醋酸锂法等。如果是在宿主细胞为动物细胞的情况下，例如可举出电穿孔法、磷酸钙法和脂质体转染法等。在宿主细胞为昆虫细胞的情况下，例如可举出磷酸钙法、脂质体转染法(lipofection method)和电穿孔法等。如果是在宿主细胞为植物细胞的情况下，例如可举出电穿孔法、农杆菌法(agrobacterium method)、基因枪法(particle gun method)、及PEG法等。

上述重组载体是否被导入到宿主细胞中的确认可以通过PCR法、Southern杂交法、以及Northern杂交法等公知的方法来进行。

在工序2中，通过培养转化体，能够生成作为产物的含有成为感染预防和/或发病预防的对象的病毒和/或细菌的抗原、以及疫苗接种对象在体内具有抗体的抗原的融合蛋白(优选含有RBD以及血凝素和/或神经氨酸酶的融合蛋白)。

转化体的培养条件只要考虑宿主的营养生理学性质适当设定即可，优选举出液体培养。另外，如果是在进行工业制造的情况下，则优选通气搅拌培养。作为培养基的营养源，可以使用转化体的生长发育所需的物质。培养温度可以在转化体能够生长发育且转化体生成融合蛋白的范围内适当设定。

在工序3中，回收上述产物。作为培养物，可以是培养上清液，也可以是培养细胞或培养菌体或它们的破碎物。在目标融合蛋白(产物)在宿主细胞中生成的情况下，可以通过将宿主细胞破碎来提取产物。另外，在目标融合蛋白(产物)在宿主细胞外生成的情况下，可以直接使用培养液，或通过离心分离等去除宿主细胞。之后，可以单独或适当组合使用在蛋白质的分离精制中使用的一般的生物化学方法，例如硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换色谱法、亲和色谱法等，进行分离和/或精制，由此回收产物。

3.疫苗

如上所述，本发明的融合蛋白能够具备或提高对成为感染预防和/或发病预防的对象的病毒和/或细菌的抗原诱导特异性抗体的特性(优选为SARS-CoV-2的RBD特异性抗体效价诱导特性)，作为成为感染预防和/或发病预防的对象的病毒和/或细菌(优选为SARS-CoV-2)的疫苗抗原是有用的，因此本发明还提供包含上述融合蛋白的疫苗。

本发明的疫苗中，除了作为成为感染预防和/或发病预防的对象的病毒和/或细菌(优选SARS-CoV-2)的疫苗抗原的上述融合蛋白之外，还可以根据目的和用途等包含缓冲剂、等渗剂、止痛剂、防腐剂、抗氧化剂等其他成分。

作为缓冲剂的例子，可举出磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等的缓冲液等。作为等渗剂的例子，可举出氯化钠、甘油、D-甘露糖醇等。作为止痛剂的例子，可举出苄醇等。作为防腐剂的例子，可举出硫柳汞、对羟基苯甲酸酯类、苯氧基乙醇、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸、抗生素、合成抗菌剂等。作为抗氧化剂的例子，可举出亚硫酸盐、抗坏血酸等。

除了上述成分之外，本发明的疫苗中还可以包含光吸收色素(核黄素、腺嘌呤、腺苷等)、稳定剂(螯合剂、还原剂等)、碳水化合物(山梨糖醇、乳糖、甘露糖醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖等)、酪蛋白消化物、各种维生素、矫臭剂、佐剂等。

应予说明，上述的本发明的融合蛋白可以具备或提高对成为感染预防和/或发病预防的对象的病毒和/或细菌诱导特异性抗体效价的特性(优选为SARS-CoV-2的RBD特异性抗体效价诱导特性)，因此即使不在疫苗中配合佐剂，也能够有效地诱导该特异性抗体效价诱导特性。因此，作为本发明的疫苗的优选方式，可举出不含佐剂的疫苗。

进而，在本发明的疫苗中，除了作为成为感染预防和/或发病预防的对象的病毒和/或细菌(优选SARS-CoV-2)的疫苗抗原的上述融合蛋白之外，还可以进一步配合针对引发另外的疾病的微生物的1种或多种疫苗抗原。

关于本发明的疫苗的剂型没有特别限定，可以根据给药方法和保存条件等适当决定。作为剂型的具体例，可举出液体制剂和固体制剂等，更具体而言，可举出片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、液剂、糖浆剂等经口给药剂；注射剂、喷雾剂等非经口给药剂。

作为本发明的疫苗的给药方法，没有特别限定，可举出肌肉、腹腔内、皮内和皮下等的注射给药、从鼻腔和口腔的吸入给药、以及经口给药等。如上所述，本发明的疫苗不需要佐剂，因此鉴于在经鼻给药疫苗中不存在临床中使用的佐剂，特别优选通过从鼻腔的吸入给药即经鼻给药进行给药。

作为本发明的疫苗的适用对象，只要是以作为针对病毒和/或细菌应该感染预防和/或发病预防的对象、且在体内具有针对与应该感染预防和/或发病预防的病毒和/或细菌不同的病毒和/或细菌的抗体的抗原为对象即可，优选可举出作为能够通过SARS-CoV-2病毒感染引起COVID-19症状的对象、并且具有针对流感病毒的抗体的对象。作为该流感病毒，可举出成为上述融合蛋白的构成要素的血凝素和/或神经氨酸酶的来源病毒。作为成为这样的适用对象的动物，例如可举出哺乳类，更具体而言，可举出：人；狗和猫等宠物；鼠、小鼠、仓鼠等实验动物等。特别是在人中，其多数具有流感疫苗接种经历和/或流感的感染经历，因此本发明的疫苗对于人的通用性高。

作为本发明的疫苗的用量，没有特别限定，可以根据有效成分的种类、给药方法、给药对象(年龄、体重、性别、有无基础疾病等的条件)适当决定。

本发明的疫苗能够以由成为感染预防对象的病毒和/或细菌引起的感染症(特别优选COVID-19)的发病的预防、以及伴随该感染症的症状/病情的预防和最小化、以及该症状/病情的治疗和减轻等为目的而使用，优选能够以上述预防和最小化为目而使用。

实施例

下面举出实施例详细说明本发明，但本发明不限于此。应予说明，在下面的试验例中使用的SARS-CoV-2的RBD的氨基酸序列为序列号1的319～541位的氨基酸序列，血凝素的氨基酸序列为序列号2的18～523位的氨基酸序列，连接肽的序列为上述连接例1的n＝1、m＝1的序列。

另外，在下面的试验例中，只要没有特别提及，则各符号和简称以下述含义使用。

[表1]

小鼠	6周龄雄性C57BL6小鼠
		Cal7	甲型H1N1流感病毒(株名：A/California/7/2009)
HA	源自A/California/7/2009的血凝素
		alum	氢氧化铝
RBD	源自SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合域的重组蛋白
		RBD-HA	上述RBD与上述HA的融合重组蛋白
RBD+HA	上述RBD的重组蛋白和上述HA的混合物
		RBD+alum	上述RBD的重组蛋白和氢氧化铝的混合物
RBD+c-di-GMP	上述RBD的重组蛋白和c-di-GMP的混合物
		RBD+CpG核酸	上述RBD的重组蛋白和CpG核酸的混合物
RBD+AddaVax	上述RBD的重组蛋白和AddaVax(InvivoGen公司)的混合物
		RBD+poly(I∶C)	上述RBD的重组蛋白和poly(I∶C)(双链RNA类似物)的混合物

alum、c-di-GMP、CpG核酸、AddaVax和poly(I∶C)用作佐剂。

试验例1

(1)实验动物、试剂等

·小鼠：6周龄雄性C57BL6小鼠

·病毒：甲型H1N1流感病毒(H1N1 influenza A virus)(株：A/California/7/2009(Cal7))

·抗原(比较用)：源自SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合域(RBD)的重组蛋白

·抗原：RBD和源自Cal7的血凝素(HA)的融合重组蛋白(RBD-HA)

·佐剂：氢氧化铝

(2)实验方法

使Cal7感染小鼠的上呼吸道，与成人相同，制作出具有针对流感病毒的抗体的情况。在感染30天和51天后，将RBD或RBD-HA进行皮下免疫。在感染58天后，回收血液，用ELISA评价血浆中的RBD特异性IgG。

(3)结果

将血浆中的RBD特异性IgG的测定结果示于图1。在感染Cal7后将RBD进行皮下免疫的情况下(RBD)，完全没有观察到抗体效价的产生。另一方面，在感染Cal7后将RBD-HA进行免疫的情况下(RBD-HA)，观察到RBD特异性抗体效价。应予说明，还确认即使对未感染Cal7的空白小鼠免疫RBD-HA，也不产生RBD特异性抗体效价。即，暗示了通过Cal7感染诱导的HA特异性免疫应答有助于RBD-HA的强力的免疫诱导。

试验例2

(1)实验动物、试剂等

·小鼠：6周龄雄性C57BL6小鼠

·病毒：甲型H1N1流感病毒(株：A/California/7/2009(Cal7))

·抗原：RBD和源自Cal7的血凝素(HA)的融合重组蛋白(RBD-HA)

·佐剂：c-di-GMP

(2)实验方法

使Cal7感染小鼠的上呼吸道。在感染30天和51天后，将RBD或RBD-HA进行经鼻免疫，或将RBD和c-di-GMP一同(RBD+c-di-GMP)进行经鼻免疫。在感染58天后，回收鼻腔清洗液和血液，用ELISA评价鼻腔清洗液中的RBD特异性IgA和血浆中的RBD特异性IgG。

(3)结果

将鼻腔清洗液中的RBD特异性IgA和血浆中的RBD特异性IgG的测定结果分别示于图2A和图2B。图中，“**”表示p＜0.01，“****”表示p＜0.0001。在感染Cal7后将RBD进行经鼻免疫的情况下(RBD)，完全没有观察到抗体效价的产生，另外，在并用作为佐剂的c-di-GMP的情况下(RBD+c-di-GMP)，也完全没有产生抗体效价。另一方面，在感染Cal7后将RBD-HA进行免疫的情况下(RBD-HA)，即使不使用佐剂，鼻腔清洗液中的RBD特异性IgA和血浆中的RBD特异性IgG也被强烈诱导。根据以上的结果，认为RBD-HA能够成为优异的疫苗抗原。

试验例3

将HA与alum一起每隔2周在小鼠皮下免疫2次(0天、14天)，制作HA免疫小鼠。在21天和第42天分别将RBD、RBD-HA进行皮下免疫。在第49天回收血液，用ELISA评价血浆中的RBD特异性IgG。

将结果示于图3。即使对未免疫HA的空白小鼠免疫RBD-HA，也没有产生RBD特异性抗体效价，因此暗示了抗HA抗体有助于RBD-HA的免疫诱导。

试验例4

将HA与alum一起每隔2周在小鼠皮下免疫2次(0天、14天)。在第21天，分别将RBD+CpG核酸、RBD+AddaVax、RBD-HA进行皮下免疫。在第49天回收血液，用ELISA评价血浆中的RBD特异性IgG。

将结果示于图4。在未使用佐剂的RBD-HA组中，与使用佐剂的RBD+CpG核酸组和RBD+AddaVax组相比，诱导了高强度的RBD特异性抗体。

试验例5

在试验例1的血浆样品中，使用表达了源自SARS-CoV-2的S蛋白的假病毒，评价对于SARS-CoV-2的中和活性。

将结果示于图5。可知RBD-HA组即使不加入佐剂，也能够诱导与加入佐剂的RBD+alum组同等的中和抗体。

试验例6

使Cal7感染小鼠的上呼吸道。在感染30天后，分别将RBD-HA、RBD+alum进行皮下免疫。感染65天后，使SARS-CoV-2从鼻腔感染下呼吸道(20μL)，评价体重变动。

将结果示于图6。未免疫的对照组(Cont)中观察到体重减少。在RBD+alum组和RBD-HA组中没有观察到体重减少。

试验例7

使Cal7感染小鼠的上呼吸道。在感染30天后，分别将RBD、RBD-HA、RBD+HA进行皮下免疫。在其14天后回收血液，用ELISA评价血浆中的RBD特异性IgG。

将结果示于图7。仅在RBD-HA组中观察到RBD特异性抗体效价。由此，暗示了仅混合RBD和HA时，即使存在抗HA抗体，也无法将RBD送达到树突状细胞。

试验例8

将卵清蛋白(OVA)或HA与氢氧化铝一同对小鼠进行2次免疫，从小鼠血清中精制IgG。将得到的精制IgG与RBD或RBD-HA混合，皮下给药至空白小鼠。在其14天后回收血液，用ELISA评价血浆中的RBD特异性IgG。

将结果示于图8。即使将从免疫了OVA的小鼠精制的IgG与RBD或RBD-HA一起对小鼠进行给药，也没有观察到RBD特异性抗体效价的上升。在将从免疫了HA的小鼠精制的IgG与RBD一起进行给药的情况下，也没有观察到RBD特异性抗体效价的上升。另一方面，在将从免疫了HA的小鼠精制的IgG与RBD-HA一起进行给药的情况下，观察到RBD特异性抗体效价的显著上升。如果考虑试验例7的结果，则示出在RBD-HA用于免疫诱导的情况下，由于通过HA免疫或流感病毒感染而诱导的抗HA抗体的存在而被免疫诱导。

试验例9

使Cal7感染小鼠的上呼吸道。在感染30天和51天后，分别经鼻免疫RBD、RBD-HA、RBD+c-di-GMP、RBD+CpG核酸、RBD+poly(I：C)(6μL)。在感染58天后，回收血液，用ELISA评价血浆中的RBD特异性IgG。

将结果示于图9。在RBD组中，未观察到抗体效价的产生。即使在并用佐剂的RBD+c-di-GMP组、RBD+CpG核酸组、RBD+poly(I：C)组中，血浆中RBD特异性IgG也未产生。另一方面，在RBD-HA组中，即使不使用佐剂，血浆中的RBD特异性IgG也被强烈诱导。由此，RBD-HA能够成为经鼻疫苗中的优异的抗原。

试验例10

在试验例9的血浆样品中，使用表达了源自SARS-CoV-2的S蛋白的假病毒来评价中和活性。

将结果示于图10。仅在RBD-HA组中观察到中和活性。

试验例11

使Cal7感染小鼠的上呼吸道。在感染30天和51天后，分别经鼻免疫RBD、RBD-HA、RBD+c-di-GMP、RBD+CpG核酸、RBD+poly(I：C)(6μL)。在感染65天后，回收鼻腔清洗液，用ELISA评价鼻腔清洗液RBD特异性IgA。

将结果示于图11。与试验例9和10的结果相同，仅在RBD-HA组中，在鼻腔清洗液中观察到RBD特异性IgA。

试验例12

使Cal7感染小鼠的上呼吸道。在感染30天和51天后，分别经鼻免疫RBD-HA、RBD+c-di-GMP(6μL)。在感染65天后，使SARS-CoV-2(5μL)从鼻腔感染上呼吸道，在其3天后，测定鼻腔清洗液中的SARS-CoV-2。

将结果示于图12。在仅感染了Cal7的对照组中，在鼻腔清洗液中观察到SARS-CoV-2。另一方面，在RBD+c-di-GMP组、RBD-HA组中没有观察到SARS-CoV-2。由此示出，RBD-HA即使不加入像c-di-GMP那样的佐剂，也能够在上呼吸道中预防SARS-CoV-2。

试验例13

使Cal7感染小鼠的上呼吸道。在感染30天和51天后，分别经鼻免疫RBD、RBD-HA、RBD+HA(6μL)。在感染65天后，回收鼻腔清洗液，用ELISA评价鼻腔清洗液RBD特异性IgA。

将结果示于图13。在RBD-HA组中发现的鼻腔清洗液中RBD特异性IgA在RBD+HA组中未被观察到。因此，认为仅混合RBD和HA时，即使存在抗HA抗体，也不能将RBD送达到树突状细胞。因此，示出了RBD和HA需要融合。

序列表

<110> 一般财团法人阪大微生物病研究会（BIKEN Co., Ltd.）

<120> 融合蛋白和疫苗

<130> 21071WO

<150> JP2020-175599

<151> 2020-10-19

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 527

<212> PRT

<213> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2型 (SARS-CoV-2)

<400> 1

Ala Glu Asn Val Thr Gly Leu Phe Lys Asp Cys Ser Lys Val Ile Thr

1 5 10 15

Gly Leu His Pro Thr Gln Ala Pro Thr His Leu Ser Val Asp Thr Lys

20 25 30

Phe Lys Thr Glu Gly Leu Cys Val Asp Ile Pro Gly Ile Pro Lys Asp

35 40 45

Met Thr Tyr Arg Arg Leu Ile Ser Met Met Gly Phe Lys Met Asn Tyr

50 55 60

Gln Val Asn Gly Tyr Pro Asn Met Phe Ile Thr Arg Glu Glu Ala Ile

65 70 75 80

Arg His Val Arg Ala Trp Ile Gly Phe Asp Val Glu Gly Cys His Ala

85 90 95

Thr Arg Glu Ala Val Gly Thr Asn Leu Pro Leu Gln Leu Gly Phe Ser

100 105 110

Thr Gly Val Asn Leu Val Ala Val Pro Thr Gly Tyr Val Asp Thr Pro

115 120 125

Asn Asn Thr Asp Phe Ser Arg Val Ser Ala Lys Pro Pro Pro Gly Asp

130 135 140

Gln Phe Lys His Leu Ile Pro Leu Met Tyr Lys Gly Leu Pro Trp Asn

145 150 155 160

Val Val Arg Ile Lys Ile Val Gln Met Leu Ser Asp Thr Leu Lys Asn

165 170 175

Leu Ser Asp Arg Val Val Phe Val Leu Trp Ala His Gly Phe Glu Leu

180 185 190

Thr Ser Met Lys Tyr Phe Val Lys Ile Gly Pro Glu Arg Thr Cys Cys

195 200 205

Leu Cys Asp Arg Arg Ala Thr Cys Phe Ser Thr Ala Ser Asp Thr Tyr

210 215 220

Ala Cys Trp His His Ser Ile Gly Phe Asp Tyr Val Tyr Asn Pro Phe

225 230 235 240

Met Ile Asp Val Gln Gln Trp Gly Phe Thr Gly Asn Leu Gln Ser Asn

245 250 255

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260 265 270

Asp Ala Ile Met Thr Arg Cys Leu Ala Val His Glu Cys Phe Val Lys

275 280 285

Arg Val Asp Trp Thr Ile Glu Tyr Pro Ile Ile Gly Asp Glu Leu Lys

290 295 300

Ile Asn Ala Ala Cys Arg Lys Val Gln His Met Val Val Lys Ala Ala

305 310 315 320

Leu Leu Ala Asp Lys Phe Pro Val Leu His Asp Ile Gly Asn Pro Lys

325 330 335

Ala Ile Lys Cys Val Pro Gln Ala Asp Val Glu Trp Lys Phe Tyr Asp

340 345 350

Ala Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Tyr Lys Ile Glu Glu Leu Phe Tyr

355 360 365

Ser Tyr Ala Thr His Ser Asp Lys Phe Thr Asp Gly Val Cys Leu Phe

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Trp Asn Cys Asn Val Asp Arg Tyr Pro Ala Asn Ser Ile Val Cys Arg

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405 410 415

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<210> 2

<211> 566

<212> PRT

<213> 甲型流感病毒

<400> 2

Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn

1 5 10 15

Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr

20 25 30

Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn

35 40 45

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50 55 60

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Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，包含SARS-CoV-2的受体结合域、以及血凝素和/或神经氨酸酶。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述血凝素为H1型、H3型、H5型和/或H7型。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白能够作为SARS-CoV-2的疫苗抗原使用。

4.一种融合蛋白，其能够作为疫苗抗原使用，

所述融合蛋白具有病毒和/或细菌的抗原、以及疫苗接种对象在体内具有抗体的抗原。

5.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求1～4中任一项所述的融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的疫苗，其中，所述疫苗不包含佐剂。

7.根据权利要求5或6所述的疫苗，其中，所述疫苗能够给药于具有针对流感病毒的抗体的对象。

8.根据权利要求5～7中任一项所述的疫苗，其中，所述疫苗能够注射给药。

9.根据权利要求5～7中任一项所述的疫苗，其中，所述疫苗能够经鼻给药。