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CN116539902A - 一种差异脂质分子作为脂质标志物的用途及试剂盒 - Google Patents

一种差异脂质分子作为脂质标志物的用途及试剂盒 Download PDF

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CN116539902A
CN116539902A CN202310819127.5A CN202310819127A CN116539902A CN 116539902 A CN116539902 A CN 116539902A CN 202310819127 A CN202310819127 A CN 202310819127A CN 116539902 A CN116539902 A CN 116539902A
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CN202310819127.5A
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郭野
杨筱
李小刚
旦曲
冀加美
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Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Original Assignee
Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
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Abstract

本发明为一种差异脂质分子作为脂质标志物的用途及试剂盒，涉及生物医学技术领域，所述差异脂质分子包括甘油三酯、磷脂酰乙醇胺，并且本发明提供的包含所述差异脂质分子的试剂盒为差异脂质分子作为发育性髋关节发育不良的脂质标志物的用途及其研究提供更多的选择和支持，且易操作，能快速批量检测，检测准确率高，具有广阔的产业推广价值。

Description

一种差异脂质分子作为脂质标志物的用途及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种差异脂质分子作为脂质标志物的用途及试剂盒。
背景技术
发育性髋关节发育不良(Developmental Dysplasia of the Hip, DDH)旧称先天性髋关节脱位(Congenital Dislocation of the Hip, CDH)。DDH治疗越早，治疗的方法越简单，也更容易获得正常或接近正常的髋关节。超声筛查是早期诊断的重要手段。应对0-6月小儿进行基本的体格检查，并对体格检查异常或存在高危因素者行超声检查，以期达到早期发现及治疗的目的。超声检查能重点评估髋关节形态、股骨头位置和髋关节稳定性，且能有效避免X线检查对于婴幼儿的不良影响。Graf检查法是最早采用髋关节冠状切面进行测量的超声检查方法，也是目前公认的最有效的筛查及诊断方法。通过规范的早期超声筛查发现异常并及时通过物理方法进行矫正，可有效的避免远期的髋关节置换术需求，降低远期致残率。
治疗基本原则对诊断为DDH的病例应早期治疗，包括：①获得中心复位；②维持稳定的复位；③促进髋关节正常生长和发育；④减少并发症。对0-6个月的DDH患儿，应用髋关节屈曲外展挽具或支具是治疗的主要方式。Pavlik挽具用于小于3个月的DDH患儿有很高的成功率，但用于年龄超过4个月或Graf Ⅳ型患儿成功率明显降低。DDH早期的治疗效果最佳，早期不及时干预，如未及时发现，将严重影响儿童生长发育，如错过最佳治疗时机，将发生髋关节疼痛，发展至成人期严重骨关节炎可致终身残疾，成为60岁以下髋关节置换最常见原因。
由于DDH具有早期症状隐匿轻微的临床特点，早期诊断一直是困扰临床的难题。对于DDH高脱位患者在其婴幼儿时期通超声筛查可以早期确诊，但超声筛查对于人员专业技术能力要求较高，存在误诊和漏诊比例，尤其是我国人口众多，地域疗阔，各地经济发展不平衡，仅个别地区实施了全面超声筛查，大部分地区采取选择性超声筛查。并结合超声筛查的结果去对患有DDH的患儿进行矫正或康复，如CN110464526A公开小儿发育性髋关节发育不良矫正装置；包括适于托起小儿左膝盖腕的第一倒V型腕托、适于托起小儿右膝盖腕的第二倒V型腕托及用以调节第一倒V型腕托与第二倒V型腕托之间间距以使撑开小儿左大腿与右大腿的伸缩式调节件；CN205459267U公开了一种发育性髋关节发育不良石膏固定架，包括底座，底座一侧端部中间位置固定有支架，支架杆体上部固定骶部托盘，底座沿宽度方向两侧对称设置若干底座螺孔，底座的两条长边分别滑动设置一个滑动卡扣，滑动架两端分别连接于相应的滑动卡扣上，每个滑动卡扣上均开设卡扣螺孔，通过卡扣螺孔与底座螺孔相配合实现滑动卡扣的固定，所述滑动架顶部固定胸部托盘，所述胸部托盘与底座相平行。以上这些矫正装置都是依赖于Graf法（髋关节超声检查）的结果，其中Graf法（髋关节超声检查）检查髋关节发育水平的简易装置一般按照以下步骤来进行，首先应当将婴儿固定于特殊的检查床，通过超声探头引导系统实施婴儿髋关节超声检查，来获取标准图像。Graf法取标准图像上三个标志点(髋臼底的髂骨支下缘、髋臼盂唇、髂骨中部的截面），获取三条线（基线、骨顶线、软骨顶线），测量骨顶角（α角）及软骨顶角（β角），再根据测量的α角与β角结合婴儿月龄进行分型诊断，而不准确或不标准的图像会导致错误的诊断结果，造成误诊或漏诊，甚至会导致使用的矫正装置不够准确，无法及时对患有DDH的人群进行矫正，延误最佳治疗时机。
基于上述现有技术的情况，现有技术中存在Graf法无法准确及时的检测和判断出婴幼儿是否患有发育性髋关节发育不良的疾病等亟待解决的技术问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种差异脂质分子作为脂质标志物的用途，即所述差异脂质分子作为发育性髋关节发育不良的体外诊断标志物的用途，所述差异脂质分子包括甘油三酯、磷脂酰乙醇胺，
所述甘油三酯包括TAG(17:0/18:1/20:1)、TAG(17:0/17:0/17:0)、TAG(17:0/18:0/18:0)、TAG(16:0/17:0/22:1)、TAG(16:0/18:0/22:0)、TAG(17:0/19:0/19:0)、TAG(13:0/20:0/20:0)、TAG(18:0/18:0/22:0)、TAG(16:0/20:0/20:0)、TAG(18:1/18:1/19:1)、TAG(18:0/18:0/20:0)、TAG(14:0/22:0/22:0)、TAG(18:0/18:0/18:0)、TAG(16:0/16:0/18:0)、TAG(16:0/16:0/17:0)、TAG(17:0/18:0/18:1)、TAG(12:1/22:0/22:0)、TAG(14:0/19:0/22:0) 中的一种或几种，所述磷脂酰乙醇胺为PE(10:0/26:4)，
其中，所述甘油三酯括号中的标识，表示甘油三酯中-C=O双键的位置，所述磷脂酰乙醇胺括号中的标识，表示磷脂酰乙醇胺中-C=O双键的位置。
进一步地，所述差异脂质分子的筛选方法，包括如下步骤：
（1）样本准备：分为病例组和对照组，其中所述样本为血清样本；
（2）脂质分子的提取和分析：分别移取步骤（1）中病例组和对照组的样本，加入提取液，所述样本和提取液的体积比为1：（4-5），所述提取液包括甲基叔丁基醚（MTBE）和甲醇（MeOH），依次经过30-60s的涡旋混匀和10-20min的冰水浴超声，在-40℃静置1-2h后得到混合物A、将混合物A在4℃、3000 rpm的转速下离心15-30 min，取离心后的上清液在37℃的条件下进行真空干燥，干燥时间为12-24h，得到溶液B，在溶液B中加入复溶液进行复溶，得到混合物C，其中，所述溶液B和复溶液的体积比为3：（1-2），所述复溶液中包括二氯甲烷（DCM）和甲醇（MeOH）；混合物C依次再经过30-60s的涡旋混匀和10-20min的冰水浴超声，经过-40℃静置1-2h后，在4℃、13000 rpm的转速下离心15-30min的条件下进行再次离心，将再次离心后的上清液采用超高效液相色谱-串联质谱分析技术进行分析，获得原始数据；
（3）数据处理：将步骤（2）获得的原始数据进行处理，对处理后的数据进行分析确定脂质分子的结构和名称；
（4）验证分析：将步骤（3）中的脂质分子通过受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析来量化其诊断性能，当选取的脂质分子的曲线下面积（Area under the curve, AUC）为0.7≤AUC≤1.0时，则可确定该脂质分子为差异脂质分子，所述差异脂质分子作为确定被诊断者是否患有发育性髋关节发育不良（DDH）的脂质标志物。
进一步地，所述步骤（1）中用Graf法（髋关节超声检查）作为诊断标准对病例组和对照组分组。
进一步地，所述提取液中甲基叔丁基醚和甲醇的体积比为5：1.
进一步地，所述二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1。
进一步地，所述步骤（2）中超高效液相色谱为Agilent 1290 (AgilentTechnologies)超高效液相色谱仪，其中，检测条件为：选用Phenomen KinetexC18(2.1 *100 mm, 1.7 μm)液相色谱柱，液相色谱A相为体积分数为40 %水和60 %乙腈溶液；B相为体积分数为10 % 乙腈，90 %异丙醇溶液；且每1000 mL的A相中再加入50 mL的10 mmol/L甲酸铵水溶液，梯度洗脱的条件为：0-1.0 min, 40 % B；1.0-12.0 min, 40 %-100 % B；12.0-13.5 min,100 % B；13.5-13.7min, 100 %-40 % B；13.7-18.0 min, 40 % B，设置流动相流速为0.3 mL/min，柱温为55 ℃，样品盘温度为4 ℃，进样体积为正离子2μL、负离子2μL，所述样品盘中的样品为步骤（2）中再次离心后提取的上清液。
进一步地，所述步骤（2）中质谱为Thermo Q Exactive Orbitrap质谱仪，所述质谱仪在控制软件（Xcalibur, 版本：4.0.27，Thermo）控制下进行一级、二级质谱数据采集，具体参数为：Sheath gas flow rate: 30 Arb, Aux gas flowrate: 10 Arb, Capillarytemperature: 320 ℃(positive)或300 ℃ (negative), Full ms resolution: 70000,MS/MSresolution: 17500, Collision energy: 15/30/45 in NCE mode,Spray Voltage:5 kV (positive)或-4.5 kV(negative)。
进一步地，所述步骤（3）中使用ProteoWizard软件将原始数据转成mzXML格式，再使用XCMS软件做保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐处理，其中minfrac设为0.5，然后基于XCMS软件、R程序包及 lipidblast数据库确定脂质分子的结构和名称。
进一步地，所述步骤（3）原始数据的处理中其算法打分的Cutoff值设为0.3，所述Cutoff值是根据统计学分析来设定的临界点。
进一步地，所述步骤（4）中ROC曲线下的面积值（AUC）在1.0和0.5之间，当在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明该差异脂质分子作为发育性髋关节发育不良的脂质标志物的用途的效果越好；当0.5＜AUC＜0.7时有较低准确性，当0.7≤AUC＜0.8时有一定准确性；AUC≥0.8时有较高的准确性，当AUC=0.5时，则无价值。
进一步地，所述差异脂质分子包括甘油三酯、磷脂酰乙醇胺，
所述甘油三酯中TAG(17:0/18:1/20:1) 的AUC≥0.916、TAG(17:0/17:0/17:0) 的AUC≥0.91、TAG(17:0/18:0/18:0) 的AUC≥0.896、TAG(16:0/17:0/22:1) 的AUC≥0.8944、TAG(16:0/18:0/22:0)的AUC≥0.8912、TAG(17:0/19:0/19:0) 的AUC≥0.8912、TAG(13:0/20:0/20:0) 的AUC≥0.8864、TAG(18:0/18:0/22:0) 的AUC≥0.8864、TAG(16:0/20:0/20:0)的AUC≥0.88、TAG(18:1/18:1/19:1) 的AUC≥0.8784、TAG(18:0/18:0/20:0) 的AUC≥0.8752、TAG(14:0/22:0/22:0) 的AUC≥0.8736、TAG(18:0/18:0/18:0)的AUC≥0.8704、TAG(16:0/16:0/18:0) 的AUC≥0.8672、TAG(16:0/16:0/17:0) 的AUC≥0.8592、TAG(17:0/18:0/18:1) 的AUC≥0.8592、TAG(12:1/22:0/22:0)的AUC≥0.8576、TAG(14:0/19:0/22:0) 的AUC≥0.8544，所述磷脂酰乙醇胺，即PE(10:0/26:4) 的AUC≥0.9008。
进一步地，还需取步骤（2）中所有样本的再次离心后提取的上清液混合以制备质量控制(QC)样品做过程质控，过程质控步骤为：取QC样品与步骤（2）中的提取液混合，所取QC样品与提取液的体积比与步骤（2）中样本和提取液的体积比相同，所述提取液与步骤（2）中的提取液相同，也同样依次经过30-60s的涡旋混匀和10-20min的冰水浴超声，在-40℃静置1-2h后得到混合物D、将混合物D在4℃、3000 rpm的转速下离心15-30 min，取离心后的上清液在37℃的条件下进行真空干燥，干燥时间为12-24h，得到溶液E，在溶液E中加入复溶液进行复溶，得到混合物F，其中，所述溶液E和复溶液的体积比与步骤（2）中溶液B和复溶液的体积比相同，所述复溶液与步骤（2）中的复溶液相同；混合物F依次再经过30-60s的涡旋混匀和10-20min的冰水浴超声，经过-40℃静置1-2h后，在4℃、13000 rpm的转速下离心15-30min的条件下进行再次离心，取离心后的上清液采用超高效液相色谱-串联质谱分析技术进行分析，获得对照数据，所述对照数据的处理与步骤（3）中原始数据的处理方法相同，所述对照数据用于在整个筛选方法的实验过程中确定仪器状态并评估系统的稳定性，即每在获得10-20组原始数据后，都进1组对照数据的获取，将每一组对照数据进行对比，根据QC样品对照数据处理后获得的主成分分析（PCA）得分图、PCA-X一维分布图、相关性分析图来确定仪器状态并评估系统的稳定性，理论上讲，QC样品都是相同的，但是仪器和系统在物质提取、检测分析过程中会有误差，导致QC样品间会有差异，而差异越小说明整个筛选方法稳定性越好、数据质量越高。
本发明还提供一种包含上述差异脂质分子的试剂盒。
本发明的有益效果在于：
1、本发明创造性地提出了一种差异脂质分子作为脂质标志物的用途，即所述差异脂质分子作为发育性髋关节发育不良的脂质标志物的用途，相对于现有技术中用Graf法容易因为不准确或不标准的图像从而导致错误的诊断结果，造成误诊或漏诊的情况，大幅度提高准确率，特别是能在婴幼儿早期是否患有DDH进行检测，及时对患有DDH的婴幼儿进行干预和治疗，具有重要价值；
2、本发明提供的包含所述差异脂质分子的试剂盒为差异脂质分子作为发育性髋关节发育不良的脂质标志物的用途及其研究提供更多的选择和支持，且易操作，能快速批量检测，检测准确率高，具有广阔的产业推广价值；
3、本发明提供脂质标志物中单个差异脂质分子在ROC曲线中的AUC值均＞0.8，具有有较高的准确性，即所述差异脂质分子作为脂质标志物用于发育性髋关节发育不良的体外诊断的用途，并且可以任选差异脂质分子中的一种或几种进行组合，选取的种类越多，结果越精确。
附图说明
图1为本发明实施例1中病例组和对照组的脂质分子热图；
图2为本发明实施例1的QC样品正离子PCA得分图；
图3为本发明实施例1的QC样品负离子PCA得分图；
图4为本发明实施例1的正离子模式下QC样品PCA-X一维分布图；
图5为本发明实施例1的负离子模式下QC样品PCA-X一维分布图；
图6为本发明实施例1的正离子QC样品相关性分析图；
图7为本发明实施例1的负离子QC样品相关性分析图；
图8为本发明实施例2中差异脂质分子TAG(17:0/18:1/20:1) 的ROC曲线；
图9为本发明实施例2 中差异脂质分子TAG(17:0/17:0/17:0) 的ROC曲线；
图10为本发明实施例2中被诊断者A正位位示的X光图；
图11为本发明实施例2中被诊断者A蛙式位示的X光图。
具体实施方式
本发明实施例中所用到的原材料信息如表1所示：
表1 原材料信息
本发明实施例中所用到的实验仪器信息如表2所示：
表2 实验仪器信息
本发明实施例1中的样本为利用Graf法作为诊断标准对病例组和对照组分组，病例组为确定已经患有DDH的患者，对照组为确定未患有DDH 的健康人群。
实施例1
本实施例提供一种差异脂质分子的筛选方法，包括如下步骤：
（1）样本准备：分为病例组和对照组，每组均有25例测试例，共50例样本，其中所述样品为血清样本；
（2）脂质分子的提取和分析：分别移取100 μL步骤（1）中病例组和对照组的样本至EP管（塑料离心管）中，加入480 μL提取液（甲基叔丁基醚和甲醇的体积比为5：1），依次经过涡旋混匀30 s、冰水浴超声10 min、在-40 ℃条件下静置1 h后得到混合物A，对混合物A进行离心，所述离心的条件为将混合物A在4℃、3000 rpm的转速（离心力为900(×g)，半径为8.6cm）下离心15 min，取离心后的300 μL上清液在37℃的条件下进行真空干燥，干燥时间为12h，得到溶液B，在溶液B中加入100 μL复溶液（二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1）进行复溶，得到混合物C，对混合物C进行再次涡旋混匀30 s、再次冰水浴超声10 min和再次离心，所述再次离心的条件为将混合物C在4℃、13000 rpm的转速（离心力为16200(×g)，半径为8.6cm）下离心15 min，将再次离心后的75 μL上清液采用超高效液相色谱-串联质谱分析技术进行分析，获得原始数据；
（3）数据处理：将步骤（2）获得的原始数据进行处理，对处理后的数据进行分析确定脂质分子的结构和名称；
（4）验证分析：将步骤（3）中的脂质分子通过受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析来量化其诊断性能，当选取的脂质分子的曲线下面积（Area under the curve, AUC）为0.7≤AUC≤1.0时，则可确定该脂质分子为差异脂质分子，所述差异脂质分子作为确定被诊断者是否患有发育性髋关节发育不良（DDH）的脂质标志物。
在本实施例中，所述差异脂质分子包括甘油三酯、磷脂酰乙醇胺；
所述甘油三酯包括TAG(17:0/18:1/20:1)、TAG(17:0/17:0/17:0)、TAG(17:0/18:0/18:0)、TAG(16:0/17:0/22:1)、TAG(16:0/18:0/22:0)、TAG(17:0/19:0/19:0)、TAG(13:0/20:0/20:0)、TAG(18:0/18:0/22:0)、TAG(16:0/20:0/20:0)、TAG(18:1/18:1/19:1)、TAG(18:0/18:0/20:0)、TAG(14:0/22:0/22:0)、TAG(18:0/18:0/18:0)、TAG(16:0/16:0/18:0)、TAG(16:0/16:0/17:0)、TAG(17:0/18:0/18:1)、TAG(12:1/22:0/22:0)、TAG(14:0/19:0/22:0) ，所述磷脂酰乙醇胺为PE(10:0/26:4)。
所述步骤（2）中超高效液相色谱为Agilent 1290 (Agilent Technologies)超高效液相色谱仪，其中，检测条件为：选用Phenomen KinetexC18(2.1 * 100 mm, 1.7 μm)液相色谱柱，液相色谱A相为体积分数为40 %水和60 %乙腈溶液；B相为体积分数为10 % 乙腈，90 %异丙醇溶液；且每1000 mL的A相中再加入50 mL的10 mmol/L甲酸铵水溶液，梯度洗脱的条件为：0-1.0 min, 40 % B；1.0-12.0 min, 40 %-100 % B；12.0-13.5 min,100 %B；13.5-13.7min, 100 %-40 % B；13.7-18.0 min, 40 % B，设置流动相流速为0.3 mL/min，柱温为55 ℃，样品盘温度为4 ℃，进样体积为正离子2μL、负离子2μL，所述样品盘中的样品为步骤（2）中再次离心后提取的上清液。
所述步骤（2）中质谱为Thermo Q Exactive Orbitrap质谱仪，所述质谱仪在控制软件（Xcalibur, 版本：4.0.27，Thermo）控制下进行一级、二级质谱数据采集，具体参数为：Sheath gas flow rate: 30 Arb, Aux gas flowrate: 10 Arb, Capillarytemperature: 320 ℃(positive)或300 ℃ (negative), Full ms resolution: 70000,MS/MSresolution: 17500, Collision energy: 15/30/45 in NCE mode,Spray Voltage:5 kV (positive)或-4.5 kV(negative)。
所述步骤（3）中的处理方法包括使用ProteoWizard软件将原始数据转成mzXML格式，再使用XCMS软件做保留时间矫正、峰识别、峰提取、峰积分、峰对齐处理，其中minfrac设为0.5，然后基于XCMS软件、R程序包及 lipidblast数据库确定脂质分子的结构和名称，其算法打分的Cutoff值设为0.3，所述Cutoff值是根据统计学分析来设定的临界点。
如图1所示，为病例组和对照组的脂质分子热图，从图中可以看出病例组和对照组多种脂质分子发生了变化，当选取的脂质分子的曲线下面积（Area under the curve,AUC）为0.7≤AUC≤1.0时，则可确定该脂质分子为差异脂质分子。
在步骤（4）中，受试者工作特征曲线，是根据一系列不同的二分类方式（分=分界值或决定阈），以真阳性率（灵敏度）为纵坐标，假阳性率（1-特异度）为横坐标绘制的曲线。对病例组中其中一组差异代谢物绘制ROC曲线，并计算其曲线下面积（Area under thecurve, AUC）。所述脂质标志物的名称和对应的AUC值如表3所示。其中ROC曲线下的面积值（AUC）在1.0和0.5之间，当在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明该差异脂质分子作为发育性髋关节发育不良的体外脂质标志物的用途的效果越好；当0.5＜AUC＜0.7时有较低准确性，当0.7≤AUC＜0.8时有一定准确性；AUC≥0.8时有较高的准确性，当AUC=0.5时，则无价值。
表3 脂质标志物的名称（共19种脂质标志物）和对应的AUC值
在本实施例中，过程质控为：取所有样本（50个测试例）的等体积（各100 μL）再次离心后提取的上清液混合以制备质量控制(QC)样品混合均匀，再移取100μL QC样品至EP管（塑料离心管）中，加入480 μL提取液（甲基叔丁基醚和甲醇的体积比为5：1），依次经过涡旋混匀30 s、冰水浴超声10 min、在-40 ℃条件下静置1 h后得到混合物D，对混合物D进行离心，所述离心的条件为将混合物D在4℃、3000 rpm的转速（离心力为900(×g)，半径为8.6cm）下离心15 min，取离心后的300 μL上清液在37℃的条件下进行真空干燥，干燥时间为12h，得到溶液E，在溶液E中加入100 μL复溶液（二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1）进行复溶，得到混合物F，对混合物F进行再次涡旋混匀30 s、再次冰水浴超声10 min和再次离心，所述再次离心的条件为将混合物F在4℃、13000 rpm的转速（离心力为16200(×g)，半径为8.6cm）下离心15 min，将再次离心后的75 μL上清液采用超高效液相色谱-串联质谱分析技术进行分析，获得对照数据，所述对照数据的处理与步骤（3）中原始数据的处理方法相同，即每在获得10组原始数据后，都进1组对照数据的获取，共计6组，编号为QC01、QC02、QC03、QC04、QC05、QC06，将每一组对照数据进行对比，获得QC样品正离子PCA得分图（图2）、QC样品负离子PCA得分图（图3）、正离子模式下QC样品PCA-X一维分布图（图4、负离子模式下QC样品PCA-X一维分布图（图5）、正离子QC样品相关性分析图（图6）、负离子QC样品相关性分析图（图7）来评估系统的稳定性。图中的主成分为本实施例中的差异脂质分子。
由图2、图3可以看到QC样品（图中圈起部分）的聚集性很好，说明筛选方法稳定性很好；由图4、图5可以看到6组QC样品（QC01、QC02、QC03、QC04、QC05、QC06）全部位于±2 std之内，说明本实施例的实验数据质量很高；从图6、图7也可以看到QC样品相关性很高（QC样品相关性接近于1），进一步说明整个筛选方法稳定性好。数据质量高。
实施例2
本实施例为不知被诊断者A是否患有DDH的情况下进行的实验：
本实施例的被诊断者A的年龄为2岁。
判断被诊断者A是否患有DDH的步骤为：
（1）样本准备：以被诊断者A的血清为样本；
（2）脂质分子的提取和分析：移取100 μL步骤（1）中血清样本至EP管中，加入480 μL提取液（甲基叔丁基醚和甲醇的体积比为5：1），依次经过涡旋混匀30 s、冰水浴超声10min、在-40 ℃条件下静置1 h后得到混合物A，对混合物A进行离心，所述离心的条件为将混合物A在4℃、3000 rpm的转速（离心力为900(×g)，半径为8.6cm）下离心15 min，取离心后的300 μL上清液在37℃的条件下进行真空干燥，干燥时间为12h，得到溶液B，在溶液B中加入100 μL复溶液（二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1）进行复溶，得到混合物C，对混合物C进行再次涡旋混匀30 s、再次冰水浴超声10 min和再次离心，所述再次离心的条件为将混合物C在4℃、13000 rpm的转速（离心力为16200(×g)，半径为8.6cm）下离心15 min，将再次离心后的75 μL上清液采用超高效液相色谱-串联质谱分析技术进行分析，获得原始数据；
（3）数据处理：将步骤（2）获得的原始数据进行处理，从脂质分子中选取差异脂质分子，对处理后的数据进行分析相应差异脂质分子的结构和名称, 在本实施例中，所述差异脂质分子选取TAG(17:0/18:1/20:1)和TAG(17:0/17:0/17:0)；
（4）验证分析：使用受试者工作特征曲线（ROC曲线）验证分析差异脂质分子，TAG(17:0/18:1/20:1) AUC=0.916（图8）和TAG(17:0/17:0/17:0) AUC=0.91（图9），结论为被诊断者A患有DDH；
（5）结果复核：为确保上述结果的正确性，本实施例采用X光进一步对被诊断者A进行分析，分析结果如图10（正位位示）和图11（蛙式位示）所示，可以看出被诊断者A的右侧髋关节脱位，右侧股骨头发育滞后，复核结论为被诊断者A患有DDH。
综上所述，本发明提供所述差异脂质分子作为发育性髋关节发育不良的脂质标志物的用途中，单个差异脂质分子在ROC曲线中的AUC值均＞0.8，具有有较高的准确性，即所述差异脂质分子作为脂质标志物用于发育性髋关节发育不良的体外诊断的用途，相对于现有技术中Graf法容易因为不准确或不标准的图像从而导致错误的诊断结果，造成误诊或漏诊的情况，大幅度提高准确率，特别是能在婴幼儿早期是否患有DDH进行检测，及时对患有DDH的婴幼儿进行干预和治疗，具有重要价值。
应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的内容，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims (7)

1.一种差异脂质分子作为脂质标志物的用途，其特征在于，所述差异脂质分子包括甘油三酯、磷脂酰乙醇胺，
所述甘油三酯包括TAG(17:0/18:1/20:1)、TAG(17:0/17:0/17:0)、TAG(17:0/18:0/18:0)、TAG(16:0/17:0/22:1)、TAG(16:0/18:0/22:0)、TAG(17:0/19:0/19:0)、TAG(13:0/20:0/20:0)、TAG(18:0/18:0/22:0)、TAG(16:0/20:0/20:0)、TAG(18:1/18:1/19:1)、TAG(18:0/18:0/20:0)、TAG(14:0/22:0/22:0)、TAG(18:0/18:0/18:0)、TAG(16:0/16:0/18:0)、TAG(16:0/16:0/17:0)、TAG(17:0/18:0/18:1)、TAG(12:1/22:0/22:0)、TAG(14:0/19:0/22:0)中的一种或几种，所述磷脂酰乙醇胺为PE(10:0/26:4)。
2.根据权利要求1所述差异脂质分子作为脂质标志物的用途，其特征在于，所述差异脂质分子的筛选方法，包括如下步骤：
（1）样本准备：分为病例组和对照组，其中所述样本为血清样本；
（2）脂质分子的提取和分析：分别移取步骤（1）中病例组和对照组的样本，加入提取液，所述样本和提取液的体积比为1：（4-5），所述提取液包括甲基叔丁基醚和甲醇，依次经过30-60s的涡旋混匀和10-20min的冰水浴超声，在-40℃静置1-2h后得到混合物A、将混合物A在4℃、3000 rpm的转速下离心15-30 min，取离心后的上清液在37℃的条件下进行真空干燥，干燥时间为12-24h，得到溶液B，在溶液B中加入复溶液进行复溶，得到混合物C，其中，所述溶液B和复溶液的体积比为3：（1-2），所述复溶液中包括二氯甲烷和甲醇；混合物C依次再经过30-60s的涡旋混匀和10-20min的冰水浴超声，经过-40℃静置1-2h后，在4℃、13000rpm的转速下离心15-30min的条件下进行再次离心，将再次离心后的上清液采用超高效液相色谱-串联质谱分析技术进行分析，获得原始数据；
（3）数据处理：将步骤（2）获得的原始数据进行处理，对处理后的数据进行分析确定脂质分子的结构和名称；
（4）验证分析：将步骤（3）中的脂质分子通过ROC曲线分析来量化其诊断性能，当选取的脂质分子的0.7≤AUC≤1.0时，则可确定该脂质分子为差异脂质分子，所述差异脂质分子作为确定被诊断者是否患有发育性髋关节发育不良的脂质标志物。
3.根据权利要求2所述差异脂质分子作为脂质标志物的用途，其特征在于，所述步骤（1）中用Graf法作为诊断标准对病例组和对照组分组。
4.根据权利要求2所述差异脂质分子作为脂质标志物的用途，其特征在于，所述步骤（1）提取液中甲基叔丁基醚和甲醇的体积比为5：1。
5.根据权利要求2所述差异脂质分子作为脂质标志物的用途，其特征在于，所述二氯甲烷和甲醇的体积比为1：1。
6.根据权利要求2所述差异脂质分子作为脂质标志物的用途，其特征在于，所述差异脂质分子包括甘油三酯、磷脂酰乙醇胺，
所述甘油三酯中TAG(17:0/18:1/20:1) 的AUC≥0.916、TAG(17:0/17:0/17:0) 的AUC≥0.91、TAG(17:0/18:0/18:0) 的AUC≥0.896、TAG(16:0/17:0/22:1) 的AUC≥0.8944、TAG(16:0/18:0/22:0) 的AUC≥0.8912、TAG(17:0/19:0/19:0) 的AUC≥0.8912、TAG(13:0/20:0/20:0) 的AUC≥0.8864、TAG(18:0/18:0/22:0) 的AUC≥0.8864、TAG(16:0/20:0/20:0)的AUC≥0.88、TAG(18:1/18:1/19:1) 的AUC≥0.8784、TAG(18:0/18:0/20:0) 的AUC≥0.8752、TAG(14:0/22:0/22:0) 的AUC≥0.8736、TAG(18:0/18:0/18:0) 的AUC≥0.8704、TAG(16:0/16:0/18:0) 的AUC≥0.8672、TAG(16:0/16:0/17:0) 的AUC≥0.8592、TAG(17:0/18:0/18:1) 的AUC≥0.8592、TAG(12:1/22:0/22:0) 的AUC≥0.8576、TAG(14:0/19:0/22:0) 的AUC≥0.8544，所述磷脂酰乙醇胺，即PE(10:0/26:4) 的AUC≥0.9008。
7.一种包含权利要求1-6任一项所述差异脂质分子的试剂盒。
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