CN116536398A - 一种基于无标记三嵌段dna的电化学适配体生物传感器检测目标dna核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于无标记三嵌段DNA的电化学适配体生物传感器检测目标DNA核酸的方法，属于核酸检测领域。该电化学适配体生物传感器包括含有腺嘌呤链的三嵌段DNA探针、DNA修饰的金电极以及信号探针；其中，DNA修饰的金电极为用所述含有腺嘌呤链的三嵌段DNA探针修饰的金电极，信号探针为六氨基合钌。三嵌段DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明两个DNA探针被固定在金电极的表面，特别是可以捕获并与目标DNA杂交；作为信号指示剂，六氨基合钌可以被带负电荷的DNA磷酸盐骨架静电吸附。通过阴离子DNA主链上吸附的六氨基合钌数量的增加导致电化学信号的增加，进而可以准确定量目标DNA。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，特别是涉及一种基于无标记三嵌段DNA的电化学适配体生物传感器检测目标DNA核酸的方法，更具体地是利用电化学适配体生物传感器阵列方法检测核酸。
背景技术
目前，DNA检测的许多方法已被广泛应用，如荧光、质谱、表面增强拉曼散射、比色、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。然而，这些方法有其自身的局限性，即耗时、成本高和操作繁琐。作为一种替代方法，电化学适配体传感器因其准确、高灵敏度、操作简单、响应快和成本低的显著特点而受到特别关注。在传统的基于DNA探针的无标记电化学适配体生物传感器用于高灵敏识别特定核酸中，DNA探针是电化学适配体生物传感器的重要部分，在这种传感器结构中，DNA由三个部分组成：两个捕获探针和poly A片段。两个捕获探针连接在poly A片段两端。但是，大部分DNA探针需依赖有机连接剂或纳米材料与电极进行连接，这限制了它们的实用性和生物相容性，也影响了其检测的灵敏性。
核酸的灵敏检测在分子诊断、疾病监测和遗传病筛查中发挥着重要作用，如何能开发出一种同时具有高选择性和高敏感性地识别特定序列核酸的方法成为了众多科研工作者的重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于无标记三嵌段DNA的电化学适配体生物传感器检测目标DNA核酸的方法，以解决上述现有技术存在的问题，利用该电化学适配体生物传感器可以同时具有高选择性和高敏感性地识别特定序列核酸，可以实现对目标DNA的更低检测限检测。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种基于无标记三嵌段DNA的电化学适配体生物传感器，包括含有腺嘌呤链的三嵌段DNA探针、DNA修饰的金电极以及信号探针；其中，所述DNA修饰的金电极为用所述含有腺嘌呤链的三嵌段DNA探针修饰的金电极，所述信号探针为六氨基合钌。
优选的是，所述三嵌段DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还公开了一种利用所述的电化学适配体生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)将含有腺嘌呤链的三嵌段DNA探针溶液滴加到金电极上，恒温孵育，制得DNA修饰的金电极；
(2)将所述DNA修饰的金电极在室温下钝化、冲洗，之后将六氨基合钌溶液滴加到所述DNA修饰的金电极上，孵育，制备所述电化学适配体生物传感器。
优选的是，步骤(1)中，所述含有腺嘌呤链的三嵌段DNA探针的浓度为1μM；恒温孵育的条件为：37℃恒温孵育1h。
优选的是，步骤(2)中，钝化试剂为6-巯基-1-己醇溶液；冲洗试剂为Tris缓冲液。
优选的是，步骤(2)中，六氨基合钌溶液的浓度为20mM；孵育条件为：常温孵育5min。
本发明还公开了一种利用所述的电化学适配体生物传感器检测目标DNA核酸的方法，包括以下步骤：
将目标DNA核酸样品滴加到DNA修饰的金电极上，恒温孵育进行杂交反应；之后，转至室温条件下，将六氨基合钌溶液滴加到DNA修饰的金电极上进行孵育反应，并在Tris-HCl缓冲液中测定SWV峰值电流，对目标DNA核酸浓度进行定量分析。
优选的是，杂交反应的条件为：37℃恒温孵育0.5h；孵育反应的条件为：常温孵育5min。
优选的是，所述SWV峰值电流与所述目标DNA核酸浓度的对数呈线性关系。
优选的是，目标DNA核酸的序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明公开了以下技术效果：
本发明开发了一种使用三嵌段DNA捕获探针的适配体传感器实现对目标DNA核酸的定量检测。利用[Ru(NH3)6]3+作为信号探针取代了过去实验方案中DNA上修饰二茂铁作为信号探针来检测的方法，实验原理更简单，还提高了信号强度和稳定性。而且，用A碱基序列通过共价力锚定在金电极上代替了有机结合剂或纳米材料，实现了绿色环保价值。另外，也没有依赖Au-S键，这就提高了专利的适用范围和生物相容性。并且，通过目标DNA与链DNA的碱基互补配对为检测提供了很好的稳定性和重现性。最终，针对目标DNA核酸得出了很好的线性拟合，SWV峰值电流与目标DNA浓度(10pM-10μM)的对数呈良好的线性关系，彰显其高灵敏度和低检测限2.885pM的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为电化学适配体传感器的传感核酸机理示意图；
图2为在Tris缓冲溶液检测目标物核酸的SWV图和线性关系；电化学传感器对缓冲溶液里的不同浓度的目标DNA(10pM-10μM)的SWV曲线(A)和雷达图(B)；(C)不同浓度(10pM-10μM)下靶DNA的SWV峰电流曲线；(D)SWV峰值电流与目标DNA浓度(10pM-10μM)的对数之间的线性关系；
图3为在血清里检测目标物核酸的SWV图和线性关系；电化学传感器对血清里的不同浓度的目标DNA(10pM-5μM)的SWV曲线(A)和雷达图(B)；(C)不同浓度(10pM-10μM)下靶DNA的SWV峰电流曲线；(D)SWV峰值电流与目标DNA浓度(10pM-5μM)的对数之间的线性关系
图4为干扰性实验结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明以下实施例所用的主要实验仪器：所有电化学测量包括循环伏安法(CV)，方波伏安法(SWV)和电化学阻抗谱(EIS)均在CHI650e电化学工作站(Chenhua,instruments,China)上进行。检测所使用的三电极体系包含裸金电极为工作电极(直径为2.0mm)，铂丝为对比电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极。
主要实验试剂：6-巯基己醇(MCH)、H2SO4、HCl、KCl、MgCl2、NaCl、K3[Fe(CN)6]等试剂；链DNA序列见表1，所有浓度的DNA溶液均由Tris缓冲溶液制备；所有的试剂均为分析纯且所有溶液均采用超纯水(电阻率为18.2MΩ·cm)；所有的检测均在20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH＝7.41，含有140mM NaCl，20mM KCl和20mM MgCl2)中进行。
本发明用于DNA检测的电化学适配体传感器的传感机制(见图1)具体为：设计了一种三嵌段DNA，它通过polyyA片段连接两个具有特定序列的DNA探针，并可以通过polyA片段锚定在金电极上。因此，两个DNA探针被固定在金电极的表面，特别是可以捕获并与目标DNA杂交。作为信号指示剂，[Ru(NH3)6]3+可以被带负电荷的DNA磷酸盐骨架静电吸附。在不存在靶DNA的情况下，[Ru(NH3)6]3+静电吸附在两个DNA探针和polyA片段上。探针与靶DNA杂交后，[Ru(NH3)6]3+不仅可以静电吸附在polyA片段和两个DNA探针上，而且可以静电吸附到杂交的靶DNA上。因此，阴离子DNA主链上吸附的[Ru(NH3)6]3+数量的增加导致电化学信号的增加。通过这种方式，成功地开发了一种有效的无标记电化学适配体传感器。
实施例1基于无标记三嵌段DNA的电化学适配体生物传感器检测目标DNA核酸
1、准备工作
(1)电极清洗
取直径为2mm金电极，用由H2SO4和H2O2(v∶v＝3∶1)配制的溶液在90℃下清洗5min。分别用粒径为0.3μm和0.05μm的Al2O3粉末各抛光两次，然后分别在去离子水和V去离子水∶V乙醇＝1∶1的溶液中进行超声清洗。将打磨后的金工作电极置于0.1M KCl的5mM铁氰化钾溶液中，在-0.2至0.6V范围内以0.2V/s进行连续电位扫描，直至得到可重复的循环伏安图。将干净的裸金电极在稀硫酸(0.5M)中酸化以便后期可以更牢固地将链DNA孵育在金电极表面。将电化学处理后的金电极用大量去离子水彻底冲洗，并干燥以获得干净的金电极。
(2)DNA处理
将各种DNA(见表1)在离心机中室温下以4000rpm离心1min。然后，制备成1μM的母液。1μM浓度的三嵌段DNA在80℃下水浴加热5min，然后冷却至室温。目标DNA配成10pM至10μM浓度梯度的溶液。
表1DNA核苷酸序列
表1序列是由上海生工生物公司合成。
2、制备DNA探针修饰金电极：
吸取20μL 1μM的三嵌段DNA溶液滴加在金电极上，放入37℃恒温烘箱孵育1h。取出DNA修饰金电极，在室温下向DNA修饰的金电极表面滴上6-巯基-1己醇(MCH)溶液钝化5min，消除非特异性吸附的DNA，即得到DNA探针修饰的电极，最后用Tris缓冲溶液冲洗链DNA修饰电极。
3、[Ru(NH3)]3+孵育
在与目标DNA杂交前，将20μL的20mM[Ru(NH3)]3+滴加在电极上，孵育5min，确保[Ru(NH3)]3+可以静电吸附在带负电荷的具有磷酸骨架的DNA主链上。
4、标准目标DNA核酸检测
为了检测目标DNA浓度，将不同浓度(10pM-10μM)的目标DNA溶液分别滴加在链DNA修饰电极上，每次都需在37℃恒温箱中孵育杂交0.5小时。取出电极后小心吹干，常温下，将20μL 20mM[Ru(NH3)]3+溶液滴加于在DNA修饰电极上并孵育反应5min。
在20mM Tris-HCl缓冲液中，用电化学工作站扫描不同浓度的目标DNA杂交后的DNA修饰电极的循环伏安(CV)曲线、方波伏安(SWV)曲线和阻抗(EIS)曲线，最终测定SWV峰值电流，对目标DNA核酸浓度进行定量分析。
如图2所示，结果显示：随着目标DNA浓度从10pM增大到10μM，传感器的SWV电流信号成比例增加，SWV峰值电流与目标DNA浓度(10pM-10μM)的对数呈良好的线性关系，相应的线性方程为y＝0.87x+14.02，相关系数(R)为0.99。计算出检测限低至2.885pM。
5、样品目标DNA核酸检测
首先，取50μL样品目标DNA溶液，与20μL Tris缓冲溶液混合稀释至1mL，在离心机中室温下以4000rpm离心1min。然后，取200μL上清液，再用缓冲液稀释50倍，作为检测样本。其余操作同标准目标DNA核酸检测。
6、血清环境下标准目标DNA核酸检测
取50μL血清样本，与20μL Tris缓冲溶液混合稀释至1mL，在离心机中室温下以4000rpm离心1min。然后，取200μL上清液，再用缓冲液稀释50倍，作为检测样本。其余操作同标准目标DNA核酸检测。
如图3所示，结果显示：随着目标DNA浓度从10pM增大到5μM，传感器的响应信号SWV峰值电流成比例增加，也呈现良好的线性关系，线性拟合方程为y＝0.92x+14.47，R为0.99。并且由3σ计算规则，计算出检测限为4.061pM。
实施例2干扰性实验
为了测试适配体传感器的选择性，选择了三条DNA链(称为干扰物1、干扰物2和干扰物3)作为干扰物质。如图4所示，与空白相比，当添加干扰时，观察到的SWV响应可以忽略不计。即使干扰物的浓度比靶DNA的浓度高100倍(1μM)，SWV的峰值电流仍显著低于靶DNA的特异性反应。这表明我们的电化学适体传感器对DNA检测具有优异的特异性。
从上述实施例的结果可以看出，本发明中所用的电化学适配体生物传感器利用了一种含有腺嘌呤链的三嵌段DNA探针，通过腺嘌呤(poly A)片段连接两个具有特定序列的DNA探针，并依靠腺嘌呤链与金电极表面的共价作用力将两段探针锚定于金电极表面，从而与目标DNA进行特异性杂交。能够放大电化学信号的分子六氨基合钌[Ru(NH3)]3+可以与带有负电的DNA磷酸盐主干发生静电吸附，在没有目标DNA的情况下，[Ru(NH3)]3+被静电吸附在DNA探针和腺嘌呤片段上。探针与目标DNA杂交后，[Ru(NH3)]3+不仅可以静电吸附在链DNA上，也可以静电吸附在杂交的目标DNA上。因此，结合在带负电的DNA主干上的[Ru(NH3)]3+导致了电化学信号(CV)的增加。这样，成功地开发了一种有效的无标记电化学适应传感器，可以应用于目标DNA核酸的检测中，并且实现对目标DNA更低检测限的检测。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于无标记三嵌段DNA的电化学适配体生物传感器，其特征在于，包括含有腺嘌呤链的三嵌段DNA探针、DNA修饰的金电极以及信号探针；其中，所述DNA修饰的金电极为用所述含有腺嘌呤链的三嵌段DNA探针修饰的金电极，所述信号探针为六氨基合钌。
2.如权利要求1所述的电化学适配体生物传感器，其特征在于，所述三嵌段DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.一种利用权利要求1所述的电化学适配体生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将含有腺嘌呤链的三嵌段DNA探针溶液滴加到金电极上，恒温孵育，制得DNA修饰的金电极；
(2)将所述DNA修饰的金电极在室温下钝化、冲洗，之后将六氨基合钌溶液滴加到所述DNA修饰的金电极上，孵育，制备所述电化学适配体生物传感器。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述含有腺嘌呤链的三嵌段DNA探针的浓度为1μM；恒温孵育的条件为：37℃恒温孵育1h。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，钝化试剂为6-巯基-1-己醇溶液；冲洗试剂为Tris缓冲液。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，六氨基合钌溶液的浓度为20mM；孵育条件为：常温孵育5min。
7.一种利用权利要求1所述的电化学适配体生物传感器检测目标DNA核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将目标DNA核酸样品滴加到DNA修饰的金电极上，恒温孵育进行杂交反应；之后，转至室温条件下，将六氨基合钌溶液滴加到DNA修饰的金电极上进行孵育反应，并在Tris-HCl缓冲液中测定SWV峰值电流，对目标DNA核酸浓度进行定量分析。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，杂交反应的条件为：37℃恒温孵育0.5h；孵育反应的条件为：常温孵育5min。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述SWV峰值电流与所述目标DNA核酸浓度的对数呈线性关系。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，目标DNA核酸的序列如SEQ ID NO：2所示。
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|---|---|---|---|
| CN202310249082.2A CN116536398A (zh) | 2023-03-15 | 2023-03-15 | 一种基于无标记三嵌段dna的电化学适配体生物传感器检测目标dna核酸的方法 |
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| CN116536398A true CN116536398A (zh) | 2023-08-04 |
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| CN202310249082.2A Pending CN116536398A (zh) | 2023-03-15 | 2023-03-15 | 一种基于无标记三嵌段dna的电化学适配体生物传感器检测目标dna核酸的方法 |
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| CN (1) | CN116536398A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN119804855A (zh) * | 2025-01-06 | 2025-04-11 | 南京林业大学 | 基于dna分子钟摆的电化学生物分子传感器及构建方法 |
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2023
- 2023-03-15 CN CN202310249082.2A patent/CN116536398A/zh active Pending
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