CN116515000A

CN116515000A - Hfe融合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN116515000A
Application number: CN202310788972.0A
Authority: CN
Inventors: 邢亚非
Original assignee: Jiajin Biomedicine Shanghai Co ltd
Current assignee: Jiajin Biomedicine Shanghai Co ltd
Priority date: 2023-06-30
Filing date: 2023-06-30
Publication date: 2023-08-01

Abstract

本发明适用于分子生物学技术领域，具体涉及一种能与TfR相结合的HFE融合蛋白及其应用。所述融合蛋白包括信号肽（signal peptide）、HFE蛋白、间隔区（Spacer）、B2M蛋白和His标签。发明对HFE&B2M特定位点连接后，改变了HFE自身无法在体外单独结合转铁蛋白受体（TfR）的缺陷。并且重组HFE&B2M融合蛋白提高了其与转铁蛋白受体（TfR）之间的亲和力，还可以用于在抗体筛选过程中的阻断实验。

Description

HFE融合蛋白及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种能与转铁蛋白受体（TfR）相结合的HFE融合蛋白及其应用。

背景技术

转铁蛋白又名运铁蛋白（Transferrin，Tf）是血浆中主要的含铁蛋白质，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁，其以三价铁复合物（Tf-Fe³⁺）的形式进入骨髓中，供成熟红细胞的生成。转铁蛋白（Tf）运载铁是通过与其受体（Transferrin Receptor，TfR）相互作用而实现的。TfR是一种表达于细胞表面的糖蛋白，由两个同源二聚体的亚基通过二硫键连接而成。

TfR作为转铁蛋白的受体不仅在多种细胞中表达，而且在多种肿瘤中高表达，其作用主要是参与铁离子的吸收，而铁离子对细胞的生产和代谢至关重要，因此通过抗体结合TfR可以阻止细胞对铁离子的吸收，进而导致细胞的死亡。目前，已有研究利用抗体靶向TfR用于治疗TfR高表达的肿瘤。此外，在药物递送方面，TfR可以结合抗体后将抗体或药物运输通过血脑屏障，进而治疗与神经系统相关的肿瘤或者其它疾病。

血色素沉着症蛋白(hemochromatosis protein, HFE蛋白)是一种同Tf竞争与TfR结合的蛋白质。HFE蛋白与TfR结合，可将TfR与转铁蛋白Tf的亲和力降低5~10倍，从而减少人体内铁元素的吸收，防止铁过载的出现。铁在多种身体功能中起着至关重要的作用，包括帮助产生血液等，但是过多的铁对人体是有害的。在血色素沉着症中，HFE蛋白的表达受到影响，导致身体吸收过多的铁，这些多余的铁会储存在主要器官（尤其是肝脏）中。长此以往，储存的多余的铁会对人体造成严重的损害，可能导致器官衰竭，还可能导致慢性疾病，如肝硬化、糖尿病和心力衰竭等。

研究表明，在中性或微碱性pH下，TfR和HFE在溶液中相互作用的微摩尔浓度比为2:1（1个TfR二聚体与1个HFE蛋白结合）（LebroÂn, J. A.等人(1998), Crystal structureof the hemochromatosis protein HFE and characterization of its interactionwith transferrin receptor, Cell 95, 111±123 .）。HFE和TfR胞外部分之间的复合物的晶体结构显示，两个HFE分子抓住了双对称TfR二聚体的两侧（LebroÂn J. A., West A.P. J和Pamela J. Bjorkman (1999), The hemochromatosis protein HFE competeswith transferrin for binding to the transferrin receptor, Journal ofMolecular Biology, 294(1), 239-245.）。在该复合物中，在TfR同型二聚体的每条链上均结合有一个HFE分子，进而形成两个对称的复合物（Bennett M. J., LebroÂn J. A.,和Pamela J. Bjorkman(2000), Crystal structure of the hereditaryhaemochromatosis protein HFE complexed with transferrin receptor. Nature, 403(6765), 46-53.）。也就是说，HFE分子单独和TfR在体外的结合能力相对较弱。

HFE和TfR结合主要参考上述提到的1998-2000年先后发表于Cell、JMB和Nature的三篇文献，其分别从HFE和TfR的表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）、HFE和Tf的竞争、以及其结构三方面研究HFE和TfR的结合模式。数据表明，TfR和HFE的结合可能需要HFE和β2-微球蛋白（beta-2 microglobulin，B2M）形成二聚体。但有大量的数据表明，体外孵育HFE和TfR结合的实验以及先孵育HFE和B2M形成二聚、再和TfR结合的实验都并不成功。而提高体外HFE的亲和力，有助于抗体筛选过程中阻断实验的顺利进行。因此运用融合蛋白技术构建并制备能较好地在体外与TfR结合的HFE融合蛋白的十分必要。同时，对于血色素沉着症患者，体外合成的HFE和B2M融合蛋白将有助于其缓解症状。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种能较好地在体外与TfR结合的重组HFE & B2M融合蛋白，所述融合蛋白包括信号肽（signal peptide）、HFE蛋白、间隔区（Spacer）、B2M蛋白和His标签，其中所述TfR为TfR1，且所述融合蛋白在pH7.5的环境下结合TfR1。

优选地，该信号肽的氨基酸残基序列为SEQ ID NO. 1，或者与之有90%以上的同源性，优选与之有95%以上的同源性，更优选为98%以上的同源性。

优选地，该HFE蛋白的氨基酸残基序列为SEQ ID NO. 2，或者与之有90%以上的同源性，优选与之有95%以上的同源性，更优选为98%以上的同源性。

优选地，该Spacer的氨基酸残基序列为SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4，或者与之相比有3个以下的氨基酸的缺失、突变或者替换。

优选地，该B2M蛋白的氨基酸残基序列为SEQ ID NO. 5，或者与之有90%以上的同源性，优选与之有95%以上的同源性，更优选为98%以上的同源性。

优选地，该融合蛋白的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或者与之有90%以上的同源性。

本发明实施例的另一目的在于提供一种编码上述重组HFE & B2M融合蛋白的核苷酸序列。该核苷酸序列包括信号肽编码序列、HFE编码序列、Spacer编码序列、B2M编码序列、His标签编码序列。

优选地，该信号肽编码序列为SEQ ID NO. 8或者与之有90%以上的同源性。

优选地，该HFE序列为SEQ ID NO.9或者与之有90%以上的同源性。

优选的，该Spacer的编码序列为SEQ ID NO. 10或SEQ ID NO. 11或者与之有90%以上的同源性。

优选地，该B2M序列为SEQ ID NO. 12或者与之有90%以上的同源性。

优选地，该核苷酸序列为SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14或者与之有90%以上的同源性。

本发明实施例的另一目的在于提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。

优选地，该表达载体为pCDNA3. 1（+）载体。

本发明实施例的另一目的在于提供一种含有上述表达载体的宿主细胞。

优选地，该宿主细胞为人胚胎肾细胞293（HEK293细胞）或中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）。

本发明实施例的另一个目的在于提供一种用于阻断TfR与其抗体结合的试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的融合蛋白。该试剂盒还可以包括将该融合蛋白输送至体内的辅助试剂。

本发明实施例的另一个目的在于提供上述融合蛋白或上述含有该融合蛋白表达载体的细胞在制备疾病治疗药物中的用途，所述疾病为血色素沉着症、代谢类疾病或罕见病，这些疾病均与TfR的结合力相关。

与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：

1）本发明对HFE & B2M特定位点连接后，改变了HFE自身无法在体外单独结合转铁蛋白受体（TfR）的缺陷。并且发现，相较于HFE和B2M联合孵育来说，重组HFE&B2M融合蛋白提高了其与转铁蛋白受体（TfR）之间的亲和力，而具有高的转铁蛋白受体（TfR）亲和力的重组HFE&B2M融合蛋白还可以用于在抗体筛选过程中的阻断实验。

2）本发明对HFE & B2M特定位点连接后，改变了HFE自身无法在体外单独结合转铁蛋白受体（TfR）的缺陷，为血色素沉着症的诊疗手段提供了体外实验的理论和实践基础。

附图说明

图1是本发明实施例提供的重组HFE & B2M融合蛋白SDS-PAGE图。

图2是本发明实施例提供的重组HFE & B2M融合蛋白SEC-HPLC纯度图。

图3是本发明实施例提供的HFE & B2M融合蛋白与TfR1的结合能力图。

图4是HFE和B2M的体外结合实验的检测结果示意图。

图5是本发明实施例提供的A抗体同HFE & B2M融合蛋白竞争与TfR1的结合能力图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下述实施例中的实验方法如无特殊说明均为常规方法，下述实施例中的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径获取。

实施例1 融合蛋白表达框的合成与表达载体的构建

根据融合蛋白各组分的氨基酸序列与编码序列，拼接成整个重组HFE & B2M融合蛋白的氨基酸序列与编码DNA表达框：在包含有信号肽的HFE氨基酸残基序列（SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2）末端分别插入Spacer的氨基酸残基序列（SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO.4），使其串联B2M的氨基酸残基序列（SEQ ID NO. 5）并在其末端带有His标签序列，最终得到对应的重组HFE & B2M融合蛋白的氨基酸残基序列SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。

分别按 HFE&B2M 1的DNA编码序列（SEQ ID NO. 13）和HFE&B2M 2的DNA编码序列（SEQ ID NO. 14），委托南京蓬勃生物科技有限公司合成其整个表达框，插入到pCDNA3. 1（+）载体的（Invitrogen）EcoRI位点，再转化到E. coli中, 经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得对应的两个重组表达载体的高品质质粒。

实施例2 融合蛋白的表达与纯化

将实施例1中构建并纯化获得的两种重组表达载体的高品质质粒，分别利用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染至CHO细胞（购自美国典型物保藏中心，ATCC）对其进行表达。

转染前一天，在60mm细胞培养皿中接种8×10⁵个细胞，加入5ml培养基（含血清,不含抗生素），于37℃和5%CO₂的环境培养。转染当天，加入待转染的质粒，混匀后静置5分钟；向混匀的混合物中加入15 ul转染试剂（Qiagen PolyFect Transfection Reagent），用加样器吹打5次。在室温下（20-25℃）孵育混合物5-10分钟。在孵育的同时，吸出细胞培养皿中的培养基，用PBS液洗涤一次，加入3ml的培养基（含血清，不含抗生素）。

2天后，将转染后的CHO细胞根据细胞的生长情况接种到新的培养板通过有限稀释法将细胞克隆化进行筛选。建立稳定转染相应表达载体的细胞株。而后，通过摇瓶培养大量扩增稳定转染细胞，收集培养物上清，经凝胶过滤亲和层析法纯化各融合蛋白。纯化好的融合蛋白经SDS-PAGE确认分子量（图1）图1中：M1泳道为蛋白Marker, Bio-rad, Cat. No.1610374S，R泳道表示Reducing condition；NR泳道表示Non-reducing condition；并经由SEC-HPLC确认纯度（图2）。其中图2对应的参数如表1所示：

表1 图2的具体参数

Signal: VWDIA,Wavelength=280 nm

实施例3 融合蛋白与TfR1的结合能力检测

a.对比实施例：非融合的HFE 和B2M（组合使用）的结合能力检测

通过4℃ 条件下过夜包被1ug/ml C-Myc/DDK Tag标记的HFE（货号NM_139006，在PBS缓冲液中，100 ul/well）后，用0.05% PBST洗2次。加入3% MPBS于37℃孵育1小时后用0.05% PBST洗1次。加入400 nM B2M 室温2小时来形成二聚体，之后加入1ug/ml Biotin-human TfR1（在PBST中, 100ul/well）于37℃孵育1小时，再用0.05% PBST洗3次。用SA[HRP]（在0.05%PBST中0.1ug/ml，100ul/well）捕获Biotin标记的human TfR1，三次重复实验结果显示吸光度在0.7左右，表明结合较弱（结果见表2）。

发明人发现，pH值会影响结合效果，实验证明：使用pH7.5的PBS作为coatingbuffer可以获得较好的结合效果，而使用pH6.0的PBS则会导致不结合。以下的实验如没有特别说明，则均在pH7.5条件下进行。

b.HFE&B2M 检测结果

发明人分别检测了实施例2制得的氨基酸序列SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的结合效果，两者检测步骤相同，分别如下：

通过4℃条件下过夜包被1ug/ml 1V：实施例2制备的HFE&B2M（在CBS中，100 ul/well）后，用0.05% PBST洗2次。加入3% MPBS于37℃孵育1小时后用0.05% PBST洗1次。加入34 ug/ml 1D: Biotin-human TfR1, His Tag（用0.05% PBST 4倍梯度稀释，100ul/well）于37℃孵育1小时，再用0.05% PBST洗3次。在pH7.5的条件下进行结合检测。用SA[HRP]（在0.05%PBST中0.1ug/ml，100ul/well），经Excel计算结果显示EC50为12.61 ug/ml。相较于HFE和B2M联合孵育来看，重组HFE&B2M融合蛋白提高了与转铁蛋白受体（TfR）之间的亲和力（图3）。

结果表明，对HFE & B2M特定位点连接后，改变了HFE自身无法单独结合转铁蛋白受体（TfR）的缺陷。并且发现，相较于HFE和B2M联合孵育来说，重组HFE&B2M融合蛋白提高了与转铁蛋白受体（TfR）之间的亲和力。

发明人还进行了补充实验：使用HFE和B2M进行体外结合实验，验证HFE和B2M体外孵育后是否能形成异源二聚体。

方案1(Format 1)：包被C-Myc/DDK Tag 标记的HFE（1U），加入His tag标记的B2M（1S），共同孵育一段时间，检测His tag的信号；

方案2(Format 2)：包被His tag标记的B2M（1S），加入C-Myc/DDK Tag 标记的HFE（1U）共同孵育一段时间，检测C-Myc的信号。检测结果如图4所示。

由此可以看出，只有先包被HFE再加入B2M，才能发现二者在体外是有结合的，但是结合能力并不强。

接下来针对HFE和B2M与TfR1的体外结合实验，发明人通过过夜包被1ug/ml HFE，第二天加入400 nM B2M 室温2小时来形成二聚体，之后加入1ug/ml Biotin-TfR1，二抗用SA[HRP]，三次重复实验结果显示结合值均为0.7左右，结合较弱。具体数值见下表2。

表2 HFE与B2M联合孵育与human TfR1的结合数据表

由此可见，HFE与B2M单独与human TfR1结合的效果都很弱。

实施例4 融合蛋白表达后用于阻断实验

本发明实施例的另一个目的在于提供上述融合蛋白用于抗体筛选过程中的阻断实验的用途。

准备一块96孔板，通过4℃条件下过夜包被1ug/ml 实施例2制备的HFE&B2M融合蛋白（CBS，100 ul/well）后，用0.05% PBST洗2次。加入3% MPBS于37℃孵育1小时后用0.05%PBST洗1次。再向板中加入4倍梯度PBST稀释的A抗体（A抗体为IgG抗体，可以特异性识别human TfR1受体，委托南京蓬勃生物科技有限公司生产，编号为CGBA-0002）和Biotin标记的human TfR1（25ug/ml，50ul/well）。再用0.05% PBST洗3次。用SA[HRP]（0.1ug/ml in0.05%PBST，100ul/well）在37℃条件下孵育30 min捕获biotin标记的TfR1。再用0.05%PBST 洗6次。检测SA[HRP]捕获biotin标记的信号强弱。根据OD450值根据浓度作图得到实验结果，如图5显示，实验结果表明：A抗体不会阻断HFE&B2M和human TfR1的结合，从而得到不会影响Fe³⁺转运的A抗体，这种抗体相对来说更为安全。由此表明本发明提供的HFE&B2M抗体融合蛋白在抗体筛选的过程中，可以有效的筛选安全性更好，不会影响Fe³⁺转运的抗体。

上文中提到的氨基酸残基序列和DNA编码序列分别列于此处：

SEQ ID NO. 1 信号肽的氨基酸残基序列：

MGWSCIILFLVATATGVHS

SEQ ID NO. 2 HFE的氨基酸残基序列：

RLLRSHSLHYLFMGASEQDLGLSLFEALGYVDDQLFVFYDHESRRVEPRTPWVSSRISSQMWLQLSQSLKGWDHMFTVDFWTIMENHNHSKESHTLQVILGCEMQEDNSTEGYWKYGYDGQDHLEFCPDTLDWRAAEPRAWPTKLEWERHKIRARQNRAYLERDCPAQLQQLLELGRGVLDQQVPPLVKVTHHVTSSVTTLRCRALNYYPQNITMKWLKDKQPMDAKEFEPKDVLPNGDGTYQGWITLAVPPG

SEQ ID NO. 3 Spacer 1的氨基酸残基序列：

GGGSGGGSGGSGGSGGGS

SEQ ID NO. 4 Spacer 2的氨基酸残基序列：

GGGSGGGSGGGSGGGS

SEQ ID NO. 5 B2M的氨基酸残基序列：

MGWSCIILFLVATATGVHSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM

SEQ ID NO. 6 融合蛋白HFE&B2M 1依次由信号肽-B2M-Spacer 1-HFE-His*融合构成，其氨基酸序列为：

MGWSCIILFLVATATGVHSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGSGGGSGGSGGSGGGSRLLRSHSLHYLFMGASEQDLGLSLFEALGYVDDQLFVFYDHESRRVEPRTPWVSSRISSQMWLQLSQSLKGWDHMFTVDFWTIMENHNHSKESHTLQVILGCEMQEDNSTEGYWKYGYDGQDHLEFCPDTLDWRAAEPRAWPTKLEWERHKIRARQNRAYLERDCPAQLQQLLELGRGVLDQQVPPLVKVTHHVTSSVTTLRCRALNYYPQNITMKWLKDKQPMDAKEFEPKDVLPNGDGTYQGWITLAVPPGHHHHHH*

SEQ ID NO. 7 融合蛋白HFE&B2M 2依次由信号肽-B2M-Spacer 2-HFE-His*融合构成，其氨基酸序列为：

MGWSCIILFLVATATGVHSIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDMGGGSGGGSGGGSGGGSRLLRSHSLHYLFMGASEQDLGLSLFEALGYVDDQLFVFYDHESRRVEPRTPWVSSRISSQMWLQLSQSLKGWDHMFTVDFWTIMENHNHSKESHTLQVILGCEMQEDNSTEGYWKYGYDGQDHLEFCPDTLDWRAAEPRAWPTKLEWERHKIRARQNRAYLERDCPAQLQQLLELGRGVLDQQVPPLVKVTHHVTSSVTTLRCRALNYYPQNITMKWLKDKQPMDAKEFEPKDVLPNGDGTYQGWITLAVPPGHHHHHH*

SEQ ID NO. 8 信号肽的编码序列：

ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCGACTGCGACTGGTGTTCATTCT

SEQ ID NO. 9 HFE的编码序列：

CGTCTGCTGCGTTCTCACTCCCTGCACTACCTGTTTATGGGTGCCTCCGAACAAGATCTGGGCCTGTCCCTGTTCGAAGCACTGGGTTACGTAGATGACCAGCTGTTTGTTTTCTACGATCACGAATCTCGTCGTGTCGAACCGCGCACCCCATGGGTATCCAGCCGTATCTCTAGCCAGATGTGGCTGCAGCTGTCCCAGTCCCTGAAAGGTTGGGACCACATGTTCACGGTGGACTTCTGGACCATTATGGAAAACCACAACCACAGCAAGGAATCTCACACCCTGCAGGTCATCCTGGGTTGTGAAATGCAGGAAGATAACTCTACTGAAGGCTACTGGAAATACGGCTATGATGGCCAGGATCACCTGGAGTTTTGTCCGGACACCCTGGACTGGCGCGCAGCTGAACCACGTGCATGGCCGACGAAACTGGAATGGGAACGTCACAAGATCCGTGCGCGTCAAAACCGTGCTTATCTGGAACGTGACTGTCCAGCGCAGCTGCAGCAACTGCTGGAACTGGGTCGCGGCGTACTGGACCAGCAAGTTCCTCCGCTGGTTAAAGTGACCCACCACGTAACTTCTAGCGTCACCACGCTGCGTTGTCGTGCACTGAACTATTACCCGCAGAACATCACTATGAAGTGGCTGAAGGACAAGCAACCGATGGACGCTAAAGAATTCGAACCGAAAGATGTCCTGCCAAATGGCGACGGTACTTATCAGGGTTGGATTACTCTGGCGGTACCGCCGGGC

SEQ ID NO. 10 B2M的编码序列：

ATGGGCTGGTCCTGCATCATTCTGTTCCTGGTAGCAACCGCAACTGGTGTGCATTCTATCCAGCGCACTCCGAAAATCCAAGTTTACTCCCGTCACCCAGCCGAAAACGGCAAATCCAACTTCCTGAACTGCTACGTATCCGGCTTCCATCCGAGCGATATCGAAGTTGATCTGCTGAAAAACGGCGAACGCATCGAGAAAGTAGAACACAGCGACCTGTCTTTCTCTAAGGATTGGAGCTTCTACCTGCTGTACTACACCGAATTCACTCCGACTGAAAAGGATGAATACGCTTGTCGCGTTAACCACGTGACTCTGTCCCAGCCGAAGATTGTTAAGTGGGATCGTGATATG

SEQ ID NO. 11 Spacer 1的编码序列：

GGTGGTGGTTCCGGTGGCGGTTCTGGCGGTAGCGGTGGTTCTGGTGGCGGTTCT

SEQ ID NO. 12 Spacer 2的编码序列：

GGTGGTGGCT CTGGCGGTGG CTCTGGTGGT GGTTCCGGTG GTGGCTCC

SEQ ID NO. 13 HFE&B2M 1 DNA编码序列：

ATGGGCTGGTCTTGTATCATCCTGTTCCTGGTTGCAACCGCCACTGGTGTCCATAGCATCCAGCGTACTCCGAAAATCCAGGTTTACAGCCGTCACCCGGCCGAAAACGGCAAATCTAACTTCCTGAACTGCTATGTCTCCGGCTTCCACCCGTCTGACATCGAAGTGGATCTGCTGAAGAACGGCGAGCGTATCGAGAAAGTTGAGCACTCTGACCTGAGCTTCTCCAAAGATTGGTCCTTCTACCTGCTGTATTACACCGAGTTCACCCCGACCGAAAAAGACGAATATGCTTGCCGCGTGAACCACGTGACCCTGTCCCAACCGAAAATTGTAAAATGGGACCGTGACATGGGTGGTGGTTCCGGTGGTGGCAGCGGTGGCTCTGGCGGTTCTGGCGGTGGCTCTCGTCTGCTGCGCTCTCACAGCCTGCACTATCTGTTCATGGGTGCATCCGAACAGGATCTGGGTCTGTCCCTGTTCGAAGCGCTGGGTTATGTGGATGATCAGCTGTTCGTGTTCTACGACCATGAGTCCCGCCGTGTGGAGCCACGTACTCCGTGGGTTTCTAGCCGTATCTCTTCCCAAATGTGGCTGCAGCTGAGCCAGAGCCTGAAAGGCTGGGATCACATGTTCACCGTGGATTTCTGGACCATCATGGAGAACCATAACCACTCCAAAGAAAGCCACACCCTGCAGGTCATCCTGGGTTGTGAGATGCAGGAAGATAACTCCACCGAAGGCTACTGGAAGTATGGCTATGATGGCCAGGATCACCTGGAATTCTGTCCGGACACTCTGGACTGGCGCGCGGCTGAACCACGTGCGTGGCCGACTAAACTGGAGTGGGAACGTCACAAAATCCGCGCACGTCAAAACCGTGCTTATCTGGAGCGTGATTGCCCGGCGCAACTGCAGCAGCTGCTGGAACTGGGTCGCGGTGTACTGGATCAGCAGGTGCCGCCTCTGGTTAAGGTTACCCACCACGTTACGTCTTCTGTTACCACCCTGCGTTGCCGCGCTCTGAACTACTATCCACAGAATATCACCATGAAATGGCTGAAAGACAAACAGCCAATGGATGCAAAAGAATTCGAACCAAAAGACGTTCTGCCGAACGGTGACGGCACCTACCAGGGTTGGATCACTCTGGCTGTTCCTCCAGGTCATCACCACCACCATCAC

SEQ ID NO. 14 HFE&B2M 2 DNA编码序列：

ATGGGCTGGTCCTGCATTATTCTGTTCCTGGTTGCTACGGCTACGGGTGTGCACAGCATCCAGCGTACTCCGAAGATCCAGGTTTACTCTCGCCACCCGGCTGAAAACGGTAAGTCTAATTTCCTGAACTGCTATGTTTCTGGCTTCCACCCATCTGACATCGAAGTTGACCTGCTGAAAAATGGCGAACGTATCGAAAAAGTCGAACACTCTGACCTGAGCTTCTCCAAAGATTGGTCCTTCTACCTGCTGTATTATACTGAATTTACTCCTACCGAAAAGGACGAATACGCATGTCGCGTGAACCACGTTACCCTGAGCCAGCCGAAAATTGTCAAATGGGACCGCGACATGGGTGGTGGCTCTGGTGGTGGTTCCGGTGGCGGTTCTGGTGGTGGCTCCCGTCTGCTGCGTTCCCATTCCCTGCATTACCTGTTCATGGGTGCTAGCGAACAGGATCTGGGTCTGTCTCTGTTTGAAGCGCTGGGTTATGTTGACGACCAGCTGTTCGTGTTTTACGACCACGAATCTCGTCGCGTTGAACCACGTACCCCGTGGGTTTCCTCTCGTATCTCCTCTCAGATGTGGCTGCAACTGTCCCAGTCTCTGAAGGGTTGGGATCACATGTTCACCGTAGACTTCTGGACCATCATGGAAAACCACAATCACAGCAAGGAATCTCACACCCTGCAGGTTATCCTGGGTTGTGAAATGCAGGAAGATAACAGCACCGAAGGCTACTGGAAATACGGTTACGACGGTCAAGATCATCTGGAATTCTGCCCGGATACCCTGGACTGGCGTGCTGCGGAACCTCGTGCTTGGCCAACCAAACTGGAATGGGAACGCCACAAAATCCGCGCCCGCCAGAATCGTGCGTACCTGGAACGTGATTGTCCTGCTCAGCTGCAGCAGCTGCTGGAACTGGGCCGTGGCGTTCTGGACCAACAGGTCCCACCACTGGTTAAAGTTACCCACCATGTCACCTCTTCTGTGACTACTCTGCGCTGTCGTGCACTGAACTATTACCCGCAGAACATCACCATGAAGTGGCTGAAAGATAAACAGCCGATGGACGCGAAAGAATTCGAACCGAAAGATGTTCTGCCGAACGGCGACGGCACCTACCAGGGTTGGATCACCCTGGCTGTTCCGCCAGGCCACCACCATCATCATCAC

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种重组HFE & B2M融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白能在体外与TfR结合，所述融合蛋白包含信号肽、HFE蛋白、间隔区、B2M蛋白和His标签，所述融合蛋白的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7，其中所述TfR为TfR1，且所述融合蛋白在pH7.5的环境下结合TfR1。

2.一种编码如权利要求1所述的融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14所示。

3.一种含有如权利要求2所述的核苷酸序列的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pCDNA3. 1（+）载体。

4.一种含有如权利要求3所述的表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为HEK293细胞或CHO细胞。

5.一种用于阻断TfR与其抗体结合的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1所述的融合蛋白。

6.如权利要求1所述的融合蛋白用于制备疾病治疗药物中的用途，其特征在于，所述疾病为血色素沉着症。