CN116509874A - 甲基巴多索隆在制备改善病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甲基巴多索隆在制备改善病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的药物中的用途。本发明本研究发现，甲基巴多索隆能够、抑制心肌内NLRP3炎症小体的活化、降低血清中心肌损伤标志物CK‑MB和cTnI的含量、抑制病毒感染引起的心肌结构和功能的改变，从而实现对病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的改善，为开发新的治疗病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的药物提供了理论支持。

Description

甲基巴多索隆在制备改善病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的 药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及甲基巴多索隆在制备改善病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的药物中的用途。

背景技术

病毒性心肌炎作为一种常见的由病毒感染引起的心肌炎症性疾病，严重危及患者的生命安全。病毒性心肌炎会引起感染者的一系列免疫反应，同时也是导致扩张型心肌病的一项重要的病因。

病毒性心肌炎患者通常变现为各种心律失常和心功能的受损，甚至会发生心源性猝死，心内膜活检是该病诊断的金标准。然而内膜活检作为一种侵入性检查，在临床工作中并没有普及。目前病毒性心肌炎的诊断仍然较多依靠于病史、临床表现及相关临床检验指标，尤其是心脏核磁共振成像检查，是诊断病毒性心肌病的重要检查手段。目前对于病毒性心肌炎仍然缺乏确切有效的治疗手段。

齐墩果酸是一种从油橄榄叶子中提取的具有抗炎、护肝、抗肿瘤作用的三萜类化合物，可用于治疗肝损伤、肝纤维化等疾病。2⁃氰基⁃3，12⁃二氧齐墩果烷⁃1，9（11）⁃二烯⁃28⁃酸甲酯（bardoxolone methyl，CDDO⁃Me），即甲基巴多索隆，是一种半合成齐墩果酸衍生物。CDDO-Me作为齐墩果酸的衍生物，具有更显著的抗炎、抗氧化及抗肿瘤作用。目前，已有报道将CDDO-Me用于治疗2型糖尿病引起的慢性肾病，如申请号为201610329985.1的专利公开了一种齐墩果院衍生物。还有报道将CDDO-Me用于治疗肺动脉高压，如《吸入CDDO⁃NO对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的作用》（伍雪橙等，2022年9月，南京医科大学学报，第42卷第9期）。有报导称CDDO-Me在心脏方面存在安全性隐患，对心肌细胞产生毒性，所以目前尚未有将CDDO-Me甲基巴多索隆用于治疗心肌炎的相关报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供甲基巴多索隆在制备改善病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的药物中的用途。本发明旨在研究甲基巴多索隆在病毒性心肌炎中的保护作用和机制。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供甲基巴多索隆（CDDO-Me）在制备改善病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的药物中的用途。

优选的，所述病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤是由嗜心性病毒感染引起的病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤。

优选的，所述嗜心性病毒为柯萨奇B3病毒（CVB3）。

本发明的第二方面，提供一种治疗病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的药物，所述药物以0.5mg/ml的甲基巴多索隆为有效成份。

本发明的第三方面，提供甲基巴多索隆在制备降低血清中CK-MB和cTnI含量的药物中的用途。

本发明的第四方面，提供甲基巴多索隆在制备抑制心肌结构和功能改变的药物中的用途。

本发明的有益效果：

本发明研究发现，甲基巴多索隆能够通过激活Nrf2/HO-1信号通路、抑制NLRP3炎症小体的活化，降低血清中心肌坏死标志物CK-MB和cTnI的含量、抑制心肌结构和功能改变，从而实现对病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的改善，为开发新的治疗病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的药物提供了理论支持。

附图说明

图1：小鼠生存曲线图，A为四组小鼠的生存曲线，B为模型组与实验组小鼠生存曲线的统计学分析，C为四组小鼠整个实验过程的体重折线图；

图2：小鼠血清中心肌损伤标志物的含量图，A为Elisa法测得各组小鼠血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）的含量统计分析图，B为Elisa法测得各组小鼠血清中肌钙蛋白I（cTnI）的含量统计分析图；数值以平均数±标准误差（X±SEM）表示，n=8，显著性以p＜0.05表示；ns：p＞0.05，*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001，****：p＜0.0001；

图3：CDDO⁃Me抑制心肌重构示意图，A为小鼠心脏图片，B为小鼠心肌HE染色切片（200X），C为小鼠心脏超声截图，D-H为小鼠心脏左室射血分数（LVEF）、左室缩短分数（FS）、左室前壁厚度（LVAWT）、左室舒张末期内径（LVDd）和左室收缩末期内径（LVDs）；数值以平均数±标准误差（X±SEM）表示，n=9，显著性以p＜0.05表示；ns：p＞0.05，*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001，****：p＜0.0001；

图4：A为NLRP3在小鼠心肌内表达的免疫荧光图（IFC），B为Caspase-1在小鼠心肌内表达的荧光图，C为ASC在小鼠心肌内表达的免疫荧光图，D为小鼠心肌内NLRP3、Caspase-1及ASC蛋白印迹图；

图5：A为心肌内NLRP3通过WB实验测定含量的统计分析图；B为心肌内NLRP3相关mRNA通过PCR实验测定含量的统计分析图，C为心肌内NLRP3通过IFC实验测定含量的统计分析图；

图6：A为心肌内Caspase-1通过WB实验测定含量的统计分析图；B为心肌内Caspase-1相关mRNA通过PCR实验测定含量的统计分析图，C为心肌内Caspase-1通过IFC实验测定含量的统计分析图；

图7：A为心肌内ASC通过WB实验测定含量的统计分析图；B为心肌内ASC相关mRNA通过PCR实验测定含量的统计分析图，C为心肌内ASC通过IFC实验测定含量的统计分析图；

图8：A为通过Luminex法测得小鼠血清中IL-1β含量的统计分析图，B为通过PCR法测得小鼠心肌内IL-1β相关mRNA含量的统计分析图；

图9：A为通过Elisa法测得小鼠血清中IL-18含量的统计分析图，B为通过PCR法测得小鼠心肌内IL-18相关mRNA含量的统计分析图；

图10：A为通过Luminex法测得小鼠血清中IL-6含量的统计分析图，B为通过Luminex法测得小鼠血清中IL-10含量的统计分析图，C为通过Luminex法测得小鼠血清中TNF-α含量的统计分析图，

图5~10中，WB和PCR实验各组n=3，Luminex和Elisa实验各组n=8，IFC实验各组n=6，统计数值以平均数±标准误差（X±SEM）表示，显著性以p＜0.05表示；ns：p＞0.05，*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001，****：p＜0.0001；

图11：A为Nrf2在小鼠心肌内表达的免疫荧光图（IFC），B为p-Nrf2在小鼠心肌内表达的免疫荧光图，C为HO-1在小鼠心肌内表达的免疫荧光图，D为NQO1在小鼠心肌内表达的免疫荧光图，E为小鼠心肌内Nrf2、p-Nrf2、HO-1及NQO1的蛋白印迹图（WB），其中，WB和PCR实验各组n=3，Luminex和Elisa实验各组n=8，IFC实验各组n=6，统计数值以平均数±标准误差（X±SEM）表示，显著性以p＜0.05表示；ns：p＞0.05，*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001，****：p＜0.0001；

图12：A为心肌内Nrf2通过WB实验测定含量的统计分析图，B为心肌内Nrf2相关mRNA通过PCR实验测定含量的统计分析图，C为为心肌内Nrf2通过IFC实验测定含量的统计分析图；

图13：A为心肌内p-Nrf2通过WB实验测定含量的统计分析图，B为心肌内p-Nrf2通过IFC实验测定含量的统计分析图；

图14：A为通过WB法测得小鼠心肌内HO-1含量的统计分析图，B为通过PCR法测得小鼠心肌内HO-1相关mRNA含量的统计分析图，C为通过IFC法测得小鼠心肌内HO-1含量的统计分析图；

图15：A 为通过WB法测得小鼠心肌内NQO1含量的统计分析图，B为通过PCR法测得小鼠心肌内NQO1相关mRNA含量的统计分析图，C为通过IFC法测得小鼠心肌内NQO1含量的统计分析图；

图12~15中，WB和PCR实验各组n=3，Luminex和Elisa实验各组n=8，IFC实验各组n=6，统计数值以平均数±标准误差（X±SEM）表示，显著性以p＜0.05表示；ns：p＞0.05，*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001，****：p＜0.0001。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，2⁃氰基⁃3，12⁃二氧齐墩果烷⁃1，9（11）⁃二烯⁃28⁃酸甲酯（bardoxolone methyl，CDDO⁃Me），即甲基巴多索隆，其结构式如下：

目前CDDO⁃Me主要用于慢性肾病、肺动脉高压及肿瘤、癌症的治疗。美国FDA已授予CDDO-Me用于Alport综合征和肺动脉高压治疗的孤儿药地位，但有研究称CDDO⁃Me在心脏方面存在安全性隐患，对心肌细胞产生毒性。所以目前尚未有CDDO-Me甲基巴多索隆用于治疗心肌炎的相关报道。

基于此，本发明的目的是提供甲基巴多索隆在制备改善病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的药物中的用途。病毒性心肌炎会导致心肌结构的改变，并出现心功能的减退和各种心律失常，甚至发生心脏骤停。但该病根本上是与病毒相关的炎性疾病，随后出现免疫反应及后续的病变。

NLRP3炎症小体是一种由多种蛋白组成的复合物，包含NLRP3、ASC和pro-caspase-1三部分组成，其组成的复合物可以激活 caspase-1，从而介导促炎细胞因子例如 IL-1β和IL-18 的成熟和分泌。NLRP3炎症小体的激活与细菌、病毒等微生物感染密切相关。病毒感染后，炎性小体被激活，炎性小体激活后又会进一步激活炎性因子IL-1β、IL-18，引起后续的炎症反应。Nrf2作为体内重要的抗炎抗氧化因子，对机体有重要的保护作用。在多种疾病中，Nrf2都起着十分重要的抗炎作用。本发明研究发现CDDO-Me除了具有通过激活Nrf2/HO-1信号通路，降低炎性因子TNF-α、IL-6、IL-10的表达这一传统抗炎方式外，还能抑制心肌内NLRP3炎症小体的激活，降低炎性因子IL-1β、IL-18的表达，进一步发挥抗炎作用。病毒性心肌炎患病后，尤其在免疫激活期，心肌结构会发生改变，出现水肿、坏死、大量炎症细胞浸润等表现，CDDO-Me可以抑制心肌结构的改变和炎症细胞的浸润；从而治疗由柯萨奇B3病毒引起的心肌炎或心肌损伤，为开发新的治疗病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的药物提供了理论支持。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

说明：CVB3病毒购自山东省医学科学院；申请人持有此毒株，并愿意按专利法相关规定自申请日起20年内向公众发放。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例

1.试验方法

1.1化学试剂及主要仪器

0.25%胰蛋白酶溶液（美国Invitrogen），BCA蛋白定量试剂盒（中国碧云天生物技术有限公司），CDDO-Me（美国Med Chem Express），ECL发光试剂盒（上海翊盛生物科技有限公司），FastPure细胞/组织总RNA 提取试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），HE染液试剂盒（中国碧云天生物技术有限公司），HiScript® III All-in-one RT SuperMixPerfect for qPCR （南京诺唯赞生物科技股份有限公司），RIPA裂解液（强）（中国碧云天生物技术有限公司），小鼠CK-MB、cTn-I、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、TNF-α ELISA 试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技公司），抗ASC抗体（美国CellSignaling Technology），抗Caspase 1抗体（中国武汉三鹰），抗HO-1抗体（英国abcam公司），抗NLRP3抗体（美国Thermofisher），抗NQO1抗体（英国abcam公司），抗Nrf2抗体（美国Thermofisher公司），抗p-Nrf2抗体（美国Thermofisher），抗β-actin 抗体（中国 Sungene生物），引物设计合成（济南博尚生物技术有限公司），荧光二抗（武汉赛维尔生物科技有限公司），自发荧光淬灭剂（武汉赛维尔生物科技有限公司），Vevo2100小动物超声成像系统（富士Visual Sonics公司）。

1.2实验动物及方法

取72只6周龄雄性SPF级Balb/c小鼠（采购自北京维通利华实验动物技术有限公司）适应性饲养1周后，随机分为4组：空白对照组、单纯药物组（注射CDDO-Me）、模型组（注射CVB3病毒液）和实验组（注射CVB3病毒液+CDDO-Me），每组18只。将CVB3病毒液（10⁸TCID50）用PBS缓冲液稀释10倍后得到病毒注射液，第0天模型组和实验组按照100μL/只的腹腔单次注射病毒注射液建立病毒性心肌炎模型；空白对照组和单纯药物组给予100μl/只的PBS缓冲液腹腔注射作为对照。

自第1天， 单纯药物组和实验组按照5mg/kg/24h给予CDDO-Me腹腔注射，给药浓度为0.5mg/ml，给药体积为10mL/kg；空白对照组和模型组给予相同体积的生理盐水腹腔注射，每天一次，连续10天。每日检测小鼠体重及状态。第10天记录体重和生存曲线，将存活小鼠完善心脏彩超。后应用戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射对小鼠进行麻醉处理，待麻醉状态满意，打开胸腔暴露心脏，心尖区取血留取血清置于-80℃冻存。取材心脏，应用生理盐水将残余血液及破碎组织冲洗干净后，将每个心脏分为两部分，一部分置于4%多聚甲醛中浸泡，另一部分液氮速冻后置于-80℃冻存，待用作后续实验。

1.3心脏超声检查

去除小鼠胸前鼠毛，暴露皮肤，并给予1.5%异氟烷持续吸入麻醉，麻醉气体流速根据麻醉状态调节。应用Vevo2100小动物超声成像系统（富士Visual Sonics公司），对小鼠完善心脏彩超检查。测量并记录左室收缩末期内径（LVDs）、左室舒张末期内径（LVDd）、左室前壁厚度（LVAWT）、左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（FS）。评估各组小鼠心脏结构及功能。

1.4血清学检查

将留取的血清解冻备用。使用Elabscience Elisa试剂盒检测小鼠血清IL-18水平；采用Luminex液相悬浮芯片检测小鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10水平，严格按照说明书进行上述操作。

1.5蛋白印迹实验

取出冻存的心脏组织，切除多余组织，将心肌切成1mm大小，用预冷PBS溶液冲洗两遍，去除残留血液和破碎组织。应用研钵和液氮将组织磨得尽可能碎。将磨碎的心脏组织移入1.5ml的ep管中，依照说明书加入适量组织裂解液，放在冰上裂解30分钟，离心后取上清液。应用BCA试剂盒测量各样本蛋白液浓度，配成2μg/μl蛋白溶液。向SDS-PAGE凝胶中加入20μg蛋白提取液进行电泳，并按照Western Blotting标准方法进行后续操作，测定蛋白中Nrf2、p- Nrf2、HO-1、醌氧化还原酶1(NQO1)和NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）的蛋白水平。并应用ImageJ软件测定灰度值，并以β-actin作为内参蛋白进行标准化比较。

1.6RT-PCR实验

按上述处理并研磨心肌组织，加入总RNA提取液制备好RNA提取液，并测定浓度。每个样品取500ng通过RT-PCR试剂盒逆转录成C-DNA、扩增，通过实时荧光定量心肌组织Nrf2、HO-1、NQO1和NLRP3、ASC、caspase-1、IL-lβ、IL-18的mRNA相对表达量。引物设计由济南博尚生物技术有限公司完成。

1.7苏木精-伊红染色和免疫荧光实验

将提前浸泡在4%多聚甲醛溶液中的心脏组织进行石蜡包埋，制成5μm厚度的石蜡切片。进行苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察心肌组织结构变化。进行免疫荧光实验，荧光显微镜下观察并采集图像，通过ImageJ软件定量分析小鼠心肌组织中Nrf2、p- Nrf2、HO-1、NQO1和NLRP3、ASC、caspase-1的蛋白水平。

1.8统计与分析

应用Graphpad Prism9软件对数据进行统计与分析，测量数据以平均数±标准差表示（X±S）。检验各组数据的正态分布性及方差齐性，应用单因素方差分析比较各组数据差异及显著性，显著性以P＜0.05表示。

2.结论

2.1CDDO-Me提高了病毒性心肌炎小鼠的生存率并改善了体重情况

如图1所示，CVB3组小鼠十天的生存率仅为50%，远低于对照组和CDOO-Me组的100%，而实验组小鼠生存率为72.2%，高于模型组，具有统计学意义。如图1C所示，模型组小鼠平均体重在实验第2天起就低于对照组，实验组较模型组略高，但仍低于对照组小鼠平均体重。

2.2 CDDO-Me降低了心肌损伤标志物水平

CK-MB和cTnI作为心肌损伤的标志物，临床上常用来辅助评估病毒性心肌炎心肌损伤的程度以及恢复情况。如图2所示，小鼠注射CVB3后，血清中心肌损伤标志物显著性升高，给予CDOO-Me干预后心肌损伤得到了减轻。图2A和图2B中分布可以看出，CVB3组即模型组小鼠血清中CK-MB和cTnI较对照组均有显著升高，具有统计学意义。经过CDDO-Me治疗后，两种心肌坏死标志物均较模型组有显著性下降。

2.3CDD0-Me减轻了心肌重构

病毒性心肌炎患病后，尤其在免疫激活期，心肌结构会发生改变，出现心肌水肿、溶解坏死、大量炎症细胞浸润等表现，从而出现心室增大、心脏收缩功能下降。如图3所示，CDDO-Me减轻了小鼠由于CVB3感染导致的心肌重构。图3A可看出，对照组和单纯注射CDDO-Me组小鼠心脏大小形态正常，表面光滑；而疾病模型组和实验组心脏有所增大，心外膜表面不光滑，可见大量白斑，以疾病模型组为著。图3B为小鼠心肌HE染色切片，Control组和CDDO-Me组小鼠心肌细胞大小正常，形态均匀，心肌纤维排列整齐，分布均匀密集，肌纤维结构清晰，间质未见明显的炎性细胞浸润。与之对比，CVB3组和CVB3+CDDO-Me组小鼠心肌细胞大小不一，形态不均匀，可见不同程度心肌细胞水肿，溶解坏死，肌纤维排列紊乱，部分心肌细胞可见空泡样改变伴有大量间质炎性细胞的浸润。CVB3+CDDO-Me组与CVB3组相比，心肌细胞水肿及坏死比例减少，炎症细胞浸润减少，说明心肌炎症受到抑制。图3D-H为心脏超声的统计分析结果，与对照组相比，CVB组小鼠心脏左室射血分数及左室缩短分数明显下降，收缩期末期左室内径显著增大，而实验组明显缓解这些改变，具有统计学意义。

2.4 CDDO-Me降低了小鼠心肌内NLRP3炎症小体及其下游炎性因子

病毒性心肌炎是与病毒感染相关的炎症性疾病，表现为心肌的炎性细胞浸润。本实施例通过研究证明了在CVB3感染导致的心肌炎小鼠中，CDDO-Me治疗抑制了NLRP3炎症小体的活化及其下游炎性因子的表达。如图4所示，CVB3感染后小鼠血清或心肌内NLRP3炎症小体及相关炎性因子水平升高，经CDDO-Me处理后炎性因子水平均有不同程度的下降，具有统计学意义。通过WB实验证实，模型组小鼠心肌内NLRP3、Caspase-1及ASC的含量均高于对照组小鼠（图4D、5A、6A、7A），三种蛋白相关mRNA表达也明显高于对照组（图5B、6B、7B），通过免疫荧光实验也证明了这一现象（图4A、4B、4C）。由NLRP3炎症小体激活的其余炎症因子的血清水平在模型组也高于对照组。通过Luminex法测得各组小鼠血清中IL-1β，并通过Elisa法测得小鼠血清中IL-18的水平，模型组的结果均高于对照组。通过RT-PCR法测出模型组小鼠心肌内IL-1β及IL-18相关mRNA均明显高于对照组小鼠。而这些炎性因子经CDDO-Me治疗后，均有不同程度的降低，且具有统计学意义。

2.5 CDDO-Me升高了小鼠心肌内Nrf2和HO-1的蛋白水平

前面提到，Nrf2是体内重要的抗炎物质。Nrf2激活后进入细胞核内，能够刺激下游抗炎物质如HO-1和NQO-1的合成，从而起到抗炎的作用。而磷酸化是Nrf2激活的重要环节，从而进行后续的抗炎调节。

实验证实了CDDO-Me能够激活Nrf2/HO-1信号通路，提高小鼠体内Nrf2、p-Nrf2、HO-1及NQO1的水平。通过WB实验和IFC实验测定了小鼠心肌内上述蛋白的含量（见图11A、11B、11C、11D、11E和12A、12C、13A、13B、14A、14C、15AB、15C），同时通过RT-PCR法测定小鼠心肌内了Nrf2、HO-1和NQO1相关mRNA的含量（图12B、14B和15B）。从结果可以看出，CVB3感染后小鼠心肌内Nrf2/HO-1信号通路被抑制，上述抗炎因子的含量和相关mRNA的表达均较对照组降低，而通过CDDO-Me干预，又激活了Nrf2/HO-1信号通路，从而起到抗炎作用，具有统计学意义。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (6)

1.甲基巴多索隆在制备改善病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤是由嗜心性病毒感染引起的病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述嗜心性病毒为柯萨奇B3病毒。

4.一种治疗病毒性心肌炎或病毒性心肌损伤的药物，其特征在于，所述药物以0.5mg/ml的甲基巴多索隆为有效成份。

5.甲基巴多索隆在制备降低血清中CK-MB和cTnI含量的药物中的用途。

6.甲基巴多索隆在制备抑制心肌结构和功能改变的药物中的用途。