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CN116509834A - 化合物在制备造血干/祖细胞增殖和损伤修复药物中的应用 - Google Patents

化合物在制备造血干/祖细胞增殖和损伤修复药物中的应用 Download PDF

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CN116509834A CN202310063075.3A CN202310063075A CN116509834A CN 116509834 A CN116509834 A CN 116509834A CN 202310063075 A CN202310063075 A CN 202310063075A CN 116509834 A CN116509834 A CN 116509834A
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Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别涉及化合物在制备造血干/祖细胞增殖和损伤修复药物中的应用。本发明提供的黄芩素类化合物具有抑制STS1和STS2磷酸酶活性从而增加造血干/祖细胞中FLT3和cKIT的磷酸化水平的作用，于体外可促进小鼠骨髓及人脐血造血干祖细胞增殖、分化，体内应用亦可增强正常小鼠骨髓中造血干/祖细胞比例及其集落形成能力，同时对化疗、放疗等导致的骨髓抑制/损伤具有明显的改善作用。因此，黄芩素类化合物可用于体外造血干/祖细胞的扩增，也可用于体内需要增强或改善骨髓造血的生理情况及化疗、放疗等导致的骨髓抑制/损伤等病理疾病的预防和治疗。

Description

化合物在制备造血干/祖细胞增殖和损伤修复药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及化合物在制备造血干/祖细胞增殖和损伤修复药物中的应用。
背景技术
造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)是具有自我更新和分化成各系成熟血细胞能力的多能干细胞，在生理状态下血液系统稳态的维持以及病理状态下血液系统重建等过程中发挥重要作用。造血干细胞移植是HSCs最重要的临床应用之一，是多种恶性血液肿瘤患者唯一有效的治疗手段。移植所需的HSCs一般来自骨髓或动员的外周血，近年来人脐带血HSCs由于采集方便、免疫原性弱、人类白细胞抗原表达较低等优点也逐渐成为HSCs的来源，但移植常因HSCs数量较少而受限；另一方面体内HSCs对化疗药物、电离辐射极为敏感，患者接受放、化疗后会出现骨髓抑制等症状，严重影响患者的生存质量和治疗效果，成为恶性肿瘤患者进行有效放、化疗的主要障碍。因此，如何在体内、外提高HSCs的增殖能力并且有效促进造血功能活性、增强其抵抗外界应激的能力，是目前造血干细胞领域的研究热点。由于小分子化合物具有成本低、性质稳定，且可精准调控等优点，因此开发出能促进造血干细胞功能的小分子化合物在临床上更具应用前景。
T细胞受体信号抑制因子1(suppressor ofT-cell receptor signaling 1，STS1)广泛存在于各组织中，STS2则特定存在于造血组织中，二者均具有磷酸酶活性，可负性调控细胞内部分蛋白质磷酸化水平信号转导。前期的研究证明，STS1和STS2敲除小鼠的骨髓中MPPs和LMPPs细胞群明显扩增且集落形成能力增强，说明缺失STS1和STS2促进了小鼠造血祖细胞的扩增，虽然HSCs的数量没有变化，但是小鼠骨髓HSPC的长期造血重建能力明显提高；体外研究证明，造血干/祖细胞(Hematopoietic stem progenitor cells，HSPC)中特性表达的标志物FMS样酪氨酸激酶3(fms-like tyrosine kinase，FLT3)和干细胞因子受体cKIT是STS1和STS2磷酸酶的底物，缺失STS1和STS2可导致细胞中FLT3和cKIT的高度磷酸化，进而增强下游信号转导。结合以上结果，说明在小鼠体内敲除STS1/STS2，可能通过促进HSPC中FLT3和cKIT的磷酸化和下游信号转导，进而提高小鼠HSPC的增殖分化能力和移植后的造血恢复能力，由此说明，STS1和STS2有可能是增强造血干细胞功能活性的潜在药物靶点。
黄芩素主要存在于黄芩中，是黄酮类化合物，其结构特征是指含有黄酮母核的一类化合物。已有研究表明黄芩素具有抗炎抗菌、抗血小板凝集等药理作用。迄今，有关黄芩素抑制STS1和STS2磷酸酶活性，促进HSPC扩增和分化功能，尤其其对骨髓抑制的改善作用还未见任何研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一类小分子化合物即黄芩素类化合物作为STS1和STS2的磷酸酶抑制剂在制备促进造血干/祖细胞增殖和损伤修复药物中的应用，其可用于体内、外造血干/祖细胞的扩增以及治疗化疗或放疗等导致的骨髓抑制/损伤的相关疾病。有鉴于此，本发明提供了化合物在制备造血干/祖细胞增殖和损伤修复药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供黄酮类化合物在制备STS1抑制剂和/或STS2抑制剂中的应用。
在本发明的部分具体实施方案中，所述黄酮类化合物包括黄芩素类化合物、其衍生物、其类似物、其可药用盐、其前药或其代谢物中的一种或多种。所述黄芩素类化合物包括但不限于黄芩素、汉黄芩素、野黄芩素、千层纸素、白杨素或柳穿鱼黄素中的一种或多种。
在本发明的部分具体实施方案中，所述黄酮类化合物
(I)、抑制STS1和/或STS2磷酸酶活性；和/或
(II)、提高底物的磷酸化水平。所述底物包括但不限于FLT3和/或cKIT。
本发明提供黄酮类化合物在制备如下任意项的药物中的应用；
(I)、体内促进造血干/祖细胞增殖和/或分化；和/或
(II)、体外促进造血干/祖细胞增殖和/或分化；和/或
(III)、增强骨髓中造血干/祖细胞比例和/或集落形成能力；和/或
(IV)、预防、改善和/或治疗放疗导致的骨髓抑制和/或损伤；和/或
(V)、预防、改善和/或治疗放疗导致的骨髓抑制和/或损伤；和/或
(VI)、降低辐射的死亡率；和/或
(VII)、预防和/或治疗造血损伤。
在本发明的部分具体实施方案中，所述造血干/祖细胞来源于骨髓或脐血。
在本发明的部分具体实施方案中，所述抑制和/或损伤由5-FU和/或辐射导致。
在本发明的部分具体实施方案中，所述黄酮类化合物包括黄芩素类化合物、其衍生物、其类似物、其可药用盐、其前药或其代谢物中的一种或多种。
在本发明的部分具体实施方案中，所述黄芩素类化合物包括但不限于黄芩素、汉黄芩素、野黄芩素、千层纸素、白杨素或柳穿鱼黄素中的一种或多种。
本发明提供了一种黄芩素类化合物在制备可体内、外促进造血干/祖细胞扩增和分化功能以及改善骨髓抑制药物中的应用。本发明首先克隆表达了STS1和STS2磷酸酶结构域重组蛋白，并建立了其体外磷酸酶活性检测方法，利用该检测方法筛选出黄芩素(baicalein，BC)可显著抑制STS1和STS2磷酸酶活性，其后又证明BC可与STS1和STS2结合及抑制细胞内STS1和STS2的磷酸酶活性，从而增加FLT3和cKIT的磷酸化水平；BC体外处理分离的小鼠骨髓有核细胞和人脐血造血干/祖细胞(Hematopoietic stem progenitorcells，HSPC)，可显著促进小鼠和人造血干/祖细胞的扩增及功能；而体内注射BC亦可显著增加正常小鼠骨髓中造血干/祖细胞的比例及其分化能力，同时可改善5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)和辐射导致的骨髓抑制，增加5-FU损伤小鼠骨髓中造血干/祖细胞的比例及增强其分化功能，从而减少5-FU和辐射导致的小鼠死亡。以上证据均提示黄芩素作为STS1和STS2磷酸酶抑制剂，具有提高造血干/祖细胞增殖、分化能力和防治骨髓损伤的药理学作用。因此，黄芩素类化合物具有在未来开发为促进造血干细胞增殖、分化和治疗、预防造血损伤药物的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示STS1和STS2磷酸酶结构域重组蛋白表达、纯化后SDS-PAGE分析结果图，其中A：STS1重组蛋白的分析结果图，B：STS2重组蛋白的分析结果图；
图2示STS1和STS2体外磷酸酶活性检测结果图，其中A：STS1重组蛋白的体外磷酸酶反应曲线，B：STS2重组蛋白的体外磷酸酶反应曲线，数据表示为均数±标准差(n＝3)；
图3示STS1和STS2磷酸酶抑制剂筛选结果图，其中A：STS1磷酸酶抑制剂筛选结果图，图中红色圆圈代表筛选到的目标小分子，B：STS2磷酸酶抑制剂筛选结果图，数据表示为均数±标准差(n＝6)；
图4示黄芩素体外抑制STS1和STS2磷酸酶活性的结果图，数据表示为均数±标准差(n＝6)；
图5示黄芩素与STS1和STS2磷酸酶结构域分子对接结果图，其中A：黄芩素与STS1磷酸酶结构域分子对接结果图(左：结合模型的3D展示；右：疏水作用2D展示)，B：黄芩素与STS2磷酸酶结构域分子对接结果图(左：结合模型的3D展示；右：疏水作用2D展示)；
图6示黄芩素(BC)与STS1和STS2重组蛋白结合的毛细管电泳分析结果图，其中A：黄芩素与STS1重组蛋白结合的毛细管电泳分析结果图，红色箭头代表STS1蛋白峰，B：黄芩素与STS2重组蛋白结合的毛细管电泳分析结果图，蓝色箭头代表STS2蛋白峰；
图7示黄芩素(BC)抑制细胞内STS1和STS2磷酸酶活性进而增加FLT3磷酸化水平的Westernblot结果图，其中A：BC增加细胞内外源表达的FLT3磷酸化水平，B：BC解除过表达STS1对FLT3磷酸化水平的抑制作用，C：BC解除过表达STS2对FLT3磷酸化水平的抑制作用；
图8示黄芩素(BC)抑制细胞内STS1和STS2磷酸酶活性进而增加cKIT磷酸化水平的Westernblot结果图，其中A：BC增加细胞内外源表达的cKIT磷酸化水平，B：BC解除过表达STS1对cKIT磷酸化水平的抑制作用，C：BC解除过表达STS2对cKIT磷酸化水平的抑制作用；
图9示黄芩素(BC)体外促进小鼠原代骨髓单个核细胞增殖的结果图，数据表示为均数±标准差(n＝3)，**表示与DMSO组相比P<0.01；
图10示黄芩素(BC)体外增加小鼠原代骨髓单个核细胞中LSK细胞比例的结果图，其中A：LSK细胞流式分析代表图，B：LSK细胞比例数据统计图，数据表示为均数±标准差(n＝3)，**P<0.01；
图11示黄芩素(BC)体外增加小鼠原代骨髓造血干/祖细胞集落形成数量的结果图，CFU-GM：粒细胞-巨噬细胞集落形成单位，BFU-E：爆式红细胞集落形成单位，CFU-GEMM：粒细胞-红细胞-巨噬细胞-巨核细胞集落形成单位，数据表示为均数±标准差(n＝3)，*表示与Control组相比P<0.05，**表示与Control组相比P<0.01；
图12示黄芩素(BC)体外增加人脐血造血干/祖细胞比例的结果图，其中A：黄芩素处理后人脐血CD34+细胞中造血干/祖细胞群(CD34+CD38-)、造血干细胞群(CD34+CD38-CD45RA-CD90+)代表性流式细胞分析图，B：统计学分析造血干/祖细胞群
(CD34+CD38-)占培养的CD34+细胞的比例，C：统计学分析造血干细胞群(CD34+CD38-CD45RA-CD90+)占培养的CD34+细胞的比例，数据表示为均数±标准差(n＝3)，*P<0.05，**P<0.01；
图13示黄芩素(BC)体外增加人脐血造血干/祖细胞集落形成数量的结果图，CFU-GM：粒细胞-巨噬细胞集落形成单位，BFU-E：爆式红细胞集落形成单位，CFU-GEMM：粒细胞-红细胞-巨噬细胞-巨核细胞集落形成单位，数据表示为均数±标准差(n＝3)，*表示与Control组相比P<0.05，**表示与Control组相比P<0.01；
图14示连续7d腹腔注射黄芩素(BC)增加正常小鼠骨髓中造血干/祖细胞比例的结果图，其中A：小鼠骨髓造血干/祖细胞流式分析代表图，B：造血干/祖细胞比例统计图，造血干/祖细胞(LSK，Lin-Sca1+cKit+)，长期造血干细胞(LT-HSCs，Lin-Sca1+cKit+CD34-FLT3-)，短期造血干细胞(ST-HSCs，Lin-Sca1+cKit+CD34+FLT3-)，多潜能祖细胞(MPPs，Lin-Sca1+cKit+CD34+FLT3+)，数据表示为均数±标准差(n＝3)，*表示与Control组相比P<0.05，**表示与Control组相比P<0.01；
图15示连续7d腹腔注射黄芩素(BC)增强正常小鼠骨髓造血干/祖细胞集落形成能力的结果图，CFU-GM：粒细胞-巨噬细胞集落形成单位，BFU-E：爆式红细胞集落形成单位，CFU-GEMM：粒细胞-红细胞-巨噬细胞-巨核细胞集落形成单位，各集落数量数据表示为均数±标准差(n＝3)，*表示与Control组相比P<0.05，**表示与control组相比P<0.01；
图16示体内注射黄芩素保护5-FU损伤小鼠的结果图，其中A：小鼠每日体重监测，B：小鼠存活率曲线，数据表示为均数±标准差(n＝10)，*表示与control相比P<0.05；
图17示体内注射黄芩素(BC)缓解5-FU对小鼠骨髓损伤的结果图，其中A：单侧股骨骨髓有核细胞数计数，数据表示为均数±标准差(n＝5)，##表示与control组相比P<0.01，**表示与5-FU组相比P<0.01，B：股骨骨髓组织HE染色，比例尺＝100μm；
图18示体内注射黄芩素(BC)增加5-FU损伤小鼠骨髓造血干/祖细胞比例的结果图，其中A：5-FU损伤小鼠骨髓造血干/祖细胞流式分析代表图，B：造血干/祖细胞比例统计图，C：造血干/祖细胞数量统计图，造血干/祖细胞(LSK，Lin-Sca1+cKit+)，长期造血干细胞(LT-HSCs，Lin-Sca1+cKit+CD34-FLT3-)，短期造血干细胞(ST-HSCs，Lin-Sca1+cKit+CD34+FLT3-)，多潜能祖细胞(MPPs，Lin-Sca1+cKit+CD34+FLT3+)，数据表示为均数±标准差(n＝5)，##表示与control组相比P<0.01，**表示与5-FU组相比P<0.01；
图19示体内注射黄芩素(BC)增强5-FU损伤小鼠骨髓造血干/祖细胞集落形成能力的结果图，CFU-GM：粒细胞-巨噬细胞集落形成单位，BFU-E：爆式红细胞集落形成单位，CFU-GEMM：粒细胞-红细胞-巨噬细胞-巨核细胞集落形成单位，各集落数量数据表示为均数±标准差(n＝3)，##表示与control组相比P<0.01，**表示与5-FU组相比P<0.01；
图20示体内注射黄芩素(BC)保护致死辐射剂量照射小鼠的结果图，其中A：小鼠每日体重监测，数据表示为均数±标准差(n＝8)；B：小鼠存活率曲线(n＝8)。
具体实施方式
本发明公开了化合物在制备造血干/祖细胞增殖和损伤修复药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和
改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种黄芩素类化合物在制备可体内、外促进造血干/祖细胞扩增和分化以及改善骨髓抑制药物中的应用。
本发明首先克隆表达了STS1和STS2磷酸酶结构域重组蛋白，并建立了其体外磷酸酶活性检测方法，利用该检测方法筛选出黄芩素(baicalein，BC)可显著抑制STS1和STS2磷酸酶活性，其后又证明BC可与STS1和STS2结合及抑制细胞内STS1和STS2的磷酸酶活性，从而增加FLT3和cKIT的磷酸化水平；BC体外处理分离的小鼠骨髓单个核细胞和人脐血造血干/祖细胞(Hematopoietic stem progenitor cells，HSPC)，可显著促进小鼠骨髓和人脐血中HSPC的扩增及功能；而体内注射BC亦可显著增加正常小鼠骨髓中HSPC的比例及增强其分化能力，同时可改善5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)和辐射导致的骨髓抑制，增加5-FU损伤小鼠骨髓中HSPC的比例及增强其分化功能，从而减少5-FU和辐射导致的小鼠死亡。以上证据均提示黄芩素作为STS1和STS2磷酸酶抑制剂，具有提高HSPC增殖、分化能力和防治骨髓损伤的药理学作用。因此，黄芩素具有在未来开发为促进造血干细胞增殖、分化和治疗、预防造血损伤药物的潜力。
在本发明中，所述黄芩素的结构类似物是指含有黄酮母核的一类化合物。
在本发明中，所述含有黄酮母核的一类化合物是指汉黄芩素、野黄芩素、千层纸素、白杨素、柳穿鱼黄素中的一种或几种。
在本发明中，所述黄芩素类化合物作为STS1和STS2抑制剂，指的是抑制STS1和STS2的磷酸酶活性，从而提高其底物包括FLT3和cKIT的磷酸化水平。
在本发明中，所述黄芩素类化合物可于体外，增加离体培养的小鼠骨髓中以及人脐血中的造血干/祖细胞比例及增强其集落形成能力。
在本发明中，所述黄芩素类化合物体内应用时增加正常小鼠骨髓中造血干/祖细胞比例及增强其集落形成能力；同时，其体内应用可缓解化疗或辐射导致的骨髓抑制，包括提升损伤骨髓中造血干/祖细胞比例及集落形成能力，并降低小鼠死亡率。
本发明发现式(I)所示的黄芩素类化合物具有促进造血干/祖细胞扩增和分化功能以及改善骨髓抑制的作用，主要基于以下研究结果：
(1)STS1和STS2磷酸酶结构域重组蛋白的表达、纯化(图1)：利用原核表达质粒在原核细胞中经IPTG诱导表达STS1(图1A)和STS2(图1B)磷酸酶结构域重组蛋白，
然后利用Ni-NTA层析柱纯化获得高纯度重组蛋白，SDS-PAGE联合考马斯亮蓝染色证明我们获得了蛋白浓度和纯度都较高的STS1(图1A)和STS2(图1B)重组蛋白，可用于后续研究。
(2)STS1和STS2磷酸酶结构域重组蛋白体外磷酸酶活性检测(图2)：选择不同浓度的PNPP作为底物，分别与25nmol/L STS1和2.5μmol/L STS2进行酶促反应，反应均在室温下进行，STS1与PNPP的反应时间为10min，STS2与PNPP的反应时间为20min，反应结束后测定产物在405nm波长下的吸光值，并根据公式Velocity(mmol/L/min)
＝OD405/time/lightpath(cm)/molar extinction coefficient(Molarextinction coefficient for pNP is 18mmol/L-1cm-1)计算不同底物浓度下的反应速度V，然后利用Graphpad Prism 8.0，对底物浓度和速度V进行非线性的拟合，得到STS1和STS2酶促反应的米氏方程。结果显示STS1酶促反应的最大反应速度Vmax为0.1015mmol/L/min，Km为3.512mmol/L(图2A)，STS2磷酸酶酶促反应的Vmax为0.04053mmol/L/min，Km为5.364mmol/L(图2B)。说明通过原核表达及纯化获得的重组STS1和STS2磷酸酶具有良好的酶活，可以用于后续的磷酸酶抑制剂的筛选。
(3)STS1和STS2磷酸酶抑制剂的筛选(图3)：利用上述建立的STS1和STS2体外磷酸酶反应体系，加入各中药单体化合物(终浓度为10μg/mL)筛选对STS1或STS2磷酸酶发挥抑制作用的备选化合物。筛选结果显示总共有2个化合物(圆圈所示)对STS1磷酸酶活性的抑制率大于20％，并达到统计学显著性(图3A)，其中之一为黄芩素(BC)，抑制率约为25％。但由于STS2磷酸酶活性比较低，未获得抑制作用达到判定标准的化合物(图3B)。
(4)黄芩素体外抑制STS1和STS2磷酸酶活性(图4)：再次利用上述建立的STS1和STS2体外磷酸酶反应体系，加入黄芩素(终浓度为10μg/mL)确认黄芩素对STS1或STS2体外磷酸酶活性的影响。结果显示，黄芩素对STS1磷酸酶活性抑制率为25％，与筛选时的结果相近，同时亦对STS2磷酸酶活性具有一定的抑制作用，抑制率为13.77％。该结果说明黄芩素对STS1和STS2的磷酸酶活性均具有一定的抑制作用。
(5)黄芩素与STS1和STS2磷酸酶结构域结合(图5～6)：使用GOLD5.2软件，以PubChem数据库中黄芩素三维构象为配体，以RCSB PDB数据库中STS1或STS2组氨酸磷酸酶结构域晶体结构为受体进行分子对接，根据GOLDscore主打分函数和ASPscore重复打分函数评价黄芩素与STS1或STS2蛋白直接的结合能力。表7显示黄芩素与STS1和STS2分子对接的Goldscore分别为51.64和54.33，打分函数均大于50，提示黄芩素与STS1和STS2磷酸酶结构域间可能存在相互作用。图5显示的是黄芩素与STS1(图5A)和STS2(图5B)蛋白分子对接的模拟图。从图中可见，黄芩素通过氢键(图5A左)及疏水作用力(图5A右)与STS1蛋白相互作用；同时亦通过氢键(图5B左)及疏水作用力(图5B右)与STS2蛋白相互作用。以上计算机模拟结果提示，黄芩素与STS1和STS2磷酸酶结构域都有良好的结合。
在以上计算机模拟结合的基础上，我们又采用毛细管电泳直接检测黄芩素(BC)与STS1或STS2重组蛋白的体外结合(图6)，从图6A可以看到，加入黄芩素后，STS1蛋白的峰值与不加化合物相比发生了滞后迁移；同样，图6B显示，加入黄芩素后，STS2蛋
白的峰值也明显发生了滞后迁移。因此，该结果进一步证明黄芩素可与STS1和STS2蛋白结合。
(6)黄芩素抑制细胞内STS1和STS2磷酸酶活性(图7～8)：为了进一步明确黄芩素是否抑制细胞内STS1和STS2的磷酸酶活性，我们在293T细胞内通过质粒转染表达STS1和STS2的底物蛋白FLT3和cKIT，然后利用western blot检测FLT3和cKIT的磷酸化水平。首先，使用黄芩素(BC)处理仅外源表达FLT3或cKIT的293T细胞，结果显示黄芩素处理2min至10min，FLT3(图7A)及cKIT(图8A)磷酸化水平显著升高；且15min后cKIT磷酸化水平仍可保持高磷酸化水平(图8A)。之后，将FLT3或c-KIT表达质粒与STS1或STS2表达质粒共转染入细胞中再进行黄芩素处理。结果发现，当STS1或STS2过表达后，FLT3(图7B，C)及cKIT(图8B，C)磷酸化水平显著降低，而当黄芩素处理后，FLT3(图7B，C)及cKIT(图8B，C)磷酸化水平则有所恢复。以上结果说明黄芩素于细胞内也可以抑制STS1和STS2的磷酸酶活性并因此促进FLT3和cKIT的磷酸化水平。
(7)黄芩素在体外促进小鼠骨髓造血干/祖细胞增殖和分化(图9～11)：分离获得小鼠骨髓单个核细胞(BMMNCs)并于体外培养，同时进行黄芩素处理，以观察黄芩素体外对小鼠骨髓中造血干/祖细胞(HSPC)增殖和分化的影响。首先细胞计数结果如图9显示，在培养14d时，黄芩素处理组的BMMNCs的数量显著高于未处理组的细胞数，而培养至第17d时，黄芩素处理组细胞数仍高于未处理组，以上结果说明黄芩素促进BMMNCs中HSPC的增殖，使其长时间保持在稳定增长的状态。其后流式细胞术分析体外培养小鼠BMMNCs中LSK(Lin-sca1+ckit+)造血干/祖细胞比例，结果如图10所示，培养至第4d时，黄芩素处理的BMMNCs中LSK细胞的比例显著高于对照组；培养至第7d时，黄芩素处理组LSK细胞比例亦显著高于对照组，以上结果表明黄芩素可以促进体外培养条件下小鼠BMMNCs中HSPC扩增。最后通过集落形成实验分析了体外培养的小鼠HSPC的分化能力，结果如图11所示，与对照组细胞相比，黄芩素处理的小鼠BMMNCs集落总数及各谱系集落的数量均显著增加，且无明显的偏系分化，说明黄芩素可以提高小鼠HSPC的分化能力。以上结果说明黄芩素可以提高小鼠造血干/祖细胞体外的增殖和分化能力。
(8)黄芩素体外促进人脐血CD34+细胞增殖和分化(图12～13)：利用磁珠分离法纯化人脐血中CD34+细胞并于体外培养，同时进行黄芩素处理，通过分析CD34+中HSPC比例及集落形成能力观察黄芩素对人脐血HSPC体外增殖和分化的影响。首先，图12结果显示，体外培养4d时，与对照组相比，黄芩素处理的人脐血CD34+细胞中CD34+CD38-细胞群(图12B)及CD34+CD38-CD45RA-CD90+细胞群(图12C)的比例占比均显著增高；培养第7d时，虽然黄芩素处理组的CD34+CD38-造血干/祖细胞群比例低于对照组(图12B)，但是更原始的造血干细胞群(CD34+CD38-CD45RA-CD90+)比例则要显著高于对照组(图12C)，代表性流式分析图如图12A所示。由此说明，黄芩素可以促进体外培养条件下人脐血HSPC扩增，且在培养4d时提高效果最明显。而图13结果显示，黄芩素体外处理的人脐血CD34+细胞，集落总数及各谱系的集落数量均显著增加，且具有统计学显著性，说明黄芩素可以提高人造血干/祖细胞的分化能力。上述结果证明黄芩素可于体外促进人脐血造血干/祖细胞的增殖和分化。
(9)黄芩素于体内促进正常小鼠骨髓造血干/祖细胞增殖和分化(图14～15)：正常小鼠连续7天腹腔注射黄芩素(BC)，然后分析小鼠骨髓中造血干/祖细胞(HSPC)增殖和分化能力。首先，图14显示，连续7d腹腔注射黄芩素后，小鼠BMMNCs中造血干/祖细胞LSK占比与对照组相比显著提高；更深入的分析显示，与对照组小鼠相比，黄芩素处理后长期HSCs(long term HSCs,LT-HSCs)、短期HSCs(short term HSCs,ST-HSCs)和多潜能祖细胞(multi-pluoripoentprogenitor cells,MPPs)的比例均显著升高。该结果表明，黄芩素可能更大程度上提高了小鼠骨髓造血干细胞中更为原始细胞的比例，可能促进了其自我更新的能力。同时，图15结果显示，注射黄芩素7d后，小鼠骨髓HSPC形成的集落总数及各谱系集落数均显著高于对照组，同时没有发生偏系分化，且更原始的祖细胞集落CFU-GEMM数量也高于对照组。以上结果表明，体内注射黄芩素可显著提高正常小鼠骨髓造血干/祖细胞的增殖和分化能力。
(10)黄芩素对5-FU骨髓损伤小鼠具有保护作用(图16～19)：以每周注射一次致死剂量5-FU来建立化疗骨髓损伤小鼠模型，于建模前连续三天腹腔注射黄芩素观察其对5-FU骨髓损伤小鼠的保护作用。首先，图16显示第三轮注射5-FU后，黄芩素给药组小鼠体重显著高于对照组(图16A)；至实验结束，对照组小鼠已全部死于5-FU损伤时，而黄芩素剂量组小鼠的存活率为40～60％(图16B)。该实验证明预防性应用黄芩素可显著改善5-FU损伤小鼠的健康状态和存活率。进一步分析各组小鼠骨髓中细胞数量的结果如图17所示，5-FU注射后，小鼠单侧股骨骨髓细胞数量急剧下降，而黄芩素处理组小鼠骨髓细胞数显著高于模型对照组，说明黄芩素治疗部分恢复了5-FU损伤小鼠骨髓有核细胞数(图17A)；小鼠股骨骨髓HE染色结果亦显示，与模型组相比，黄芩素处理组小鼠的骨髓结构有了明显改善，骨髓细胞数量和微结构完整度也有了明显的提高(图17B)。之后的骨髓细胞流式分析结果如图18所示，与正常对照组小鼠相比，两次致死剂量5-FU注射后，骨髓细胞中LSK比例显著下降，而黄芩素处理组小鼠LSK的比例为显著高于模型组(图18B)；进一步对LSK细胞中不同细胞群的比例进行分析，黄芩素处理组LT-HSCs、ST-HSCs及MPPs细胞群的比例均显著高于未治疗模型组(图18C)。最后，图19显示致死剂量5-FU注射后，小鼠骨髓造血干/祖细胞形成的集落数显著低于正常对照组，而黄芩素处理组集落总数，以及BFU-E和CFU-GM及CFU-GEMM各集落的数量均显著高于模型组。以上结果表明预防性应用黄芩素可通过提高小鼠造血干/祖细胞的增殖和分化能力，以抵抗5-FU导致的骨髓损伤，进而提高小鼠生存率。
(11)黄芩素降低致死剂量辐射小鼠的死亡率(图20)：致死剂量X射线照射小鼠建立辐射致骨髓抑制小鼠模型，于照射前腹腔注射黄芩素。结果如图20所示，与对照组相比，黄芩素组小鼠体重有所增加(图20A)。至实验结束时，辐射对照组小鼠存活率为25％，而黄芩素组的存活率为37.5-50％，说明预防性应用黄芩素组可以在一定程度上提高辐射损伤小鼠的存活率(图20B)。综上所述黄芩素对辐射导致的骨髓损伤有预防作用。
(12)黄芩素结构类似物抑制STS1及STS2的磷酸酶活性：利用之前确认的STS1及STS2体外磷酸酶活性检测方法，检测了黄芩素结构类似物对STS1和STS2磷酸酶活性的影响。结果如表20所示，黄芩素结构类似物，包括汉黄芩素、野黄芩素、千层纸素、白杨素、柳穿鱼黄素对STS1和STS2的磷酸酶活性均表现出不同程度的抑制作用，因此认为
是它们结构中的共同部分在发挥此作用，推断其它具有这个共同结构的黄芩素结构类似物，也应该具有相同的抑制STS1或STS2磷酸酶活性的作用，可以作为促进造血干/祖细胞增殖、分化及改善骨髓抑制的药物。
本专利克隆表达了STS1和STS2磷酸酶结构域重组蛋白，并建立了其体外磷酸酶活性检测方法，利用该检测方法筛选出黄芩素(baicalein，BC)可显著抑制STS1和STS2磷酸酶活性，其后又证明BC可与STS1和STS2结合及抑制细胞内STS1和STS2的磷酸酶活性，从而增加FLT3和cKIT的磷酸化水平；BC体外处理分离的小鼠骨髓有核细胞和人脐血HSPC，可显著促进小鼠和人中HSPC的扩增及功能；而体内注射BC亦可显著促进正常小鼠骨髓中HSPC的增殖和分化能力，同时可改善5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)和辐射导致的骨髓抑制，增加5-FU损伤小鼠骨髓中HSPC的比例及增强其分化功能，从而减少5-FU和辐射导致的小鼠死亡。
本发明所提到的黄芩素类化合物单独或组合物，作为STS1和STS2磷酸酶活性抑制剂，用于需要加强或改善骨髓造血的其它生理或病理情况，亦在本发明的范围之内。
本发明所用黄芩素可以通过商品购买获得(源叶生物，货号：B20571)或者通过以下方法制备：范景辉，李海燕，周杨。黄芩素的制备及抗肿瘤药理作用研究进展[J]。黑龙江医药。2015，28(04):783-384；
周健，杜永峰，张文广。一种制备黄芩素的新方法。第四军医大学学报[J]。第四军医大学学报。2009，30(18)：1825-1827。
本发明所用黄芩素的结构类似物汉黄芩素(源叶生物，货号：B20489)、野黄芩素(源叶生物，货号：B21479)、千层纸素(源叶生物，货号：B20958)、白杨素(源叶生物，货号：B20063)、柳穿鱼黄素(源叶生物，货号：B20761)均可以通过商品购买获得。
本发明提供的化合物在制备造血干/祖细胞增殖和损伤修复药物中的应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1STS1和STS2磷酸酶结构域重组蛋白的表达、纯化
主要材料：pNIC28-Bsa4-STS1、pNIC28-Bsa4-STS2重组蛋白原核表达质粒由德国歌德大学血液/肿瘤医学院张晶老师惠赠(Zhang J,et al.Stem Cell Reports,2015,5(4):633-646.)；考马斯亮蓝购自Sigma-Aldrich公司；IPTG购自北京索莱宝科技有限公司；Ni SepharoseTM high performance购自GE Healthcare公司，咪唑购自Acros Organics公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，蛋白超滤管购自美国Millipore公司。
方法：在无菌1.5mL离心管中加入50μLE.coli BL21(DE3)感受态细胞，于冰上融化后，按照常规转化方法转入pNIC28-Bsa4-STS1或pNIC28-Bsa4-STS2重组质粒；获得的克隆菌，经单克隆接种培养过夜及再次接种扩大培养至对数生长期，然后进行IPTG诱导表达。其中STS1诱导表达的条件是IPTG 0.8mM，37℃诱导12h；而STS2诱导表达的条件是IPTG0.1mmol/L，37℃诱导4h。诱导后的重组菌常规方法裂解后，对重组蛋白进行镍柱亲和层析纯化，洗脱的重组蛋白使用蛋白超滤管进行脱盐浓缩，Bradford法测定蛋白浓度后，进行SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析。
结果：结果如图1所示，与未诱导组相比，诱导组分别可见目的分子量大小的STS1(图1A)或STS2(图1B)阳性重组蛋白条带，分子量均在30kDa左右，且蛋白浓度和纯度都较高。据此，我们获得了较理想的STS1和STS2重组蛋白。
实施例2STS1和STS2磷酸酶结构域重组蛋白体外磷酸酶活性检测
主要材料：对硝基苯磷酸酯(PNPP)购自Sigma-Aldrich公司。
方法：选择不同浓度的PNPP作为底物，分别与25nmol/L STS1和2.5μmol/L STS2进行酶促反应，反应均在室温下进行，STS1与PNPP的反应时间为10min，STS2与PNPP的反应时间为20min，反应结束后测定产物在405nm波长下的吸光值，并根据公式Velocity(mmol/L/min)＝OD405/time/light path(cm)/molar extinction coefficient(Molar extinctioncoefficient forpNP is 18mmol/L-1cm-1)计算不同底物浓度下的反应速度V，然后利用Graphpad Prism 8.0，对底物浓度和速度V进行非线性的拟合，得到STS1和STS2酶促反应的米氏方程。
结果：不同PNPP底物浓度下STS1和STS2磷酸酶反应产物吸光值见表1(STS1)和表3(STS2)，反应速度见表2(STS1)和表4(STS2)，据此得出酶促反应的米氏方程曲线如图2所示，图2A是STS1酶促反应的米氏方程曲线，从图中可以得知STS1酶促反应的最大反应速度Vmax为0.1015mmol/L/min，Km为3.512mmol/L，图2B是STS2酶促反应的米氏方程曲线，从图中可以得知STS2磷酸酶酶促反应的Vmax为0.04053mmol/L/min，Km为5.364mmol/L。说明通过原核表达及纯化获得的重组STS1和STS2磷酸酶具有良好的酶活，可以用于后续的磷酸酶抑制剂的筛选。
表1：不同PNPP底物浓度下STS1磷酸酶反应产物吸光值
表2：不同PNPP底物浓度下STS1磷酸酶反应速度
表3：不同PNPP底物浓度下STS2磷酸酶反应产物吸光值
表4：不同PNPP底物浓度下STS2磷酸酶反应速度
实施例3STS1和STS2磷酸酶活性抑制剂筛选
主要材料：筛选所用的292种中药单体化合物均由东北师范大学药物基因与蛋白筛选国家工程实验室提取自不同中草药，纯度大于98％；阳性对照抑制剂Na3VO4、底物对硝基苯磷酸酯(PNPP)购自Sigma-Aldrich公司。
方法：各单体化合物溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配制成1mg/mL的母液，于-20℃保存。选用96孔板筛选，每个筛药板每组设置6个重复孔，且须有一组阴性对照(即DMSO组)和一组阳性对照组(Na3VO4组，100mmol/L，pH：10.0)，筛选组各组加入待筛选的各中药单体化合物。首先向96孔板中加入3μL中药单体化合物(终浓度为10μg/mL)或对照溶液，然后向其中加入50μL PNPP，混合均匀，之后加入10μL STS1(150nmol/L)或STS2蛋白(15μmol/L)工作液，室温孵育10min(STS1)及20min(STS2)，反应后加入40μL终止缓冲液终止反应，酶标仪检测405nm处的吸光值。按照如下公式计算抑制率：抑制率(100％)＝(1-加药组OD405nm/阴性对照组OD405nm)×100％)，最后利用SPSS、Graphpad Prism8.0对抑制率和p值进行统计和分析，并筛选出抑制率超过20％且与阴性对照组存在显著差异的中药单体化合物为目标化合物。
结果：STS1磷酸酶抑制剂筛选结果(共筛选292种天然小分子化合物)见表5，STS2磷酸酶抑制剂筛选结果(共筛选263种天然小分子化合物)见表6。筛选总结结果如图3显示，图3A为STS1磷酸酶活性抑制剂筛选结果，黑色加粗显示的是黄芩素(BC)，抑制率为25％，达到统计学显著性。图3B为STS2磷酸酶活性抑制剂筛选结果，由于STS2磷酸酶活性比较低，未获得达到抑制作用判定标准的化合物。
表5：STS1磷酸酶活性抑制剂筛选结果
注：表中162号化合物为BC，显示了其对STS1的抑制率及P值。
表6：STS2磷酸酶活性抑制剂筛选结果
实施例4黄芩素体外抑制STS1和STS2磷酸酶活性
主要材料：对硝基苯磷酸酯(PNPP)购自Sigma-Aldrich公司。
方法：利用之前确认的STS1及STS2体外磷酸酶活性检测方法，在96孔板确认黄芩素对STS1和STS2磷酸酶活性的抑制作用。每组设置6个重复孔。首先向96孔板中加入3μL黄芩素(终浓度为10μg/mL)、阴性对照溶液DMSO或阳性抑制剂Na3VO4(100mmol/L，pH：10.0)，然后向其中加入50μL PNPP，混合均匀，然后加入10μL STS1(150nmol/L)或STS2(15μmol/L)蛋白工作液，室温孵育10min(STS1)及20min(STS2)，反应后加入40μL终止缓冲液终止反应，酶标仪检测405nm处的吸光值。按照如下公式计算抑制率：抑制率(100％)＝(1-加药组OD405nm/阴性对照组OD405nm)×100％。
结果：如图4所示，黄芩素对对STS1磷酸酶活性抑制率为25％，与筛选时结果相近，同时亦对STS2磷酸酶活性具有一定的抑制作用，抑制率为13.77％，说明黄芩素对STS1和STS2的磷酸酶活性均具有一定的抑制作用。
实施例5黄芩素与STS1和STS2的磷酸酶结构域结合
(1)分子对接验证黄芩素与STS1或STS2蛋白相互作用
主要材料：利用SYBYL-X及GOLD5.2软件进行分子对接，PyMol软件进行对接作图，LigPlot分析相互作用的氨基酸残基，并进行2D展示。
方法：利用SYBYL-X处理配体，生成黄芩素潜在的三维构象，作为配体集合，使用GOLD5.2软件进行分子对接研究。STS1组氨酸磷酸酶结构域晶体结构来源于RCSB PDB数据库(ID：5W5G)，STS2组氨酸磷酸酶结构域晶体结构来源于RCSB PDB(ID：5WDI)，将蛋白晶体结构作为受体，黄芩素的结构来源于PubChem数据库(CID：5281605)作为配体。首先将STS1/STS2组氨酸磷酸酶结构域的晶体结构在GOLD5.2软件中打开，将晶体结构中的配体抽出，添加氢原子，同时删掉水分子。以原配体为中心，范围内定义活性位点：将30设置为配体的遗传算法次数，提前终止指令关闭，将化合物与蛋白重新对接。以打分函数作为评价标准，GOLDscore为主打分函数，ASPscore为重复打分函数，保留排名前15的对接构象，其余均保留默认设置。基于以上参数，对黄芩素与STS1和STS2进行对接，根据打分函数评价小分子化合物与蛋白之间结合能力的强弱，打分函数越高表示结合能力越强，反之，结合能力越弱。
结果：表7为黄芩素与STS1和STS2蛋白分子对接的打分函数，从表中可以看到，黄芩素与STS1和STS2分子对接的Goldscore分别为51.64和54.33，打分函数均大于50，提示黄芩素与STS1和STS2磷酸酶结构域间亦可能存在相互作用。图5A左和5B左展示的是黄芩素与STS1和STS2蛋白结合的3D图，图中显示，黄芩素与STS1蛋白的Ala194、Arg7、Ser195、Arg11号氨基酸残基形成氢键相互作用(图5A左)，与STS2蛋白的Arg12、Glu124、Arg91、His194、Arg8号氨基酸残基形成氢键相互作用(图5B左)；图5A右和5B右展示的是黄芩素与STS1和STS2蛋白结合的2D图，从图中可看到，黄芩素与STS1蛋白的Trp122、Glu118、So4538、His193号氨基酸残基产生疏水作用力(图5A右)，与STS2蛋白的Lys284、Trp123、Gly283、Val1220、Arg8、Glu119号氨基酸残基形成疏水作用(图5B右)。以上结果说明，黄芩素与STS1和STS2磷酸酶结构域都有良好的结合。
表7：黄芩素与STS1和STS2蛋白分子对接打分函数值
(2)毛细管电泳验证黄芩素与STS1和STS2蛋白的结合
主要材料：毛细管电泳装置购自北京彩陆科学仪器有限公司。
方法：将电压调试至20kV，进样方式为高差10cm进样5s；依次注入0.1mol/L NaOH(5min)，ddH2O(2min)和PBS(5min)对毛细管进行预处理；黄芩素浓度为1mg/mL，进样条件为高差10cm，5s，STS1或STS2组氨酸磷酸酶结构域重组蛋白样品注入到毛细管中后，施加20kV的分离电位进行分离。在每次电泳的间隙，依次用0.1mol/L NaOH(5min)，蒸馏水冲洗毛细管2min，PBS冲洗毛细管5min，并通过蛋白峰值的出现来判定迁移时间的改变。
结果：如图6所示，从图6A可以看到，加入黄芩素后，STS1蛋白的峰值与不加化合物相比发生了滞后迁移，根据毛细管电泳的原理，由于黄芩素与STS1蛋白的结合，改变了STS1蛋白的荷质比，导致了蛋白峰值的滞后迁移，因此说明黄芩素可与STS1蛋白结合；图6B显示，加入黄芩素后，STS2蛋白的峰值也明显发生了滞后迁移。该结果说明黄芩素可与STS1和STS2的磷酸酶结构域结合。
实施例6黄芩素抑制细胞内STS1和STS2磷酸酶活性
主要材料：人胚肾细胞239T购于中国科学院上海细胞生物学研究所DMEM培养基和胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司；2000转染试剂盒购自Invitrogen公司；pcDNA-FLT3、pcDNA-STS1及pcDNA-STS2等表达质粒由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；pcDNA-cKIT质粒由武汉淼灵生物科技有限公司合成；anti-GAPDH(CAT#10494-1-AP)、anti-STS1(CAT#19563-1-AP)、anti-STS2(CAT#15823-1-AP)抗体购自Proteintech Group公司(CAT#：KC-5G4)，anti-FLT3(8F2)(CAT#3462S)、anti-phospho(p)FLT3 Tyr591(54H1)(CAT#3466S)、anti-p-FLT3 Tyr842(10A8)(CAT#4577S)和anti-p-cKIT Tyr719(CAT#3391S)等抗体购自Cell Signaling Technology公司；anti-Flag(CAT#F1804)抗体购自Sigma公司；PVDF购于膜罗氏公司；蛋白标准分子量购于Thermo公司；超特敏ECL发光试剂盒购于碧云天生物技术有限公司。
方法：将培养于10％FBS高糖DMEM培养基中的生长状态良好的293T细接种于6孔培养板中，以第二天细胞密度达到80～90％为宜，24h后使用Lipofectamine 2000脂质体转染试剂按照说明书将各目的质粒按照图中标记的不同组合共转染入细胞，转染所用质粒总量为4μg/孔。转染48h后，加入黄芩素(终浓度10μg/mL)处理不同时间，同时以DMSO做为对照。处理结束后，用预冷的PBS洗细胞3次，然后用细胞刮刀轻轻刮下板内细胞，5000rpm离心5min，弃上清后，加入全细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH7.5，150mmol/LNaCl，1mmol/LNaF，0.5％NP-40，2μg/mL Aprotinin，1mmol/L PMSF)，冰上静置裂解10min，4℃12000rpm离心5min，取上清即全细胞蛋白提取物至另一离心管，加入三分之一上清体积的4×蛋白上样缓冲液，100℃煮10min，冷却后可直接进行电泳。
上述处理的全细胞裂解物按常规方法经12％SDS-PAGE电泳分离及转膜后，进行Westernblot分析，PVDF膜用TBST(0.2％的Tween20)洗涤2次，每次5min，然后于5％脱脂奶粉封闭液中室温封闭2h；TBST缓冲液中洗2次，每次5min；将PVDF膜放入装有一抗的杂交盒中，4℃过夜标记；用TBST洗涤PVDF膜3次，每次15min；室温标记二抗50min；用TBST洗涤膜3次，每次10min；滴加超特敏ECL对PVDF膜进行显影。
结果：如图7和8所示。FLT3和c-KIT是STS1和STS2磷酸酶的底物，为了检测黄芩素于血细胞内对STS1和STS2磷酸酶的抑制作用，以检测细胞内FLT3和c-KIT的磷酸化水平为评估指标。首先，将pcDNA-FLT3(图7A)或pcDNA-cKIT(图8A)表达质粒单独转染到293T中并于黄芩素处理不同时间后，Western Blot分析FLT3或c-KIT的磷酸化水平。结果显示，黄芩素处理2min后，FLT3磷酸化水平即显著升高且达到峰值，10min后，FLT3仍可保持高磷酸化水平，之后则逐渐减弱(图7A)。而黄芩素处理2min后，cKIT磷酸化水平即显著提高，处理10min后，cKIT磷酸化水平达到峰值，处理15min后仍可保持高磷酸化水平(图8A)。之后，将FLT3或c-KIT表达质粒与STS1或STS2表达质粒共转染入细胞中再进行黄芩素处理。结果发现，当STS1或STS2过表达后，FLT3磷酸化水平显著减弱(图7B，C)，而当黄芩素处理2min后，FLT3磷酸化水平则有所恢复(图7B，C)。同样，当STS1或STS2过表达后，cKIT磷酸化水平也显著减弱(图8B，C)，而黄芩素处理10min后，cKIT磷酸化水平恢复(图8B，C)。以上结果说明黄芩素于细胞内也可以抑制STS1和STS2的磷酸酶活性并因此促进FLT3和cKIT的磷酸化水平。
实施例7黄芩素在体外促进小鼠骨髓造血干/祖细胞增殖和分化
主要材料：实验用6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠(SPF级)购于辽宁长生生物公司；Ammonium Chloride Solustion(CAT#07800)、MethoCultTM GF M3434培养基(CAT#03434)购于Stemcell公司；小鼠SCF(CAT#250-03)、TPO(CAT#AF-315-14)和IL-3(CAT#213-13)购于PeproTech公司；BD Cytofix/CytopermTM(CAT#554714)购于BD Bioscience，200目铜网购于河北环宇金属丝网制品公司；anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)PE(D7)(CAT#12-5981-83)、anti-mouse CD34 Alexa Fluor 700(RAM34)(CAT#56-0341-82)、anti-mouse CD117(c-Kit)PE-Cyanine7(2B8)(CAT#25-1178-42)、anti-mouse CD135(FLT3)APC(BV 10A4H2)(CAT#17-1351-82)、anti-mouse CD150 APC(mShad 150)(CAT#17-1502-80)等抗体购自eBioscience公司。
方法：小鼠脱颈处死后，75％乙醇中浸泡15min，然后取左右两边的股骨和胫骨并置于预冷的PBS中，用灭菌剪刀剪断股骨和胫骨两端，使骨髓腔暴露，PBS冲洗骨髓腔反复几次，直至骨头冲洗发白为止，用移液器将冲出的骨髓细胞吹散，然后用200目铜网过滤骨髓细胞悬液，获得骨髓单细胞悬液后，1200rpm，离心10min；弃上清，用1mL预冷的PBS重悬细胞，按照1:4的比例加入1×红细胞裂解液，4℃静置20min，1200rpm离心10min；细胞沉淀用5mL PBS洗涤用1mL培养基重悬细胞(IMDM+10％FBS+100ng/mL SCF+25ng/mL TPO+25ng/mLIL-3)，即为小鼠原代骨髓单个核细胞(BMMNCs)；
细胞计数：按照每孔1×107个细胞将小鼠原代BMMNCs接种于6孔板中，设置两组黄芩素浓度，分别为10μg/mL和20μg/mL，同时设置Control组(即DMSO组)作为对照，加药后按照正常BMMNCs的培养方式于37℃，5％CO2培养箱中培养，分别于培养的第4d、7d、11d、14d对各组细胞进行台盼蓝染色及计数，并计算出细胞增殖率；
流式检测：如上描述培养和处理的BMMNCs于培养的第4d、7d，收集培养的小鼠原代骨髓细胞，每组取5×106个细胞，1500rpm离心5min，弃上清后，用500μL PBS清洗细胞后，加入含有不同抗体组合的100μL 2％FBS染色液(LSK：5μL Lineage-FITC，1μLSca-1-PE，1μLcKit-PE-Cy7；LT-HSCs、ST-HSCs及MPPs：5μL Lineage-FITC，1μL Sca-1-PE，1μL cKit-PE-Cy7，1μL FLT3-APC，1μL CD34)，4℃避光孵育30min，PBS洗涤细胞后200μLPBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测；
集落形成实验:收集体外培养第7d经黄芩素处理的小鼠BMMNCs，收集2×103个细胞，将细胞加入MethoCultTM GF M3434培养基后，涡旋振荡，将细胞和培养基混匀，然后用螺旋针管和钝针头吸取1.2mL培养基，匀速注射到6孔板中，使培养基均匀稳定的平铺于6孔板中；37℃，5％CO2培养箱中培养，培养到第10-12d可以观察到小鼠造血干/祖细胞集落；依据小鼠造血干/祖细胞集落的图谱观察：粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(colony formingunits for granulocytes and macrophages，CFU-GM)，爆式红细胞集落形成单位(burst-forming unit-erythroid，BFU-E)；粒细胞-红细胞-巨噬细胞-巨核细胞集落形成(colonyforming unit-granulocyte,erythrocyte,monocyte and megakaryocyte，CFU-GEMM)并且计数。
实验结果：
(1)黄芩素在体外促进小鼠BMMNCs增殖
表8显示的是黄芩素体外处理分离的BMMNCs不同时间后，细胞数相对于未处理组的比值，分析结果如图9所示，黄芩素处理组的BMMNCs细胞在培养的前4d细胞增殖不明显，随着培养时间的延长，细胞增殖速度逐渐加快，在培养第14d时达到峰值，10μg/mL和20μg/mL黄芩素处理组的细胞数量分别是初始细胞数的5.35倍和6.11倍，此时未处理组的细胞数是初始细胞数的4.18倍，显著低于黄芩素处理组，在继续培养后，黄芩素处理组细胞数量下降的不明显，培养至第17d时，细胞数量仍高于未处理组，10μg/mL和20μg/mL黄芩素处理组细胞数分别是原始细胞数量的4.73倍和5.61倍，而未处理组细胞数是原始细胞数的3.32倍。以上结果说明黄芩素在培养初期促细胞增殖速度平缓，但可使细胞长时间保持在稳定增长的状态，在培养后期仍可使细胞数量保持较高水平。
表8：黄芩素处理不同时间的BMMNCs细胞数量相对于未处理组的倍数
(2)黄芩素在体外增加小鼠BMMNCs中造血干/祖细胞比例
Lin-为未成熟的细胞，LSK(Lin-sca1+ckit+)为造血干/祖细胞。结果如图10所示，A图为LSK细胞流式分析代表图，B图为LSK细胞比例的统计图，图中可看到，整体上，随着体外培养时间的延长，细胞中LSK细胞的比例逐渐增加，培养至第4d时，对照组LSK细胞的比例占BMMNCs的0.49％，而黄芩素处理的BMMNCs在培养的第4d LSK细胞的比例显著高于对照组，10μg/mL和20μg/mL黄芩素处理后LSK比例分别为0.69％和0.65％；培养至第7d时，对照组LKS的比例升至0.94％，10μg/mL和20μg/mL黄芩素处理组LSK细胞比例分别为1.46％和2.71％，显著高于对照组，以上结果表明黄芩素可以提高体外培养条件下小鼠BMMNCs中造血干/祖细胞的比例，且在培养至第7d时，20μg/mL黄芩素的提升效果更优。
(3)黄芩素在体外提高小鼠造血干/祖细胞集落形成能力
三次重复实验的各谱系集落形成数见表9，结果分析如图11所示，20μg/mL黄芩素处理后，集落总数有显著增加，分别是对照组的1.44倍和1.36倍，同时各谱系集落的数量也均有不同程度的增加，且无明显的偏系分化，说明黄芩素可以提高小鼠HSPC的分化能力。以上结果与体外培养后对小鼠BMMNCs细胞表型分析的结果基本一致，说明黄芩素可以提高小鼠造血干/祖细胞的增殖和分化能力。
表9：体外黄芩素处理的BMMNCs各谱系集落形成数
实施例8黄芩素促进人脐血CD34+细胞增殖和分化
主要材料：人脐带血样本采集自吉林大学第二临床医院妇产科健康的顺产产妇，由产妇自愿捐献，并符合伦理学规定。无菌条件下将脐带血收集到肝素钠抗凝采血袋中，4℃保存，24h内进行分选；Ammonium Chloride Solution(CAT#07800)、MethoCultTMH4034optimum培养基(CAT#04034)、StemSpanTM SFEM II造血干细胞无血清培养基(CAT#09605)、EasySep Human CD34 Positive selection Kit II(CAT#17856)及Lymphoprep(CAT#07801)购于Stemcell公司；人SCF(CAT#30007)、TPO(CAT#300-18)和IL-6(CAT#20006)购于PeproTech公司；BD Cytofix/CytopermTM购于BD Bioscience；anti-human CD45 APC(HI30)(CAT#17-0459-42)抗体购自eBioscience公司、anti-human CD34 PE(581)(CAT#343506)、anti-human CD90(Thy 1)(CAT#328108)、anti-human CD38(HIT2)FITC(CAT#980304)和anti-human CD45RA-PE/Cy7(HI100)(CAT#983006)等抗体购自Biolegend公司、200目铜网购于河北环宇金属丝网制品公司。
方法：在50mL离心管理收集脐带血样本，每管15mL样本；向血液样本中加入75μLRosetteSep，混匀后室温孵育20min；加入等体积的EasySep Buffer并进行密度梯度离心；离心后的细胞经EasySep Buffer洗涤细胞后加入2mL EasySep Buffer重悬细胞，然后按照1:4的比例加入红细胞裂解液裂解红细胞；余下的有核细胞加入0.75mL EasySep Buffer并转入到5mL流式管中，加入75μL Selection Cocktail，混匀并室温孵育10min后加入50μL磁珠进行CD34+细胞磁珠分选；
人脐血CD34+细胞的培养：将分选后的人脐血CD34+细胞按照每孔1×105个/mL细胞接种于12孔板中，培养条件为StemSpan SFEMⅡ造血干细胞无血清培养基，添加人SCF(100ng/mL)、人TPO(100ng/mL)及人IL-6(100ng/mL)，培养前3d不作处理，培养第4d观察培养基颜色，从粉红色变为稍偏黄，此时采用半量换液的方式，加入等体积的含有细胞因子的新鲜培养基，之后每2d半量换液一次，37℃，5％CO2培养箱中培养。黄芩素处理时，设置对照组及黄芩素10μg/mL及20μg/mL加药组，在培养的第0d就用含有相应浓度化合物的培养基培养细胞，之后每次半量换液时，均加入新鲜的含有黄芩素的培养基；
流式检测：如上描述培养和处理的人脐血CD34+细胞，每组1×105个细胞，分别于培养的第4d和第7d收集细胞并加入100μL抗体染色液(即100μL 2％FBS的PBS中加入1μLCD34-PE，1μL CD38-FITC，1μL CD45RA-Cy7，1μL CD90-APC)进行染色，用CD34和CD38作为标记物来标记造血干/祖细胞群，利用CD45RA和CD90进一步的区分更原始的造血干细胞群，洗涤后加入200μL PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测；
集落形成实验:收集体外培养第7d经黄芩素处理的各组脐血CD34+细胞，收集2×103个细胞，将细胞加入MethoCultTM H4034培养基后，涡旋振荡，然后用螺旋针管和钝针头吸取1.2mL培养基，匀速注射到6孔板中，使培养基均匀稳定的平铺于6孔板中；37℃，5％CO2培养箱中培养，培养到第10-12d可以观察到人造血干/祖细胞集落；依据人造血干/祖细胞集落的图谱观察集落并且计数。
实验结果：
(1)黄芩素在体外增加人脐血造血干/祖细胞比例
如图12所示，培养第4d时，10μg/mL和20μg/mL黄芩素均明显提高造血干/祖细胞比例，CD34+CD38-细胞群占体外培养的CD34+细胞的比例分别达到14.429％和13.291％，是对照组的1.4倍和1.29倍(图12B)，CD34+CD38-CD45RA-CD90+细胞群的比例分别为4.465％和4.306％，是对照组的1.9倍和1.83倍(图12C)；培养第7d时，虽然黄芩素处理组的CD34+CD38-造血干/祖细胞群比例低于对照组(图12B)，但是更原始的造血干细胞群(CD34+CD38-CD45RA-CD90+)比例则要显著高于对照组，10μg/mL和20μg/mL黄芩素处理组的比例分别为0.793％和1.106％，是对照组的1.48倍和2.08倍(图12C)，代表性流式分析图如图12A所示。由此说明，黄芩素可以提高体外培养条件下人脐血造血干/祖细胞的比例，且在培养4d时提高效果最明显。
(2)黄芩素在体外提高人脐血造血干/祖细胞集落形成能力
三次重复实验的各谱系集落形成数见表10，结果分析如图13所示，10μg/mL黄芩素处理后，集落总数均显著增加，是对照组的1.72倍，同时各谱系的集落数量也有不同程度的增加，且均具有统计学显著性。该结果说明黄芩素可以提高人造血干/祖细胞的分化能力，CFU-GEMM的数量也显著增加，这说明黄芩素可以促进人脐血造血干/祖细胞的增殖和分化能力。
表10：体外黄芩素处理的人脐血造血干/祖细胞各谱系集落形成数
实施例9黄芩素于体内促进正常小鼠骨髓造血干/祖细胞增殖和分化
主要材料：见实施例7中的材料介绍。
方法：选择雄性8周龄C57BL/6小鼠，黄芩素连续给药7d，给药浓度为10mg/kg和20mg/kg，同时设置对照组(即不给药组)，每组6只小鼠，7d后处死小鼠，然后根据实施例8中方法部分介绍的有关小鼠BMMNCs分离、流式分析及克隆形成能力检测等方法进行相关检测。
实验结果：
(1)黄芩素在体内增加正常小鼠骨髓中造血干/祖细胞比例
图14A所示为流式分析造血干/祖细胞比例代表图，图14B为造血干/祖细胞比例统计图，具体数据见表11。结果显示连续7d腹腔注射黄芩素后，小鼠BMMNCs中造血干/祖细胞LSK占比显著提高，10mg/kg和20mg/kg黄芩素注射小鼠分别为0.43％和0.47％，是对照组的1.19倍和1.3倍；对造血干/祖细胞群进行更深入的分析后发现，10mg/kg和20mg/kg黄芩素处理后长期HSCs(long term HSCs,LT-HSCs)的比例显著升高，其比例为0.049％和0.047％，分别是对照组的1.63倍和1.57倍，短期HSCs(short term HSCs,ST-HSCs)和多潜能祖细胞(multi-pluoripoent progenitor cells,MPPs)的比例也有一定升高，其中，10mg/kg黄芩素处理组ST-HSCs的要显著高于对照组，是对照组的1.3倍，20mg/kg黄芩素处理组MPPs的比例显著高于对照组，是对照组的1.39倍。以上结果表明，健康小鼠注射黄芩素后，骨髓中LSK的比例显著提高，而且三个细胞亚群的比例均有所增加，但以LT-HSCs比例的增加为主。总之，该结果说明，黄芩素可能更大程度上提高了小鼠骨髓造血干细胞中更为原始细胞的比例，可能促进了其自我更新的能力。
表11：黄芩素处理小鼠的骨髓中造血干/祖细胞比例流式分析结果
(2)黄芩素在体内增强正常小鼠骨髓造血干/祖细胞集落形成能力
三次重复实验的各谱系集落形成数见表12，结果分析如图15所示，连续腹腔注射黄芩素7d后，小鼠骨髓造血干/祖细胞形成的集落总数要显著高于对照组，分别是对照组的1.17倍和1.37倍，同时没有发生偏系分化，各谱系集落数均有所增加，更原始的祖细胞集落CFU-GEMM数量也高于对照组。以上结果表明，经过连续7d腹腔注射黄芩素，小鼠骨髓造血干/祖细胞的增殖和分化能力明显提高，且20mg/kg的注射剂量对造血干/祖细胞增殖和分化能力的提高效果要优于10mg/kg的注射剂量。
表12：黄芩素处理小鼠的骨髓中造血干/祖细胞各谱系集落形成数
实施例10黄芩素对5-FU骨髓损伤小鼠具有保护作用
材料：见实施例7中的材料介绍。
方法：选择8周龄的雄性C57BL6/J小鼠，5-FU模型组，每周一次腹腔注射致死剂量150mg/kg 5-FU，观察生存期需连续注射3-4周组至全部死亡，分析骨髓抑制情况，注射两周；黄芩素处理组，观察生存期采用20mg/kg和40mg/kg两个剂量，分析骨髓抑制情况采用20mg/kg剂量，另有一组为正常对照组。黄芩素组给药方案为小鼠腹腔注射黄芩素(20mg/kg)，连续注射3d，1次/d，最后1次给药24h后开始第一次的腹腔注射致死剂量的5-FU。
观察生存期的实验，至模型组小鼠全部死亡时统计各时间段死亡率；分析骨髓抑制情况时，第2次5-FU注射后一周，给小鼠腹腔注射适量的4％水合氯醛及5mg/kg卡洛芬对小鼠进行麻醉，然后按照实施例8中方法部分介绍的有关小鼠BMMNCs分离、流式分析及克隆形成能力检测等方法进行相关检测。
实验结果：
(1)黄芩素降低5-FU骨髓损伤小鼠死亡率
各组每只小鼠的体重记录如表13所示，结果分析如图16A所示，，致死剂量5-FU注射后，小鼠的体重同样呈现出现先降低后升高的趋势，前两轮注射5-FU后，黄芩素给药组小鼠的体重与对照组相比没有显著差异，至第三轮注射5-FU，即首次注射5-FU的15d后，20mg/kg黄芩素给药组小鼠体重显著高于对照组，而40mg/kg黄芩素给药组小鼠的体重与对照组相比没有显著差异，体重结果说明低剂量黄芩素可能更有助于5-FU损伤小鼠恢复健康状态。各组小鼠的死亡情况记录如表14所示，至实验结束，对照组小鼠已全部死于5-FU损伤时，20mg/kg黄芩素剂量组小鼠的存活率为60％，40mg/kg剂量组小鼠的存活率达到40％，即20mg/kg组的存活率要高于的存活率(图16B)，亦说明低剂量的黄芩素对骨髓损伤小鼠的保护效果更显著，与体重检测结果相符。该实验证明预防性应用黄芩素可显著改善5-FU损伤小鼠的健康状态和存活率。
表13：黄芩素处理5-FU损伤小鼠的体重
Days 5-FUControl BC20mg/kg+5-FU BC40mg/kg+5-FU
1 22.885 22.452 21.775
2 22.701 22.576 22.405
3 22.317 21.948 21.655
4 23.4 23.067 23.315
5 21.351 20.913 21.094
6 20.588 20.339 20.344
7 20.363 20.571 20.399
8 20.239 21.136 20.563
9 20.508 21.683 21.143
10 21.527 22.062 21.601
11 22.799 22.886 22.631
12 20.297 21.059 20.573
13 19.598 20.181 20.486
14 20.45667 20.945 20.199
15 20.58556 21.111 20.291
16 19.81444 21.104 20.26333
17 19.13222 20.98444 19.27444
18 18.82857 20.895 18.4675
19 17.86286 19.84625 17.34143
20 17.74167 19.29625 16.405
21 18.1475 20.61167 18.57667
22 17.1 18.75222 17.53
23 16.43 17.95222 17.03
24 16.31 18.04 17.49
表14：黄芩素处理5-FU损伤小鼠的死亡情况分析
注：表中1表示死亡，0表示存活
(2)黄芩素改善5-FU导致的骨髓损伤增加骨髓有核细胞数
结果如图17所示。5-FU注射后，小鼠单侧股骨骨髓细胞数量为0.79×107个，细胞数量急剧下降，仅为正常对照组骨髓有核细胞数的56％，而黄芩素治疗组小鼠单侧骨髓细胞数为1.2432×107个，显著高于模型对照组，说明黄芩素治疗部分恢复了5-FU损伤小鼠骨髓有核细胞数(图17A)；小鼠股骨骨髓HE染色结果显示，5-FU导致的骨髓内细胞数量明显减少、骨小梁排列不整齐、结构紊乱、微结构不完整并出现大量空洞等病理现象明显减少，黄芩素治疗组小鼠的骨髓结构有了明显改善，骨髓细胞数量和微结构完整度也有了明显的提高(图17B)。以上结果说明黄芩素预处理对5-FU损伤小鼠股骨内骨髓结构的破坏具有一定的保护作用。
(3)黄芩素治疗对5-FU损伤小鼠骨髓造血干/祖细胞比例的影响
结果如图18所示，图18A为造血干/祖细胞流式分析代表图，图18B和图18C为造血干细胞及祖细胞比例和绝对数目统计图，结果显示正常小鼠LSK占总全骨髓细胞的0.34％左右，与之前结果类似。经过了两次致死剂量5-FU注射后，LSK比例显著下降，仅为0.046％，而黄芩素治疗组小鼠LSK的比例为0.209％，显著高于未治疗组(图18B)；进一步对LSK细胞中不同细胞群的比例进行分析，黄芩素治疗组LT-HSCs、ST-HSCs及MPPs细胞群的比例分别为0.05％、0.065％和0.09％，而未治疗组的比例则为0.009％、0.013％和0.023％，三种细胞群的比例显著高于未治疗组(图18B)；而黄芩素治疗组小鼠骨髓中各群细胞的绝对数目亦显著高于未治疗组(图18C)。具体数据见表15和表16。上述结果说明黄芩素预处理可以部分缓解由致死剂量5-FU导致的骨髓衰竭。
表15：黄芩素处理5-FU损伤小鼠的骨髓中造血干/祖细胞比例流式分析结果
表16：黄芩素处理5-FU损伤小鼠的骨髓中造血干/祖细胞总数流式分析结果
(4)黄芩素治疗提高5-FU损伤小鼠骨髓造血干/祖细胞集落形成能力
三次重复实验的各谱系集落形成数见表17，结果分析如图19所见，致死剂量5-FU注射后，小鼠骨髓造血干/祖细胞形成的集落为21个，显著低于正常对照组，而黄芩素治疗组集落总数为44个，是未治疗组总数的2.09倍，同时BFU-E和CFU-GM及CFU-GEMM的集落数量也因黄芩素的治疗而增加，各集落的数量均显著高于未治疗组。以上结果表明预防性应用黄芩素可通过提高小鼠造血干/祖细胞的增殖和分化能力，以抵抗5-FU导致的骨髓损伤。
表17：黄芩素处理5-FU损伤小鼠的骨髓中造血干/祖细胞各谱系集落形成数
实施例11黄芩素降低致死剂量辐射小鼠的死亡率
材料：实验用8周龄雄性C57BL/6J小鼠(SPF级)购于辽宁长生生物公司；X射线放射治疗机购于丹东市康嘉仪器设备有限公司。
方法：小鼠随机分组，黄芩素共设两个给药浓度，分别为20mg/kg和40mg/kg，小鼠给予辐射的剂量为6.5Gy，同时设置对照组(照射并给予溶剂组)，每组8只小鼠。连续3d腹腔注射黄芩素，最后一次给药24h后，给予小鼠6.5Gy的照射，每天记录体重，观察存活率。
结果：各组每只小鼠的体重记录如表18所示，结果分析如图20A所示，与对照组相比，黄芩素组小鼠体重有所增加，但整体上体重仍是呈下降趋势，始终低于照射前；而20mg/kg黄芩素组小鼠的体重变化与对照组相比没有差异(图20A)。各组小鼠的情况记录如表19所示，结果分析如图20B所示，至实验结束时，对照组存活率为25％，20mg/kg和40mg/kg黄芩素组的存活率分别为50％和37.5％，说明20mg/kg和40mg/kg黄芩素组均可以在一定程度上提高辐射损伤小鼠的存活率(图20B)。综上所述黄芩素对辐射导致的骨髓损伤有预防作用。
表18：黄芩素处理致死剂量辐射损伤小鼠的体重
表19：黄芩素处理致死剂量辐射小鼠的死亡情况分析
Days Control BC20mg/kg BC40mg/kg
23 0 —— ——
23 0 —— ——
18 1 —— ——
15 1 —— ——
15 1 —— ——
14 1 —— ——
11 1 —— ——
11 1 —— ——
23 —— 0 ——
23 —— 0 ——
23 —— 0 ——
23 —— 0 ——
22 —— 1 ——
15 —— 1 ——
13 —— 1 ——
11 —— 1 ——
23 —— —— 0
23 —— —— 0
23 —— —— 0
22 —— —— 1
17 —— —— 1
14 —— —— 1
13 —— —— 1
10 —— —— 1
注：表中1表示死亡，0表示存活
实施例12黄芩素结构类似物抑制STS1和STS2磷酸酶活性
主要材料：对硝基苯磷酸酯(PNPP)购自Sigma-Aldrich公司。
方法：利用之前确认的STS1及STS2体外磷酸酶活性检测方法，在96孔板确认黄芩素结构类似物对STS1和STS2磷酸酶活性的抑制作用。每组设置6个重复孔。首先向96孔板中加入3μL各黄芩素结构类似物(终浓度为10μg/mL)、阴性对照溶液DMSO或阳性抑制剂Na3VO4(100mmol/L，pH：10.0)，然后向其中加入50μL PNPP，混合均匀，然后加入10μL STS1(150nmol/L)或STS2(15μmol/L)蛋白工作液，室温孵育10min(STS1)及20min(STS2)，反应后加入40μL终止缓冲液终止反应，酶标仪检测405nm处的吸光值。按照如下公式计算抑制率：抑制率(100％)＝(1-加药组OD405nm/阴性对照组OD405nm)×100％)。
结果：如表20所示，各黄芩素结构类似物对STS1和STS2的磷酸酶活性均表现出不同程度的抑制作用。
表20：黄芩素结构类似物对STS1和STS2磷酸酶活性的抑制作用
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.黄酮类化合物在制备STS1抑制剂和/或STS2抑制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述黄酮类化合物包括黄芩素类化合物、其衍生物、其类似物、其可药用盐、其前药或其代谢物中的一种或多种。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述黄酮类化合物
(I)、抑制STS1和/或STS2磷酸酶活性；和/或
(II)、提高底物的磷酸化水平。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述底物包括但不限于FLT3和/或cKIT。
5.如权利要求2至4任一项所述的应用，其特征在于，所述黄芩素类化合物包括但不限于黄芩素、汉黄芩素、野黄芩素、千层纸素、白杨素或柳穿鱼黄素中的一种或多种。
6.黄酮类化合物在制备如下任意项的药物中的应用；
(I)、体内促进造血干/祖细胞增殖和/或分化；和/或
(II)、体外促进造血干/祖细胞增殖和/或分化；和/或
(III)、增强骨髓中造血干/祖细胞比例和/或集落形成能力；和/或
(IV)、预防、改善和/或治疗化疗导致的骨髓抑制和/或损伤；和/或
(V)、预防、改善和/或治疗放疗导致的骨髓抑制和/或损伤；和/或
(VI)、降低辐射的死亡率；和/或
(VII)、预防和/或治疗造血损伤。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述造血干/祖细胞来源于骨髓或脐血。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制和/或损伤由5-FU和/或辐射导致。
9.如权利要求6至8任一项所述的应用，其特征在于，所述黄酮类化合物包括黄芩素类化合物、其衍生物、其类似物、其可药用盐、其前药或其代谢物中的一种或多种。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述黄芩素类化合物包括但不限于黄芩素、汉黄芩素、野黄芩素、千层纸素、白杨素或柳穿鱼黄素中的一种或多种。
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