CN116479134A - 生物标志物cenph在制备检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种生物标志物CENPH在制备诊断或评估胶质瘤的产品中的应用，属于生物医学技术领域，生物标志物为CENPH。本发明通过生物信息学数据分析以及体外实验的细胞表型验证。通过生物信息学数据分析发现相对于正常脑组织，CENPH在胶质瘤中的表达明显上调，并且对胶质瘤细胞系的PCR和WB验证也得到相同结果。另外，高表达的CENPH与胶质瘤的恶性生物学特点呈正相关，并且与患者的不良预后显著相关。在体外细胞实验中证实，下调CENPH的表达能够有效抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力。整体说明CENPH的高表达水平可以促进胶质瘤的恶性生物学行为，能够很好地应用于胶质瘤患者的诊断及预后预测。

Description

生物标志物CENPH在制备检测或评估胶质瘤预后情况的产品 中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及生物标志物CENPH在制备诊断或评估胶质瘤的产品中的应用。

背景技术

胶质瘤是神经系统中最常见的原发性脑肿瘤，其中多形性胶质母细胞瘤（GBM）是具有最高恶性程度的亚型，且患者中位生存期不超过2年，无进展生存期仅为6.9个月。胶质瘤不仅给患者的健康造成严重的威胁，还给我国社会发展带来每年数百亿元的经济负担。然而针对胶质瘤的治疗，目前基于组织病理学的多学科联合治疗并不能达到满意的效果，究其原因在于缺乏对胶质瘤复杂发病机制的深入了解。因此，发掘全新的标志性分子，揭示其在肿瘤发生发展机制中的关键作用，为胶质瘤早期诊断和预后预测提供特异性的靶点，对胶质瘤的预防和治疗提供新的策略。

CENPH是着丝粒/动粒复合体的重要促成部分之一，在有丝分裂和染色体分离过程中扮演关键的角色。CENPH是染色体聚合所必须的，可以有效地将染色体排列在中板上，能够调控有丝分裂过程中姐妹染色单体的分离，能够主导细胞周期G2/M期的转变。CENPH在多个肿瘤的发生发展机制中发挥关键功能。在结直肠癌中，CENPH与患者预后相关，并且可以通过调控mTOR通路对治疗抵抗产生影响。在肾细胞癌中，过表达的CENPH能够促进肿瘤的增殖和抗凋亡能力。另外，CENPH还可以作为肺腺癌患者总生存率的预后标志物。但是CENPH在胶质瘤恶性进展中确切的作用机制目前还有待阐明。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种生物标志物CENPH在制备诊断或评估胶质瘤的产品中的应用，通过生物信息学和实验验证，表明CENPH对于诊断胶质瘤患者有着较好的敏感性。

基于此，本发明的技术方案如下：

生物标志物CENPH在制备用于检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用，包括检测生物样本中的生物标志物CENPH的表达水平,从而对胶质瘤的发展进行检测和评估；所述生物样本取自胶质瘤组织。

进一步的，其中所述生物标志物CENPH在NCBI的Gene ID为64946。

进一步的，包括检测所述生物标志物CENPH的DNA含量的试剂。

进一步的，所述试剂为特异性识别CENPH基因的探针。

进一步的，包括检测所述生物标志物CENPH的mRNA含量的试剂。

进一步的，所述试剂为特异性扩增CENPH基因的引物，所述试剂是在mRNA水平上检测生物标志物CENPH表达水平的试剂。

进一步的，包括检测所述生物标志物CENPH的蛋白质含量的试剂。

进一步的，所述试剂为特异性结合CENPH基因编码的蛋白的结合剂。

进一步的，所述胶质瘤为胶质母细胞瘤。

进一步的，与对照组的生物样本相比，所述生物标志物CENPH在脑胶质瘤组织中的表达水平上调。

综上所述，本申请与现有技术相比至少具有以下一种有益技术效果：

1、本发明通过生物信息学数据分析及体外细胞实验验证了CENPH在胶质瘤患者中有明显的诊断和预后价值。首先在GPEIA数据库中，在胶质瘤的患者中CENPH基因的表达水平显著高于正常情况，并且PCR和WB验证也证明CENPH在胶质瘤细胞系U251和LN229中的表达水平明显高于人正常胶质细胞HA。随后通过TCGA数据库中，Wilcox检验和KruskalWallace检验提示CENPH高表达与胶质瘤恶性特点正相关，KM曲线分析、ROC曲线分析、单因素分析推测CENPH在胶质瘤患者中的高表达与患者的不良预后密切相关，是胶质瘤的一个独立风险因素。

2、本发明还通过在胶质瘤细胞系LN229上，主要通过敲低CENPH的表达与对照组来进行体外实验。CCK8用于检测胶质瘤细胞活力，克隆形成实验和Ki67实验用于检测胶质瘤细胞增殖能力，Transwell实验和划痕实验用于检测胶质瘤细胞的侵袭能力。通过这一系列实验的验证，发现敲低CENPH的表达可以显著抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为。说明，胶质瘤中CENPH的表达量高低能在一定程度上影响胶质瘤的恶性进展，从而影响患者预后。

附图说明

图1为本发明通过GPEIA数据分析工具确定CENPH在胶质瘤患者组织中的表达差异结果图；

图2为本发明的PCR和Western Blot检测结果图；

图3为本发明的Wilcox检验和Kruskal Wallace检验结果图；

图4为本发明通过TCGA数据库分析预测CENPH在胶质瘤患者中的KM曲线、ROC曲线和单多因素分析图；

图5为本发明敲低CENPH表达后可显著抑制胶质瘤细胞的恶性生物学特征图。

附图标记：

图4中的标记为A：KM生存分析显示CENPH在胶质瘤中的高表达明显缩短患者的生存期；B：ROC曲线分析显示CENPH在胶质瘤中具有良好的诊断意义；C:单因素分析说明CENPH是导致胶质瘤的危险因素。D:多因素分析说明CENPH是导致胶质瘤的独立危险因素；

图5中的标记为A：CCK8实验结果：敲低CENPH在胶质瘤细胞中的表达后，胶质瘤细胞活力随之降低；B：克隆形成实验：与正常组相比，敲低胶质瘤细胞中CENPH的表达后，胶质瘤细胞形成集落的能力降低。C：KI67实验：CENPH敲低后胶质瘤细胞相关抗原Ki67明显减少，说明胶质瘤细胞增殖能力受到抑制；D：敲低CENPH表达后，胶质瘤细胞侵袭能力显著降低；E：划痕实验：CENPH敲低后胶质瘤细胞的相对爬行距离明显缩短。**表示P<0.01；***表示P<0.001。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图1-4，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、首先以下实施例一至实施例四是通过生物信息学对标志物CENPH进行的验证。

生物信息学数据来源：GEPIA公开数据库、GTEx数据库中正常脑组织基因表达数据、TCGA数据库中的GBM(胶质瘤)患者的基因表达数据。

GPEIA数据库网站为http://gepia.cancer-pku.cn/index.html。

通过在GPEIA公开数据库取得分析样本，分析样本有来自TCGA数据库的163例胶质母细胞瘤样本和来自GTEX数据库的207例正常脑组织样本。

通过GPEIA数据分析工具，确定CENPH在胶质瘤组织与正常脑组织中的表达差异。

实施例一

本实施例通过差异分析明确了CENPH在胶质瘤组织样本中是否显著表达。

使用差异性分析比较CENPH在上述分析样本的肿瘤组织和正常组织中的表达差异，结果如图1所示，CENPH在胶质瘤样本中的表达显著增高。

实施例二

本实施例通过基因含量以及免疫印迹等实验明确了CENPH在胶质瘤组织样本中是否显著表达。

通过对分析样本中人正常胶质细胞HA和胶质瘤细胞系U251与LN229的PCR实验和WB实验均验证得到如图2所示，CENPH在胶质瘤样本中的表达显著增高。

PCR扩增实验用的PCR引物：

CENPH的NCBI的Gene ID:64946，转录本号NM_022909.4。

根据CENPH的基因序列，设计CENPH的扩增引物，序列如下：

1.4实验用的抗体

CENPH抗体（Proteintech，货号：12841-1-AP）；Ki67(Abcam，货号：ab15580)；β-actin抗体（Proteintech，货号：81115-1-RR）

实施例三

本实施例通过信息生物学手段确认CENPH的高表达在胶质瘤组织样本中的相关性。

通过分析样本的数据，进行Wilcox检验和Kruskal Wallace检验，分析CENPH的表达和胶质瘤特点之间的关系，如图3所示，CENPH的高表达与恶性生物学特征呈显著正相关关系。

实施例四

本实施例通过分析样本的数据得出CENPH表达所具有的价值。

对分析样本进行如下分析：

通过KM生存曲线分析CENPH表达与胶质瘤患者生存之间的关系，结果如图4A所示，CENPH表达越高的患者生存期越短。

ROC曲线的分析结果如图4B所示，CENPH的表达对于胶质瘤的诊断具有一定的价值。

通过单多因素分析后得到如图4C，图4D所示高表达的CENPH对于胶质瘤患者是一个独立的危险因子。

二、其次，以下实施例五至实施例九是通过细胞实验对标志物CENPH进行的验证。

实验细胞：人正常星形胶质细胞HA，人胶质瘤细胞LN229，人胶质瘤细胞U251。

培养基：ProcellDMEM高糖。

血清：Gibco南美胎牛血清。

1、细胞培养

从37℃恒温孵箱中取出前述细胞系，置于已经经过至少30分钟紫外消毒的超净台中，用1mL移液枪吸出6cm培养皿中残存的培养基，并用无菌PBS 1mL清洗两到三次随后弃去PBS，加入3ml新的含10％血清的培养基，然后放入37℃恒温孵箱继续培养。

2、铺板

待6cm培养皿中细胞密度长满后，先用PBS清洗一下，然后用胰蛋白酶消化1分钟后加入3mL培养基终止消化，用1mL移液枪缓缓吹打重悬细胞，然后将500uL重悬的细胞加到盛有2mL培养基的六孔板中，次日待六孔板中细胞密度长满后转染。

3、转染

在每一个孔中配好试剂如下试剂：

NC：lipo3000 (125μL OPTI+7.5μL lipo3000）+ NC(125μL OPTI+7μLNC）混合静置15分钟；

Si： lipo3000 (125μL OPTI+7.5μL lipo3000)+Si(125μL OPTI+7μL Si）混合静置15分钟。

加入2mL无血清培养基，混合均匀后，每个孔中加入2mL混合液，6-8h将培养基换成带有10%血清的培养基。

1.3实验用的针对性敲低CENPH的shRNA（上海吉玛合成）：

实施例五

CCK8实验

待转染后六孔板细胞密度长满后，使用胰蛋白酶消化和培养基重悬，细胞计数后稀释，以每孔2000个细胞的密度铺到96孔板中。

次日在特定时间加入CCK8试剂：培养基=1：10混合液，37℃恒温孵箱孵育3小时后测试0h吸光度值，随后在24h、48h、72h、96h进行同样操作测试吸光度值，待所有数据测试完用prism软件进行数据统计作图，如图5中A所示。

实施例六

克隆形成实验

转染后长满的六孔板，2mL有血清培养基重悬，然后用细胞计数板测试细胞密度，每个孔3000个细胞的密度铺于6孔板中。

37℃恒温孵箱中培养14天，用PBS清洗后，然后使用4%多聚甲醛固定15分钟后PBS再次清洗，再用结晶紫染色15分钟随后用超纯水清洗，最后拍照统计数据作图，如图5中B所示。

实施例七

Ki67实验

转染后长满的六孔板，2mL有血清培养基重悬，然后用细胞计数板测试细胞密度，取5000个细胞铺于3.5cm培养皿中。

待细胞密度长到70%-80%后用4%多聚甲醛固定细胞15分钟，PBS清洗然后Tritonx-100通透后用血清封闭。先使用识别Ki67的抗体孵育过夜，PBS洗三次，每次摇床晃动10分钟。随后使用带荧光标记的二抗避光孵育一小时，PBS洗三次，每次摇床晃动10分钟。最后加入DAPI孵育15分钟，然后荧光显微镜拍照统计数据作图，如图5中C所示。

实施例八

Transwell实验

转染后长满的六孔板，2mL有血清培养基重悬，然后用细胞计数板测试细胞密度，每个孔30000个细胞的密度铺于Transwell小室。

将带有孔径8μm小孔的Transwell小室中加入含5%血清的培养基，在下室中加入含20%血清的培养基，利用血清浓度差引导细胞运动。最后通过对侵袭到Transwell小室底面的胶质瘤细胞利用结晶紫溶液进行染色，最后在光学显微镜下进行拍照统计数据作图。

实施例九

划痕实验

待转染后六孔板中细胞长满后，利用无菌的200ul枪头对细胞进行划线，PBS清洗后加入无血清培养基，继续培养0h，24h，48h。利用光学显微镜观察并拍照同一位置细胞的相对距离，然后统计数据作图。

上述实验结果如图5统一显示，敲低CENPH在胶质瘤细胞中的表达后可以抑制胶质瘤的恶性生物学特征。

本发明通过生物信息学数据分析及PCR和WB实验验证，在胶质瘤的患者中，CENPH基因的表达水平显著高于正常脑组织，随后通过生物信息学数据分析CENPH高表达与胶质瘤的恶性生物学特点呈显著正相关关系，通过KM生存分析验证CENPH的高表达可以导致胶质瘤患者的不良预后，ROC分析在CENPH胶质瘤中具有一定的诊断意义。体外实验验证敲低CENPH的表达能够有效抑制胶质瘤细胞的恶性肿瘤生物特征。CENPH可作为生物标记物对胶质瘤患者的诊断和预后进行预测。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.生物标志物CENPH在制备用于检测或评估胶质瘤预后情况的产品中的应用，包括检测生物样本中的生物标志物CENPH的表达水平,从而对胶质瘤的发展进行检测和评估；所述生物样本取自胶质瘤组织。

2.如权利要求1所述的生物标志物CENPH在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，其中所述生物标志物CENPH在NCBI的Gene ID为64946。

3.如权利要求1所述的生物标志物CENPH在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，包括检测所述生物标志物CENPH的DNA含量的试剂。

4.如权利要求3所述的生物标志物CENPH在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，所述试剂为特异性识别CENPH基因的探针。

5.如权利要求1所述的生物标志物CENPH在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，包括检测所述生物标志物CENPH的mRNA含量的试剂。

6.如权利要求5所述的生物标志物CENPH在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，所述试剂为特异性扩增CENPH基因的引物，所述试剂是在mRNA水平上检测生物标志物CENPH表达水平的试剂。

7.如权利要求1所述的生物标志物CENPH在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，包括检测所述生物标志物CENPH的蛋白质含量的试剂。

8.如权利要求7所述的生物标志物CENPH在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，所述试剂为特异性结合CENPH基因编码的蛋白的结合剂。

9.如权利要求1~8所述的生物标志物CENPH在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，所述胶质瘤为胶质母细胞瘤。

10.如权利要求9所述的生物标志物CENPH在制备检测或评估胶质瘤的产品中的应用，与对照组的生物样本相比，所述生物标志物CENPH在脑胶质瘤组织中的表达水平上调。