[go: up one dir, main page]

CN116466074A - 基于特异性抗原fhh的肝片吸虫胶体金检测方法 - Google Patents

基于特异性抗原fhh的肝片吸虫胶体金检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116466074A
CN116466074A CN202310270980.6A CN202310270980A CN116466074A CN 116466074 A CN116466074 A CN 116466074A CN 202310270980 A CN202310270980 A CN 202310270980A CN 116466074 A CN116466074 A CN 116466074A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fhh
colloidal gold
protein
specific antigen
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310270980.6A
Other languages
English (en)
Inventor
宫鹏涛
李利君
张西臣
曹利利
李建华
刘娟
王晓岑
李新
张楠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin University
Original Assignee
Jilin University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin University filed Critical Jilin University
Priority to CN202310270980.6A priority Critical patent/CN116466074A/zh
Publication of CN116466074A publication Critical patent/CN116466074A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法，该检测方法采用肝片吸虫特异性抗原基因FHH、FHH蛋白、胶体金颗粒、金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金颗粒和检测试纸条进行检测。该方法具有简单快速、结果可视、成本低廉、且高特异性高灵敏性等优点。其中通过肝片吸虫成虫cDNA表达文库筛选所得的抗原基因FHH，保证了本发明的特异性。适用于临床快速诊断以及大规模的流行病学调查。

Description

基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，具体为基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法。
背景技术
肝片吸虫病是由肝片吸虫引起的一种重要的人兽共患寄生虫病，该病可感染多种哺乳动物，包括牛、羊、鹿等反刍动物，猪、马属动物以及部分野生动物，人也有感染的报道。该病能引发宿主肝炎与胆管炎，并伴有全身性中毒现象和营养障碍，不仅严重危害人类健康安全，同时也给畜牧养殖业带来极大的影响。肝片吸虫病目前常用的检测方法有病原学、分子生物学、免疫学方法等，病原学诊断多采用显微镜对病畜所排粪便样品虫卵进行观察，是肝片吸虫病的一种经典诊断手段，但是该方法存在消耗人力物力，检出率低，容易漏检等缺点。分子生物学诊断主要是以肝片吸虫特异性基因作为靶标来进行检测，尽管该方法具有高度的特异性和敏感性，但是对于仪器设备存在需求，适用于实验室检测，不适合在临床实践中推广应用。肝片吸虫免疫学诊断的原理是抗原抗体特异性结合，利用已知的肝片吸虫抗原(抗体)来检测抗体(抗原)。其中ELISA检测方法需要专业操作、相关仪器，且检测时间长；胶体金试纸条是一种检测快速、操作简单、结果直观、不需要专业操作与设备的诊断方法，适合临床检查。成熟可靠的免疫学诊断方法基于特异性好，敏感性高的抗原基因，所以，特异性抗原的选择尤为重要。且针对目前我国肝片吸虫病诊断抗原稀缺的问题，本发明通过肝片吸虫cDNA文库筛选出肝片吸虫特异性抗原基因，并以此为基础建立一种检测羊肝片吸虫的胶体金试纸条，并对临床样品进行检测。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法，以解决上述背景技术提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法，该检测方法包含肝片吸虫特异性抗原基因FHH、FHH蛋白、胶体金颗粒、金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金颗粒和检测试纸条进行检测，通过肝片吸虫cDNA表达文库筛选肝片吸虫特异性抗原基因FHH，建立了一种间接胶体金试纸条检测方法；检测过程中所述FHH蛋白与羊肝片吸虫感染阳性血清中的特异性抗体发生结合，使其胶体金免疫层析检测试纸条更具特异性；该试纸条可在常规环境中保存，无需仪器设备，且便于携带；该方法在15min左右即可肉眼观察结果，适合大范围临床样品检测。
作为本发明的一种优选技术方案，所述肝片吸虫特异性抗原基因FHH，其基因序列如序列1所示；其抗原基因FHH的扩增引物，利用CE designV1软件设计，使用酶切位点BamHI、Xho I，其核苷酸序列如序列2所示。
作为本发明的一种优选技术方案，所述FHH蛋白为纯化的pET-32a-FHH重组蛋白，使用生物信息学分析预测其可能具有较好的抗原性，并通过Western Blotting验证该蛋白具有良好的反应原性。
作为本发明的一种优选技术方案，所述胶体金颗粒的制备过程：利用柠檬酸三钠还原法烧制，制备40nm胶体金颗粒。
作为本发明的一种优选技术方案，所述金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金颗粒，其制备方法如下：1mL胶体金溶液加2μL 0.2mol/LK2CO3调节pH，加入5μg SPA蛋白进行标记，之后用10％BSA进行封闭，离心后弃上清，溶解于10％复溶液中并滴加在金标垫上。
作为本发明的一种优选技术方案，所述检测试纸条通过PVC底板、样品垫、金标垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水板构成；其中金标垫上为金标抗体，NC膜检测线上为纯化的肝片吸虫特异性抗原FHH蛋白，NC膜质控线上为兔抗SPA二抗；最后将样品垫、金标垫、NC膜、吸水板相互重叠2mm组装成试纸条。
本发明的有益效果是：
第一，通过肝片吸虫cDNA表达文库筛选提供了一种新的肝片吸虫特异性抗原基因FHH(基因号)，并以此基因提升胶体金检测方法的特异性；
第二，通过原核表达FHH蛋白，自制胶体金颗粒、金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)标记胶体金颗粒以及检测试纸条等方式，降低了该检测方法的制作成本；
第三，建立间接胶体金检测试纸条，具有简单、快速、无需专业人员及仪器，且结果直观，适于临床推广。
综上所述，该方法快速、便捷、结果可视、成本低廉，且特异性高，可作为一种检测羊肝片吸虫的工具，且无需专业仪器与人员，特别适用临床现场检测与大规模流行病学调查，为肝片吸虫病的诊断与防治提供了良好的技术手段。
附图说明
图1所示为噬菌斑和免疫筛查结果图；
图2所示为FHH蛋白生物信息学分析图；
图3所示为FHH重组蛋白纯化图；
图4所示为FHH重组蛋白鉴定图；
图5所示为胶体金试纸条判定标准图；
图6所示为胶体金颗粒透射电镜图；
图7所示为SPA标记胶体金颗粒透射电镜图；
图8所示为检测线(T)最佳包被浓度的确定；
图9所示为质控线(C)最佳包被浓度的确定；
图10所示为敏感性试验；
图11所示为特异性试验；
图12所示为重复性试验；
图13所示为临床样品检测图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：肝片吸虫cDNA表达文库的筛选与分析
1.噬菌体培养及诱导表达；
(1)XL1-Blue菌培养：取10μLXL1-Blue甘油菌接种于含有0.1％四环素的液体LB培养基中，37℃摇床过夜。菌液离心取沉淀。
(2)噬菌体培养：提前将NZY琼脂板预热；45℃处理NZY顶层琼脂；依次用200μL20mM Mg2SO4、100μL SM buffer、100μL 105稀释倍数的肝片吸虫噬菌体cDNA表达文库重悬XL1-Blue菌块至4mL离心管，补足NZY顶层琼脂，混匀倒入NZY琼脂板。密封放入37℃恒温箱中培养6h。
(3)噬菌体筛库诱导表达：NC膜置于10mM IPTG溶液中浸润。将NC膜覆盖于培养好的NZY顶层培养基，封口后倒置放入37℃恒温箱孵育6h。用镊子小心将NC膜剥离放入平皿，平板放置4℃。
2.噬菌斑表达蛋白的免疫孵育；
(1)封闭：用TNT buffer洗涤NC膜，5-8min/次，洗3次。将带有肝片吸虫表达蛋白的NC膜置于TNT封闭液中，室温封闭2h。
(2)一抗孵育：将羊肝片吸虫自然感染阳性血清用TNT封闭液进行稀释，稀释倍数1:400。随后将NC膜置于含一抗的一抗稀释液中，室温孵育3h。
(3)洗膜：一抗孵育结束后，进行洗膜。将NC膜置于TNT buffer溶液中进行洗涤，15-20min/次，共3次。
(4)二抗孵育：将HRP-兔抗羊IgG抗体按照1:5000的稀释倍数用TNT封闭液进行稀释，随后将NC膜置于二抗稀释液中，室温孵育1h；
(5)洗膜：二抗孵育结束后，进行洗膜。将NC膜置于TNT buffer溶液中进行洗涤，15-20min/次，共3次；
(6)显影：将NC膜置于ECL化学发光成像仪中，NC膜与NZY培养基贴合的一面为正面，朝上放置。在NC膜上滴加适量显影液，进行显影。
3.阳性噬菌斑的扩增；
选平板中与显影结果一致的噬菌斑进行扩增，引物为噬菌体测序通用引物，上游引物:5'-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3'；下游引物：5'-ATACGACTCACTATAGGGCGAAT-TGGCC-3'。PCR反应体系(共20μL)：2×Master Mix 10μL，上、下游引物各1μL，模板1μL，用ddH2O补足体系。PCR程序：94℃5min；94℃60s，61℃60s，72℃1min，共35个循环；72℃10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，将回收纯化后的PCR产物送公司测序，测序结果在NCBI上进行Blast分析；
4.特异性基因生物信息学分析；
使用生物信息学软件DNAStar中protean程序分析蛋白二级结构和抗原表位，用I-TASSER中COFACTOR算法对其进行功能预测分析。
结果：
1.阳性噬菌斑筛选；
噬菌体过夜培养在平板上显示均匀且分布适中的噬箘体斑(图1)。NC膜孵育后显影呈现明显蛋白表达印迹(图1)，结果显示肝片吸虫抗原基因成功于噬菌体表面表达。
2.阳性噬菌斑的PCR扩增与序列分析；
选取阳性噬菌斑用噬菌体通用引物扩增，得到噬菌体中插入的肝片吸虫基因片段。对PCR产物测序结果进行同源性分析，结果显示假定蛋白D915-009456为肝片吸虫特异性抗原基因，只与肝片吸虫相关蛋白有同源性，与其他种属蛋白无交叉同源性。
3.特异性抗原基因生物信息学分析；
利用生物学软件分析二级结构和抗原表位(图2)，发现假定蛋白D915_009456蛋白基因全长231bp，编码76个氨基酸。综合该蛋白二级结构、亲水性、表面可能性、柔韧性、抗原性等方面，预测假定蛋白D915_009456蛋白具有3个潜在的B细胞抗原表位，主要位于11-16、22-24、43-49位氨基酸残基或其附近，共16个氨基酸，占整个氨基酸序列的21％，同时蛋白功能预测假定蛋白D915_009456蛋白可能具有水解酶活性(hydrolase activity)，故假定蛋白D915_009456在下面表述中简称FHH蛋白，推测该蛋白具有较好的抗原性。
实施例2：肝片吸虫特异性抗原FHH蛋白的表达与纯化；
1,原核载体的构建；
(1)引物设计：利用CE designV1软件设计特异性基因FHH的扩增引物，酶切位点BamH I、Xho I，上游引物：5'-GCCATGGCTGATATCGGATCCATGAATTTCCTTGGGATTATTTTAACT-3'；下游引物：5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGAAGCTGAGCAATATATCCGCG-3'。
(2)目的基因扩增：以肝片吸虫cDNA为模板进行扩增，PCR反应体系(25μL)：TaKaRaTaq酶0.25μL，10×PCR Buffer(Mg2+plus)5μL，dNTP Mixture 4μL，Template<500ng，上下游引物各2μL，dd H2O补足体系。PCR程序：94℃3min；94℃30s，60℃10s，72℃1min，共35个循环；72℃10min。
(3)载体构建：目的基因扩增回收产物连接克隆载体pMD-18T，后提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳双酶切鉴定及测序。双酶切体系(20μL):pMD-18T-FHH 16μL，10×QuickcutGreen 2μL，QuickCutTMBamHI 1μL、QuickCutTMXhoI 1μL，37℃25min。序列比对正确后，连接表达载体pET-32a，并再次进行双酶切鉴定及测序。提取序列结果比对正确的质粒转入表达感受态细胞BL21(DE3)中，保存待用。
2.重组蛋白FHH的纯化与鉴定；
(1)包涵体纯化：pET-32a-FHH菌液37℃摇床过夜培养后，取活化菌液1mL至新的1L含Amp+抗性的LB培养基中，37℃震荡至菌液OD值为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG，16℃培养16h。培养结束后菌液离心取沉淀。用0.01mol/L的PBS洗涤菌体沉淀3次，加入TE缓冲液，超声破碎，收集包涵体沉淀。加入洗涤缓冲液Ⅰ，室温200r/min搅拌洗涤2h；4℃，6080g离心40min，收集包涵体沉淀；相同条件下洗涤缓冲液Ⅱ洗涤包涵体1次。溶解于变性缓冲液室温120r/min搅拌过夜；25℃，6080g离心30min，收集上清。变性包涵体装入透析袋中，依次浸入复性缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中置于4℃进行复性，每次透析6～12h；再置0.01mol/L的PBS缓冲液(p H 7.4)中透析6h；4℃，6080×g离心30min，取上清。取各步骤样品进行15％SDS-PAGE分析。
(2)特异性血清验证：取纯化后的肝片吸虫FHH重组蛋白，制样，并利用羊肝片吸虫感染阳性血清进行Western Blotting试验，对重组蛋白进行鉴定，分析其反应原性。
结果：
1.肝片吸虫特异性抗原基因FHH的蛋白表达载体构建；
(1)目的基因扩增：通过1％琼脂糖凝胶电泳分析，250bp处有单一明显条带，成功获得FHH基因条带。
(2)载体构建：将表达载体pET-32a和重组克隆质粒pMD-18T-FHH分别进行双酶切，切胶回收抗原基因片段和载体片段，使用T4连接酶连接片段；菌落PCR显示，抗原基因片段和载体片段成功连接。
2.重组蛋白FHH的纯化与鉴定；
(1)包涵体纯化：将重组表达载体转入表达菌株BL21后，利用IPTG对重组蛋白进行诱导表达，经SDS-PAGE试验发现，目的条带大小与预期大致相符，约28kDa，且为包涵体形式表达(图3)；
(2)特异性血清验证：利用羊肝片吸虫感染血清进行Western-Blotting试验，得到明显免疫印迹(图4)，说明FHH具有较好反应原性。
实施例3：羊肝片吸虫胶体金层析试纸条检测方法的建立；
1.胶体金溶液的制备与鉴定；
(1)胶体金溶液的制备：以100mL为例，量取99mL超纯水加入圆底烧瓶，置于加热磁力搅拌器上。打开加热开关，待转子表面覆满气泡后，打开磁旋开关，依次加入1mL氯金酸溶液和1mL柠檬酸钠溶液。观察液体颜色转为稳定的酒红色后，持续加热8min关闭。胶体金冷却至室温，使用超纯水定容至100mL，4℃避光保存。
(2)胶体金颗粒的鉴定：拍摄透射电镜，观察胶体金颗粒是否大小均一，是否分布均匀。
2.检测条件的优化；
(1)最佳pH值的确定：分别加入1、2、3、4、5、6μL的0.2M K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH，每管加入过量SPA蛋白30μg。混合后室温静置30min，每管加入100μL 10％ NaCl溶液，室温孵育2h。观察溶液颜色变化，能维持胶体金胶体状态，颜色依旧呈亮红色的为最佳pH值。
(2)SPA蛋白最佳标记量的确定：将溶液调节至最适pH后，依次加入0、5、10、15、20、25μg SPA蛋白。充分混合后于室温下静置30min，每管加入100μL的10％NaCl溶液，置于室温孵育2h。基于颜色变化确定胶体金溶液SPA最佳标记量。通常选择高于该添加量的10％。
3.金标抗体的制备与鉴定；
(1)金标抗体的制备：加入最适条件的0.2M K2CO3调节胶体金溶液至最适pH值。加入最佳标记量的SPA蛋白进行胶体金标记。加入总体积10％的BSA进行封闭。充分混匀后，12000g，4℃离心30min。弃上清，用10％体积复溶液重悬沉淀，将其添加于金标垫37℃干燥备用。
(2)金标抗体的鉴定：通过透射电镜观察金标抗体颗粒的大小、均一度和聚沉情况等，是否在胶体金颗粒周围出现晕圈。
4.检测线(T)与质控线(C)最佳条件的确定；
将NC膜裁剪为300×25mm的长条，分别将SPA和FHH蛋白添加至NC膜上作为质控线(C)和检测线(T)。
使用PBS溶液稀释SPA二抗至浓度为1、0.5、0.25、0.125mg/mL，添加于NC膜作为T线。组装成试纸检测羊肝片吸虫感染阳性血清，取显色效果最好且用量最少的SPA二抗添加浓度。
使用PBS溶液稀释纯化蛋白FHH浓度为2、1、0.5、0.25mg/mL，与T线保持一定距离，添加C线。组装成试纸检测羊肝片吸虫感染阳性血清与阴性血清，取C线显色效果与T线相一致的浓度作为纯化蛋白的添加浓度。
6.试纸条的组装；
将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸组装于支撑底板PVC垫上，彼此重叠1～2mm，以便液体流动。使用切纸机裁成单独的4.0mm宽的试纸条带，并装入塑料外壳，分装于密封袋中，干燥避光保存。
7.胶体金试纸条的判定标准；
样品首先被胶体金标记的SPA蛋白捕获，形成抗原-抗体免疫复合物，随后在试纸条上层析迁移。移动至C线时被SPA二抗捕获，并在C线显示肉眼可见的红色条带，证明其试纸条有效；若C线不显色，则表明试纸条无效。当血清中存在肝片吸虫特异性抗体时，该复合物层析作用移动至FHH蛋白包被线时被捕获，在T线显示肉眼可见的红色条带；若不存在肝片吸虫特异性抗体，则不显色。故其判定标准为，如图5所示：
若C线、T线均显色，则说明该样品检测阳性；
若C线显色、T线不显色，则说明该样品检测阴性；
若C线不显色，无论T线是否显色，均说明试纸条已失效，需重测。
结果：
1.胶体金溶液的烧制；
结果显示，成功烧制的胶体金溶液，眼观呈透亮清澈的酒红色，瓶身底部无颗粒沉淀，表面也没有浮游状杂质。
2.检测条件的优化；
通过调整K2CO3溶液的加入量，当加入2μL 0.2mol/LK2CO3时胶体金溶液颜色稳定且用量最少，证明其调节的pH值效果最佳。
且当SPA加入量为5μg时，颜色稳定无明显变化，且随着SPA加入量增高而颜色固定不变，在此基础上增加20％的SPA投入量6μg，即为本实验中SPA最佳标记量。
3.透射电镜(TEM)观察；
通过透射电镜观察，制备的胶体金溶液中胶体金颗粒大小均匀，密度适中分散无聚集，呈圆形或椭圆形(图6)。金标抗体的胶体金颗粒通过观察，镜下显示胶体金颗粒周围存在明显晕圈，表明SPA蛋白成功标记了胶体金颗粒(图7)。
4.检测线(T)和质控线(C)的最佳包被浓度的确定；
将FHH蛋白稀释至0.5mg/mL，检测线(T)依然清晰(图8)，且使用的蛋白量最少。因此检测线(T)的最佳包被浓度为0.5mg/mL。
检测线(T)包被0.5mg/mL的FHH蛋白，用PBS对兔抗SPA二抗进行倍比稀释。当包被浓度为0.125mg/mL时，质控线(C)颜色依然清晰(图9)，所以质控线(C)兔抗SPA二抗最佳包被浓度为0.125mg/mL。
实施例4：试纸条的性能测试与临床样品的检测；
1.试纸条相关性能测试；
(1)敏感性试验和特异性试验；
使用上述条件的试纸条检测羊肝片吸虫感染标准阳性血清评价胶体金试纸条的最低检测限。将阳性血清从1:10倍开始倍比稀释至1:160倍，根据检测线(T)是否有颜色变化来判断该方法的敏感性。
使用优化好的试纸条，分别检测羊肝片吸虫感染阳性血清、阴性血清、双腔吸虫感染阳性血清、新孢子虫感染阳性血清、捻转血矛线虫感染阳性血清，判断试纸条结果，确定有无交叉反应。
(2)重复性试验和稳定性试验；
用三次不同批次制作的试纸条，分别对羊肝片吸虫感染标准阳性血清与标准阴性血清进行测定，根据试纸条检测线(T)颜色变化，评价试纸条的重复性。
将组装好的试纸条放入装有干燥剂的密封袋里，分别置于4℃、室温与37℃环境中，并在保存7天、30天、60天和90天后，进行测试，根据试纸条检测线(T)颜色变化，确定试纸条最长保存期限。
2.胶体金层析试纸条临床样品的检测；
为了进一步评估胶体金试纸，用该检测试纸条和商品化ELISA试剂盒共同检测了同一批内蒙古某地区的24份羊血清样品。
结果；
1.试纸条的性能测试；
(1)敏感性试验与特异性试验；
选取羊肝片吸虫感染阳性血清样品按照1:10，1:20，1:40，1:80，1:160进行倍比稀释，结果当1:80倍稀释时检测线(T)仍有显色，所以该试纸条敏感性为1:80(图10)。
用优化好的试纸条，分别对羊肝片吸虫感染阳性血清、阴性血清、双腔吸虫感染阳性血清、新孢子虫感染阳性血清、捻转血矛线虫感染阳性血清进行检测，观察检测线(T)的颜色变化，结果发现只有滴加羊肝片吸虫感染阳性血清样品的试纸条检测线(T)线显色，滴加羊肝片吸虫感染阴性血清、双腔吸虫感染阳性血清、新孢子虫感染阳性血清、捻转血矛线虫感染阳性血清的试纸条检测线(T)线均无显色，与羊其他特异性血清无交叉反应，表明该试纸条特异性良好(图11)。
(2)重复性试验和保存期试验；
用三个不同批次的试纸条，分别滴加羊肝片吸虫感染阳性血清，阴性血清，进行重复性试验，结果显示该试纸条重复性良好(图12)。
将制备好的试纸条放入带有干燥剂的密封袋中，分别储存于4℃、室温和37℃的环境中，在分别储存7d,30d,60d,90d后进行试验，通过试纸条检测线(T)的颜色变化，判定其保存期限，试纸条在4℃环境中保存时间较长，在90d时仍可判定阳性样品。试纸条在室温和37℃环境中只可保存60d。
2.胶体金层析试纸条临床样品的检测；
使用建立的胶体金层析试纸条方法检测内蒙古某地区的24份羊血清样品(图13)，发现4份为阳性样品，阳性率为16.7％(4/24)。与商品化试剂盒对这24份羊血清样品的检测结果一致，说明胶体金层析试纸可用于临床样品检测。
序列1：肝片吸虫特异性抗原基因FHH
GenBank:JXXN02005516.1
>JXXN02005516.1:c51472-51366,c51152-51029 Fasciola hepatica F_hepatica-1.0_Cont5516,whole genome shotgun sequence
ATGAATTTCCTTGGGATTATTTTAACTTTTCGACCAACTAGATATTCT
TATCTGCCCTCTTTTCTACTTT
CTTTCACCTGTTTGATCTGCAGAAAGCAATACTACAGCTTCTTCAAAT
GGCACATCGAGGCCCCCCAGTC
ACATGGCTTTCCTCACATTCCCGCTAAAGTGTCTTGGATTGATCCAGT
AGTGGATACGTTTAGTTGCCGC
GGATATATTGCTCAGCTTTAA
序列2：肝片吸虫特异性抗原基因FHH的扩增引物
上游引物：
5'-GCCATGGCTGATATCGGATCCATGAATTTCCTTGGGATTATTTTAACT-3'；
下游引物：
5'-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGAAGCTGAGCAATATATCCGCG-3'。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.基于基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法，其特征在于：该检测方法通过肝片吸虫特异性抗原基因FHH、FHH蛋白、胶体金颗粒、金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金颗粒和检测试纸条进行检测，通过肝片吸虫cDNA表达文库筛选肝片吸虫特异性抗原基因FHH，建立了一种间接胶体金试纸条检测方法；检测过程中所述FHH蛋白与羊肝片吸虫感染阳性血清中的特异性抗体发生结合，使其胶体金免疫层析检测试纸条更具特异性；该试纸条可在常规环境中保存，无需仪器设备，且便于携带；该方法在15min左右即可肉眼观察结果，适合大范围临床样品检测。
2.根据权利要求1所述的基于基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法，其特征在于：所述肝片吸虫特异性抗原基因FHH，其基因序列如序列1所示；其抗原基因FHH的扩增引物，利用CEdesignV1软件设计，使用酶切位点BamHI、XhoI，其核苷酸序列如序列2所示。
3.根据权利要求1所述的基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法，其特征在于：所述FHH蛋白为纯化的pET-32a-FHH重组蛋白，使用生物信息学分析预测其可能具有较好的抗原性，并通过WesternBlotting验证该蛋白具有良好的反应原性。
4.根据权利要求1所述的基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法，其特征在于：所述胶体金颗粒的制备过程：利用柠檬酸三钠还原法烧制，制备40nm胶体金颗粒。
5.根据权利要求1所述的基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌蛋白A标记的胶体金颗粒，其制备方法如下：1mL胶体金溶液加2μL0.2mol/LK2CO3调节pH，加入5μgSPA蛋白进行标记，之后用10％BSA进行封闭，离心后弃上清，溶解于10％复溶液中并滴加在金标垫上。
6.根据权利要求1所述的基于特异性抗原FHH的肝片吸虫胶体金检测方法，其特征在于：所述检测试纸条通过PVC底板、样品垫、金标垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水板构成；其中金标垫上为金标抗体，NC膜检测线上为纯化的肝片吸虫特异性抗原FHH蛋白，NC膜质控线上为兔抗SPA二抗；最后将样品垫、金标垫、NC膜、吸水板相互重叠2mm组装成试纸条。
CN202310270980.6A 2023-03-20 2023-03-20 基于特异性抗原fhh的肝片吸虫胶体金检测方法 Pending CN116466074A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310270980.6A CN116466074A (zh) 2023-03-20 2023-03-20 基于特异性抗原fhh的肝片吸虫胶体金检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310270980.6A CN116466074A (zh) 2023-03-20 2023-03-20 基于特异性抗原fhh的肝片吸虫胶体金检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116466074A true CN116466074A (zh) 2023-07-21

Family

ID=87181530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310270980.6A Pending CN116466074A (zh) 2023-03-20 2023-03-20 基于特异性抗原fhh的肝片吸虫胶体金检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116466074A (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014056885A1 (en) * 2012-10-09 2014-04-17 Universiteit Gent Cooperia vaccine
WO2017161181A1 (en) * 2016-03-16 2017-09-21 Spogen Biotech Inc. Fusion proteins, recombinant bacteria, and exosporium fragments for animal health and aquaculture
CN111077300A (zh) * 2018-10-22 2020-04-28 吉林大学 一种肝片吸虫假定蛋白基因及胶体金免疫层析试纸
CN111574608A (zh) * 2020-04-21 2020-08-25 沈阳农业大学 牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原及其应用
CN112538484A (zh) * 2021-01-05 2021-03-23 吉林大学 一种肝片吸虫特异抗原基因FhSAP-2及医用用途
CN113201546A (zh) * 2021-05-18 2021-08-03 吉林大学 一种华支睾吸虫特异抗原val28及医用用途
CN114080454A (zh) * 2019-06-26 2022-02-22 豪夫迈·罗氏有限公司 核酸的随机化构型靶向整合
CN114236117A (zh) * 2021-11-17 2022-03-25 吉林大学 一种用于羊肝片吸虫感染循环抗原检测的胶体金试纸条

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014056885A1 (en) * 2012-10-09 2014-04-17 Universiteit Gent Cooperia vaccine
WO2017161181A1 (en) * 2016-03-16 2017-09-21 Spogen Biotech Inc. Fusion proteins, recombinant bacteria, and exosporium fragments for animal health and aquaculture
CN111077300A (zh) * 2018-10-22 2020-04-28 吉林大学 一种肝片吸虫假定蛋白基因及胶体金免疫层析试纸
CN114080454A (zh) * 2019-06-26 2022-02-22 豪夫迈·罗氏有限公司 核酸的随机化构型靶向整合
CN111574608A (zh) * 2020-04-21 2020-08-25 沈阳农业大学 牛细粒棘球蚴病的特异性检测抗原及其应用
CN112538484A (zh) * 2021-01-05 2021-03-23 吉林大学 一种肝片吸虫特异抗原基因FhSAP-2及医用用途
CN113201546A (zh) * 2021-05-18 2021-08-03 吉林大学 一种华支睾吸虫特异抗原val28及医用用途
CN114236117A (zh) * 2021-11-17 2022-03-25 吉林大学 一种用于羊肝片吸虫感染循环抗原检测的胶体金试纸条

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GOURBAL, BEF 等: "Excretory-secretory products of larval Fasciola hepatica investigated using a two-dimensional proteomic approach", MOLECULAR AND BIOCHEMICAL PARASITOLOGY, vol. 161, no. 1, 30 September 2008 (2008-09-30), pages 63 - 66 *
刘天 等: "肝片吸虫cDNA文库构建及诊断候选抗原基因筛选", 中国病原生物学杂志, vol. 14, no. 1, 12 March 2019 (2019-03-12), pages 27 - 31 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111024954A (zh) 联合检测covid-19抗原和抗体的胶体金免疫层析装置及其使用法
CN113281523B (zh) 一种SARS-CoV-2中和抗体试纸条及其制备方法、试剂盒
WO2022032983A1 (zh) 一种检测非洲猪瘟病毒黏膜sIgA抗体的量子点微球免疫层析试纸条及其应用
CN111735943A (zh) 一种能够同步检测猪血中非洲猪瘟病毒抗原和抗体的试剂盒及检测方法
CN107045062B (zh) 检测人ngal的胶体金免疫层析试纸条、试剂盒及其制备方法
CN110568178A (zh) 一种寨卡病毒ns1抗原及其在制备荧光免疫层析试剂中的应用
CN102879561B (zh) 一种牛奶中人乳铁蛋白筛查试纸条及制备方法
CN101858914A (zh) 梅毒特异性总抗体胶体金免疫层析检测试剂条及其制备方法
CN101858916A (zh) 梅毒特异性IgM抗体胶体金免疫层析检测试剂条及其制备方法
CN101825635B (zh) 梅毒特异性IgG抗体与特异性总抗体联合检测试剂条及其制备方法
CN101858915A (zh) 梅毒特异性IgG抗体胶体金免疫层析检测试剂条及其制备方法
CN101782577A (zh) 旋毛虫病斑点免疫金渗滤法诊断试剂盒
CN104569425B (zh) 一种与酪氨酸磷酸酶抗体特异结合的抗原蛋白质
CN102095858A (zh) 梅毒心磷脂和特异性抗体IgM免疫印迹试剂盒及其制备
CN116466074A (zh) 基于特异性抗原fhh的肝片吸虫胶体金检测方法
CN201926662U (zh) 梅毒特异性总抗体免疫印迹试剂盒
CN113884674A (zh) 一种牛支原体胶体金免疫检测试纸条、制备方法及其应用
CN117603366B (zh) 一种布鲁氏菌特异性融合抗原及其应用
CN119125552A (zh) 一种区分猪胸膜肺炎放线杆菌野毒感染与疫苗免疫的胶体金试纸条及应用
CN102081096A (zh) 梅毒心磷脂和特异性抗体IgG免疫印迹试剂盒及其制备
CN201955343U (zh) 梅毒心磷脂和特异性抗体IgM免疫印迹试剂盒
CN116794304A (zh) 一种联合检测asfv抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸及其应用
CN117169496A (zh) 检测犬华支睾吸虫感染胶体金免疫层析试纸及制备方法
CN115166238A (zh) 羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条
CN103146714A (zh) 一种结核分枝杆菌cfp10抗原蛋白串联重组表达方法及其在结核检测中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination