CN116445303A

CN116445303A - 一株利用生物质糖化液发酵生产虾青素的菌株及其应用

Info

Publication number: CN116445303A
Application number: CN202310275423.3A
Authority: CN
Inventors: 徐宁; 刘晓燕; 王嫣然; 王娅; 崔双玥; 信丰学; 许家兴; 胡磊; 吴真
Original assignee: Huaiyin Normal University
Current assignee: Huaiyin Normal University
Priority date: 2023-03-20
Filing date: 2023-03-20
Publication date: 2023-07-18

Abstract

本发明公开了一株利用生物质糖化液发酵生产虾青素的菌株及其应用，所述菌株分类命名为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)H15，保藏编号为CCTCC NO：M 20221891。本发明通过等离子体诱变，得到的突变菌株H15具有较强的耐受性，可很好的适应生物质水解糖化液，并能以其为唯一碳源，发酵生产虾青素产量达到了225.86mg/L，含量为11.2mg/g细胞干重，是同等条件培养的原始菌株的1.3倍。该菌株虾青素单位产量高、稳定性高好，是一株适合作为工业化应用的优良菌种。本技术工艺步骤简单、发酵时间短、原料来源广泛，可以促进可再生生物质资源的高效利用；发酵所得酵母菌体经过洗涤后冷冻干燥可获得虾青素含量大于1.1％(w/w)的酵母虾青素干粉，具有较高的经济价值。

Description

一株利用生物质糖化液发酵生产虾青素的菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种以生物质水解糖化液为原料发酵生产虾青素的菌株及其应用。

背景技术

随着经济社会的发展，人们的生活质量大步提高，追求营养更加丰富的健康饮食。以虾青素为代表的类胡萝卜素属于萜类化合物，存在于动物、植物、藻类的黄色、橙红色或红色的色素之中，人体自身不能合成，必须通过饮食摄入。虾青素是自然界最强的抗氧化剂之一，具有很好的着色、抗氧化、提高免疫力、抗衰老等功效，其生物来源的产品安全性好，是一种营养价值较高的食品、饲料添加剂，可很好的满足人们对高质量饮食的需求。

目前，虾青素主要以化工合成为主，占总产量的80％左右。以虾青素为例，其生产主要被西方欧美公司垄断，我国的虾青素来源主要依靠进口。另外，生物来源的类胡萝卜素的产量较少，主要以天然提取、微藻养殖法为主，产量低且成本较高。在生物合成(发酵法)方面，国外企业已经在菌种、工艺等方面开展了大量的研究，拥有多项专利技术和较为成熟的工艺，但其主要方式还是以藻类提取为主，其生产周期较长、成本较高，集约化程度较低，经济效益不高。当前国内的类胡萝卜素生物合成起步较晚，只有少数几个企业开展了试验性的初步探索，缺乏具有自主知识产权的高效生产工艺，产品缺乏市场竞争力。

目前,虾青素的微生物发酵工艺主要是以红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)为发酵菌种，在好氧条件下以葡萄糖作为底物进行发酵生产。生物质资源中含有大量的纤维素、半纤维素及淀粉等多聚糖类物质，这些碳水化合物聚合物可水解生成富含葡萄糖、木糖等多种低聚糖在内的糖化液，然后再由微生物转化生产下游产品。当前，下游产品主要是以醇类、酸类、微生物之油脂为主，其附加值不高，规模化经济效益较低，工业化生产潜力不足。如能将生物质水解产生的糖化液用来生产高附加值虾青素，将具有显著的经济和社会效益。

申请人长期从事生物质高效水解工艺研究，拥有城市废弃生物质资源多级水解糖化方法等专利技术，其水解液富含葡萄糖等糖类物质，可以尝试用于虾青素的发酵生产。但是生物质水解糖化液相对于葡萄糖，成分复杂，现有菌株难以适应，

发明内容

本发明本发明筛选得到一株新的菌株，能够以生物质水解糖化液为发酵原料，进而发酵生产虾青素的技术工艺，既可以充分利用各种废弃生物质资源，又可以生产高附加值的虾青素，同步实现多重经济和社会效益。

为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

一株高产虾青素的菌株，其分类命名为红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)H15，已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：M 20221891，保藏日期为2022年12月7日。

所述菌株红法夫酵母H15通过等离子体诱变筛选得到，具有较强的耐受性，可以很好的耐受生物质水解液中糠醛、有机酸等有害物质，可以利用生物质水解液中的葡萄糖等糖类为碳源，发酵获得高产虾青素。

菌株特征描述：在普通光学显微镜(1000×)下观察为卵圆形，有芽孢；在固体平板培养基上生长72h后观察菌落成球形，表面光滑、大而厚、湿润；菌落呈现血红色，颜色均匀。

本发明的另一目的在于提供所述红法夫酵母H15以生物质糖化液为原料发酵生产虾青素的方法。

具体的，以生物质水解糖化液为原料，将所述红法夫酵母发酵培养后的发酵液分离得到总固形物浓度大于90％(w/w)的酵母菌体，冷冻干燥后获得虾青素含量大于1.1％(w/w)的酵母虾青素。

所述红法夫酵母发酵培养方式如下：

1)平板培养：将红法夫酵母接种至平板培养基培养，培养温度15-35℃，培养时间50-100h；优选培养温度22℃，培养时间72h；

2)种子培养：将平板培养的红法夫酵母接种到种子培养基中培养，培养温度15-35℃，培养时间20-80h；优选培养温度22℃，培养时间48h；

3)发酵培养：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量5-15％(v/v)，优选10％(v/v)，发酵温度15-35℃，发酵培养时间为50-200h，优选发酵温度22℃，发酵培养时间为120h。

进一步的，所述红法夫酵母在好氧条件下发酵培养，通气量0.5-3vvm。

进一步的，所述红法夫酵母以生物质水解糖化液为碳源发酵培养，其生物质水解糖化液是按照专利ZL201710594661.5的技术工艺进行制备获得的高浓度糖化液。

YM固体平板培养基配方：酵母粉0.3％、蛋白胨0.5％、麦芽提取物0.3％、葡萄糖1％，琼脂2％，其余为水，pH 6.0。

种子培养基：酵母粉0.3％、蛋白胨0.5％、麦芽提取物0.3％、葡萄糖1％，其余为水。

发酵培养的培养基配方为(以质量含量计)：生物质水解糖化液40-60％(折算为在培养基中的葡萄糖10-15％)、KH₂PO₄ 0.1-0.2％、(NH₄)₂SO₄ 0.2-0.4％、MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2％、酵母提取物0.1-0.2％、玉米浆干粉0.5-3％；微量元素为：ZnSO₄、CaCl₂、MnCl₂、CuSO₄，其添加量分别为0.1-0.3×10^-3g/L、0.1-0.4×10^-3g/L、0.2-0.8×10^-4g/L、0.1-0.3×10^-4g/L。优选为：生物质水解糖化液50％(折算为在培养基中的葡萄糖6％)、KH₂PO₄0.15％、(NH₄)₂SO₄ 0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％、酵母提取物0.15％、玉米浆干粉1.0％；微量元素为：ZnSO₄、CaCl₂、MnCl₂、CuSO₄，其添加量分别为0.192×10^-3g/L、0.167×10^-3g/L、0.54×10^-4g/L、0.16×10^-4g/L。

本发明所述的红法夫酵母经等离子体诱变，利用平板筛选具有较强的耐受性，可很好的适应生物质水解糖化液，并能以此为碳源发酵生产虾青素。利用本发明的菌株和工艺进行发酵，以生物质水解糖化液作为碳源，在摇瓶发酵产物中虾青素产量达到了12.04mg/g细胞干重，是同等条件培养的出发菌株的1.3倍，所得酵母虾青素可作为高品质饲料添加剂应用于养殖行业，具有较高的经济价值。

有益效果

本发明菌株能够以生物质水解糖化液作为碳源，在摇瓶发酵产物中虾青素产量达到了12.04mg/g细胞干重，产量高，稳定性好。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。根据下述实施例，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其它形式的限制，不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。任何熟悉本专业的技术人员能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。

以下实施例中所述生物质水解糖化液是按照专利ZL201710594661.5的技术工艺进行制备获得的高浓度糖化液。其将城市废弃生物质分为园林绿化废弃物、餐厨废弃物、废弃纸张三大类，针对不同来源生物质特性，采用ZL201710594661.5的方法将废弃生物质多级水解为包含葡萄糖、木糖在内的多种单糖的溶液，生物质水解液中同时也含有糠醛、有机酸等有害物质。

实施例1：本实施例说明红法夫酵母的筛选方法

红法夫酵母原始菌株为海洋野生菌，获取地点：山东省日照市。

以YM平板作为培养基，在好氧22℃条件下进行培养，培养2-4天，进行划线纯化5-7次，最终能在平板上生长的菌株进行验证，并将其发酵，考察其发酵产物和性能，发现该菌株可以利用葡萄糖为碳源生长，菌株呈红色，可以产生虾青素。将此菌株为出发菌株进行菌株改造。

野生菌株等离子体诱变的方法如下：

将红法夫酵母原始菌株活化培养，培养温度22℃，250mL三角瓶装液量20mL，培养时间48h，得到处于对数生长期的菌液；取新鲜培养的细胞用生理盐水稀释至细胞浓度OD₆₀₀＝0.6，取10微升菌液铺开在小铁片上，无菌空气吹干；用10KeV注入1.6×10¹⁶ions/cm²剂量，脉冲方式每次注入5s，间隔15s。离子束注入诱变后，将菌膜洗脱下来。

对诱变菌株进行进一步筛选，方法如下：

其中，所使用的培养基配方：

(1)固体平板培养基(质量百分比)：酵母粉0.3％、蛋白胨0.5％、麦芽提取物0.3％、生物质水解糖化液50.0％(并折算为培养基中葡萄糖6％)，琼脂2％，其余为水，pH6.0。

(2)摇瓶发酵筛选培养基：生物质水解糖化液50.0％(葡萄糖6.0％)、KH₂PO₄0.04％、NaH₂PO₄ 0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.15％、酵母提取物0.075％，添加不同的氮源(蛋白胨、玉米浆、硫酸铵)，pH为6.0，115℃，高压灭菌20min。注：生物质水解糖化液单独灭菌。

(3)磷酸盐缓冲溶液：0.2M NaH₂PO₄溶液，直至pH为6.0，121℃高压灭菌20min。

筛选步骤：

1、平板筛选

用生理盐水洗出经等离子体诱变的菌株，稀释成不同浓度涂布于常规YM固体培养基平板上，在22℃好氧培养72h，挑选可以在筛选平板上生长、菌落较大、色泽鲜红的菌落10株。

2、平板复筛

将筛选的菌株接种于250mL的三角瓶装液量20mL，22℃好氧培养24～30h，无菌生理盐水制成浓度OD₆₀₀＝0.6的菌悬液，吸取2uL点滴培养基平板上，在22℃温度下好氧培养48h，挑选出菌落直径大于原始菌的菌落。

经过复筛后得到两株红法夫酵母菌株H7、H15。

3、摇瓶发酵筛选

将菌株H7、H15和原始菌株接入种子培养基：酵母粉0.3％、蛋白胨0.5％、麦芽提取物0.3％、葡萄糖1％，进行扩大培养，培养温度22℃，250mL的三角瓶装液量50mL，培养时间48h。然后再以本实施例中的摇瓶发酵筛选培养基(实施例1中的摇瓶发酵筛选培养基)进行好氧发酵，接种量10％(v/v)，发酵温度22℃，500mL三角瓶装液量100mL，发酵时间120h后检测各菌株的虾青素产量如表1所示：

表1原始菌、H7、H15发酵筛选结果

经过筛选获得了两株突变株的细胞干重、虾青素产量含量均明显高于出发菌株，其中H15产量最高，其中诱变株H15可以很好的耐受生物质水解液中糠醛、有机酸等有害物质，可以利用生物质水解液中的葡糖等糖类为碳源，发酵获得高产虾青素，虾青素摇瓶发酵产量可以达到123.75mg/L，产量可以达到12.04mg/g(细胞干重)，对比原始菌株，在生物质水解液为唯一碳源情况下，虾青素产量提高了一倍。

实施例2：本实施例说明突变株H7、H15的传代稳定性及菌株特征。

菌株特征描述：在普通光学显微镜(1000×)下观察两株菌均为卵圆形，有芽孢；在固体平板培养基上生长72h后观察菌落成球形，表面光滑、大而厚、湿润；菌落呈现血红色，颜色均匀。

在以生物质水解液为碳源的发酵培养基(配方按照实施例1中的摇瓶发酵筛选培养基配置)中，检测突变株H7、H15的传代稳定性，传代发酵结果如表2所示：

表2菌株H7、H15传代发酵试验结果

从实验结果可知，经过10次连续传代，两株突变株的虾青素产量较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。

实施例3：本实施例说明红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)H15发酵生产虾青素的工艺。

本实施例所述的培养基配方(％，质量百分比)：

固体平板培养基：酵母粉0.3％、蛋白胨0.5％、麦芽提取物0.3％、葡萄糖1％，琼脂2％，其余为水，pH 6.0。

种子液培养基：酵母粉0.3％、蛋白胨0.5％、麦芽提取物0.3％、葡萄糖1％，其余为水。

发酵培养基：生物质水解浓缩糖化液50％(葡萄糖6.0％)、KH₂PO₄ 0.15％、(NH₄)₂SO₄0.3％、MgSO₄·7H₂O 0.15％、酵母提取物0.15％、玉米浆干粉1.0％；微量元素为：ZnSO₄、CaCl₂、MnCl₂、CuSO₄，其添加量分别为0.192×10^-3g/L、0.167×10^-3g/L、0.54×10^-4g/L、0.16×10^-4g/L。

将红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)H15接种至平板培养基，22℃培养时间72h；将平板培养的H15接种到种子培养基中，22℃下160r/min培养48h；将种子接种到5L发酵培养基中，接种量10％(v/v)，发酵温度22℃，通气量1vvm，好氧发酵培养120h后，检测虾青素产量225.86mg/L，含量为11.2mg/g(细胞干重)。

实施例4：本实施例说明红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)H15制得酵母虾青素干粉。

采用实施例3方法获得红法夫酵母H15发酵液，发酵液10000r/min离心洗涤两次并控干水分，得到总固形物浓度为大于90％(w/w)的酵母菌体。将1L发酵液所获得的湿菌体在-80℃下快速冷冻，然后冷冻干燥24小时后获得酵母虾青素干粉20.45g，其虾青素含量为1.1％(w/w)。

Claims

1.一株可利用生物质糖化液高产虾青素的菌株，其分类命名为红法夫酵母(Phaffiarhodozyma)H15，保藏编号为CCTCC NO：M 20221891。

2.权利要求1所述菌株以生物质水解糖化液为碳源发酵生产虾青素的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以生物质水解糖化液为原料，将所述红法夫酵母发酵培养后的发酵液分离得到总固形物浓度为大于90％(w/w)的酵母菌体，冷冻干燥后获得虾青素含量大于1.1％(w/w)的酵母虾青素。

4.根据权利要求2或3任一项所述的应用，其特征在于，所述红法夫酵母发酵培养的方式如下：

1)平板培养：将红法夫酵母接种至平板培养基培养，培养温度15～35℃，培养时间50～100h；

2)种子培养：将平板培养的红法夫酵母接种到种子培养基中培养，培养温度15～35℃，培养时间20～80h；

3)发酵培养：将种子培养液接种到发酵培养基中，接种量5～15％(v/v)，发酵温度15～35℃，发酵培养时间为50～200h。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述红法夫酵母在好氧条件下发酵培养，通气量1vvm。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述平板培养基配方为：酵母粉0.3％、蛋白胨0.5％、麦芽提取物0.3％、葡萄糖1％，琼脂2％，其余为水，pH 6.0。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述种子培养基配方为：酵母粉0.3％、蛋白胨0.5％、麦芽提取物0.3％、葡萄糖1％，其余为水。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵培养基配方为：生物质水解糖化液40-60％、KH₂PO₄ 0.1-0.2％、(NH₄)₂SO₄ 0.2-0.4％、MgSO₄·7H₂O 0.1-0.2％、酵母提取物0.1-0.2％、玉米浆干粉0.5-3％；微量元素为：ZnSO₄、CaCl₂、MnCl₂、CuSO₄，其添加量分别为0.1-0.3×10^-3g/L、0.1-0.4×10^-3g/L、0.2-0.8×10^-4g/L、0.1-0.3×10^-4g/L。