CN116406423A

CN116406423A - 制备具有所需特异性的效应细胞的方法

Info

Publication number: CN116406423A
Application number: CN202180070920.9A
Authority: CN
Inventors: 河本宏; 县保年; 永野诚治; 寺田晃士; 增田乔子; 近藤健太
Original assignee: Shiga University of Medical Science NUC; Kyoto University NUC
Current assignee: Shiga University of Medical Science NUC; Kyoto University NUC
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2021-09-24
Publication date: 2023-07-07
Also published as: JPWO2022065444A1; KR20230074505A; JP7807756B2; WO2022065444A1; CA3193384A1; AU2021349574A1; US20230357715A1; IL301534A; EP4219707A4; EP4219707A1

Abstract

提供了一种制备表达所需特异性决定区的效应细胞的方法。在该方法中，首先提供在其基因组具有带包含编码标记蛋白的基因的盒式磁带基因的磁带盒结构的材料细胞，其中材料细胞可以分化为效应细胞，并且其中当材料细胞分化为效应细胞或其祖细胞时，标记蛋白可以在效应细胞或其祖细胞中表达。材料细胞增殖，增殖的细胞分化成效应细胞，然后，效应细胞中编码标记蛋白的基因与编码有助于所需特异性的蛋白的基因交换。

Description

制备具有所需特异性的效应细胞的方法

背景

技术领域

本申请涉及一种产生具有所需特异性的效应细胞的方法。具体地，本申请涉及通过使用重组酶介导的盒交换(RMCE)或基因组编辑有效地产生表达具有所需特异性的T细胞受体的成熟T细胞或表达具有所需特异性的嵌合抗原受体(CAR)的成熟CAR-T细胞或其祖细胞的方法。

背景技术

肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是高度特异性的T淋巴细胞，其将体内的肿瘤组织识别为外来物质并浸润到肿瘤中。据报道，在50％-80％的各种癌症患者中存在TIL。TIL的存在被认为是免疫系统对癌症有反应的证据。TIL含有具有不同特异性的多种类型的T淋巴细胞，如果能够大量扩增TIL并施用于患者，则可以预期治疗效果。然而，很难从每个患者身上提取和增殖TIL，即使可能，也需要时间和成本，迄今为止仅证明了有限的功效。

通过将编码抗原特异性受体如TCR或CAR的基因引入成熟T细胞中获得的细胞已被提议用于治疗，特别是CAR-T细胞已被批准用于临床。为了获得这样的细胞，成熟的T细胞通过使用逆转录病毒或慢病毒随机引入有抗原特异性受体基因。如果将TCR或CAR基因敲入原始TCR基因基因座，则可以预期更多的生理表达模式。在随机基因引入中，存在插入位点无法控制、基因组受损的风险以及表达水平难以控制的问题。此外，为了应用该疗法，以同时施用表达各种TCR的成熟T细胞，如肿瘤浸润淋巴细胞，需要将TCR或CAR逐一引入成熟T细胞中。那是不现实的。

本发明的一些发明人提出将TCR基因引入多能干细胞，诱导多能干细胞分化为成熟T细胞，并将它们用于细胞免疫疗法(专利文献1至4)。另一组也提出将CAR基因引入多能干细胞中(专利文献5)。在那些文献中以可实现的方式公开的程序包括将TCR或CAR基因引入iPS细胞中，然后将iPS细胞分化成表现出功能的效应细胞的步骤。

本发明人还提出了通过提供用于将TCR基因引入ES细胞或iPS细胞的TCR基因座中的磁带盒(cassette deck)来引入所需的TCR的方法，使得TCR基因可以在启动子和内源增强子的控制下被引入。(专利文献6)。该方法使用称为重组酶介导的盒交换(RMCE)的程序。在该方法中，预先将具有可与外源序列交换的盒式磁带基因(cassette tape gene)的磁带盒结构置于材料细胞的基因组中。盒式磁带基因可以通过使用重组酶如Cre或翻转酶(FLP)与另一个盒式磁带基因交换。具体而言，构建具有包含耐药基因的空盒式磁带基因的磁带盒结构的多能干细胞，使得耐药基因在多能干细胞的表达控制机制下表达。在内源TCR基因座的表达控制下表达外源TCR基因的多能干细胞可以通过用含有编码所需TCR的基因的盒式磁带基因替换空的盒式磁带基因来产生。获得的多能干细胞可根据需要进行增殖，诱导分化为成熟T细胞，用于细胞免疫疗法。

这样的方法使得有效地制备稳定表达所需TCR基因或CAR基因的用于细胞疗法的细胞成为可能。虽然将TCR引入成熟T细胞或T祖细胞的程序得到广泛实施，但将多能干细胞分化为成熟T细胞的程序并不流行，也不是该程序广泛应用于临床领域的情况。如果治疗的靶标是在许多癌症中普遍表达的抗原，例如WT1抗原，则大规模制备具有一种类型的靶向该抗原的TCR基因的成熟T细胞可能对细胞免疫疗法有用。然而，为了再生TIL，需要分离TIL的TCR，将TCR引入iPS细胞中以产生多个TCR-iPS细胞，然后诱导TCR-iPS细胞分化为成熟的T细胞。这些程序是高度劳动密集型和耗时的。

引用列表

专利文献

PTL1:WO2016/010153

PTL2:WO2016/010154

PTL3:WO2016/010155

PTL4:WO2017/179720

PTL5:WO2014/165707

PTL6:WO2020/022512

非专利文献

NPL1:Themeli et al.,Nat Biotechnol.(2013)928-33

NPL2:Gong Ying et al.,Journal of Cell Biology(2015)1481-1489

发明内容

技术问题

本发明的一个目的是提供一种用于容易地制备具有所需特异性决定位点的效应细胞的方法。本发明的另一个目的是提供在基因组中具有所谓的磁带盒结构的效应细胞，该磁带盒结构允许容易地交换特异性决定位点。本发明的另一个目的是提供一种同时产生具有不同特异性决定位点的相同类型的效应细胞的方法。

问题的解决方案

提供的是产生表达所需蛋白质的效应细胞的方法，包括以下步骤：

(1)提供材料细胞，该材料细胞在其基因组中具有带盒式磁带基因的磁带盒结构，该盒式磁带基因含有编码标记蛋白的基因，其中材料细胞可分化为效应细胞，并且其中当材料细胞分化为效应细胞或其祖细胞时，标记蛋白可在效应细胞或其祖细胞中表达；

(2)增殖材料细胞，

(3)将材料细胞分化为效应细胞或其祖细胞；和

(4)将效应细胞或其祖细胞中编码标记蛋白的基因替换为编码所需蛋白质的基因。

为了进行步骤(4)，可以采用RMCE或基因组编辑。在一个实施方案中，可以采用RMCE。在该实施方案中，一对重组酶靶序列位于步骤(1)中编码标记蛋白的基因的上游和下游。步骤(3)中获得的效应细胞或其祖细胞将包括编码标记蛋白的基因，该基因夹在该对重组酶靶序列之间。如此获得的效应细胞或其祖细胞和包含相同的一对重组酶靶序列和重组酶靶序列之间编码所需蛋白质的基因的盒式磁带交换载体在重组酶存在下一起培养，使得编码标记蛋白的基因与编码所需蛋白质的基因交换。

在另一个实施方案中，可以通过基因组编辑的方式破坏编码标记蛋白的基因，然后引入编码所需蛋白质的基因，使得所需蛋白质在材料细胞中表达。

在另一个实施方案中，产生效应细胞的方法包括以下步骤：

(i)提供效应细胞或其祖细胞，该效应细胞或其祖细胞在其基因组中包含具有盒式磁带基因的磁带盒结构，所述盒式磁带基因包含编码标记蛋白的基因，使得标记蛋白可以在细胞中表达并且所述细胞不包含任何外源性耐药基因，和

(ii)将编码标记蛋白的基因与编码所需蛋白质的基因交换。

在进一步的实施方案中，本申请还提供了一种制备具有带盒式磁带基因的磁带盒结构的材料细胞的方法，包括以下步骤：

(a)制备用于引入磁带盒结构的载体，该载体按从上游到下游的顺序包含第一启动子序列、第一重组酶的靶序列、被连接以在第一启动子序列下表达的编码标记蛋白的基因、第一重组酶的靶序列、第二重组酶的靶序列和可以在材料细胞中表达的第二启动子序列，以及被连接以在第二启动子下表达的耐药基因，

(b)将步骤(a)制备的载体敲入材料细胞，使引入的载体在材料细胞的表达调控系统下表达，

(c)将(b)中获得的细胞在耐药基因耐受的药物存在下进行培养，从而选择其中载体已经成功敲入的细胞，所述载体用于引入具有编码标记蛋白的基因的磁带盒结构，

(d)在第二重组酶存在下培养(c)中选择的细胞以去除第二耐药基因。在本实施方案中，本申请提供的具有带盒式磁带基因的磁带盒结构的材料细胞可以优选用于通过RMCE进行的盒式磁带交换。

在本申请中，“材料细胞”是指分化为效应细胞之前的细胞。术语“材料细胞”包括用于引入编码标记蛋白的基因的细胞，以及具有带盒式磁带基因的磁带盒结构的细胞，该盒式磁带基因包含编码标记蛋白的基因。作为材料细胞，可以优选使用多能干细胞，更优选使用ES细胞和iPS细胞。

“效应细胞”的实例可以包括成熟T细胞及其祖细胞。标记蛋白和所需蛋白质的实例可以包括T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)。备选地，标记蛋白可以是荧光蛋白。

在本发明的方法中，优选地制备在每个细胞的细胞的表达控制系统下仅具有一个具有编码标记蛋白的盒式磁带基因的磁带盒结构的材料细胞。

通过使用所述材料细胞，可以提供效应细胞或其祖细胞的克隆群体，其每个细胞仅具有一个具有盒式磁带基因的磁带盒结构，该盒式磁带基因包含编码标记蛋白的基因。通过将效应细胞或祖细胞克隆群体中的盒式磁带基因与多个盒式磁带基因交换，可以同时制备表达不同蛋白质的效应细胞。

本申请还提供了一种用于免疫疗法的组合物，其包含表达不同蛋白的多种类型的效应细胞，可以通过本方法制备。

附图说明

图1A为本申请提供的“TIL混合物法”的示意图。在此图中，采用了RMCE。当采用基因组编辑时，不需要已知的TCR两端的重组酶靶序列lox2272和loxP。可以应用用于基因组编辑的载体代替重组酶Cre。

图1B为本申请提供的“TIL混合物法”的示意图。

图2为实施例1的程序的示意图。

图3提供了实施例1的中间结果。将磁带盒结构KI载体敲入Jurkat细胞，然后用FLP和更昔洛韦处理细胞以去除耐药基因。

图4提供了图3所示细胞的FACS Aria图。分离了TCR表达细胞。

图5A是用含有NY-ESO1-特异性TCR的盒式磁带交换质粒载体和Cre重组酶表达载体处理图4中所示的TCR表达细胞的程序的示意图，所述TCR表达细胞是Jurkat细胞，其中敲入了包含WT1特异性TCR基因的盒式磁带基因。

图5B是与图5A相同程序的示意图，除了用于敲入NY-ESO1特异性TCR的盒式交换载体是线性DNA载体。

图6提供了通过用含有NY-ESO1的盒式磁带交换质粒或线性DNA载体和Cre重组酶表达载体处理图4中所示的TCR表达细胞获得的细胞的FACS分析，所述TCR表达细胞是Jurkat细胞，其中敲入了包含WT1特异性TCR基因的盒式磁带基因。

图7A提供了实施例2的示意图。显示了将磁带盒KI载体敲入细胞的步骤。

图7B提供了实施例2的示意图。从细胞中去除磁带盒KI载体中的耐药基因的步骤。

图8提供了实施例2的结果。

图9提供了实施例3的结果。

图10表示实施例4中使用的用于切割WT1特异性TCR(WT1 TCR)基因的指导RNA以及用于在切割位点引入基因的所需基因KI靶向载体的5'臂和3'臂的设计构思。

图11提供了实施例4中使用的NY-ESO1特异性TCR(NYESO1-TCR)基因KI载体的示意图。

图12提供了实施例4中使用的CRISPR-Cas9载体的示意图。包括各自可操作地连接到U6启动子的用于TCR基因切割的指导RNA(gRNA#1)和用于KI载体切割的指导RNA(gRNA#5)，以及可操作地连接到CBh启动子的编码Cas9的基因。

图13为实施例4的敲入过程的示意图。

图14A提供了实施例4的结果，其中使用了gRNA#1。

上图：分析具有小鼠Cβ的TCRβ的表达和NYESO1(NYESO1四聚体：NYESO1)的表达。上面的数字表示右上部分中细胞(mTCRβ+NYESO1+)与细胞总数的百分比。

中图：具有小鼠Cβ的TCRβ的表达和人TCR的表达的分析。

下图：小鼠TCRβ阳性和NYESO1四聚体阳性细胞中小鼠TCRβ的表达和人TCRαβ的表达的分析。小鼠TCRβ阳性、NYESO1四聚体阳性和人TCRαβ阴性细胞数显示在底部线中。

图14B提供了实施例4的结果，其中使用了gRNA#4。

中图：具有小鼠Cβ的TCRβ的表达和人TCR的表达的分析。

详细说明

在本说明书和权利要求书中，“效应细胞”代表一类在施用时执行特定活性的细胞。效应细胞的实例可包括各种成熟T细胞如辅助性T细胞、调节性T细胞和细胞毒性T细胞，以及免疫细胞如自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、巨噬细胞和树突细胞。此外，效应细胞还包括血小板、激素产生细胞、包括间充质干细胞的免疫抑制细胞。进一步地，以悬浮液施用的细胞如神经细胞也可以是效应细胞。效应细胞的实例还可以包括形成二维组织如视网膜、视网膜色素上皮、皮肤和肠上皮的细胞。此外，效应细胞的实例可包括形成三维器官如心脏、肝脏和肾脏的细胞。

本申请的方法可优选用于产生免疫细胞，如成熟T细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、巨噬细胞或树突细胞作为效应细胞。特别地，具有特异性决定位点，例如特异性T细胞受体(TCR)或特异性嵌合抗原受体(CAR)的成熟T细胞或其祖细胞，以及CAR-T细胞可优选通过该方法产生。

在本申请中，待引入效应细胞的编码所需蛋白质的基因不限于特定的TCR基因，该基因可以是任何已知的重排的TCR基因，以及从对免疫疗法靶向的抗原特异的T细胞获得的并通过已知程序扩增的TCR基因。可以举例说明对癌抗原特异的TCR。对于TIL疗法，可以从患者的癌组织中采集TIL，通过TIL的单细胞分析获得高频杀伤性T细胞克隆的TCR并加以利用。

术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指重组多肽构建体，其包含至少细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、细胞质信号传导结构域(其包括当与抗原结合时足以刺激T细胞的CD3ζ链的细胞质序列)，以及任选地一种或多种(例如，2、3或4种)细胞质共刺激蛋白，当抗原结合结构域与抗原结合时，该细胞质共刺激蛋白共同刺激T细胞。共刺激蛋白的实例可以包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40L、CD40、PD-1、PD-L1、ICOS、LFA-1、CD2、CD7、CD160、LIGHT、BTLA、TIM3、CD244、CD80、LAG3、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。

表述“祖细胞”是指处于分化途中并且能够分化成特化类型细胞的细胞。表述“能够分化成效应细胞的材料细胞”是指能够在体外分化成效应细胞或其祖细胞的细胞。材料细胞优选为具有分化成效应细胞并在体外增殖的能力的细胞。

能够分化成效应细胞的细胞的实例可以包括多能干细胞和组织特异性干细胞。

组织特异性干细胞或成体干细胞的实例可包括神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞和牙髓干细胞。

如本文和权利要求中所用，多能干细胞是多能的，能够分化成活生物体中存在的多种类型的细胞，并且能够自我更新的干细胞。多能干细胞包括，例如，胚胎干(ES)细胞、源自通过核移植获得的克隆胚胎的胚胎干(ntES)细胞、精子干细胞(“GS细胞”)、胚胎geRMCElls(“EG细胞”)、诱导的多能干细胞(iPS)，以及源自培养的成纤维细胞和骨髓干细胞的多能细胞(“Muse细胞”)。多能干细胞优选来源于哺乳动物，并且优选来源于人。优选使用ES细胞和iPS细胞作为材料细胞。

ES细胞和iPS细胞可以通过已知方法产生或者可以采用市场上可获得的细胞。可以使用从待治疗患者的体细胞诱导的iPS细胞。此外，还提出了利用基因组编辑技术对ES细胞或iPS细胞的HLA进行操作，生成通用多能干细胞的方法，本申请的材料细胞可由此获得通用多能干细胞。

如上所述，本申请的方法特别适用于获得具有所需TCR或CAR的成熟T细胞作为效应细胞。作为表达所需蛋白质的效应细胞，以下将作为实例描述通过RMCE获得表达所需TCR的成熟T细胞的方法。

首先，提供了材料细胞，所述材料细胞在多能干细胞的基因组中具有磁带盒结构，所述磁带盒结构具有盒式磁带基因，所述盒式磁带基因包含一组重组酶靶序列和靶序列之间编码标记蛋白的序列，使得当细胞分化为成熟T细胞或其祖细胞时标记基因被表达。

标记蛋白的实例可以包括在效应细胞或其祖细胞的表面上表达的已知配体或受体。一种可获得的对已知的TCR或CAR特异的四聚体，优选用作标记蛋白以产生表达所需TCR的成熟T细胞。备选地，已知的荧光蛋白也被例示为标记蛋白。用于基因工程的大量荧光蛋白是已知的，并且其中有多种是可商购的。荧光蛋白可以从这些已知的蛋白中适当地选择。

如本文和权利要求书中所用，“重组酶”是诱导位点特异性重组的酶，重组酶靶序列是重组酶识别并能够诱导两个靶序列之间的序列的缺失、掺入或倒位的序列。重组酶与其靶序列的组合的例子包括Cre重组酶和loxP及其衍生物、翻转酶(FLP)重组酶和frt，以及克隆酶(clonase)和attB/attP/attL/attR。包括在本申请的盒式磁带基因中的重组酶及其靶序列的组合可以是可以用来用编码在相同方向上被相同靶序列夹在中间的所需蛋白质的基因来替换被靶序列夹在中间的标记基因的任何组合。

例如，当采用Cre重组酶时，靶序列可以选自loxP、lox2272、lox511和loxFas。在Cre重组酶的存在下，促进那些具有相同靶序列的靶序列的同源重组且保持方向。因此，例如材料细胞基因组中夹在lox2272和loxP间的序列可以与载体中夹在lox2272和loxP间的另一个序列交换。

本申请方法中使用的材料细胞以下述方式在其基因组中具有包含编码标记蛋白的基因的盒式磁带基因，使得当材料细胞分化为效应细胞或祖细胞时，可以表达标记蛋白。为了获得表达所需TCR或CAR的成熟T细胞，可以将盒式磁带基因引入材料细胞中，使得编码所述TCR的基因在材料细胞的TCR表达系统下或与编码包括启动子和/或增强子的TCR表达控制系统的基因一起被表达。

在下文的描述中，从上游到下游依次包含启动子、编码标记蛋白的基因和增强子的结构被称为“磁带盒结构”，并且包含编码标记蛋白的基因的基因被称为“盒式磁带基因”。首先，在下文描述了步骤(1)：制备具有磁带盒结构的材料细胞的程序，所述磁带盒结构包含盒式磁带基因。

当材料细胞具有重排的TCR基因时，例如材料细胞是由T细胞诱导的iPS细胞，可以在材料细胞的TCR表达控制系统下引入具有标记蛋白的盒式磁带基因。包含盒式磁带基因的磁带盒结构可以构建在材料细胞的重排的TCR基因座的启动子和增强子之间。

当材料细胞不具有重排的TCR基因座时，可以采用专利文献6(WO2020/022512)中解释的以下三种类型的程序。

(A)引入盒式磁带基因，以缩短材料细胞中TCR基因座中C区增强子和V区启动子之间的距离。

(B)在材料细胞中在TCR基因座的C区增强子的上游引入序列，其中该序列从上游到下游包括TCR基因座的V区启动子和盒式磁带基因，从而C区增强子和V区启动子彼此足够接近，以使TCR表达控制系统发挥作用来表达夹在它们之间的基因。

(C)在材料细胞中在TCR基因座的V区启动子的下游引入序列，该序列从上游到下游包括盒式磁带基因和C区增强子，使得C区增强子和V区启动子彼此足够接近，以使TCR表达控制系统发挥作用来表达夹在它们之间的基因。

在“V区启动子和C区增强子彼此足够接近以使TCR表达控制系统发挥作用来表达夹在它们之间的基因”的上下文中，启动子和增强子之间的距离没有特别限制，只要V区启动子受C区增强子控制。举例说明，引入外源盒式磁带基因后V区启动子和C区增强子之间的距离例如为约8至50kbp、约10至40kbp、约12至32kbp或约14至22kbp。

“TCR基因座中的C区增强子”和“TCR基因座中的V区启动子”各自可以是源自材料细胞、源自材料细胞来源的相同物种动物的其他个体的细胞，或源自材料细胞来源的其他动物物种的细胞。

在材料细胞中引入磁带盒结构可以通过一步或多步程序进行。它可以通过常规已知的重组技术进行，例如同源重组、基因组编辑，以及使用重组酶，例如Cre重组酶和翻转酶重组酶的组合的技术。

当重排的TCR用作盒式磁带基因中的标记蛋白时，TCR优选是TCRα和β的异二聚体。为了表达重排的TCRα和β的异二聚体，编码标记蛋白的基因优选具有重排的TCRα基因和TCRβ基因通过自切割p2A肽连接的序列。通过将自切割p2A肽置于α和β链之间，可以在单个基因表达系统的控制下表达两个基因。

可以使用p2A、T2A、E2A和F2A等2A肽，据称具有良好切割效率的p2A肽是合适的。可将TCRα基因或TCRβ基因中的任一个引入上游，并且多聚腺苷酸序列适当地连接至引入下游的TCR基因。

内含子优选包含在TCR基因的上游。除了要通过剪接去除的序列之外，内含子还可以包括剪接供体序列和剪接受体序列。举例说明了人类多肽链延长因子α(EF1α)基因的内含子或鸡β-肌动蛋白(CAG)基因启动子的内含子。

编码TCRα和TCRβ的基因优选地敲入材料细胞中，使得当材料细胞分化成效应细胞时这些基因处于一个表达控制系统之下。敲入了具有盒式磁带基因的磁带盒结构的材料细胞基因组中的TCR基因座可以是TCRα或TCRβ基因座。优选缺失不用于基因转移的TCRα和β基因座。特定基因座的缺失可以使用已知的方法适当地进行，并且可以使用已知的基因组编辑技术，例如CRISPR/Cas9和Talen来进行。

专利文献6(WO2020/022512)/中公开了制备用于表达重排的TCRα和TCRβ的异二聚体的载体并将该载体引入材料细胞的程序。

上述(B)的实施方式提供用于RMCE的材料细胞，即在材料细胞中在TCR基因座的C区增强子的上游引入序列，其中该序列从上游到下游包括TCR基因座的V区启动子和盒式磁带基因，使得C区增强子和V区启动子彼此足够接近以使得TCR表达控制系统发挥作用来表达夹在它们之间的基因，如下所解释的。材料细胞可以是具有重排的TCR基因的细胞或具有非重排的TCR基因的细胞。

当采用RMCE时，将重组酶靶序列引入盒式磁带基因中编码标记蛋白的基因的上游和下游侧翼。在本实施方案中，提供了一种用于制备具有磁带盒结构的材料细胞的方法。该方法包括以下步骤：(a)制备磁带盒KI载体，该载体从上游到下游具有包含第一启动子的盒式磁带基因(当材料细胞分化为效应细胞时，第一启动子可以在效应细胞中表达)，第一重组酶的靶序列，被连接以在第一启动子下表达的编码标记蛋白的基因，以及第一重组酶的靶序列；第二重组酶的靶序列，可以在材料细胞中表达的第二启动子，被连接以在第二启动子下表达的耐药基因和第二重组酶的靶序列，

(b)将步骤(a)中制备的磁带盒KI载体敲入材料细胞中，

(c)通过在耐药基因耐受的药物存在下培养细胞，选择磁带盒KI载体成功敲入的细胞；和

(d)使第二重组酶作用于步骤(c)中选择的细胞，以去除第二重组酶靶序列侧翼的耐药基因。

在该实施方案中，第一重组酶是对上述具有磁带盒结构的材料细胞中包含的重组酶靶序列具有特异性的重组酶。第二重组酶与其靶序列的组合没有特别限制。可以使用与第一重组酶不具有交叉反应性的任何重组酶。例如，当Cre/loxp系统用于第一重组酶时，第二重组酶可以是FLP/frt系统。可以选择第二重组酶与其靶序列的组合，使得当在第二重组酶存在下培养细胞时夹在靶序列之间的序列将被交换。

第一启动子是能够在由材料细胞分化出的效应细胞中诱导标记蛋白的表达的启动子。当标记蛋白是已知的TCR时，第一启动子优选是材料细胞的TCR基因座中的启动子。举例说明了TCR基因座中的V区启动子。

在TCR基因座的V区，每个V基因有一个启动子。本实施方案中使用的TCR基因座的V区启动子不受限制，可以适当选择。例如，在使用TCRβ基因座的情况下，例示了Vβ20-1启动子。启动子可以通过PCR利用引物对序列扩增获得，引物被设计用于获得正好V基因第一个外显子翻译起始点之前上游的启动子DNA片段。

可以在材料细胞中表达的启动子没有限制，可以是任何能够诱导与其连接的耐药基因在材料细胞中表达的启动子。实例包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。小鼠磷酸甘油酸激酶(PGK)基因(pPGK)的启动子就是一个例子。

作为耐药基因，可以使用在材料细胞中可以作为标记发挥作用的已知耐药基因。例如，可以使用耐受潮霉素、嘌呤霉素或新霉素的基因。

耐药基因可优选与其下游的药物敏感基因融合。药物敏感基因是这样一种基因，当其表达时，可以响应于外部添加的物质而诱导细胞凋亡。可以从已知的药物敏感基因中选择药物敏感基因，也不特别受限。例如，可以使用单纯疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶基因。更昔洛韦是诱导掺入该基因的细胞的凋亡的物质的一个例子。耐药基因的下游可优选与多聚腺苷酸序列连接。

作为本申请中使用的载体，可以适当使用基因重组中使用的载体，例如病毒、质粒、人工染色体等载体。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和仙台病毒载体。人工染色体载体包括例如人人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC、PAC)。作为质粒载体，可以使用用于哺乳动物细胞的质粒载体。可以根据目的选择和使用市售的载体。

在构建靶向载体时，首先确定材料细胞基因组中TCR基因座中将引入磁带盒结构的位点。引入磁带盒结构的位点可以是当从上游到下游依次包含V区启动子和盒式磁带基因的序列被引入时，材料细胞的C区增强子可以激活V区启动子的任何位点。

例如，当将磁带盒结构引入材料细胞的TCRβ基因座时，可以将基因引入TCRβ基因座尚未被重排的区域。可以将基因引入靠近增强子的位点，例如Dβ2上游和Cβ1下游的位点。当将磁带盒结构引入材料细胞的TCRα基因座时，可以将基因引入TCRα基因座尚未被重排的区域。可以将基因引入靠近增强子的位点，例如最上游Jα基因的上游和最下游Vα基因的下游的位点。

一旦确定了材料细胞基因组的TCR基因座中的引入位点，与引入位点上游和下游序列同源的序列分别被引入作为5'臂和3'臂，以允许同源重组。在这种情况下，如果5'臂和3'臂的序列分别同源到发生同源重组的程度，则“同源序列”就足够了。

例如，在将磁带盒结构引入材料细胞基因组中的非重排TCRβ基因座的情况下，使用从Dβ2基因上游约110bp至更上游约1.6kbp的DNA片段作为5'臂序列，以及从Dβ2基因上游约50bp至下游约1.6kbp的DNA片段用作3'臂序列。使用能够特异性扩增各序列的引物，通过PCR扩增作为模板的材料细胞的基因组DNA，得到各5'和3'臂的DNA片段。

换句话说，举例说明了磁带盒结构敲入靶向载体可以包括，按照从上游到下游的顺序，与材料细胞基因组的TCR基因座中的引入位点的5'侧同源的序列(5'臂)、TCR基因座中的V区启动子、包含第一重组酶的靶序列的盒式磁带基因、第一启动子、编码被连接以在第一启动子下表达的标记蛋白的基因，以及第一重组酶的靶序列；第二重组酶的靶序列、可在材料细胞中表达的第二启动子、在第二启动子下表达的耐药基因、第二重组酶的靶序列和与材料细胞的引入位点的3’侧同源的序列(3'臂)。当通过PCR扩增每个序列时，设计引物使得所得PCR产物包括将其引入耐药载体所需的DNA序列。获得的PCR产物可用于使用已知方法如Gibson组装法或市售试剂盒构建载体。

磁带盒结构KI靶向载体还可以在3'臂的下游包含可以在材料细胞中表达的启动子和标记基因。启动子-标记组合的一个例子是MC1启动子和白喉毒素(DTA)的组合。

步骤(b)

磁带盒结构KI靶向载体通过同源重组被敲入材料细胞的TCR基因座。可以通过已知方法例如通过电穿孔来进行载体的敲入。

为了提高同源重组中的敲入效率，在敲入耐药基因盒敲入靶向载体之前，优选在敲入位点附近引入两个单链断裂(切口)，例如，在3'臂的起始位点(上游)附近。切口的引入可以通过已知的技术进行，例如CRISPR/Cas9n。

步骤(c)

同源重组成功的材料细胞在引入的启动子作用下表达耐药基因。因此，通过在耐药基因耐受的药物存在下培养细胞，可以筛选出同源重组成功的材料细胞。此外，当标记基因最终被引入磁带盒结构KI靶向载体的3'臂下游时，这意味着当材料细胞被引入“5'和3'臂序列的外部”时，标记例如细胞毒素被表达，细胞不能存活，所述“5'和3'臂序列的外部”不含有盒式磁带基因和耐药基因。因此，通过选择活细胞，可以选择其中磁带盒结构KI靶向载体成功敲入的细胞。选择的材料细胞可以通过PCR进一步确认，只选择其中V区启动子和盒式磁带基因被敲入的细胞。

步骤(d)

将第二重组酶应用于已敲入磁带盒结构KI靶向载体的材料细胞。为了应用第二重组酶，例如，可以将第二重组酶表达载体引入细胞中。通过在细胞中表达第二重组酶，去除耐药基因，可以获得基因组中具有磁带盒结构的材料细胞。磁带盒结构具有包含启动子、一对重组酶靶向序列和重组酶靶向序列之间的编码标记蛋白的基因的盒式磁带基因。材料细胞可分化为效应细胞，当材料细胞分化为效应细胞或其祖细胞时，标记蛋白在效应细胞或其祖细胞中表达。

如果引入的耐药基因与药物敏感基因融合，材料细胞可以在步骤(d)后在激活药物敏感基因以诱导细胞凋亡的因子存在下培养，以便去除未能缺失耐药基因的细胞。

上面解释的程序是进行步骤(1)的程序的一个实施例：提供材料细胞，该材料细胞在其基因组中具有带盒式磁带基因的磁带盒结构，该盒式磁带基因含有编码标记蛋白的基因，其中材料细胞可分化为效应细胞，并且其中当材料细胞分化为效应细胞或其祖细胞时，标记蛋白可在效应细胞或其祖细胞中表达。

例如，为了进行上述实施方式(A)，即“引入盒式磁带基因以缩短材料细胞基因组中TCR基因座中C区增强子和V区启动子之间的距离”，可以使用不包含第一启动子序列的磁带盒结构KI靶向载体。为了进行所述的实施方案(C)，即“在材料细胞的TCR基因座中的V区启动子下游位点引入包含盒式磁带基因和C区增强子的序列，从而使C区增强子和V区启动子彼此足够接近以使得TCR表达控制系统发挥作用来表达夹在它们之间的基因”，可以使用磁带盒结构KI靶向载体，该磁带盒结构KI靶向载体不包含第一启动子序列但包含耐药基因下游位点的材料细胞中的TCR基因座的C区增强子和第二重组酶靶序列。

步骤(2)

在该步骤中，前提是材料细胞增殖。可以根据材料细胞的类型采用合适的程序来增殖材料细胞。

步骤(3)

增殖的材料细胞分化为效应细胞。当材料细胞是多能干细胞并且效应细胞是T细胞时，多能干细胞向T细胞的分化可以通过任何已知的程序进行。例如，非专利文献1和2以及专利文献1-5公开了分化程序。通过使用在引用的现有技术参考文献中公开的已知程序，材料细胞可以分化成T成熟细胞而不破坏在材料细胞中构建的磁带盒结构。分化时，材料细胞中的Rag 1和Rag 2基因可能会被缺失，以抑制TCR的重排。对于Rag 1和Rag 2基因，只需要缺失其中一个即可。

T细胞是表达CD3以及CD4和CD8中的至少一种的细胞。基于用效应细胞进行治疗的目的，细胞可以分化成表达CD8的杀伤性T细胞或表达CD4细胞的辅助性T细胞。

所得的T细胞在其基因组中可包含磁带盒结构并表达已知的TCR作为标记蛋白，该结构从上游到下游具有启动子、一对重组酶靶序列、重组酶靶序列之间编码已知TCR的基因和增强子。

具有磁带盒结构的T细胞可以通过使用对TCR特异的抗体或四聚体确认标记蛋白(已知的TCR)的表达来选择。

通过本申请公开的方法，可以制备大量成熟的T细胞，其具有包含编码标记蛋白的基因的相同盒式磁带基因，并表达所述标记蛋白。

步骤(4)

在该步骤中，将获得的效应细胞或其祖细胞中编码标记蛋白的基因替换为编码所需蛋白质的基因。在一个实施方案中，交换可以通过RMCE的方式进行。将获得的效应细胞或其祖细胞与包含一对与上述相同的重组酶靶向序列和编码所需蛋白质的基因的盒式磁带交换载体在重组酶存在下培养，从而编码标记蛋白的基因与编码所需蛋白质的基因交换。

包含一对重组酶靶序列之间的编码已知TCR的基因的盒式磁带基因被替换为包含一对相同重组酶靶序列之间的编码所需重排TCR的基因的盒式磁带基因。

编码待引入T细胞中的重排TCR的基因可通过已知程序从T细胞中扩增和分离TCR基因来获得，该T细胞对作为细胞免疫疗法中的靶标的抗原具有特异性。对于TIL治疗，可以从患者的癌组织中采集TIL，通过对TIL进行单细胞分析，可以得到高频杀伤性T细胞克隆的TCR。

制备用于TCR引入的盒式磁带交换载体。待引入细胞中的TCR优选是TCRα和β的异二聚体，如作为标记蛋白的TCR。为了表达重排的TCRα和β的异二聚体，编码TCR的基因优选具有重排的TCRα基因和TCRβ基因通过自切割2A肽连接的序列。所述载体可优选地从上游到下游包含内含子、TCRα和β基因以及多聚腺苷酸序列，所述TCRα和β基因通过夹在重组酶靶序列间的2A肽连接。

盒式磁带交换载体可以选自上述用于基因重组的载体。例如病毒、质粒和人工染色体等载体。也可以使用线性DNA载体。

在重组酶存在下，将盒式磁带交换载体引入具有磁带盒结构的成熟T细胞，然后，将盒式磁带交换载体中编码TCR的基因和材料细胞中编码作为标记蛋白的TCR的基因进行交换。

盒式磁带交换载体和重组酶表达载体被敲入成熟T细胞中。可以通过已知方法例如通过电穿孔来进行载体的敲入。

通过确认在获得的细胞中用作标记蛋白的已知TCR的表达，可以确认盒式磁带交换。已知的TCR可以通过四聚体或TCR特异性抗体来确认。

通过本申请的方法，可以制备大量相同类型的效应细胞，所述效应细胞中的每个细胞都具有带有相同盒式磁带基因的磁带盒结构。通过交换盒式磁带基因，可以在效应细胞中表达所需的蛋白质。

本申请的方法可以通过使用基因组编辑来进行。当采用基因组编辑时，步骤(1)中提供的具有磁带盒结构的材料细胞可以是其基因组中具有带盒式磁带基因的磁带盒结构的细胞，该盒式磁带基因包含编码标记蛋白的基因，其中所述材料细胞可分化为效应细胞，并且其中当材料细胞分化为效应细胞或其祖细胞时，标记蛋白可在效应细胞或其祖细胞中表达。在本文中，“磁带盒结构”从上游到下游依次包括启动子、编码标记蛋白的基因和增强子，并且“编码标记蛋白的基因”对应于“盒式磁带”。当采用基因组编辑时，不需要通过重组酶靶序列将编码标记蛋白的基因夹在中间。

步骤(2)和(3)与采用RMCE时相同。

通过基因组编辑的方式，将编码所需蛋白质的基因引入步骤(3)得到的效应细胞中，破坏编码标记蛋白的基因和引入编码所需蛋白质的基因，或者将编码标记蛋白的基因与编码所需蛋白质的基因进行交换，使得编码所需蛋白质的基因可以在材料细胞中表达。在一个实施方案中，CRISPR/Cas9系统，一种基因组编辑技术，可用于破坏编码标记蛋白的基因并引入另一种重排的TCR。

i)用于标记蛋白基因切割的指导RNA的设计(见图10)

设计指导RNA使得基因组中影响标记蛋白特异性的位点被切割。例如，当标记蛋白为TCR且编码其的基因包含通过2A连接的TCRα和TCRβ基因时，可以设计指导RNA使得TCR链中任一条的CDR1、CDR2和CDR3之一(其是影响TCR特异性的区域)被切割。TCRβ链可变区中的CDR3被切割的一个实施方案解释如下。

ii)重排的TCR基因KI载体的臂设计(见图10)。

确定CDR3区域的指导RNA识别位点或CRISPR/Cas9切割位点，并将切割位点至上游20bp和下游20bp的序列分别鉴定为5'和3'臂同源序列。

iii)重排的TCR基因KI载体的设计(见图11)

然后，设计了用于引入TCR的KI载体。当敲入重排的TCRα和β的异二聚体时，编码TCR的基因可以优选是编码其中重排的TCRα和TCRβ通过自切割2A肽连接的氨基酸序列的基因。待敲入的序列夹在步骤ii)中鉴定的5'和3'臂同源序列间，两端放置KI载体切割指导RNA识别位点。

编码自切割2A肽的基因位于侧翼是5'和3'臂的敲入序列的上游，终止密码子位于编码所需蛋白质的基因的下游。在一个实施方案中，重排的TCR基因KI载体包含KI载体切割指导RNA识别序列、5'臂序列、编码2A肽的基因、编码TCRβ的基因、编码2A肽的基因、编码TCRα的基因、终止子密码子、3'臂序列和KI载体切割指导RNA识别序列。

iv)CRISPR/Cas9载体的制备

单独或一起制备能够将Cas9与用于切割编码标记蛋白的基因的指导RNA和用于切割重排的TCR基因KI载体的指导RNA一起表达的表达载体。可以通过将两个指导RNA序列插入每个启动子下游的市售CRISPR/Cas9载体中来制备载体，以便指导RNA可操作地连接到启动子。图12显示插入了两个指导RNA的载体的示意图。市售Cas9基因表达载体的例子包括pX330、pCAS-Guide和pGuide-it。

v)将重排的TCR基因KI载体和CRISPR/Cas9载体敲入材料细胞

可以通过已知方法例如电穿孔将载体敲入材料细胞。

通过敲入载体，编码重排的TCR的基因以中断TCR基因中特异性控制区的方式插入，TCR基因是编码标记蛋白的基因(图13)。在图13中，从材料细胞中编码标记蛋白的基因中的起始密码子到KI重排的TCR基因中的终止密码子的序列被翻译。标记TCRβ链的5'侧片段被p2A肽的自切割切掉并失去其特异性。标记TCR的其余部分是KI重排TCR基因末端的终止密码子的3'侧，并且不被翻译。翻译后的重排的TCRα和β链通过插入的p2A肽的自切割产生为两种蛋白质。因此，用作标记蛋白的TCR被所需的重排的TCR替换。

通过本申请的方法，可以制备大量的成熟T细胞或祖细胞，所述细胞具有带盒式磁带基因的磁带盒结构，所述盒式磁带基因包含编码已知重排的TCR的基因，然后可以用具有编码所需TCR的基因的盒式磁带基因来替换材料细胞中的盒式磁带基因。通过提供每个细胞各自具有一个磁带盒结构的成熟T细胞或其祖细胞，多个成熟T细胞或其祖细胞中的盒式磁带基因可以同时与多个TCR盒式磁带基因交换(图1A)。例如，通过破坏不具有标记蛋白的TCR表达系统，可以提供每个细胞仅具有一个磁带盒结构的效应细胞。在TIL疗法中将优选采用其中将仅具有一个磁带盒结构的效应细胞的克隆群中的盒式磁带基因与多个TCR盒式磁带基因交换的方法。

当本申请的方法用于TIL疗法时，示例了一种混合物法，其中一个细胞中仅具有一个磁带盒结构的克隆细胞中的盒式磁带基因与多个TCR盒式磁带基因交换。首先，从患者身上获取TIL，通过单细胞分析鉴定TIL中的多个高频杀伤性T细胞克隆，然后确定杀伤性细胞克隆中的TCR信息。编码如此获得的多个TCR的基因被引入盒式磁带交换载体中(图1B)。另一方面，通过操纵它们的HLA获得的通用多能干细胞可以用作用于产生效应细胞的材料细胞。可以从材料细胞再生具有磁带盒结构的T细胞的克隆群，并且将所需的TCR引入再生的T细胞。在将TCR引入具有磁带盒结构的T细胞的步骤中，可以采用本申请的方法。该策略理论上适用于所有可获得TIL的患者。该实施方案是普遍疗法和个体化疗法的组合，即T细胞是普遍使用的而TCR是个体衍生的。

已经提出了操纵ES细胞或iPS细胞的HLA以提供通用多能干细胞的技术，并且在一个实施方案中，在本申请提供的方法中使用的材料细胞可以是通用多能干细胞。

当采用RMCE时，TIL混合物方法可能具有以下特征：

1)在ES/iPS细胞的TCR基因座的一个位点引入编码重排的TCR的基因，使得引入的TCR基因的表达处于内源增强子的控制之下(图1A)。

2)Lox2272和loxP被放置于基因组中，使得引入的TCR基因的上游和下游分别位于这些序列的侧翼。

3)在该实施方案中可以使用可获取特异性四聚体的已知重排的TCR。四聚体可用于四聚体染色。

4)引入了重排的TCR基因的TCR基因座以外的细胞内的TCR基因座被破坏，从而细胞内仅表达1个TCR基因座。

5)因此制备的ES/iPS细胞分化为T细胞。

6)另一方面，lox2272和loxP被放置于待引入细胞的所需TCR基因的上游和下游，以提供盒式磁带交换载体，

7)将多个盒式磁带交换载体与Cre重组酶一起引入T细胞。

当采用基因组编辑时，TIL混合物方法可能具有以下特征：

1)在ES/iPS细胞的TCR基因座的一个位点引入编码重排的TCR的基因，使得引入的TCR基因的表达处于内源增强子的控制之下。

2)引入了重排的TCR基因的TCR基因座以外的细胞内的TCR基因座被破坏，从而细胞内仅表达1个TCR基因座。

4)因此制备的ES/iPS细胞分化为T细胞。

5)另一方面，制备用于在特定位点引入编码重排的TCR的基因的基因组编辑载体和用于引入所需重排的TCR基因的盒式磁带交换载体。

6)将多个盒式磁带交换载体与用于基因组编辑的载体一起引入T细胞。

通过那些实施方案，有令人难以置信的效果，包括1)包含不同TCR基因的盒式磁带交换载体的混合物可以用于基因转移而没有错配的风险，和2)TCR已经成功交换的T细胞可以作为四聚体阴性细胞群进行分离。结果，可以产生大量表达与TIL中的TCR相似的多个TCR的T细胞。

另一方面，本发明也可用于在再生的T细胞中引入一个或多个编码对癌抗原特异的TCR或CAR的基因。

实施例1

将参照以下实施例更详细地描述本申请。在实施例中，具有特异性基因的盒式磁带基因被称为“特异性基因盒式磁带”。

在本申请的实施例中，制备了在内源TCR表达控制系统下具有WT1特异性TCR基因盒式磁带的磁带盒结构的Jurkat细胞。通过用NY-ESO1特异性TCR基因盒式磁带交换载体处理细胞，将细胞中磁带盒结构中的WT1特异性TCR基因盒式磁带与NY-ESO1特异性TCR基因盒式磁带交换。本实施例的方案如图2所示。

1)通过同源重组将带有TCR基因盒式磁带的磁带盒结构敲入Jurkat细胞中TCRβ基因座上的Dβ2区域。

试剂和抗体：

KOD-Plus-Neo(Toyobo,KOD-401)，

细胞系

试剂盒V(Lonza,VACA-1003)，

嘌呤霉素二盐酸盐(Wako,160-23151)

更昔洛韦(Wako,078-04481)

PE/Cy7抗人TCRα/β单克隆抗体(BioLegend，306719)，

APC抗人CD3单克隆抗体(BioLegend，300439)，

APC/Cyanine7抗人CD3抗体(BioLegend,300426)

APC小鼠IgG2bκ同种型对照抗体(BioLegend，400322)，

HLA-A*24:02修饰的WT1四聚体-CYTWNQMNL-PE(MBL，TS-M014-1)，

HLA-A*02:01NY-ESO-1四聚体-SLLMWITQC-PE(MBL，TB-M011-1)

以下所示的培养基用于所有实施例中的细胞培养。在通过试剂进行选择的情况下，将各试剂添加到培养基中进行培养。

[表1]

细胞培养基	(最终浓度)
		RPMI1640	500mL
FCS	50mL(9％)
		*青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺溶液	5.55mL(1％)
2-巯基乙醇	2μL(50μM)
		总计	555mL

*青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺溶液的组成为10,000U/mL青霉素、10,000μg/mL链霉素和29.2mg/mL L-谷氨酰胺，因此最终浓度分别为100U/mL、100μg/mL和292μg/mL。

通过电穿孔将载体引入细胞。电穿孔按照

细胞系

试剂盒V说明书进行。将细胞和载体悬浮于试剂盒提供的试剂中，将悬浮液转移至试剂盒提供的比色皿中，将比色皿置于Amaxa Nucleofector II(Lonza)，并使用内置程序X001将载体引入细胞。

J.RT3-T3.5 Jurkat细胞，内源性TCRβ基因表达受损的Jurkat细胞系的变体(以下称为Jurkatβ突变体)(Ohashi等人，Science 316,606-609,1985)被用作材料细胞。

如图2A所示的靶向载体用作磁带盒结构敲入靶向载体。该载体包含具有重排的TCR基因的盒式磁带基因，其对应于标记蛋白，侧翼是lox2272和loxP。该载体还具有DCT基因和用于在3'臂同源区下游表达该基因的启动子(图2A中未示出)。

Vβ20-1启动子和TCR基因盒式磁带被引入到Jurkat细胞(一种T细胞系)的TCRβ位点(图2B)上Dβ2基因上游约50bp处，使用磁带盒结构KI靶向载体(KI靶向载体)(图2A)。KI后的材料细胞的示意图如图2C所示。

为了通过同源重组提高敲入效率，通过CRISPR/Cas9n系统在Dβ2基因上游约50bp的位点引入了两个单链断裂(切口)。KI靶向载体与下面所示的两个CRISPR/Cas9n载体一起被引入到Jurkatβ突变体中。

在通过同源重组将磁带盒结构KI靶向载体掺入其基因组DNA的细胞中，与疱疹病毒胸苷激酶(ΔTK)(PurorΔTK)的激酶结构域融合的嘌呤霉素抗性基因将通过EF1α启动子的作用被表达(图2C)。因此，使用0.25μg/mL嘌呤霉素/培养基(正选择)选择将磁带盒结构KI靶向载体中的耐药基因掺入到其基因组中的克隆。另一方面，由于在细胞内产生白喉毒素(DTA)(负选择)，通过随机整合掺入了耐药基因KI靶向载体的5'臂和3'臂外部的细胞无法存活，并被去除。

然后，从如此选择的克隆细胞群中，通过PCR鉴定在TCRDβ2基因座上掺入了从Vβ20-1启动子到frt的部分的细胞，该部分包括TCR基因和耐药基因。因此，通过PCR选择仅在Dβ2区域的一个等位基因中引入了TCR基因盒式磁带载体并且该载体未掺入其基因组DNA中的其他区域的克隆。

材料

[表2]

使用以下寡核苷酸制备CRISPR/Cas9n载体：

A:5’-CACCGAGGTTAGTCTGACTGTGTG-3’(SEQ ID NO:1)

B:5’-AAACCACACAGTCAGACTAACCTC-3’(SEQ ID NO:2)

C:5’-CACCCTGCCGCTGCCCAGTGGTTG-3’(SEQ ID NO:3)

D:5’-AAACCAACCACTGGGCAGCGGCAG-3’(SEQ ID NO:4)

寡核苷酸A和B(载体1)和寡核苷酸C和D(载体2)分别退火，然后引入用限制酶Bbs1切割的质粒pX460。

使用如下所示的引物通过PCR扩增5'臂和3'臂区域，以确认TCR基因掺入到了细胞的TCRDβ2基因座。

实施例中使用的引物如下：

对于5'臂区域

引物1,5’-ACGGCTGAAATCTCCCTAACCC-3’(SEQ ID NO:5)

引物2,5’-ATACGAAGTTATAGCTAGTCTTCCGTGATGGCCTCACACCA-3’(SEQ ID NO:6)

使用KOD-FX(Toyobo，KFX-101)在94℃，2分钟→[98℃，10秒→68℃，4分钟]35个循环进行PCR。

对于3'臂区域

引物3,5’-GTCCAGACCCACGTCACC-3’(SEQ ID NO:7)

引物4,5’-GGGGACCGAGGGGCTGGAAG-3’(SEQ ID NO:8)

使用KOD-FX(Toyobo，KFX-101)在94℃下，2分钟→[98℃，10秒→68℃，2分钟30秒]35个循环进行PCR。

为了证实TCR基因仅掺入到了TCRDβ2区域的一个等位基因中，使用以下引物进行PCR：

引物5,5’-CCTCCTGTCATAAGGTGCCAT-3’(SEQ ID NO:9)

引物6,5’-CCACTTTGCTGTCTTGGCCTT-3’(SEQ ID NO:10)

使用KOD-FX(Toyobo，KFX-101)在94℃下，2分钟→[98℃，10秒→60℃，30秒→68℃，8分钟]35个循环进行PCR。

为了确认载体是否通过随机整合掺入基因组DNA，使用以下引物通过PCR扩增白喉毒素(DTA)基因：

白喉毒素(DTA)基因

引物7,5’-AGCCAAAATCTGGTACACAAGG-3’(SEQ ID NO:11)

引物8,5’-CTGAGCACTACACGCGAAGCA-3’(SEQ ID NO:12)

使用KOD-FX(Toyobo，KFX-101)在94℃下，2分钟→[98℃，10秒→58℃，30秒→68℃，25秒]35个循环进行PCR。

不含白喉毒素的细胞在以下程序中用作“磁带盒结构KI靶向载体KI-Jurkat细胞”。

2)将FLP载体引入磁带盒结构KI靶向载体KI-Jurkat细胞(产生外源TCR表达Jurkat细胞)

材料

[表3]

通过电穿孔将翻转酶表达载体(pCAGGS-FLPe)引入磁带盒结构KI靶向载体KI-Jurkat细胞中。FLP识别frt序列并缺失它们侧翼的区域。图2C和2D显示了敲入后TCRβ基因座上的Dβ2区域(图2C)和缺失frt序列侧翼的部分的TCRβ基因座(图2D)。

通过电穿孔的瞬时FLP表达，其中frt侧翼的区域被缺失的细胞与没有缺失的细胞共存。因此，更昔洛韦用于消除未能缺失frt侧翼的区域的细胞，即FLP重组失败的细胞。更昔洛韦通常对人体细胞，例如Jurkat细胞没有影响。相反，在存在PurorΔTK的细胞中，更昔洛韦在被ΔTK磷酸化时变成核酸类似物，导致DNA复制受到抑制，最终导致细胞生长停滞或细胞死亡。

将细胞与12μM更昔洛韦/培养基一起培养9天，然后通过FACS分析细胞膜上TCR和CD3的表达。结果如图3所示。更昔洛韦选择增加了TCR表达细胞。然而，包括许多不表达TCR的细胞。然后使用FACA Aria(BD)分离表达TCR的细胞并在下面使用(图4)。

培养分离的细胞，通过PCR确认frt序列侧翼的区域的缺失，并通过FACS重新分析。经证实，分离的细胞缺少frt序列侧翼的区域并保持TCR表达(图4)。获得的细胞作为“TCR表达磁带盒KI-Jurkat细胞”用于以下实验。

3)使用质粒DNA在TCR表达磁带盒KI-Jurkat细胞中进行TCR盒式磁带交换

材料

[表4]

程序如图2D和2E所示。图5A中再次总结了这些程序。上图显示了TCR磁带盒KI-Jurkat细胞的TCRβ基因座中的Dβ2区域。中图显示了TCR盒式磁带交换质粒载体。下图显示了盒式磁带交换后TCRβ基因座的示意图。在TCRβ基因座上的Dβ2区的Vβ20-1启动子下游，有一段含有内含子-TCRβ-p2A-TCRα-poly A的序列，侧翼分别是Lox2272和Loxp。

含有侧翼为Lox2272和Loxp的内含子-TCRβ-p2A-TCRα-poly A序列的质粒载体被用作TCR盒式磁带交换载体。使用对NY-ESO1抗原特异的TCRα和TCRβ。

为了交换盒式磁带，通过电穿孔将TCR盒式磁带交换载体和Cre重组酶表达载体(pCAG-nls-Cre)引入TCR磁带盒I-Jurkat细胞中。电穿孔后将细胞培养7天。为了确认lox2272和loxP侧翼的区域通过该盒式磁带交换程序进行了交换，通过FACS确认了NY-ESO1四聚体阳性细胞的存在。结果如图6所示。在未进行盒式磁带交换程序的细胞中，没有确认到NY-ESO1四聚体阳性细胞。在引入了TCR盒式磁带交换载体和Cre表达载体的细胞中，确认了NY-ESO1四聚体阳性细胞的存在。

4)通过使用线性DNA载体在表达TCR的磁带盒KI-Jurkat细胞中的TCR盒式磁带交换程序。

为了提高盒式磁带交换程序的效率，在盒式磁带交换程序中使用了尺寸小于质粒DNA载体的线性DNA载体。该过程的示意图如图5B所示。通过PCR扩增上述TCR盒式磁带交换载体的lox2272和loxP侧翼的区域来制备线性DNA载体。请参阅下面显示的材料。通过电穿孔将用于TCR盒式磁带交换的线性DNA载体和Cre重组酶表达载体(pCAG-nls-Cre)引入TCR磁带盒KI-Jurkat细胞中。电穿孔后将细胞培养十四天。在该实施例中，敲入了NY-ESO1特异性TCR。为了确认lox2272和loxP侧翼的区域已通过此盒式磁带交换程序进行了交换，FACS确认了NY-ESO1四聚体阳性细胞的存在。结果如图6所示。在引入了线性DNA TCR盒式磁带交换载体和Cre表达载体的细胞中确认了NY-ESO1四聚体阳性细胞，并且确认了NY-ESO1四聚体阳性细胞的存在。结果与使用质粒载体时获得的结果相似。

材料

用于TCR盒式磁带交换的线性DNA

引物9,5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO:13)

引物10,5’-CAGGAAACAGCTATGACCATG-3’(SEQ ID NO:14)

使用KOD-FX(Toyobo，KFX-101)在94℃，2分钟→[98℃，10秒→59.1℃，30秒→68℃，4分钟]35个循环进行PCR。

材料

[表5]

实施例2

1)将带有侧翼为lox位点(盒式磁带基因)的WT-1特异性TCR基因的磁带盒结构敲入人iPS细胞中TCRβ基因座的Dβ2区域

材料

[表6]

使用了以下iPS克隆

HKM1：京都大学前沿医学研究所川本实验室从人单核细胞建立的人iPS细胞系

I14s04：京都大学iPS细胞研究与应用中心从人单核细胞建立的人iPS细胞系。

2)通过使用CRISPR/Cas9进行基因组编辑敲入TCR

以与实施例1相同的方式制备磁带盒结构KI靶向载体。该载体的结构如图7A所示。这里使用的TCR基因是从WT1特异性TCR制备的KM#3-3。将表6所示的1:CRISPR/CAS9n和引导RNA表达载体与2:TCR磁带盒结构KI靶向载体混合得到的质粒通过电穿孔法转染iPS细胞。电穿孔两天后，收集细胞并以5×10⁴个细胞/孔重新接种在6孔板上。一天后，将板以如下所示的终浓度进行嘌呤霉素选择。

电穿孔用1×10⁶个iPS细胞和每次总共10μg的质粒DNA进行。该程序是根据以下标准使用NEPA21进行的：

第0天：电穿孔

第1天：培养基交换

第2天：以5×10⁴个细胞/孔的速度重新接种细胞

第3天：嘌呤霉素180ng/ml

第4天：嘌呤霉素150ng/ml

第5-9天：正常培养

第10天：采集iPSC菌落

通过PCR分析如此转染的iPS细胞的基因组DNA，并确认和选择实现所需敲入的克隆。

3)药物选择结构的缺失

胸苷激酶在图7A所示的磁带盒结构KI靶向载体的下游表达，并且更昔洛韦(GCV)由于该酶而在细胞中具有毒性。因此，细胞在与GCV共培养时死亡。使用这种机制，通过电穿孔瞬时引入3：FLP表达载体，转染后，添加如下所示最终浓度的GCV以选择细胞。示意图如图7B所示。

第0天：电穿孔

第2天：以2-4×10³个细胞/孔的速度重新接种细胞

第3-6天：GCV 5μg/ml

第7-12天：正常培养

第12天：采集iPSC菌落

通过PCR分析如此转染的iPS细胞克隆的基因组DNA并确认PurorΔTK区域是否缺失。

CD8单阳性T细胞或细胞毒性T细胞(CTL)从具有带lox2272-TCR-loxP基序的磁带盒结构的iPS细胞中分化出来，其中TCR是WT1特异性TCR。

通过专利文献4(WO2017/179720)中描述的方法进行iPS细胞向CTL的分化。即，iPS细胞分化为CD4CD8双阳性细胞的T细胞祖细胞，然后分离CD4CD8双阳性细胞。分离的CD4CD8双阳性细胞进一步分化为CD8单阳性细胞。结果如图8所示。获得了具有包含CD8α和CD8β链的杂合型CD8抗原的WT1特异性CD8单阳性细胞。

实施例3

具有磁带盒结构的CD8单阳性T细胞与实施例2中获得的WT1特异性TCR盒式磁带进行盒式磁带交换

1)使用质粒DNA在CD8SP T细胞中进行TCR盒式磁带交换

[表7]

根据图5A所示的程序交换盒式磁带基因。盒式磁带交换载体是一种环状质粒载体，其包含内含子-TCRβ-p2A-TCRα-poly A序列，侧翼是lox2272和LoxP。TCRα和TCRβ对抗原NY-ESO1具有特异性。可以表达侧翼为lox2272和Lox的GFP基因的载体用作MOCK载体。

为了在CD8 SP细胞的磁带盒结构中交换WT1特异性TCR盒式磁带基因，通过电穿孔将TCR盒式磁带交换载体或MOCK载体连同Cre表达载体(cCAG-nls-Cre)引入了CD8 SP细胞中，该CD8 SP细胞具有带WT1特异性TCR盒式磁带的磁带盒结构。电穿孔后将细胞培养13天。为了确认TCR是否被交换，通过FACS确认NY-ESO1四聚体阳性细胞的存在。WT1特异性TCR盒式磁带与NY-ESO1特异性TCR盒式磁带交换的细胞被检测为NY-ESO1阳性细胞。结果如图9所示。作为阴性对照，使用10μg的可以表达侧翼为Lox2272和Lox的GFP基因的MOCK载体。

当使用MOCK载体时，NY-ESO1四聚体阳性细胞根本没有产生。发明人以不同的条件进行了两次盒式磁带交换步骤。生成了NY-ESO1四聚体阳性细胞，并确认盒式磁带基因在每种条件下均已成功交换。

实施例4

标记蛋白TCR通过基因组编辑与不同的TCR交换。

使用在实施例1中通过在细胞的TCRβ基因座上的Dβ2区域中敲入重排的WT1特异性TCR基因而产生的TCR磁带盒KI-Jurkat细胞。细胞的TCRβ基因座具有图5A“WT1-TCR KI人TCR基因座”所示的结构。在这个实施例4中，这些细胞被表示为“Jurkat WT1-TCR细胞”。在此实施例中，Jurkat WT1-TCR细胞中的WT1-TCR通过使用基因组编辑与NYESO1-TCR交换。

制备了靶向编码TCRβ链上的CDR3区的序列的两种类型的指导RNA(gRNA#1和gRNA#4)。确定5'臂和3'臂分别包括从每个指导RNA的切割位点到上游20bp和下游20bp的序列。两个指导RNA与5'和3'臂的同源序列设计的示意图如图10所示。在图中，分隔序列的垂直线对应翻译成蛋白质的阅读框。还使用了另一种用于切割NYESO-1-TCR KI载体的指导RNA(gRNA#5)。gRNA#5识别了以下序列中带下划线的部分：

5’-GCATCGTACGCGTACGTGTTTGG-3’(SEQ ID NO:15)

之前已经被报道过的DNA序列用于gRNA#5载体的gRNA区域的序列(NatureProtocol 11,118-133,2016)。

包含由编码p2A肽的基因连接的嵌合TCRβ链和嵌合TCRα链的嵌合基因用作NYESO1-TCR基因，以与WT1-TCR基因交换(图11)。嵌合TCRβ链包含识别NYESO1抗原的已知人TCR的可变区(Vβ)和连接到Vβ的小鼠TCR恒定区(mCβ)，以与嵌合TCRβ链相同的方式制备嵌合TCRα链。

NYESO1-TCR基因KI载体的示意图如图11所示。NYESO1-TCR KI载体是一种质粒DNA载体，其从上游到下游依次包含gRNA#5识别序列、5'臂序列，p2A序列，其中TCRβ链TCRα链通过p2A序列连接的NYESO1-TCR基因、3'臂序列和gRNA#5识别序列。终止密码子包含在NYESO1-TCR基因的3'端。

用于CRISPR/Cas9表达载体的指导RNA的制备。

CRISPR/Cas9载体使用可共表达指导RNA和Cas9的pX330制备。制备包含gRNA#1、gRNA#4或gRNA#5，或gRNA#1和gRNA#5的组合，或gRNA#4和gRNA#5的组合的CRISPR/Cas9载体。作为一个示例，用于表达gRNA#1、gRNA#5和Cas9的载体的示意图如图12所示。

在Jurkat WT-TCR细胞中引入NYESO1-TCR KI载体和CRISPR/Cas9载体。

通过电穿孔将载体引入细胞。根据

细胞系

试剂盒V的手册进行电穿孔。在试剂盒提供的100μL试剂中悬浮2×10⁶个细胞和载体。将悬液转移至试剂盒提供的比色皿中，将比色皿置于Amaxa Nucleofector II(Lonza)中，通过内置程序X001将载体引入细胞。

电穿孔的条件

条件1：gRNA#1用于切割WT1-TCR基因

[表8]

1-1

DNA1	NYESO1-TCR KI载体#1	1μg
			DNA2	CRISPR/Cas9(gRNA#1&5)载体	1μg

1-2

DNA1	NYESO1-TCR KI载体_#1	2μg
			DNA2	CRISPR/Cas9(gRNA#1&5)载体	2μg

1-3

DNA1	NYESO1-TCR KI载体_#1	1μg
			DNA2	CRISPR/Cas9(gRNA#1)载体	0.5μg
DNA3	CRISPR/Cas9(gRNA#5)载体	0.5μg

1-4

DNA1	NYESO1-TCR KI载体_#1	2μg
			DNA2	CRISPR/Cas9(gRNA#1)载体	1μg
DNA3	CRISPR/Cas9(gRNA#5)载体	1μg

条件2：gRNA#4用于切割WT1-TCR基因

[表9]

2-1

DNA1	NYESO1-TCR KI载体_#4	1μg
			DNA2	CRISPR/Cas9(gRNA#4&5)载体	1μg

2-2

DNA1	NYESO1-TCR KI载体_#4	2μg
			DNA2	CRISPR/Cas9(gRNA#4&5)载体	2μg

2-3

DNA1	NYESO1-TCR KI载体_#4	1μg
			DNA2	CRISPR/Cas9(gRNA#4)载体	0.5μg
DNA3	CRISPR/Cas9(gRNA#5)载体	0.5μg

2-4

DNA1	NYESO1-TCR KI载体_#4	2μg
			DNA2	CRISPR/Cas9(gRNA#4)载体	1μg
DNA3	CRISPR/Cas9(gRNA#5)载体	1μg

基因引入后第6天，通过条件1-1至2-4获得的8种细胞以及未进行电穿孔的JurkatWT1-TCR细胞中的TCR表达通过流式细胞仪进行分析。下面显示的两种抗体和一种四聚体用于分析。

抗体

人TCRαβ抗体-PECy7(BioLegend,306720)

小鼠TCRβ抗体-APC(BioLegend,109212)

四聚体

NYESO1-四聚体-PE(MBL,TB-M011-1)

人TCRαβ抗体识别具有人C区的TCR，但不识别具有小鼠C区的TCR。另一方面，小鼠TCRβ抗体可识别具有小鼠C区的TCR，但不能识别具有人C区的TCR。NYESO1四聚体仅识别NYESO1-TCR。在这个实施例中，人TCRαβ抗体被认为识别WT1-TCR(KM#3-3)，小鼠TCRβ抗体以及NYESO1-四聚体被认为识别NYESO1-TCR。结果示于图14A和14B中。

未引入基因的Jurkat WT1-TCR细胞被证实表达被人TCRαβ抗体识别的TCR(KM#3-3)，但没有被小鼠TCRβ抗体或NYESO1-四聚体识别的TCR的细胞被确认(图14A和B，在图中表示为Jurkat WT1-TCR)。在通过敲入NYESO1-TCR KI载体和用于在WT1-TCR的CD3区域敲入NYESO1-TCR的gRNA/Cas9载体获得的细胞中，表达NYESO1-TCR的细胞群，虽然百分比很低。此外，几乎所有表达NYESO1-TCR的细胞都不表达WT1-TCR(图4A，条件1-1、1-2、1-3和1-4的下图，图14B，条件2-1、2-2和2-4的下图)。根据结果，可以得出结论，在Jurkat WT1-TCR细胞中表达的TCR由WT1-TCR与NYESO1-TCR交换。这个实施例证实了T细胞中表达的TCR可以通过基因组编辑与另一个TCR交换。

序列表

<110> 国立大学法人京都大学

国立大学法人滋贺医科大学

<120> 制备具有所需特异性的效应细胞的方法

<130> 676442

<150> JP 2020-160252

<151> 2020-09-24

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 1

caccgaggtt agtctgactg tgtg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 2

aaaccacaca gtcagactaa cctc 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 3

caccctgccg ctgcccagtg gttg 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 4

aaaccaacca ctgggcagcg gcag 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 5

acggctgaaa tctccctaac cc 22

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 6

atacgaagtt atagctagtc ttccgtgatg gcctcacacc a 41

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 7

gtccagaccc acgtcacc 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 8

ggggaccgag gggctggaag 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 9

cctcctgtca taaggtgcca t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 10

ccactttgct gtcttggcct t 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 11

agccaaaatc tggtacacaa gg 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 12

ctgagcacta cacgcgaagc a 21

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 13

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 14

caggaaacag ctatgaccat g 21

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 15

gcatcgtacg cgtacgtgtt tgg 23

<210> 16

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 16

cagcttctac atctgcagtg ctagagcagg gacgggtggg gccaacgtcc tgact 55

Claims

1.制备表达所需蛋白质的效应细胞的方法，其包括以下步骤：

(1)提供材料细胞，所述材料细胞在其基因组中具有带盒式磁带基因的磁带盒结构，所述盒式磁带基因包含编码标记蛋白的基因，其中所述材料细胞分化为效应细胞，并且其中当所述材料细胞分化为效应细胞或其祖细胞时，所述标记蛋白在效应细胞或其祖细胞中表达；

(2)增殖所述材料细胞，

(3)将所述材料细胞分化为效应细胞或其祖细胞；和

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中，在所述材料细胞中，编码标记蛋白的基因的上游和下游侧翼是一对重组酶靶序列，其中步骤(4)是在存在重组酶的情况下，培养所述效应细胞或其祖细胞与盒式磁带交换载体的步骤，所述盒式磁带交换载体包含编码所需蛋白质的基因，所述基因侧翼是相同的重组酶靶序列，以便编码标记蛋白质的基因与编码所需蛋白质的基因交换。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(4)是通过基因组编辑的方式将编码所需蛋白质的基因引入所述效应细胞或其祖细胞的步骤，从而在所述效应细胞或其祖细胞中表达所需蛋白质而不是标记蛋白。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括选择标记蛋白呈阴性的效应细胞或其祖细胞的步骤，从而选择表达所需蛋白质的效应细胞或祖细胞。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述标记蛋白是在效应细胞或其祖细胞的表面上表达的已知配体或受体。

6.根据权利要求5所述的方法，其中编码所述标记蛋白的基因是编码已知的重排的T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的基因。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述标记蛋白是荧光蛋白。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤(1)中提供的具有磁带盒结构的材料细胞在每个材料细胞的基因组中仅包含一个磁带盒结构。

9.根据权利要求8所述的方法，其中在步骤(4)中，将克隆效应细胞或其祖细胞所含的磁带盒结构中的盒式磁带基因与多个盒式磁带基因交换，所述多个盒式磁带基因中的每个盒式磁带基因包含编码不同所需蛋白质的基因，从而同时产生表达不同蛋白质的效应细胞。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述盒式磁带基因在其上游和下游包含一对重组酶靶序列，其中在步骤(4)中，所述效应细胞或其祖细胞在重组酶的存在下与多个盒式磁带交换载体一起同时培养。

11.根据权利要求9所述的方法，其中在步骤(4)中，通过基因组编辑将效应细胞或其祖细胞中的盒式磁带基因与多个盒式磁带基因交换，所述多个盒式磁带基因中的每个盒式磁带基因包含编码不同所需蛋白质的基因。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述材料细胞是多能干细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述多能干细胞是ES细胞或iPS细胞。

14.制备多种类型的各自表达不同的蛋白质的效应细胞的方法，其包括以下步骤：

提供克隆效应细胞或其祖细胞，所述克隆效应细胞或其祖细胞中的每个细胞在其基因组中包含一个磁带盒结构，其中所述磁带盒结构包含盒式磁带基因并且不包含外源耐药基因，所述盒式磁带基因包含编码标记蛋白的基因，以使得所述标记蛋白能够在细胞中表达，和

将所述效应细胞或其祖细胞中编码所述标记蛋白的基因与编码多种蛋白质的基因交换，以同时产生多种类型的各自表达不同的蛋白质的效应细胞。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述盒式磁带基因在其上游和下游包含一对重组酶靶序列，在重组酶存在下将效应细胞或其祖细胞与各自包含编码不同蛋白质的基因的多个盒式磁带交换载体一起培养，以同时产生多种类型的各自表达不同的蛋白质的效应细胞，其中所述效应细胞或其祖细胞包含具有盒式磁带基因的磁带盒结构，所述盒式磁带基因包含编码标记蛋白的基因。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，将效应细胞或其祖细胞中编码标记蛋白的基因与编码多种所需蛋白质的基因进行交换的步骤是通过基因组编辑的方式进行的。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述效应细胞是免疫细胞。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述效应细胞是NK细胞或T细胞。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中编码所述标记蛋白的基因是编码已知的重排的T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体的基因。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述所需蛋白质是TCR或CAR。

21.组合物，其包含通过权利要求20的方法获得的效应细胞，其中所述组合物用于治疗受试者的免疫相关疾病。