[go: up one dir, main page]

CN116376976A - 人源IL32γ条件敲入小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents

人源IL32γ条件敲入小鼠模型的构建方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116376976A
CN116376976A CN202310191519.1A CN202310191519A CN116376976A CN 116376976 A CN116376976 A CN 116376976A CN 202310191519 A CN202310191519 A CN 202310191519A CN 116376976 A CN116376976 A CN 116376976A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mice
mouse
protein
gene
il32γ
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310191519.1A
Other languages
English (en)
Inventor
翟侃
邵明明
伊凤双
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Chaoyang Hospital
Original Assignee
Beijing Chaoyang Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Chaoyang Hospital filed Critical Beijing Chaoyang Hospital
Priority to CN202310191519.1A priority Critical patent/CN116376976A/zh
Publication of CN116376976A publication Critical patent/CN116376976A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
    • C12N15/8775—Murine embryos
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0337—Animal models for infectious diseases
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了人源IL32γ条件敲入小鼠模型的构建方法及其应用。所述方法包括将人源白细胞介素32剪接体IL32γ蛋白基因特异性导入受体小鼠得到转基因小鼠，将所述转基因小鼠与Cre酶转基因小鼠杂交得到小鼠模型，所述小鼠模型在CD4+T细胞中特异表达IL32γ蛋白。所述IL32γ蛋白的氨基酸序列是序列表中序列1。实验证明本发明方法构建的小鼠模型在CD4+T细胞中成功敲入的人源IL32γ基因表达IL32γ蛋白，使其中Th1细胞大量表达，小鼠模型胸腔冲洗液中的Th1细胞占比显著高于对照小鼠。本发明中的构建方法及使用该方法构建的小鼠模型可应用于临床研究胸膜炎的发病机制和临床指导用药。

Description

人源IL32γ条件敲入小鼠模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及医学生物技术领域，具体涉及人源IL32γ条件敲入小鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术
白介素-32(interleukin-32,IL-32)是具有多种亚型的促炎细胞因子，与已知IL家族并不同源。IL-32广泛表达于各种细胞，尤其是T细胞和NK细胞，并未发现明确的IL-32受体。共发现9种分泌型IL-32，其中IL-32α、IL-32β、IL-32γ和IL-32δ的含量最多。与其他亚型相比，IL-32γ的活性最强，然而，IL-32γ的功能并不完全清楚。IL-32在不同微环境的同种细胞中表达水平不同，IL-32在同种微环境的不同细胞中表达水平也不相同，因此，研究疾病中表达IL-32的特定细胞的功能，对认识IL-32在疾病的发生发展中的作用具有重要意义。
并不是在所有动物体中都表达IL-32，已知人中表达IL-32，但是小鼠和大鼠等模式动物中并无IL-32表达，这就给疾病研究带来一定难度。
结核病(Tuberculosis，TB)是严重危害人类健康的全球性公共卫生问题。据世界卫生组织发布的《2021年全球结核病报告》，2020年全球有近20亿结核分枝杆菌潜伏感染、987万TB新发病例报道。TB防控在将来相当长的时间内仍面临严峻挑战。前期的研究发现，结核性胸膜炎中T细胞、B细胞、巨噬细胞表达IL-32的水平具有很大差异，在CD4+T细胞中表达量最高。阐明IL-32+CD4+T细胞对TB免疫调控的作用机制具有重要意义。
基于上述分析，需要构建一种在CD4+T细胞中表达IL-32的工具小鼠，对阐明IL-32调控TB免疫微环境的机制、开发新的诊断和干预手段都具有重要意义。
人白细胞介素32(interleukin-32,IL-32)剪接体IL32γ(NCBI参考序列:NM_001308078.4)坐落在人类第16号染色体上。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何构建在CD4+T细胞中特异表达人白介素-32剪接体IL32γ的小鼠模型。
为了解决上述技术问题，本发明首先构建了在免疫细胞中特异表达人源白细胞介素32的剪接体IL32γ蛋白的小鼠模型的方法。
所述方法包括将人源白细胞介素32的剪接体IL32γ蛋白基因特异性导入受体小鼠的免疫细胞，得到转基因小鼠，将所述转基因小鼠与Cre酶转基因小鼠杂交得到所述小鼠模型。所述Cre酶转基因小鼠可在免疫细胞中特异表达Cre酶。所述小鼠模型可在所述免疫细胞中特异表达所述IL32γ蛋白。
上述方法中，所述IL32γ蛋白可选自下述任一种：
A1)氨基酸序列是序列表中序列1；
A2)将A1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有谷氨酸脱羧酶活性的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
上述方法中，所述导入可为特异性敲入。
所述IL32γ蛋白的编码序列可为序列表中序列2的第3632-4333位。
上述方法中，所述特异性敲入可为将所述白细胞介素32的剪接体IL32γ蛋白条件性过表达盒敲入受体小鼠的ROSA26基因的内含子。
所述ROSA26基因为小鼠基因组GenBank Accession No.NC_000072.7(UpdateDate 18-Oct-2022)的第113044389-113054205位核苷酸的互补序列，将上述基因组第113054205位核苷酸记为ROSA26基因的第1位核苷酸，其中，第1210-1211位核苷酸为白细胞介素32剪接体IL32γ表达框插入位点，该位点位于ROSA26基因内含子上。
上述方法中，所述特异性敲入可包括采用CRISPR/Cas9系统将所述基因敲入受体小鼠的ROSA26基因的内含子的步骤。
上述方法中，所述敲入可包括将表达靶向所述ROSA26基因的内含子的gRNA的核酸分子、Cas9蛋白和所述人源白细胞介素32剪接体IL32γ蛋白的编码基因的核酸分子导入所述受体小鼠得到转基因小鼠的步骤。
所述核酸分子可为包含有人源Il32γ的条件性过表达盒。
上述方法中，所述gRNA的靶序列可对应于小鼠基因组GenBank Accession No.NC_000072.7(Update Date 18-Oct-2022)的第113,052,985-113,053,007位核苷酸的互补序列。
上文所述免疫细胞可为CD4+T淋巴细胞。
上述方法中，所述方法可包括如下步骤：
将表达靶向受体小鼠的所述ROSA26基因的内含子的gRNA的核酸分子、Cas9蛋白和所述人源白细胞介素32剪接体IL32γ蛋白的突变编码基因的核酸分子导入受体小鼠得到F0代转基因小鼠。
F0代转基因小鼠与野生型受体小鼠杂交获得F1代杂合子小鼠，和所述受体小鼠相比，所述F1代杂合敲入小鼠一条染色体上的ROSA26基因基因组GenBank Accession No.NC_000072.7的第113,052,996-113,052,997位核苷酸间的互补序列插入了序列表中序列2所示的人源IL32γ条件性表达盒；
将所述F1代杂合敲入小鼠和CD4-Cre小鼠杂交，得到靶向敲入人源白细胞介素32基因和Cre重组酶的双基因杂合子小鼠，得到所述小鼠模型。
所述Cre转基因小鼠可含有Cre重组酶的表达盒，可以在CD4+T淋巴细胞中特异性表达Cre重组酶。
所述Cre酶转基因小鼠可为(赛业(苏州)生物科技有限公司馈赠的CD4-Cre小鼠。所述T淋巴细胞可为CD4+T细胞。
下述任一种应用也属于本发明的保护范围：
B1)上文所述的方法和/或上文所述的小鼠模型在制备、开发或研究人源白细胞介素32调控TB免疫微环境相关药物中的应用；
B2)上文所述的方法和/或上文所述的小鼠模型在制备与人源白细胞介素32相关疾病临床实验用药中的应用。
附图说明
图1为人源白细胞介素32剪切体IL32γ条件性敲入小鼠模型的构建策略图示。Wildtype allele代表野生型ROSA26位点，Targeting vector代表含有IL32γ条件性表达盒的目标载体，Mutant allele 1(Targeted allele)代表成功插入IL32γ条件性表达盒的ROSA26位点，Mutant allele 2(After Cre recombination)CD4-Cre重组后的过表达IL32γ的ROSA26位点。Exon代表ROSA26基因外显子，Homology arm代表用于定点整合的同源臂,CAG promoter代表CAG全身广泛表达强启动子，loxP site代表Cre重组酶识别位点loxP,6*SV40 pA代表由6个SV40晚期聚腺苷酸化信号组成的强终止元件，Kozak为增强human IL32γ蛋白表达的元件，human IL32γCDS代表人白介素-32剪接体IL32γ的CDS区域，rBG pA代表兔β-珠蛋白多腺苷化信号。
图2为本发明实施例中F1代小鼠基因型PCR鉴定引物方案图示。Mutant allele 1(Targeted allele)代表成功插入IL32γ条件性表达盒的ROSA26位点。
图3为本发明实施例中F1代小鼠基因型鉴定结果。A为F1/R1引物琼脂糖凝胶电泳图片，B为F2/R2引物琼脂糖凝胶电泳图片。其中泳道17、24和27分别代表F1代小鼠编号为17、24和27的阳性小鼠的检测结果，M代表Marker，Water代表水对照，WT代表野生型小鼠。
图4为本发明实施例中F1代小鼠Southern blot鉴定的酶切、5’探针和3’探针设计示意图。
图5为本发明实施例中F1代小鼠基因型Southern杂交检测结果。A为F1代17号样品使用限制性内切酶Bsu36I酶切及5’arm探针的Southern杂交检测结果，WT代表野生型小鼠的泳道，检测出～4.48kb条带，17代表F1代17号小鼠的泳道，检测出～4.48kb和7.81kb的条带；B为F1代17号样品，使用限制性内切酶BstEII酶切及3’arm探针的Southern杂交检测结果，WT代表野生型小鼠的泳道，检测出～4.77kb条带，17代表F1代17号小鼠的泳道，检测出～4.77kb和9.66kb的条带；C为F1代24、27号样品，使用限制性内切酶Bsu36I酶切及5’arm探针的Southern杂交检测结果，WT代表野生型小鼠的泳道，检测出～4.48kb条带，24、27代表F1代24、27号小鼠的泳道，检测出～4.48kb和7.81kb的条带；D为F1代24、27号样品，使用限制性内切酶BstEII酶切及3’arm探针的Southern杂交检测结果，WT代表野生型小鼠的泳道，检测出～4.77kb条带，24、27代表F1代24、27号小鼠的泳道，检测出～4.77kb和9.66kb的条带；上述结果说明，人源IL32γ成功插入ROSA26安全位点。
图6为本发明实施例中F2代小鼠基因型鉴定方案。Wildtype allele代表野生型小鼠，，Mutant allele 2(After Cre recombination)代表最终获得的mutant human IL32γCD4+T细胞特异性敲入小鼠。Exon代表ROSA26基因外显子，rBG pA代表兔β-珠蛋白多腺苷化信号，loxP site代表loxP位点序列，CAG promoter代表CAG启动子，Kozak-Human IL32 CDS代表人白介素-32可变剪接体IL32γ蛋白的CDS区域，Homology arm代表同源臂。F3/R3用于检测WT位点，F5/R6用于检测Cre重组酶作用后的过表达的IL32γ位点。
图7为本发明实施例中F2代小鼠PCR鉴定方案。A为IL32γflox/-CD4Cre小鼠使用引物对F3/R3进行PCR扩增的鉴定结果(345bp)；B为IL32γflox/-CD4Cre小鼠使用引物对Cre-F/Cre-R进行进行PCR扩增的鉴定结果(336bp)；C为IL32γflox/-CD4Cre小鼠使用引物对F5/R6进行PCR扩增的鉴定结果(323bp)。
图8为KI(IL32γflox/-CD4Cre)小鼠和IL32γflox/-小鼠CD4+T或CD4-T细胞中IL32γ蛋白表达检测结果。纵坐标为IL32γ蛋白的浓度。A代表KI小鼠的CD4+T细胞检测结果，B代表KI小鼠的CD4-T细胞检测结果，C代表IL32γflox/-小鼠的CD4+T细胞检测结果。
图9为分别使用KI(IL32γflox/-CD4Cre)小鼠和IL32γflox/-小鼠构建的胸膜炎小鼠中Th1细胞在CD4+T细胞中的占比检测。纵坐标为Th1细胞在CD4+T细胞中的占比百分率。***代表P＜0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、人源白细胞介素32剪接体IL32γ蛋白条件敲入小鼠模型的构建
小鼠ROSA26基因(Gene ID：14910)位于小鼠6号染色体上，其基因组序列为GenBank Accession No.NC_000072.7(Update Date 18-Oct-2022)的第113044389-113054205位核苷酸的互补序列，共9817个核苷酸。在ROSA26基因的内含子1的第1033-1034位(小鼠基因组GenBank Accession No.NC_000072.7(Update Date18-Oct-2022)的第113,052,996-113,052,997位核苷酸间的互补序列)核苷酸之间敲入了人源IL32γ的条件性表达盒。
1.构建向小鼠ROSA26基因打靶的RNP注射复合物
1.1gRNA靶序列设计
根据小鼠ROSA26基因的内含子序列设计的gRNA靶序列如下：
5’-CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT-3’
gRNA的靶序列可对应于小鼠基因组GenBank Accession No.NC_000072.7(UpdateDate 18-Oct-2022)的第113,052,985-113,053,007位核苷酸的互补序列。
1.2CrRNA和tracrRNA的合成
人工合成CrRNA(CRISPR RNA)序列(IDT公司)和tracrRNA(trans-activatingcrRNA)序列(金斯瑞生物科技)。CrRNA与tracrRNA结合会形成gRNA序列。
CrRNA：
5’-CUCCAGUCUUUCUAGAAGAUGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3’；
tracrRNA：
5’-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3’。
1.3外源供体载体的制备
人工合成外源供体载体Donor质粒，Donor质粒为人源IL32γ条件性表达盒(名称为CAG Promoter-loxP-6xSV40 pA-loxP-Kozak-Human IL32 CDS-rBG pA)(序列表中序列2)，其上包括CAG启动子序列(序列表中序列2的第1-1726位核苷酸)、loxP位点序列(序列表中序列2的第1728-1761位核苷酸和第3565-3598位核苷酸)、6个SV40病毒late polyA序列(序列表中序列2的第1762-3564位核苷酸)和人IL32γ的CDS核苷酸序列(序列表中序列2的第3632-4336位核苷酸)。人IL32γ的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
序列1(5’-3’)：
MCFPKVLSDDMKKLKARMIMLLPTSAQGLGAWVSACDTEDTVGHLGPWRDKDPALWCQLCLSSQHQAIERFYDKMQNAESGRGQVMSSLAELEDDFKEGYLETVAAYYEEQHPELTPLLEKERDGLRCRGNRSPVPDVEDPATEEPGESFCDKVMRWFQAMLQRLQTWWHGVLAWVKEKVVALVHAVQALWKQFQSFCCSLSELFMSSFQSYGAPRGDKEELTPQKCSEPQSSK。
序列2(5’-3’)：
attgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattcataacttcgtatagcatacattatacgaagttatttcttctgatattgacttgcggcgcctccgcgatcgcgatcagcttgatggggatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtatggctgattatgatcctctagagtcgcagatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtatggctgattatgatcctctagagtcgcagatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtatggctgattatgatcctctagagtcgcagatcctctagagtcgcagatctgcaagctaattcctgcaggtcgaggggatatcgccacctgagttactgggagatgcgctgatgttgaggccccttgggttctcgagctggatatgctctagaaaggcaggccctgagcagcttagcaaatgatgcatgatcagcttgatggggatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtatggctgattatgatcctctagagtcgcagatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtatggctgattatgatcctctagagtcgcagatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtatggctgattatgatcctctagagtcgcagatcctctagagtcgcagatctgcaagctaattcctgcaggtcgagggacctaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatattaagggttccggatccactacacgtgccaccatgtgcttcccgaaggtcctctctgatgacatgaagaagctgaaggcccgaatgataatgctcctccctacttctgctcaggggttgggggcctgggtctcagcgtgtgacactgaggacactgtgggacacctgggaccctggagggacaaggatccggccctttggtgccaactctgcctctcttcacagcaccaggccatagaaagattttatgataaaatgcaaaatgcagaatcaggacgtggacaggtgatgtcgagcctggcagagctggaggacgacttcaaagagggctacctggagacagtggcggcttattatgaggagcagcacccagagctcactcctctacttgaaaaagaaagagatggattacggtgccgaggcaacagatcccctgtcccggatgttgaggatcccgcaaccgaggagcctggggagagcttttgtgacaaggtcatgagatggttccaggccatgctgcagcggctgcagacctggtggcacggggttctggcctgggtgaaggagaaggtggtggccctggtccatgcagtgcaggccctctggaaacagttccagagtttctgctgctctctgtcagagctcttcatgtcctctttccagtcctacggagccccacggggggacaaggaggagctgacaccccagaagtgctctgaaccccaatcctcaaaatgacttaagtcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgccctggctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccatatgctggctgccatgaacaaaggttggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctgctgtccattccttattccatagaaaagccttgacttgaggttagattttttttatattttgttttgtgttatttttttctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagccagatttttcctcctctcctgactactcccagtcatagctgtccctcttctcttatggagatc。
1.4RNP注射复合物的制备
管1溶液：在5.2uL RNase-free水中加入0.8uL 100pmol/uL的CrRNA，再加入0.6uL100pmol/uL的TracRNA混匀孵育5min，之后再加入0.2uL Cas9蛋白(NEB，货号：M0646M)混匀孵育10min得到管1溶液；
管2溶液：终浓度为15ng/uL的Donor质粒；
将管1溶液和管2溶液混合得到RNP注射复合物。
2.人源白细胞介素32可变剪接体IL32γ蛋白条件敲入小鼠的制备
2.1小鼠受精卵细胞的制备
2.1.1超排卵
筛选3-4周龄雄性C57BL/6J小鼠1只，雌性C57BL/6小鼠3只。雌鼠于第一天14：00腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG(5U/只)，第三天14：00腹腔注射人绒毛膜促性腺激素hCG(5U/只)，两者注射时间间隔46-48h；然后立即将3只雌鼠与1只雄鼠合笼，第四天8：00-9：00检查雌鼠阴道栓，选取检查到阴栓的雌鼠。
2.1.2受精卵收集及培养
安乐死上述步骤2.1.1中检查到阴栓的雌鼠，无菌采集其输卵管，放入一个35mm皮氏培养皿(用M2培养液和透明质酸酶溶液制作的液滴培养基，37℃预温)中，在体视显微镜下将输卵管壶腹部用镊子撕破，将卵丘细胞包围的合子团释放出来，移入透明质酸酶液滴中放置几分钟，收集受精卵，转移到M2液滴培养基中，挑选形态正常的受精卵，在37℃、5％CO2条件下培养备用。
2.1.3原核显微注射及输卵管内胚胎移植
制备显微注射注射针和固定针(品牌Sutter；型号BF100-78-15)和固定针(品牌Sutter；型号：B100-75-15)；
将步骤1制备得到的RNP注射复合物加样(3～5uL)到显微注射针内；
筛选步骤2.1.2中收集得到的形态正常的受精卵置于注射皿内，在200-400×倍的倒置显微镜下，将RNP注射复合物通过显微注射的方式注射到受精卵细胞核内；
将注射完毕的受精卵转移到M16培养基中，并放入37℃恒温5％的CO2培养箱内条件下过夜培养，挑选发育到2细胞期的胚胎植入代孕小鼠。
胚胎移植的具体步骤如下：准备假孕雌鼠：选取适龄(周龄6-8w，体重25-33g)的可育CD-1雌性小鼠(维通利华)与输精管结扎后绝育的CD-1雄性小鼠(维通利华)交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠，作为受精卵转基因后的代孕鼠；
假孕0.5d(当天早晨检查到阴栓)的CD-1雌性小鼠，麻醉后于背部做约1cm切口，暴露卵巢和输卵管，体视显微镜下，将显微注射后培养到2细胞期的胚胎植入输卵管壶腹部，将卵巢和输卵管放回腹腔后缝合，左右两侧输卵管均移植，每只小鼠植入20个2细胞期胚胎，得到CD-1代孕小鼠。
2.1.4阳性F0代小鼠的鉴定
1)移植后约20天CD-1代孕小鼠产仔，得到F0代小鼠。F0代小鼠出生后，在1-2周龄时剪尾，并将获得的组织用于基因组DNA的提取，同时以野生型C57BL/6J小鼠作为对照。
2)以提取的基因组DNA为模板，采用引物对F1/R1、F2/R2进行PCR扩增，得到F1/R1引物对的PCR产物1(2.8kb)和F2/R2引物对的PCR产物2(2.6kb)，使用F3引物对PCR产物1进行测序，使用R3引物对PCR产物2进行测序。引物序列如下：
F1：5’-AAAGATCGCTCTCCACGCCCTAG-3’；
R1：5’-GATGGGGAGAGTGAAGCAGAACG-3’；
F2：5’-GCATCTGACTTCTGGCTAATAAAG-3’；
R2：5’-ATGGGAAGTTAGTAGCAAACAAGAG-3’；
F3：5’-CACTTGCTCTCCCAAAGTCGCTC-3’；
R3：5’-ATACTCCGAGGCGGATCACAA-3’。
PCR鉴定结果结果表明：和野生型C57BL/6J小鼠相比，阳性F0代杂合子小鼠(含有2.8kb的PCR产物1和2.6kb的PCR产物2)6号染色体两条同源染色体中的一条同源染色体上的ROSA26基因的内含子1的第1033-1034位核苷酸之间插入了序列表中序列2所示的DNA分子(即IL32γ突变体的表达盒)，另一条染色体没有发生突变。
2.1.5F1代小鼠的获得及鉴定
2.1.5.1F1代小鼠PCR检测和测序分析
将阳性F0代小鼠与野生型C57BL/6J小鼠杂交获得F1代杂合子小鼠。
使用与F0代小鼠同样的检测方法对F1代杂合子小鼠进行PCR检测和测序分析，包括使用引物对F1/R1和F2/R2进行PCR扩增检测(图2)，以及使用F3和R3引物进行测序分析：F1代杂合子小鼠1-2周龄时，剪尾基因型鉴定筛选与阳性F0代杂合子小鼠基因型一致的小鼠，即F1代阳性杂合子小鼠(含有2.8kb的PCR产物1和2.6kb的PCR产物2)的两条同源染色体中的一条同源染色体上的ROSA26基因的内含子1的第1033-1034位核苷酸之间插入了序列表中序列2所示的DNA分子(即IL32γ的表达盒)，另一条染色体没有发生突变，共得到3只F1代阳性杂合子靶向敲入小鼠(IL32flox/-，编号分别为17、24和27)(图3)。
2.1.5.2F1代小鼠Southern杂交检测：
对3只F1代阳性靶向敲入小鼠(17、24和27)的尾DNA样本(3-4周龄时剪尾，并从获得的组织提取得到的基因组DNA)进行Southern blot分析，证实了正确的基因敲入靶向。Southern blot分析策略如图4所示，分别使用限制性内切酶Bsu36I和BstEII对野生型小鼠(WT)和F1代阳性靶向敲入小鼠(MT)的基因组DNA进行酶切和使用5’arm探针和3’arm探针进行鉴定。
限制性内切酶Bsu36I酶切及5’arm探针的Southern杂交检测结果显示，野生型小鼠(WT)可以检测出4.48kb条带，F1代阳性靶向敲入小鼠(MT)(17、24和27)均可检测出4.48kb和7.81kb的条带；使用限制性内切酶BstEII酶切及3’arm探针的Southern杂交检测结果显示，野生型小鼠(WT)可以检测出4.77kb条带，F1代阳性靶向敲入小鼠(MT)(17、24和27)可以检测出4.77kb和9.66kb的条带(图5)。检测结果说明，F1代阳性靶向敲入小鼠中，人源IL32γ成功插入ROSA26安全位点。
5’端正向引物:5’-AAACGTGGAGTAGGCAATACCCAGG-3’
5’端反向引物:5’-AAAGAAGGGTCACCTCAGTCTCCCT-3’
3’端正向引物:5’-TTCTGGGCAGGCTTAAAGGCTAAC-3’
3’端反向引物:5’-AGGAGCGGGAGAAATGGATATGAAG-3’。
2.1.6CD4+T细胞特异性过表达IL32γ的小鼠模型获得
2.1.6.1IL32flox/-CD4Cre小鼠的繁殖
F1代杂合子小鼠(IL32flox/-)和CD4-Cre鼠(含有Cre重组酶基因的表达盒Cd4-Cre，在CD4表达的T淋巴细胞中特异表达Cre重组酶，赛业(苏州)生物科技有限公司馈赠，JaxStrain#:022071,RRID:IMSR_JAX:022071)达到性成熟后进行交配获得F2代小鼠，5-7天时，按照步骤2.1.5同样的方法进行剪尾基因型鉴定筛选出F2代杂合子小鼠IL32flox/-CD4Cre，F2代IL32flox/-CD4Cre杂合子小鼠同时携带有IL32γ条件性表达盒和Cd4-Cre。Cd4-Cre含有驱动Cre重组酶基因表达的CD4增强子、启动子和沉默子序列。这些小鼠可用于在CD4表达组织中产生条件突变。
F2代IL32flox/-CD4Cre杂合子小鼠使用三对引物进行鉴定：
F3:5’-GTGTTGCAATACCTTTCTGGGAGTT-3’；
R3:5’-ATACTCCGAGGCGGATCACAA-3’；
使用引物对F3/R3进行PCR检测ROSA26位点野生型条带，大小为353bp。
F5:5’-GGCAACGTGCTGGTTATTGTG-3’；
R6:5’-TTTCTATGGCCTGGTGCTGTGAAG-3’；
使用引物对F5/R6进行PCR检测Cre作用后IL32γ过表达条带，大小为323bp。
Cre重组酶PCR鉴定：
Cre-F：5’-GTTCTTTGTATATATTGAATGTTAGCC-3’
Cre-R：5’-CTTTGCAGAGGGCTAACAGC-3’
扩增产物大小为：336bp
以小鼠的基因组DNA为模板，进行PCR，选择扩增产物同时含有含有353bp和323bp和336bp三种条带的小鼠为目的小鼠，即靶向敲入IL32γ条件性过表达盒杂合子和Cre转基因杂合子的小鼠(cKI小鼠)。
实施例2、人源IL32γ条件敲入小鼠模型的验证
人源IL32γ为分泌性蛋白，因此本发明检测实施例1中构建的人源IL32γ条件性敲入小鼠(cKI小鼠)CD4细胞的培养上清中IL32γ的表达来确证人源IL32γ条件性敲入小鼠模型的成功构建。
挑选IL32γflox/-CD4Cre小鼠(cKI小鼠)和IL32γflox/-小鼠各3只，每只分别检测，脱颈处死后酒精浸泡消毒5分钟，取脾脏研磨，用淋巴细胞分离液(MP Biomedicals,货号：50494X)提取单个核细胞，裂解红细胞(TONBO,货号：TNB-4300-L100)6min后用PBS洗涤。用小鼠磁珠阳性分选试剂盒(Miltenyi Biotec，货号：130-117-043)获取CD4+T细胞，同时收集cKI小鼠的CD4-细胞。细胞计数后分别取1×106个细胞/孔，接种于48孔板，每孔内加入250uL RPMI1640培养基，同时加入细胞刺激混合物(Thermo Fisher,货号：00-4970-03)0.5uL/孔，在37℃孵箱中培养4h后收集细胞培养上清液。使用IL32 ELISA试剂盒(CUSABIO,货号：CSB-E12074h)按说明书操作检测培养基上清中IL32γ的浓度。检测结果如图8所示，在cKI小鼠中检测到IL32γ在CD4+T细胞中表达(图8中IL32flox/-CD4CreCD4+Tcells代表)，而在cKI小鼠中检测到IL32γ在CD4-细胞(图8中IL32flox/-CD4CreCD4-cells代表)以及IL32γflox/-小鼠的CD4+T细胞(图8中IL32flox/-CD4+T cells代表)中均未检测到IL32γ蛋白的表达。所以，人源IL32γ条件性敲入小鼠模型成功构建。
实施例3、使用人源IL32γ条件敲入CD4+T细胞的小鼠构建胸膜炎模型
众所周知Th1细胞在胸膜炎中比例升高并发挥重要的免疫调节作用。本实施例中使用实施例1中构建的cKI小鼠注射BCG活菌构建胸膜炎小鼠模型，观察胸膜炎小鼠模型中Th1细胞的比例。
挑选6-8周龄大小的实施例1中构建的实验组IL-32γflox/-CD4Cre小鼠(cKI小鼠)和同窝出生的对照组IL-32flox/-小鼠各9只，每组中的小鼠随机分成3小组，每小组各3只，用0.5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，每只小鼠胸腔内注射5×106BCG活菌(100μL)构建胸膜炎模型。
在造模后的第7天收集实验组和对照组小鼠胸腔冲洗液中的细胞，将每小组小鼠胸腔冲洗液细胞混合得到总胸腔冲洗液并提取单个核细胞核，运用流式细胞术检测实验组和对照组小鼠胸腔冲洗液中Th1占CD4+T细胞的比例。
实验结果发现cKI小鼠胸腔冲洗液中的Th1细胞占比(图9中IL32flox/-CD4Cremouse代表)显著高于IL-32γflox/-小鼠胸腔冲洗液(图9中IL32flox/-mouse代表，p＜0.001)。因此，实施例1中构建的cKI小鼠由于在CD4+T细胞中成功敲入了人源IL32γ基因表达IL32γ蛋白，影响了其中Th1细胞的表达，使得cKI小鼠大量表达Th1细胞从而成功获得胸膜炎小鼠模型。本发明中构建的人源IL32γ条件敲入CD4+T细胞的小鼠和胸膜炎小鼠模型可应用于临床研究胸膜炎的发病机制和临床指导用药。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.构建在免疫细胞中特异表达人源白细胞介素32剪接体IL32γ蛋白的工具小鼠模型的方法，包括将人源白细胞介素32剪接体IL32γ蛋白基因特异性导入受体小鼠得到转基因小鼠，将所述转基因小鼠与Cre酶转基因小鼠杂交得到所述小鼠模型；所述Cre酶转基因小鼠在免疫细胞中特异表达Cre酶；所述小鼠模型在所述免疫细胞中特异表达所述IL32γ蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述IL32γ蛋白选自下述任一种蛋白质：
A1)氨基酸序列是序列表中序列1；
A2)将A1)所示的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有谷氨酸脱羧酶活性的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述导入为特异性敲入，所述基因的编码核苷酸序列是序列表中序列2的第3632-4333位。
4.根据权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述特异性敲入为将所述基因敲入受体小鼠的ROSA26基因的内含子。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述特异性敲入包括采用CRISPR/Cas9系统将所述基因敲入受体小鼠的ROSA26基因的内含子。
6.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述敲入包括将表达靶向所述ROSA26基因的内含子的gRNA的核酸分子、Cas9蛋白和所述人源白细胞介素32剪接体IL32γ蛋白的编码基因的核酸分子导入所述受体小鼠得到转基因小鼠的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述gRNA的靶序列对应于小鼠基因组GenBank Accession No.NC_000072.7的第113,052,985-113,053,007位核苷酸的互补序列。
8.根据权利要求6或7中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
将表达靶向受体小鼠的所述ROSA26基因的内含子的gRNA的核酸分子、Cas9蛋白和所述人源白细胞介素32剪接体IL32γ蛋白的突变编码基因的核酸分子导入受体小鼠得到F0代转基因小鼠；
F0代转基因小鼠与野生型受体小鼠杂交获得F1代杂合子小鼠，和所述受体小鼠相比，所述F1代杂合敲入小鼠一条染色体上的ROSA26基因基因组GenBank AccessionNo.NC_000072.7的第113,052,996-113,052,997位核苷酸间的互补序列插入了序列表中序列2所示的人源IL32γ条件性表达盒；
将所述F1代杂合敲入小鼠和CD4-Cre小鼠杂交，得到靶向敲入人源白细胞介素32基因和Cre重组酶的双基因杂合子小鼠，得到所述小鼠模型；所述Cre转基因小鼠含有Cre重组酶的表达盒，在CD4+T淋巴细胞中特异性表达Cre重组酶。
9.权利要求1-8中任一权利要求所述的方法和/或权利要求1-8中任一权利要求中所述的小鼠模型在制备、开发或研究人源白细胞介素32调控TB免疫微环境相关药物中的应用。
10.权利要求1-8中任一权利要求所述的方法和/或权利要求1-8中任一权利要求中所述的小鼠模型在制备与人源白细胞介素32相关疾病临床实验用药中的应用。
CN202310191519.1A 2023-03-02 2023-03-02 人源IL32γ条件敲入小鼠模型的构建方法及其应用 Pending CN116376976A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310191519.1A CN116376976A (zh) 2023-03-02 2023-03-02 人源IL32γ条件敲入小鼠模型的构建方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310191519.1A CN116376976A (zh) 2023-03-02 2023-03-02 人源IL32γ条件敲入小鼠模型的构建方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116376976A true CN116376976A (zh) 2023-07-04

Family

ID=86968331

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310191519.1A Pending CN116376976A (zh) 2023-03-02 2023-03-02 人源IL32γ条件敲入小鼠模型的构建方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116376976A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119709862A (zh) * 2024-12-12 2025-03-28 西安交通大学 一种构建肺组织特异性表达SARS-Cov2结构蛋白的转基因小鼠模型的方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119709862A (zh) * 2024-12-12 2025-03-28 西安交通大学 一种构建肺组织特异性表达SARS-Cov2结构蛋白的转基因小鼠模型的方法
CN119709862B (zh) * 2024-12-12 2025-12-12 西安交通大学 一种构建肺组织特异性表达SARS-Cov2结构蛋白的转基因小鼠模型的方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12096753B2 (en) Transgenic animals and methods of use
CN108660161B (zh) 基于CRISPR/Cas9技术的制备无嵌合基因敲除动物的方法
US20180371493A1 (en) Methods of modifying genes in eukaryotic cells
US6891031B2 (en) Coordinate cytokine regulatory sequences
US20190281798A1 (en) Genetically Modified Non-Human Animal With Human Or Chimeric PD-L1
JPH07509137A (ja) 異種抗体の生産
JPH07503848A (ja) 遺伝子標的現象による同型遺伝子接合
US10793829B2 (en) Transgenic mammals and methods of use thereof
JP2019507610A (ja) ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノム編集に基づく、Ｆｅｌ ｄ１ノックアウト並びに関連組成物及び方法
WO2020240876A1 (ja) エクソンヒト化マウス
CN117701634A (zh) 一种itgb5条件性基因敲除小鼠模型、构建方法及其应用
JP2001521749A (ja) 遺伝子標的化ベクターの効率良い構築
CN110438160A (zh) 一种Cd2ap基因敲除动物的构建方法及应用
CN104120147A (zh) 一种制备iGb3S基因敲除的非人哺乳动物的方法及应用
CN116376976A (zh) 人源IL32γ条件敲入小鼠模型的构建方法及其应用
Kang et al. Apancreatic pigs cloned using Pdx1-disrupted fibroblasts created via TALEN-mediated mutagenesis
CN116286973A (zh) 一种在肝干细胞中特异性表达Cre的工具鼠模型的构建方法
CN101265483A (zh) 乳腺特异性表达载体及其构建方法
CN111549070B (zh) 对x染色体多拷贝基因进行编辑实现动物性别控制的方法
CN110283851B (zh) 与恶性胸腔积液相关的靶点myo9b及其应用
WO1993019166A1 (en) Small animal model for studying cholesterol metabolism
CN118726371A (zh) 一种人源化abca4点突变的遗传性视网膜变性疾病小鼠模型的构建方法及其应用
CN117265006A (zh) 一种CHD1Lflox/flox小鼠模型的构建方法与应用
Brakebusch Generation and analysis of genetically modified mice
CN115011606A (zh) Cd37基因人源化非人动物的构建方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination