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CN116333056A - 一种高结合容量的耐碱重组Protein A及其制备方法和应用 - Google Patents

一种高结合容量的耐碱重组Protein A及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116333056A CN202310087062.XA CN202310087062A CN116333056A CN 116333056 A CN116333056 A CN 116333056A CN 202310087062 A CN202310087062 A CN 202310087062A CN 116333056 A CN116333056 A CN 116333056A
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李建鹏
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Abstract

本发明提供了一种高结合容量的耐碱重组Protein A，该重组Protein A具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2所示的基因序列。本发明还提供了一种高结合容量的耐碱重组Protein A的纯化方法，该方法包括诱导培养表达菌株后，收集菌体，依次经亲和层析、离子交换层析、透析脱盐和超滤浓缩获得重组Protein A。与现有技术相比，本发明提供的高结合容量的耐碱重组Protein A能够在pH>4.0时即可实现与抗体的充分解离，并具有更强的耐碱能力。该重组Protein A可用于亲和层析介质中的配体和/或免疫球蛋白检测中的分子标记物。采用该重组Protein A制备的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率显著改善，纯化效果好的优点，且其使用寿命也得到显著增加，大幅降低了抗体的分离纯化成本。

Description

一种高结合容量的耐碱重组Protein A及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高结合容量的耐碱重组Protein A及其制备方法和应用。
背景技术
天然Protein A的分子量为42.0kDa，由A、B、C、D、E和X六个结构域组成，其中A、B、C三个结构域有90％的同源性，D、E与其他结构域有70％的相似性。这六个结构域的内部结构相似，均含有3个螺旋(Helix)和2个环(loop)，其中Helix I和Helix II与IgG的Fc区相互作用，Helix III同Fab相互作用。
Protein A能够特异性结合大多数哺乳动物的IgG，亲和力高。一个Protein A分子可以结合两个IgG分子，并且两者的结合会随pH的降低(pH 3.0～3.5)而解离。因此，Protein A已被广泛用作纯化或检测IgG的亲和配基。但天然Protein A用于层析纯化时也存在很多不足，主要有：1、在层析过程中，Protein A与抗体解分离大多在酸性(pH<4.0)环境中进行，这种低pH洗脱不仅会导致抗体形成可溶性聚集体，降低抗体生物学活性，增加了抗体药物的ADA风险。此外，低pH还会导致其它蛋白形成不溶性沉淀，给纯化造成麻烦，降低层析柱的使用寿命和产量；2、清洗Protein A层析柱，去除非特异吸附的内毒素等杂质，通常要使用0.5～1.0M的NaOH，但天然Protein A的耐碱性较差，频繁和/或长时间的碱处理会破坏Protein A配基，导致其变性或脱落，降低层析柱的使用寿命；3、以天然Protein A为亲和配基的树脂，其抗体的动态载量(dynamic binding capacity，DBC)通常在20～30g/L，在大规模纯化IgG时，DBC较低会导致树脂用量大、纯化成本高昂。
发明内容
为解决现有技术问题，本发明提供了一种高结合容量的耐碱重组Protein A及其制备方法和应用。
本发明的具体技术方案如下：
本发明提供了一种高结合容量的耐碱重组Protein A，其特征在于，具有如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。
本发明提供的高结合容量的耐碱重组Protein A，还具有这样的技术特征，具有如SEQ ID NO:2所示的基因序列。
本发明还提供了一种表达载体，其特征在于，含有上述高结合容量的耐碱重组Protein A的基因序列。
本发明还提供了一种表达菌株，其特征在于，含有上述表达载体。
本发明还提供了一种高结合容量的耐碱重组Protein A的纯化方法，其特征在于，包括：诱导培养上述表达菌株后，收集菌体，依次经亲和层析、离子交换层析、透析脱盐和超滤浓缩获得高结合容量的耐碱重组Protein A。
本发明还提供了一种高结合容量的耐碱重组Protein A的应用，其特征在于，该高结合容量的耐碱重组Protein A用于抗体分离纯化和/或免疫球蛋白检测。
本发明提供的高结合容量的耐碱重组Protein A的应用，还具有这样的技术特征，该高结合容量的耐碱重组Protein A用于亲和层析介质中的配体和/或免疫球蛋白检测中的分子标记物。
发明的作用与效果
与现有技术相比，本发明提供的高结合容量的耐碱重组Protein A能够在pH>4.0时即可实现与抗体的充分解离，并具有更强的耐碱能力。采用高结合容量的耐碱重组Protein A制备的亲和层析介质具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率显著改善，纯化效果好的优点，且其使用寿命也得到显著增加，大幅降低了抗体的分离纯化成本。
附图说明
图1是本发明实施例的利用Ni-NTA sepharose纯化高结合容量的耐碱重组Protein A(rProtein A)。其中，图1中的a为Ni-NTA sepharose亲和层析色谱图，图中峰1为流穿峰，峰2为洗涤峰，峰3为洗脱峰；图1中的b为SDS-PAGE电泳鉴定图，图中箭头所指为rProtein A。
图2是本发明实施例的利用DEAE-sepharose纯化高结合容量的耐碱重组ProteinA(rProtein A)。其中，图2中的a为DEAE-sepharose离子交换层析色谱图，图中峰1为杂蛋白，峰2为rProteinA；图2中的b为SDS-PAGE电泳鉴定图，图中峰2为rProtein A。
图3是本发明实施例的纯化后的rProtein A的SDS-PAGE电泳鉴定图。
图4是本发明实施例的高结合容量的耐碱重组Protein A(rProtein A)与天然Protein A(wtProtein A)的耐酸碱能力对比图。
图5是本发明实施例的rProtein A-琼脂糖凝胶与wtProtein A-琼脂亲和纯化兔IgG的效果对比图。其中，图5中的a为rProtein A-琼脂糖凝胶的亲和纯化结果；图5中的b为wtProtein A-琼脂的亲和纯化结果。
具体实施方式
在本发明中使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的蛋白与树脂偶联等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais,T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2ndedition,Cold spring Harbor Laboratory Press。
下述实施例中所采用的试剂为普通商业途径购得，未注明的实验操作及实验条件参考本领域的常规操作及常规条件。
以下结合实施例和附图来说明本发明的具体实施方式。
<实施例>
本实施例提供了一种高结合容量的耐碱重组Protein A(rProtein A)及其制备方法。
为获得一种新型的Protein A，使其能够在pH>4.0时即可与抗体充分解离，并同时兼具更高的DBC和更强的耐碱能力，本实施例对天然Protein A进行了系统改造，并利用重组蛋白表达技术进行了表达和功能验证，具体如下：
为提高Protein A的DBC，本实施例去除了天然Protein A的IgG非结合区，由4个仅保留有Fc结合区的连续B区串联形成。
本实施例去除了天然Protein A的D区和E区，降低了蛋白A的异源相互作用，改善了Protein A的低pH洗脱性能。
本实施例的rProtein A中的B区包含了N3A、N6D、Q9A、N23T、G29A和E47T等6个突变位点，其中，G29A突变点用于降低蛋白的Fab结合力，提高其DBC；N3A、N6D、Q9A、N23T、E47T等5个突变位点用于提高蛋白的碱耐受力。
本实施例的rProtein A中，B区通过GGGGS多肽连接，Gly4 Ser多肽序列同时兼具疏水性和伸展性，能够抵抗蛋白酶水解，使rProtein A具有更好的稳定性和生物活性，同时也避免了天然Protein A中复杂氨基酸序列的物质结合特性，降低了抗体纯化过程中的杂质蛋白残留。
本实施例的rProtein A中的C末端由GGGGS多肽链连接有一个半胱氨酸，由此可以单一位点偶联到载体上，降低了空间位阻，增加了rProtein A与抗体的结合能力，从而提高了层析柱的DBC。
系统改造后的rProtein A经蛋白二维结构优化，最终形成的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
根据rProtein A的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，逆向翻译出其基因序列，再经密码子优化形成最终序列如SEQ ID NO:2所示。
本实施例的rProtein A的制备方法包括如下步骤：
步骤1，rProtein A基因表达载体和表达菌株的制备，具体过程如下：
为方便蛋白纯化和交联，rProtein A在C末端加入6×His标签肽编码序列和一个Cys的编码序列(如SEQ ID NO:3所示)，并委托金唯智生物科技有限公司合成该基因，随后将之克隆入pET52载体内，形成rProtein A的表达载体pET-rProtein A。将pET-rProtein A转染大肠杆菌BL21(DE3)plysS，筛选获得rProtein A的表达菌株，将含有20％甘油的rProtein A表达菌株置于-80℃长期保存。
步骤2，rProtein A的诱导表达与纯化
rProtein A的诱导表达：取出-80℃保存的rProteinA表达菌株，LB平板划线，过夜培养。挑取单菌落接种到5ml含有50mM氨苄青霉素的LB培养中，37℃，220rpm培养过夜。取过夜培养物，按1:100的体积比将表达菌接种于新鲜的LB培养基中，37℃培养至OD600达到0.5～0.8。加入IPTG至终浓度为0.5mM，继续诱导培养4小时后，10000g 10min离心收集菌体。
rProtein A的纯化：将收集的菌体，按照100ml/50g菌重比例加入适量溶液一(20mM NaH2PO4、0.1M NaCl、5mM咪唑、1mM PMSF)，混合均匀后，于4℃、800psi进行高压均质破壁细菌。将破壁好的菌液于4℃，10000g离心10min，收集上清，并经0.22μm滤膜过滤，随后进行rProtein A的纯化(包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析)，过程如下：
Ni-NTA sepharose亲和层析，流动相为溶液一(20mM NaH2PO4、0.1M NaCl、5mM咪唑、1mM PMSF)，后用洗涤液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑)洗杂，最后用洗脱液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、300mM咪唑)洗脱，收集洗脱峰(如图1中的峰3)；将亲和层析的洗脱液用溶液二(20mM Tris-HCl，pH 8.0)透析过夜，再使用DEAE-sepharose进行离子交换层析，流动相为溶液二，随后用0～400mM NaCl线性洗脱，收集洗脱峰(如图2中的峰2)；将离子交换层析的洗脱液用无菌去离子水透析过夜(透析脱盐)，最后使用10KDa超滤管浓缩至10mg/ml(超滤浓缩)，得到rProtein A。
对每一步层析后的洗脱液进行12％ SDS-PAGE电泳检测。
图1是本发明实施例的利用Ni-NTA sepharose纯化高结合容量的耐碱重组Protein A(rProtein A)。其中，图1中的a为Ni-NTA sepharose亲和层析色谱图，图中峰1为流穿峰，峰2为洗涤峰，峰3为洗脱峰；图1中的b为SDS-PAGE电泳鉴定图，图中箭头所指为rProtein A。
图2是本发明实施例的利用DEAE-sepharose纯化高结合容量的耐碱重组ProteinA(rProtein A)。其中，图2中的a为DEAE-sepharose离子交换层析色谱图，图中峰1为杂蛋白，峰2为rProteinA；图2中的b为SDS-PAGE电泳鉴定图，图中峰2为rProtein A。
图3是本发明实施例获得的rProtein A的SDS-PAGE电泳鉴定图。
如图3所示，rProtein A经12％ SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，为单一条带。
将rProtein A分装在1.5ml储存管内，300μl/管，于冷冻干燥机中冻干，冻干参数：冷阱温度-50℃，真空度＜0.01MPa，冻干时间为24小时。
<测试例>
本测试对上述实施例获得的高结合容量的耐碱重组Protein A(rProtein A)进行耐酸碱能力检测。
用无菌去离子水溶解冻干的rProtein A，并调整浓度至10mg/ml，以10mg/ml的天然Protein A(wtProtein A，购置于Abcame公司，货号ab7399)作为对照，用于耐酸碱能力检测，检测方法如下：
分别用pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0的磷酸-柠檬酸溶液(20mM Na2PO4、10mM柠檬酸)将rProtein A稀释10倍至1mg/ml，使得溶液pH值分别为pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH5.0。以wtProtein A作为对照。分别用0.25M、0.50M、0.75M和1.00M的NaOH将rProtein A稀释10倍至1mg/ml。以wtProtein A作为对照。
各组样品22℃放置1天、2天、3天。到达每个时间点后，取10μl测试液，加入990ulpH7.4的PBS使测试液的pH值恢复至中性，rProtein A浓度至10μg/ml。随后，用恢复至中性的10μg/ml的rProtein A包被ELISA板，50μl/孔，16孔/测试点，4℃包被过夜。同时，设置wtProtein A作为对照。包被好的孔板用于免疫杂交测试，检测各个时点rProtein A、wtProtein A与兔IgG的结合能力，检测过程如下：
用5％脱脂奶粉封闭包被好的板孔，100μl/孔，4℃过夜。倒掉封闭液，用PBS-T震荡洗板三次，200μl/孔，10min/次。用5％脱脂奶粉稀释兔IgG至浓度为1mg/ml。将稀释好的兔IgG加入板孔，50μl/孔。等比稀释的兔IgG加好后，室温孵育2小时；倒掉杂交液，用PBS-T震荡洗板三次，200μl/孔，10min/次。加入1:2000稀释的鼠抗兔IgG-HRP酶标二抗，稀释液为5％的脱脂奶粉，50μl/孔，室温孵育2小时。杂交完成后，倒掉杂交液，用PBS-T震荡洗板三次，200μl/孔，10min/次。加入显色液，90μl/孔，37℃孵育15min。加入中止液，50μl/孔，震荡混匀。酶标仪读取OD450的光吸收值，根据各组数值，判定rProtein A、wtProtein A的耐酸碱情况，rProtein A、wtProtein A的耐酸碱能力列于表1。
表1
Figure BDA0004069124950000061
Figure BDA0004069124950000071
图4是本发明实施例的高结合容量的耐碱重组Protein A(rProtein A)与天然Protein A(wtProtein A)的耐酸碱能力对比图。
由图4、表1可知，rProtein A在pH 2.0～5.0以及0.25～1.00M NaOH中3天仍能保持70％以上活性，而天然ProteinA(wtProtein A)仅保持不足50％的活性。
<应用例>
将上述实施例获得的高结合容量的耐碱重组Protein A(rProtein A)用于制备亲和层析介质(rProtein A-琼脂糖凝胶)，并将rProtein A-琼脂糖凝胶用于纯化兔IgG。具体过程如下：
rProtein A-琼脂糖凝胶的制备，具体过程如下：
用10～20倍体积去离子水冲洗环氧活化琼脂糖凝胶6FF(购自中科森辉微球技术(苏州)有限公司)，离心去除上清。将10ml(约7.5g)的冲洗后的环氧活化琼脂糖凝胶加入到30ml的三角瓶中。取15ml 10mg/ml的rProtein A溶液(溶剂为0.1M硼砂-硼酸缓冲液，pH8.6)加入冲洗后的环氧活化琼脂糖凝胶中，37℃振荡偶联24h。反应完毕后，用砂芯漏斗抽干液体，收集滤过料液。将抽干液体的琼脂胶用水洗涤后，用1倍体积的20％乙醇重新悬起，4℃保存。
采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型，购自上海碧云天生物技术有限公司，产品编号P0006C)测定滤过料液中的蛋白浓度为7.8mg/ml，由此计算得出与琼脂糖凝胶结合的总rProtein A量为：(10-7.8)×15＝33(mg)。由此计算得出偶联配基密度为3.3mg/ml。
rProtein A-琼脂糖凝胶纯化兔IgG，具体过程如下：
取10ml兔血清加入10mL冷饱和硫酸铵中，室温85rpm连续搅拌30min。4500g室温下离心20min，收集沉淀。小心弃掉上清液，用10mL 45％(w/v)的饱和硫酸铵重悬沉淀，离心收集沉淀(4500g，20min)。如此清洗两次，保留沉淀。最后用5mL PBS溶解沉淀，用5ml PBS透析过夜。
取rProtein A-琼脂糖凝胶5ml装柱，以商品化的wtProtein A-琼脂(购置于中科森辉微球技术(苏州)有限公司)5ml预装柱作为对照。用5倍柱体积的平衡缓冲液(20mMNa2HPO4、0.15M NaCl，pH 7.0)平衡层析柱，流速1.0ml/min。PBS透析过夜的兔血清样品，1.0ml/min的流速上样至层析柱中，用5～10倍柱体积的平衡缓冲液洗涤树脂，流速2.0ml/min，至流出液的A280吸光度达到稳定。用10ml洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH 4.2；wtProteinA-琼脂洗脱液为0.1M甘氨酸，pH3.5)洗脱IgG，收集洗脱液，并立刻加入1/10洗脱液体积的1M Tris(pH 8.5)使样品pH达到中性，得到纯化样品兔IgG。采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型，购自上海碧云天生物技术有限公司，产品编号P0006C)测定蛋白浓度，rProtein A-琼脂糖凝胶纯化样品中的蛋白浓度为5.5mg/ml，总量为55mg；wtProtein A-琼脂纯化样品的蛋白浓度为4.5mg/ml，总量为45mg。
取纯化样品10ul进行SDS-PAGE分析。
图5是本发明实施例的rProtein A-琼脂糖凝胶与wtProtein A-琼脂亲和纯化兔IgG的效果对比图。其中，图5中的a为rProtein A-琼脂糖凝胶的亲和纯化结果；图5中的b为wtProtein A-琼脂的亲和纯化结果。
由蛋白得率(55mg/10ml vs 45mg/10ml)和图5所示的纯化抗体纯度分析可知，本发明的rProtein A-琼脂糖凝胶可有效用于亲和层析纯化IgG，效果优于市购wtProtein A-琼脂。
以上是对实施例的详细描述，方便本领域的技术人员能正确理解和使用本发明。凡本领域的技术人员依据本发明在现有技术基础上，不经过创新性的劳动，仅通过分析、类推或有限列举等方法得到的改进或修改技术方案，都应该在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种高结合容量的耐碱重组Protein A，其特征在于，具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的高结合容量的耐碱重组Protein A，其特征在于，具有如SEQID NO:2所示的基因序列。
3.一种表达载体，其特征在于，含有如权利要求2所述的高结合容量的耐碱重组Protein A的基因序列。
4.一种表达菌株，其特征在于，含有如权利要求3所述的表达载体。
5.一种如权利要求1或2所述的高结合容量的耐碱重组Protein A的纯化方法，其特征在于，包括：诱导培养如权利要求4所述的表达菌株后，收集菌体，依次经亲和层析、离子交换层析、透析脱盐和超滤浓缩获得所述高结合容量的耐碱重组Protein A。
6.一种如权利要求1或2所述的高结合容量的耐碱重组Protein A的应用，其特征在于，所述高结合容量的耐碱重组Protein A用于抗体分离纯化和/或免疫球蛋白检测。
7.根据权利要求6所述的高结合容量的耐碱重组Protein A的应用，其特征在于，所述高结合容量的耐碱重组Protein A用于亲和层析介质中的配体和/或免疫球蛋白检测中的分子标记物。
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CN117327200A (zh) * 2023-11-28 2024-01-02 西宝生物科技（上海）股份有限公司 一种调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白gik及其制备方法
CN117327200B (zh) * 2023-11-28 2024-02-09 西宝生物科技（上海）股份有限公司 一种调控糖脂代谢和抗衰老的双功能重组蛋白gik及其制备方法

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