CN116338167A - 使用经掩蔽的半抗原在福尔马林固定的石蜡包埋的组织中的蛋白邻近测定法 - Google Patents

Abstract

本文中公开了经掩蔽的半抗原和经掩蔽的半抗原‑抗体缀合物，其可用于实现样品中位于彼此附近的靶标的检测。

Description

使用经掩蔽的半抗原在福尔马林固定的石蜡包埋的组织中的 蛋白邻近测定法

本申请是申请日为2017年8月25日，申请号为201780060757.1，发明名称为“使用经掩蔽的半抗原在福尔马林固定的石蜡包埋的组织中的蛋白邻近测定法”的发明专利申请的分案申请。

本申请要求2016年8月26日提交的国际申请号PCT/US2016/049153的提交日期的权益，该申请要求2016年2月29日提交的美国临时专利申请号62/301,489的权益和2015年8月28日提交的美国临时专利申请号62/211,590的提交日期的权益，它们的公开内容特此通过引用整体并入本文。

技术领域

所公开的实施方案涉及检测样本中的靶标，包括位于样品近侧的靶标。所公开的实施方案还提供了使用经掩蔽的半抗原(caged hapten)或经掩蔽的半抗原缀合物检测福尔马林固定的、石蜡包埋的组织中的蛋白二聚体的邻近测定法(proximity assay)。

工业适用性的声明

本公开内容在化学和诊断领域中具有工业适用性。

背景技术

免疫组织化学(IHC)表示使用对特定抗原具有特异性的抗体对生物样品中的抗原(诸如蛋白)进行检测、定位和/或定量的方法。IHC提供了确切地识别特定蛋白位于组织样品内何处的实质性优点。它也是检查组织本身的有效方式。原位杂交(ISH)表示检测、定位和定量核酸的方法。IHC和ISH两者均可在各种生物样品诸如组织(例如新鲜冷冻的、福尔马林固定的、石蜡包埋的组织)和细胞学样品上进行。靶标的识别可以使用各种标记(例如，产色的、荧光的、发光的、放射性测量的标记)来检测，而不管靶标是核酸还是抗原。为了在临床场合稳健地检测、定位和定量靶标，识别事件的扩增是合乎需要的，因为确信地检测低丰度细胞标志物的能力对于诊断目的而言变得越来越重要。例如，响应于单个抗原检测事件而在标志物位点沉积数百或数千个标记分子，会通过扩增而增强检测该识别事件的能力。

蛋白-蛋白相互作用的网络是生物系统的标志。蛋白-蛋白相互作用形成信号通路，其调节正常细胞和癌细胞的细胞功能的所有方面。已经开发了用于检测蛋白-蛋白相互作用的方法，诸如细胞外生长因子激活之后的瞬时型感受器酪氨酸激酶二聚化和复合物形成；但是，这些方法不是特别设计用于福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。

对于已知在癌症生物学中是重要决定因素的生物标志物而言，询问特定分子间相互作用的存在和分布的能力在新的诊断能力的背景下是高度感兴趣的并且用于确定在药物开发背景下的治疗效果。在冷冻和石蜡包埋的组织上探测和记录分子相互作用分布的能力仍然无法获得；已经提出了解决该问题的替代技术，尽管解决方案没有被证明在实际使用中是有效和可靠的。

OLink AB最近已经开发了邻近连接测定法。这是在福尔马林固定的石蜡包埋的组织上原位检测蛋白-蛋白相互作用的唯一已知商业产品。邻近连接测定技术使用DNA连接酶来产生挂锁环形DNA模板，以及用于滚环扩增的Phi29 DNA聚合酶。这些酶是昂贵的。而且，这些酶不适合与自动化系统和方法一起使用。因为这些原因，邻近连接测定法通常不被认为可用于商业应用。

发明内容

申请人已经开发了一种检测位于样品近侧的靶标的优良方法。在本公开内容的一个方面，是一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)形成第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物；(b)形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)使所述第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的经掩蔽的半抗原暴露，以形成第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；(d)使所述样品与第一检测试剂接触，以标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或所述第一靶标；和(e)检测所述经标记的第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。

在一些实施方案中，所述第一检测试剂包含(i)对所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体复合物的暴露的半抗原具有特异性的第二抗体，所述第二抗体缀合至第一酶，使得所述第二抗体用所述第一酶标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体复合物；和(ii)所述第一酶的第一底物。在一些实施方案中，所述第一底物是生色底物或荧光底物。在一些实施方案中，所述第一检测试剂包括扩增组分，以使用多个第一报告物部分标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物的暴露的酶。在一些实施方案中，所述多个第一报告物部分是半抗原。在一些实施方案中，所述第一检测试剂进一步包含对多个第一报告物部分具有特异性的第二抗体，每个第二抗体缀合至第二报告物部分。在一些实施方案中，所述第二报告物部分选自扩增酶或荧光团。在一些实施方案中，所述第二报告物部分是扩增酶并且其中所述第一检测试剂进一步包含所述扩增酶的第一生色底物或荧光底物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述样品与对所述第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物的暴露的酶具有特异性的第二底物接触和检测对应于所述第二底物与所述暴露的酶之间反应的产物的信号。

在本公开内容的另一个方面，是一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)形成第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物；(b)形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)使所述第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的经掩蔽的半抗原暴露，以形成第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；(d)执行信号放大步骤，以使用多个报告物部分标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；和(e)检测所述多个报告物部分。

在一些实施方案中，所述多个报告物部分是半抗原；并且其中所述方法进一步包括引入对所述多个第一报告物部分具有特异性的第二抗体，每个第二抗体缀合至第二报告物部分。在一些实施方案中，所述第二报告物部分是扩增酶并且其中所述方法进一步包括引入所述扩增酶的生色底物或荧光底物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所述样品中靶标的总量。

在本公开内容的另一个方面，是一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)形成第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物；(b)形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)执行脱掩蔽步骤，使得所述第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物的暴露的酶与所述第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物的酶底物部分反应，以形成第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；(d)使所述样品与第一检测试剂接触，以标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或所述第一靶标；和(e)检测所述经标记的第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。

在一些实施方案中，所述脱掩蔽步骤包括改变所述样品的温度。在一些实施方案中，所述脱掩蔽步骤包括改变所述样品的pH。在一些实施方案中，所述脱掩蔽步骤包括引入一个或多个洗涤步骤。在一些实施方案中，所述脱掩蔽步骤包括加入所述暴露的酶的辅因子。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所述样品中的靶标的总量。

在本公开内容的另一个方面，是一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与对所述第一靶标具有特异性的经掩蔽的半抗原-抗体缀合物接触，以形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(b)使所述样品与对所述第二靶标具有特异性的暴露的酶-抗体缀合物接触，以形成第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物，其中选择所述暴露的酶-抗体缀合物的暴露的酶，使得它能够与所述经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的酶底物部分反应以形成第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)使所述样品与第一检测试剂接触，以标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或所述第一靶标；和(d)检测所述经标记的第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标。

在一些实施方案中，所述经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的经掩蔽的半抗原部分衍生自选自以下的半抗原：DCC、生物素、硝基吡唑、噻唑磺酰胺、苯并呋咱和2-羟基喹喔啉。在一些实施方案中，所述暴露的酶-抗体缀合物的暴露的酶选自碱性磷酸酶、B-葡萄糖苷酶、B-半乳糖苷酶、B-葡糖醛酸糖苷酶、脂肪酶、硫酸酯酶、酰胺酶、蛋白酶、硝基还原酶、β-内酰胺酶、神经氨酸酶和尿素酶。在一些实施方案中，所述第一检测试剂包含(i)对所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体复合物的暴露的半抗原具有特异性的第二抗体，所述第二抗体缀合至第一酶，使得所述第二抗体用所述第一酶标记第一靶标-暴露的半抗原-抗体复合物；和(ii)第一生色底物或荧光底物。在一些实施方案中，所述第一酶不同于所述暴露的酶。在一些实施方案中，所述第一酶是过氧化物酶。在一些实施方案中，所述第一生色底物选自3,3’-二氨基联苯胺(DAB)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、HRP-Silver和酪胺-色原。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述样品与第二生色底物或荧光底物接触，所述第二生色底物或荧光底物对所述第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物的暴露的酶具有特异性，其中所述第一和第二生色底物是不同的。在一些实施方案中，所述第一检测试剂包括扩增向所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物引入的标记的量的组分。在一些实施方案中，所述第一靶标是PD-1或PD-L1中的一种，并且所述第二靶标是PD-1或PD-L1中的另一种。

在本公开内容的另一个方面，是一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与第一检测探针接触，所述第一检测探针包含经掩蔽的半抗原-抗体缀合物或暴露的酶-抗体缀合物中的一种；(b)使所述样品与第二检测探针接触，所述第二检测探针包含所述经掩蔽的半抗原-抗体缀合物或所述暴露的酶-抗体缀合物中的另一种；(c)使所述样品与至少第一检测试剂接触，以标记形成的暴露的半抗原-抗体缀合物靶标复合物；(d)检测来自所述标记的暴露的半抗原-抗体缀合物靶标复合物的信号。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所述样品内的靶标的总量。在一些实施方案中，所述第一检测试剂包括扩增组分，以使用多个第一报告物部分标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物的暴露的酶。在一些实施方案中，所述多个第一报告物部分是半抗原。在一些实施方案中，所述第一检测试剂进一步包含对所述多个第一报告物部分具有特异性的第二抗体，每个第二抗体缀合至第二报告物部分。在一些实施方案中，所述第二报告物部分选自扩增酶或荧光团。在一些实施方案中，所述第二报告物部分是扩增酶并且其中所述第一检测试剂进一步包含所述扩增酶的第一生色底物或荧光底物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括脱掩蔽步骤。

在本公开内容的另一个方面，是一种用于分析样品以确定第一靶标是否与第二靶标邻近的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与对所述第一靶标具有特异性的经掩蔽的半抗原-抗体缀合物接触，以形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(b)使所述样品与对所述第二靶标具有特异性的暴露的酶-抗体缀合物接触，以形成第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物，其中选择所述暴露的酶-抗体缀合物的暴露的酶，使得它能够与所述经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的酶底物部分反应以形成第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)使所述样品与第一标记缀合物接触，所述第一标记缀合物特异性地结合所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物，其中所述第一标记缀合物包含不同于所述暴露的酶的第一酶；(d)使所述样品与第一信号传递缀合物接触，所述第一信号传递缀合物包含第一潜在反应性部分和第一产色或荧光部分；和(e)检测来自所述第一产色或荧光部分的信号，所述第一信号指示邻近的第一和第二靶标。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述样品与第二信号传递缀合物接触，所述第二信号传递缀合物包含第二潜在反应性部分和第二产色或荧光部分，其中所述第一和第二产色或荧光部分提供不同的信号。在一些实施方案中，进一步包括检测来自第二产色部分的信号，所述来自第二产色或荧光部分的信号指示总蛋白。

在本公开内容的另一个方面，是具有式(I)的经掩蔽的半抗原：

其中

Y选自羰基反应性基团、胺反应性基团或巯基反应性基团；

X是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

A是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；且

'掩蔽基团'包含酶底物并且任选地包含离去基团，其中，在某些非限制性的实施方案中，所述离去基团部分可以包含被取代的或未被取代的5、6或7元芳族环或杂环。

在一些实施方案中，所述5、6或7元芳族环或杂环被选自以下的部分取代：卤素，具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)₂基团；和分支的或未分支的、被取代的或未被取代的具有1-4个碳原子的烷基。在一些实施方案中，所述掩蔽基团具有式(II)的结构：

其中

R¹独立地选自H、F、Cl、Br、I、-O-甲基、-O--乙基、-O-正丙基、-O--异丙基；-O-正丁基、-O-仲丁基或-O-异丁基；具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)₂基团；具有1-4个碳原子且任选地被N或S取代的烷基；氰基基团；和羧基基团；且

R²是酶底物、-烷基-酶底物或-O-烷基-酶底物。

在一些实施方案中，所述酶底物选自磷酸基团、酯基、酰胺基、硫酸基团、糖苷基团、脲基团和硝基。在一些实施方案中，所述掩蔽基团具有式(IIB)的结构：

且

其中R²选自磷酸基团、酯基、酰胺基、硫酸基团、糖苷基团、脲基团、-烷基-磷酸基团、-O-烷基-磷酸基团和硝基。在一些实施方案中，每个R¹基团是不同的。

在一些实施方案中，所述掩蔽基团具有式(IIC)的结构：

且

其中R²选自磷酸基团、酯基、酰胺基、硫酸基团、糖苷基团、脲基团、-烷基-磷酸基团、-O-烷基-磷酸基团和硝基。在一些实施方案中，每个R¹基团是不同的。

在一些实施方案中，所述掩蔽基团具有式(IID)的结构：

且

其中R²选自磷酸基团、酯基、酰胺基、硫酸基团、糖苷基团、脲基团、-烷基-磷酸基团、-O-烷基-磷酸基团和硝基。

在一些实施方案中，每个R¹基团是不同的。在一些实施方案中，X具有式(IIIA)的结构：

其中d和e是各自独立地在4-18范围内的整数；Q是键、O、S或N(R^c)(R^d)；R^a和R^b独立地是H、C₁-C₄烷基、F、Cl或N(^Rc)(R^d)；且R^c和R^d独立地是CH₃或H。在一些实施方案中，d和e是各自独立地在1-24范围内的整数。

在一些实施方案中，所述经掩蔽的半抗原选自：

在本公开内容的另一个方面，是以下物质的缀合物：(i)特异性结合实体，和(ii)经掩蔽的半抗原，包括本文中引用的经掩蔽的半抗原中的任一种。在一些实施方案中，所述经掩蔽的半抗原具有式(I)的结构：

其中

“半抗原”是半抗原；

Y选自羰基反应性基团、胺反应性基团或巯基反应性基团；

X是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

A是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；且

'掩蔽基团'包含酶底物并且任选地包含离去基团，其中所述离去基团部分包含被取代的或未被取代的5、6或7元芳族环或杂环。

在一些实施方案中，所述缀合物的特异性结合实体是抗体。在一些实施方案中，所述缀合物具有式(IV)的结构：

其中

“抗体”是抗体；

“半抗原”是半抗原；

Z是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子，

A是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

“掩蔽基团”是任选地被选自以下的部分取代的5、6或7元芳族环或杂环：卤素，具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)₂基团；和分支的或未分支的、被取代的或未被取代的具有1-4个碳原子的烷基。

q是0或1；且

n是在1-25范围内的整数。

在一些实施方案中，所述掩蔽基团具有式(II)的结构：

其中

R¹独立地选自H、F、Cl、Br、I、-O-甲基、-O--乙基、-O-正丙基、-O--异丙基；-O-正丁基、-O-仲丁基或-O-异丁基；具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)₂基团；具有1-4个碳原子且任选地被N或S取代的烷基；氰基基团；和羧基基团；且

R²是酶底物、-烷基-酶底物或-O-烷基-酶底物。

在一些实施方案中，所述酶底物选自磷酸基团、酯基、酰胺基、硫酸基团、糖苷基团、脲基团和硝基。

在一些实施方案中，所述掩蔽基团具有式(IIB)的结构：

且

其中R²选自磷酸基团、酯基、酰胺基、硫酸基团、糖苷基团、脲基团、-烷基-磷酸基团、-O-烷基-磷酸基团和硝基。在一些实施方案中，每个R¹基团是不同的。

在一些实施方案中，所述掩蔽基团具有式(IIC)的结构：

且

其中R²选自磷酸基团、酯基、酰胺基、硫酸基团、糖苷基团、脲基团、-烷基-磷酸基团、-O-烷基-磷酸基团和硝基。在一些实施方案中，R¹基团是不同的。

在一些实施方案中，所述掩蔽基团具有式(IID)的结构：

且

其中R²选自磷酸基团、酯基、酰胺基、硫酸基团、糖苷基团、脲基团、-烷基-磷酸基团、-O-烷基-磷酸基团和硝基。在一些实施方案中，每个R¹基团是不同的。

在一些实施方案中，所述抗体是第二抗体。在一些实施方案中，所述抗体是第一抗体。在一些实施方案中，所述第一抗体对选自以下的靶标具有特异性：PD-L1/CD80(B7-1)；CTLA-4/CD80(B7-1)；CTLA-4/CD86(B7-1)；PD-L2/PD-1；ErbB家族(Her1(EGFR)、Her2、Her3、Her4)的任意组合；DNA混合匹配修复蛋白(MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1和PMS2)的任意组合；翻译后修饰(PTM)-磷酸化的蛋白(将抗-磷酸酪氨酸/磷酸丝氨酸/磷酸苏氨酸/磷酸组氨酸抗体与对所关注的靶标具有特异性的任意抗体组合)；和PTM-泛素化的蛋白。

在本公开内容的另一个方面，是一种用于检测样品内的多个靶标的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与对所述第一靶标具有特异性的经掩蔽的半抗原-抗体缀合物接触，以形成第一靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物；(b)使所述样品与对所述第二靶标具有特异性的暴露的酶-抗体缀合物接触，以形成第二靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物，其中选择所述暴露的酶-抗体缀合物的暴露的酶，使得它能够与所述经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的酶底物部分反应以形成第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物；(c)使所述样品与第一检测试剂接触，以标记所述第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或所述第一靶标；(d)使所述样品与对第三靶标具有特异性的第一检测探针接触，以形成第三靶标-检测探针复合物；(e)使所述样品与第二检测试剂接触以标记所述第三靶标-检测探针复合物；(f)检测所述经标记的第一靶标-暴露的半抗原-抗体缀合物复合物或经标记的第一靶标；和(g)检测所述经标记的第三靶标-检测探针复合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所述样品内的总蛋白。在一些实施方案中，所述第一检测探针包含抗体。在一些实施方案中，所述第一检测探针包含核酸探针。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述样品与对第四靶标具有特异性的第二检测探针接触，以形成第四靶标-检测探针复合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在使所述样品与第二检测试剂接触之前灭活所述暴露的酶。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在使所述样品与探针接触以标记所述第三靶标和第二检测试剂之前灭活所述第一和第二靶标复合物。

在本公开内容的另一个方面，是具有式(IE)或(IF)的经掩蔽的半抗原化合物：

其中

“半抗原”是半抗原；

A是基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

Y选自羰基反应性基团、胺反应性基团或巯基反应性基团；

X是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

W是5、6或7元被取代的或未被取代的芳族环或杂环基团；

每个R¹独立地选自H、F、Cl、Br、I、-O-甲基、-O--乙基、-O-正丙基、-O--异丙基；-O-正丁基、-O-仲丁基或-O-异丁基；具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)₂基团；具有1-4个碳原子且任选地被N或S取代的烷基；氰基基团；和羧基基团；

V是键、被取代的或未被取代的具有1-4个碳原子的烷基、或被取代的或未被取代的-O-烷基；

R³是酶底物；

q是0或1；

s是0或在1-4范围内的整数；且

t是0或1。

在一些实施方案中，所述酶底物选自磷酸基团、酯基、酰胺基、硫酸基团、糖苷基团、脲基团和硝基。在一些实施方案中，所述酶底物是磷酸基团。

在一些实施方案中，每个R¹基团是不同的。

在一些实施方案中，X具有式(IIIA)的结构：

其中d和e是各自独立地在4-18范围内的整数；Q是键、O、S或N(R^c)(R^d)；R^a和R^b独立地是H、C₁-C₄烷基、F、Cl或N(^Rc)(R^d)；且R^c和R^d独立地是CH₃或H。在一些实施方案中，d和e是各自独立地在1-24范围内的整数。

在一些实施方案中，当V是被取代的-烷基或被取代的-O-烷基时，它被一个或多个吸电子基团取代。

在一些实施方案中，t是1且V是-CH₂-。

在一些实施方案中，t是1且V是-O-CH₂-。

在一些实施方案中，t是1且V是-C(R³)₂，其中R³是C₁-C₄烷基。

在一些实施方案中，t是1且V是-O-C(R³)₂，其中R³是C₁-C₄烷基。

在一些实施方案中，s是2，R¹是-O-CH₃-，t是1且V是-CH₂-。

附图说明

专利或申请文件至少含有一幅彩色绘制的图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在要求并支付必要的费用后提供给专利局(Office)。

图1A解释了暴露的半抗原的一个实施方案。

图1B解释了经掩蔽的半抗原的一个实施方案。

图1C解释了与半抗原偶联的掩蔽基团的结构。

图2是解释包含碱性磷酸酶的暴露的酶-抗体缀合物(结合至靶标2)与经掩蔽的半抗原-抗体缀合物(结合至靶标1)之间的相互作用的示意图，其中所述暴露的酶-抗体缀合物的暴露的酶与所述经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的酶底物部分反应(由于靶标1和靶标2相互邻近)以提供可被检测到的相应的暴露的半抗原。

图3是解释暴露的酶-抗体缀合物(结合至靶标2)和经掩蔽的半抗原-抗体缀合物(结合至靶标1)的示意图，其中两个靶标彼此不紧密邻近，使得所述暴露的酶-抗体缀合物的暴露的酶不与所述经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的酶底物部分相互作用，且因此所述经掩蔽的半抗原保持被掩蔽并且不能被检测到。

图4提供了解释检测样品中的蛋白二聚体和/或总蛋白的步骤的程序框图。

图5是解释IHC染色方案的一个实施方案的示意图，其中用cHQ标记的第二抗体检测单一抗原。

图6A是用cHQ标记且用AP处理的第二抗体检测前列腺组织上的PSA的图像。

图6B是用cHQ标记且没有AP处理的第二抗体(阴性对照)没有检测到前列腺组织上的PSA的另一图像。

图6C是用天然HQ标记的第二抗体检测前列腺组织上的PSA的另一图像。

图7A是用DAB染色测量的β-连环蛋白的总蛋白的图像。

图7B是用DAB染色测量的具有正邻近性的蛋白的图像。

图7C是用DAB染色测量的E-钙粘着蛋白的总蛋白的图像。

图8A是在FFPE扁桃体组织上用DAB染色测量的EGFR的总蛋白的图像。

图8B是在FFPE扁桃体组织上不存在DAB染色时测量的没有邻近性的共定位蛋白的图像。

图8C是在FFPE扁桃体组织上用DAB染色测量的E-钙粘着蛋白的总蛋白的图像。

图9A是在FFPE乳房组织上用DAB染色测量的具有邻近性的共定位蛋白的图像。

图9B是通过在FFPE乳房组织上不存在DAB染色时测量的没有邻近性的共定位蛋白的另一图像。

图10A是基于第二抗体上的经掩蔽的半抗原标记的数目的信号强度的图像。

图10B是基于第二抗体上的经掩蔽的半抗原标记的数目增加的信号强度增加的另一图像。

图11A是用HRP-Silver染色测量的邻近性信号检测的图像。

图11B是用HRP-Purple色原染色测量的邻近性信号检测的另一图像。

图12是解释紧密邻近的两种蛋白(靶标1和靶标2)和总蛋白(靶标2)的多路检测的示意图。

图13A是显示用HRP-DAB检测邻近蛋白的图像。

图13B是显示用HRP-Silver检测邻近蛋白和用AP-Yellow检测总蛋白的图像。

图14是显示用HRP-Purple检测邻近性信号和用AP-Yellow检测总蛋白的图像。

图15解释了经掩蔽的半抗原的结构，并指出了可与经掩蔽的半抗原的酶底物部分反应的特定酶。

图16提供了在FFPE非小细胞肺癌(NSCLC)病例中用HRP-Purple色原染色测量的PD-1和PD-L1蛋白的邻近性信号检测的图像(箭头＝PD-L1/PD-1邻近性信号)。

图17提供了用HRP-Purple色原染色测量的PD-1和PD-L1蛋白的邻近性信号检测的图像，以及FFPE扁桃体中用AP-Yellow检测的PD-1的总蛋白(箭头＝PD-L1/PD-1邻近性信号；虚线圆圈＝PD-1蛋白信号)。

图18提供了PD-1和PD-L1蛋白的邻近性信号检测的阴性对照的图像，其中在FFPE扁桃体中省略PD-1抗体并且未观察到信号。

图19提供了在FFPE扁桃体中用HRP-Purple色原染色测量的PD-1和PD-L1蛋白的邻近性信号检测和用AP-Yellow测量的CD8的多路染色图像(箭头＝PD-L1/PD-1邻近性信号；虚线圆圈＝CD8蛋白信号)。

图20A是用DAB染色测量的Her2的总蛋白的图像。

图20B是用DAB染色测量的具有正邻近性的Her2/Her3蛋白的图像。

图20C是用DAB染色测量的Her3的总蛋白的图像。

图21是解释包含碱性磷酸酶(结合至靶标2上的抗体堆)的暴露的酶-抗体缀合物和经掩蔽的半抗原-抗体缀合物(结合至靶标1上的抗体堆)之间的相互作用的示意图，其中所述暴露的酶-抗体缀合物的暴露的酶与所述经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的酶底物部分反应(由于靶标1和靶标2相互邻近)以提供可通过随后的扩增方案检测到的相应的暴露的半抗原。

图22A是使用式(IC)或(ID)的经掩蔽的半抗原用DAB染色测量的具有正邻近性的E-钙粘着蛋白和β-连环蛋白蛋白质的图像。

图22B是使用式(IE)或(IF)的经掩蔽的半抗原用DAB染色测量的具有正邻近性的E-钙粘着蛋白和β-连环蛋白蛋白质的图像，并显示与式(IC)或(ID)的经掩蔽的半抗原相同的特定信号程度。

图23是解释对照实验的示意图，所述对照实验研究所述抗体缀合物上的半抗原的掩蔽完整性。如果抗-半抗原缀合物209识别暴露的半抗原206，可能产生不希望的信号。当所有半抗原206都被掩蔽时，那么不会产生信号。

图24A是使用具有式(IC)或(ID)的经掩蔽的半抗原的抗体缀合物在FFPE SKBR3细胞系上的Her2蛋白的对照染色的图像。阳性信号指示所述抗体缀合物中的半抗原的不完全掩蔽。

图24B是使用具有式(IC)或(ID)的经掩蔽的半抗原的抗体缀合物在FFPE扁桃体组织上的λ蛋白的对照染色的图像。阳性信号指示所述抗体缀合物中的半抗原的不完全掩蔽。

图24C是使用具有式(IE)或(IF)的经掩蔽的半抗原的抗体缀合物在FFPE SKBR3细胞系上的Her2蛋白的对照染色的图像。阳性信号的不存在指示所述抗体缀合物中的半抗原的完全掩蔽。

图24D是使用具有式(IE)或(IF)的经掩蔽的半抗原的抗体缀合物在FFPE扁桃体组织上的λ蛋白的对照染色的图像。阳性信号的不存在指示所述抗体缀合物中的半抗原的完全掩蔽。

图25是解释各种经掩蔽的半抗原的稳定性的图，将稳定性显示为随时间(天数)的脱掩蔽百分比。

发明详述

本文中公开了经掩蔽的半抗原和它们的合成方法。本文中还公开了包含经掩蔽的半抗原的缀合物。如将在本文中更详细地描述的，所述经掩蔽的半抗原缀合物可以用于检测组织样品中的近侧抗原。本文描述了这些和其它实施方案。

定义

本文中使用的单数术语“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指出。类似地，除非上下文另外清楚地指出，词语“或”意图包括“和”。术语“包括”被包含性地定义，使得“包括A或B”意指包括A、B、或者A和B。

如本文在说明书中和在权利要求中使用的，“或”应当理解为具有与上面定义的“和/或”相同的含义。例如，当在列表中分隔项目时，“或”或“和/或”应当解释为包含性的，即，包括数字或要素列表中的至少一个，但是也包括超过一个，且任选地包括另外的未列出的项目。仅清楚地相反指出的术语，诸如“中的仅一个”或“中的刚好一个”，或者，当用在权利要求中时，“由……组成”，将表示包括数字或要素列表中的刚好一个要素。一般而言，当前面存在排它性术语诸如“任一个”、“之一”、“中的仅一个”或“中的刚好一个”时，本文中使用的术语“或”仅应当解释为指示排它替代物(即“一个或另一个，但是并非二者”)。当用在权利要求中时，“基本上由……组成”应当具有如在专利法领域中所用的它的普通含义。

术语“包含(comprising)”、“包括包括(including)”、“具有(having)”等互换使用且具有相同的含义。类似地，“包含(comprises)”、“包括(includes)”、“具有(has)”等互换使用且具有相同的含义。具体地，每个术语被定义为与“包含”的通用美国专利法定义一致，并且因此被解释为意指“至少以下”的开放术语，并且也不被解释为排除附加的特征、限制、方面等。因而，例如，“具有组分a、b和c的装置”意指该装置至少包括组分a、b和c。类似地，短语“包含步骤a、b和c的方法”意指所述方法至少包括步骤a、b和c。此外，尽管所述步骤和方法可以按照特定顺序在本申请中概述，但是熟练的技术人员会认识到，排序的步骤和方法可以变化。

如本文在说明书中和在权利要求中使用的，提到一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应当被理解为是指至少一个选自要素列表中的任意一个或多个要素的要素，但不一定包括在所述要素列表内明确地列出的每个和每一个要素中的至少一个，且不排除所述要素列表中的要素的任意组合。该定义也允许可以任选地存在除了在短语“至少一个”所提及的要素列表内明确地指出的要素以外的要素，无论与明确地指出的那些要素有关还是无关。因而，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或，等同地，“A或B中的至少一个”，或，等同地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以表示，至少一个(任选地包括超过一个)A，且不存在B(且任选地包括除了B以外的要素)；在另一个实施方案中，表示至少一个(任选地包括超过一个)B，且不存在A(且任选地包括除了A以外的要素)；在另一个实施方案中，表示至少一个(任选地包括超过一个)A，和至少一个(任选地包括超过一个)B(且任选地包括其它要素)；等。

本文中使用的碱性磷酸酶(AP)是这样的酶：其通过破坏磷酸-氧键并且暂时形成中间体酶-底物键而除去(通过水解)并转移磷酸基团有机酯。例如，AP将萘酚磷酸酯(底物)水解为酚类化合物和磷酸酯。所述酚与无色的重氮鎓盐(色原)偶联以生成不溶性的有色偶氮染料。

本文中使用的术语“烷基”表示包含完全饱和的(无双键或三键)烃基的直链或支链烃链。仅仅作为示例，所述烷基可以具有1-20个碳原子(每当它在本文中出现时，数字范围诸如“1-20”表示在给定范围内的每个整数；例如，“1-20个碳原子”意指所述烷基可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等(直到且包括20个碳原子)组成，尽管本定义也涵盖在没有指定数字范围的情况下术语“烷基”的出现)。如本文中进一步指出的，所述化合物的烷基可以被命名为“C₁-C₄烷基”或类似名称。仅仅作为示例，“C₁-C₄烷基”指示，在烷基链中存在1-4个碳原子，即，烷基链选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基包括，但是绝不限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。所述烷基可以是被取代的或未被取代的，如本文中定义的。

本文中使用的术语“抗体”(偶尔缩写为“Ab”)表示免疫球蛋白或免疫球蛋白-样分子，包括作为示例且不限于，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM、其组合以及在任何脊椎动物中(例如，在哺乳动物诸如人类、山羊、兔和小鼠中)在免疫应答期间产生的类似分子和特异性地结合感兴趣的分子(或高度类似的感兴趣的分子的集合)的抗体片段，从而基本上排除与其它分子的结合。抗体还指至少包含特异性地识别和结合抗原表位的轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体可以由重链和轻链组成，每个重链和轻链具有可变区，称为可变重(VH)区和可变轻(VL)区。VH区域和VL区域一起负责结合被抗体识别的抗原。术语抗体还包括完整的免疫球蛋白以及本领域众所周知的变体和部分。

本文中使用的短语“抗体缀合物”表示与一个或多个标记缀合(直接地或间接地)的那些抗体，其中所述抗体缀合物对特定靶标是特异性的，并且其中所述标记能够被检测到(直接地或间接地)，诸如用第二抗体(抗-标记抗体)检测。例如，抗体缀合物可以与半抗原偶联诸如通过聚合物接头和/或间隔物，并且可以借助于半抗原间接地检测抗体缀合物。作为一个替代实例，抗体缀合物可以与色原偶联，诸如通过聚合物接头和/或间隔物，并且可以直接检测抗体缀合物。抗体缀合物进一步描述在美国公开号2014/0147906和美国专利号8,658,389、8,686,122、8,618,265、8,846,320和8,445,191中。作为另一个实例，术语“抗体缀合物”包括与酶(例如HRP或AP)缀合的那些抗体。

本文中使用的术语“抗原”表示可以被特异性体液或细胞免疫的产物(诸如抗体分子或T-细胞受体)特异性地结合的化合物、组合物或物质。抗原可以是任何类型的分子，包括例如半抗原、简单的中间代谢物、糖(例如，寡糖)、脂质和激素以及大分子诸如复合糖(例如，多糖)、磷脂、核酸和蛋白。

本文中使用的术语“生物样品”可以是得自任何活生物体、由其排泄或由其分泌的任何固体或流体样品，所述生物体包括、但不限于，单细胞生物体(诸如细菌、酵母、原生动物和变形虫等)、多细胞生物体(诸如植物或动物，包括来自健康或表面上健康的人受试者或受到要诊断或调查的病症或疾病(诸如癌症)侵袭的人患者的样品)。例如，生物样品可以是得自例如血液、血浆、血清、尿液、胆汁、腹水、唾液、脑脊髓液、水性或玻璃体液的生物流体，或任何身体分泌物、漏出液、渗出物(例如得自脓肿或任何其它感染或炎症部位的流体)，或得自关节(例如，正常关节或受疾病侵袭的关节)的流体。生物样品也可以是得自任何器官或组织的样品(包括活组织检查或尸体剖检样本，诸如肿瘤活组织检查)，或者可以包括细胞(不管是原代细胞还是培养的细胞)或由任何细胞、组织或器官调理的培养基。在某些实施例中，生物样品是核提取物。在某些实施例中，样品是质量控制样品，诸如所公开的细胞沉淀部分样品之一。在其它实施例中，样品是试验样品。普通技术人员使用本领域已知的任意方法可以制备样品。样品可以得自进行常规筛查的受试者或疑似患有障碍诸如遗传异常、感染或瘤形成的受试者。所公开的方法的所述实施方案也可以应用于不具有遗传异常、疾病、障碍等的样品，被称作“正常”样品。样品可以包括可被一个或多个检测探针特异性地结合的多个靶标。

本文中使用的术语“生色团”表示对其颜色负责的分子或分子的一部分(例如生色底物)。当分子吸收可见光的某些波长并透射或反射其它光时，就会产生颜色。在可见光谱范围内的两个不同分子轨道之间具有能量差的分子可以吸收可见光，并因此适当地表征为生色团。在生色团上的入射可见光可以被吸收，从而将电子从基态分子轨道激发至激发态分子轨道。

本文中使用的术语“缀合物”表示共价地连接成较大构建体的两个或更多个分子或部分(包括大分子或超分子分子)。在一些实施方案中，缀合物包括与一个或多个其它分子部分共价地连接的一个或多个生物分子(诸如肽、蛋白、酶、糖、多糖、脂质、糖蛋白和脂蛋白)。

本文中使用的术语“偶联”表示将一个分子或原子与另一个分子或原子结合、键合(例如共价键合)或连接。

本文中使用的术语“可检测部分”表示可以产生可检测的(诸如在视觉上、电子地或其它方面)信号的分子或材料，所述信号指示样品中标记的存在(即定性分析)和/或浓度(即定量分析)。通过任何已知的或有待发现的机制(包括光子(包括无线电频率、微波频率、红外频率、可见频率和紫外频率光子)的吸收、发射和/或散射)，可以产生可检测信号。可检测部分的实例包括产色、荧光的、磷光的和发光的分子和材料。

本文中使用的术语“表位”表示抗原决定簇，诸如在分子上的具有抗原性(即引发特异性免疫应答)的连续或非连续肽序列。抗体结合特定的抗原表位。

本文中使用的辣根过氧化物酶(HRP)是可与经标记的分子缀合的酶。当与适当的底物一起温育时，它产生经标记的分子的有色的、荧光测量的或发光的衍生物，使其被检测和定量。HRP在有电子供体存在下起作用，首先形成酶底物复合物，并然后随后起氧化电子供体的作用。例如，HRP可以作用于3,3'-二氨基联苯胺盐酸盐(DAB)以产生可检测的颜色。HRP还可以作用于经标记的酪胺缀合物或酪胺样反应性缀合物(即阿魏酸盐、香豆酸、咖啡酸、肉桂酸盐、多巴胺等)以沉积用于酪胺信号放大(TSA)的有色或荧光或无色可检测部分。

本文中使用的术语“多路”、“多路化的”或“多路化”表示并行地、基本上同时地或依次地检测样品中的多种靶标。多路化可以包括单独地及以任何和全部组合鉴定和/或定量多种不同的核酸(例如，DNA、RNA、mRNA、miRNA)和多肽(例如，蛋白)。

本文中使用的术语“第一抗体”表示特异性地结合组织样品中的靶蛋白抗原的抗体。第一抗体通常是用在免疫组织化学程序中的第一抗体。

如本文中使用的，术语“第二抗体”在本文中表示这样的抗体：其特异性地结合第一抗体，由此形成第一抗体和后续试剂(例如标记、酶等，如果有的话)之间的桥。第二抗体通常是用在免疫组织化学程序中的第二抗体。

本文中使用的术语“特异性结合实体”表示特异性结合对的成员。特异性结合对是特征在于它们彼此结合以基本上排除与其它分子的结合的分子对(例如，特异性结合对可以具有比所述结合对的两个成员中的任一个与生物样品中的其它分子的结合常数大至少10³M^-1、10⁴M^-1或10⁵M^-1的结合常数)。特异性结合部分的具体实例包括特异性结合蛋白(例如，抗体、凝集素、抗生物素蛋白诸如抗生蛋白链菌素和蛋白A)。特异性结合部分还可以包括被这样的特异性结合蛋白特异性地结合的分子(或其部分)。

每当将基团或部分描述为“被取代的”或“任选地取代的”时，该基团可以是未被取代的或被指定取代基中的一个或多个取代。同样地，当将基团描述为“被取代的或未被取代的”时，如果被取代，所述取代基可以选自指定取代基中的一个或多个。如果没有指示取代基，它是指指示的“任选地被取代的”或“被取代的”基团可以被一个或多个单独地和独立地选自以下的基团取代：烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基、杂脂环基(heteroalicyclyl)、芳烷基、杂芳烷基、(杂脂环基)烷基、羟基、受保护的羟基、烷氧基、芳氧基、酰基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、氰基、氰酸盐、卤素、硫代羰基、O-氨基甲酰基、N-氨基甲酰基、O-硫氨基甲酰基、N-硫氨基甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、受保护的C-羧基、O-羧基、异氰酰、硫氰酰基、异硫氰酰基、硝基、甲硅烷基、次磺酰基、亚磺酰基、磺酰基、卤代烷基、卤代烷氧基、三卤甲磺酰基、三卤甲磺酰氨基、氨基、醚、氨基(例如单取代的氨基基团或二取代的氨基基团)和受保护的其衍生物。以上基团中的任一个可以包括一个或多个杂原子，包括O、N或S。例如，在一个部分被烷基取代的情况下，该烷基可以包含选自O、N或S的杂原子(例如-(CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂)-)。

本文中使用的术语“靶标”表示可以确定其存在、位置和/或浓度的任何分子。靶分子的实例包括蛋白、表位、核酸序列和半抗原，诸如与蛋白共价地键合的半抗原。通常使用特异性结合分子和可检测标记的一种或多种缀合物来检测靶分子。

本文中使用的术语“酪胺信号放大”或“TSA”表示一种酶介导的检测方法，其利用过氧化物酶(诸如辣根过氧化物酶)的催化活性原位产生靶分子(诸如蛋白或核酸序列)的高密度标记。TSA通常涉及三个基本步骤：(1)使特异性结合成员(例如抗体)结合至靶标，随后用第二过氧化物酶标记的特异性结合成员对特异性结合成员进行二次检测；(2)通过过氧化物酶活化经标记的酪胺衍生物(例如半抗原标记的酪胺)的多个拷贝；和(3)将所得高度反应性的酪胺残基共价偶联至邻近过氧化物酶-靶标相互作用位点的残基(例如蛋白酪氨酸残基的酚部分)，导致在靶标近端的半抗原的沉积(由扩散和反应性介导)。在TSA的一些实例中，涉及更多或更少的步骤；例如，可以依次重复TSA方法来增加信号。执行TSA的方法和用于执行TSA的商业试剂盒和试剂是可得到的(参见，例如，具有TSA^TM的AmpMap检测试剂盒，目录号760-121,Ventana Medical Systems,Tucson,Ariz.；Invitrogen；TSA试剂盒号T-20911，Invitrogen Corp,Carlsbad,Calif.)。可以替代地使用其它酶催化的、半抗原或信号传递连接的反应性物质，因为它们可能变得可用。

经掩蔽的半抗原

在本公开内容的一个方面是“经掩蔽的半抗原”，诸如图1B所示。如本领域技术人员将认识到的，半抗原是针对其已经产生抗-半抗原抗体的小分子。“经掩蔽的半抗原”是一种半抗原，其结构已经被修饰，使得合适的抗-半抗原抗体不再识别该分子并且不发生结合事件。实际上，半抗原的身份被“掩蔽”或“保护”。本文中公开的经掩蔽的半抗原已经设计成具有酶可切割的掩蔽基团，使得通过酶处理释放各自的半抗原(即未掩蔽的或暴露的半抗原)以再生天然半抗原(参见例如图2，其解释了经酶处理来暴露经掩蔽的半抗原)。因此，在有适当的酶存在下，经掩蔽的半抗原被暴露，并且抗-半抗原抗体自由地与其结合。

在一些实施方案中，本公开内容的经掩蔽的半抗原具有式(I)的结构：

其中

X是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

A是基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

Y是能够与另一个基团形成共价键的反应性基团；且

“半抗原”和“掩蔽基团”如本文中所述；且

q是0或1。

在一些实施方案中，半抗原包括、但不限于：吡唑类(例如硝基吡唑类)；硝基苯基化合物类；苯并呋咱类；三萜类；脲类(例如苯基脲类)；硫脲类(例如苯基硫脲类)；鱼藤酮和鱼藤酮衍生物类；噁唑类(例如噁唑磺酰胺类)；噻唑类(例如噻唑磺酰胺类)；香豆素和香豆素衍生物类；和环木酚素类。半抗原的另外的非限制性实例包括噻唑类；硝基芳基类；苯并呋喃类；三萜类；和环木酚素类。

半抗原的具体实例包括二硝基苯基、生物素、地高辛配基(digoxigenin)和荧光素及其任何衍生物或类似物。其它半抗原描述在美国专利号8,846,320、8,618,265、7,695,929、8,481,270、9,017,954和9,575,067中，其公开内容通过引用整体并入本文。

半抗原的其它非限制性实例包括二硝基苯酚、生物素和地高辛配基。另外的半抗原公开在美国专利号8,618,265和9575067内，它们描述了半抗原，包括吡唑类，特别是硝基吡唑类；硝基苯基化合物类；苯并呋咱类；三萜类；脲类和硫脲类，特别是苯基脲类，和甚至更特别是苯基硫脲类；鱼藤酮和鱼藤酮衍生物类，在本文中也被称作鱼藤酮类；噁唑和噻唑类，特别是噁唑和噻唑磺酰胺类；香豆素和香豆素衍生物类；环木酚素类，它们的公开内容特此通过引用整体并入本文。半抗原的再其它实例以及它们的制备和使用方法公开在美国专利号7,695,929中，其通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，所述酶底物部分偶联至离去基团部分，诸如在式(IA)的经掩蔽的半抗原半抗原化合物中。在一些实施方案中，所述掩蔽基团是包含2个共价地键合的组分的酶可切割部分，即(i)离去基团部分，和(ii)酶底物部分，如在式(IA)中所示。

其中Y、X、“半抗原”、A、q、“离去基团”和“酶底物”中的每一个如本文中定义。

在一些实施方案中，所述离去基团包含5、6或7元芳族环或杂环，其中所述环的任何位置可以是被取代的或未被取代的。在一些实施方案中，所述离去基团是被取代的或未被取代的5、6或7元杂环，所述杂环具有1、2或3个选自O、N或S的杂原子。在一些实施方案中，所述离去基团选自被取代的或未被取代的呋喃、吡咯、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、异噁唑、噻唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪、2H-吡喃、4H-吡喃、2H-噻喃、4H-噻喃、噁嗪或噻嗪。在一些实施方案中，所述5、6或7元芳族环或杂环被以下基团取代：卤素，具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)₂基团；或分支的或未分支的、被取代的或未被取代的具有1-4个碳原子的烷基，所述烷基本身可以包含一个或多个选自O、N或S的杂原子和/或其可以被一个或多个卤素取代。在一些实施方案中，所述离去基团可以被硝基、氰基基团或羧基基团取代。

在其它实施方案中，所述掩蔽基团包含酶底物，其直接地或间接地偶联至半抗原，如在式(IB)中：

其中Y、X、“半抗原”、A、q和“酶底物”中的每一个如本文中定义。

合适的酶底物(和对它们起作用的酶)的实例包括、但不限于：磷酸基团(被碱性磷酸酶作用)、酯基团(被脂肪酶作用)；硫酸基团(被硫酸酯酶作用)；糖苷基团(被糖基化酶作用)；酰胺基团(被酰胺酶或蛋白酶作用)；脲基团(被尿素酶作用)；和硝基基团(被硝基还原酶作用)。

在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(IC)或(ID)的结构：

Y-X-半抗原-R³ (ID)，

其中

“半抗原”是如本文中定义的；

Y选自羰基反应性基团、胺反应性基团或巯基反应性基团；

X是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

A是基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

W是5、6或7元被取代的或未被取代的芳族环或杂环基团；

每个R¹独立地选自H、F、Cl、Br、I、-O-甲基、-O--乙基、-O-正丙基、-O--异丙基；-O-正丁基、-O-仲丁基或-O-异丁基；具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)₂基团；具有1-4个碳原子且任选地被N或S取代的烷基；氰基基团；和羧基基团；

R³是酶底物；

q是0或1；且

s是0或在1-4范围内的整数；且

在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(IE)的结构：

其中

Y选自羰基反应性基团、胺反应性基团或巯基反应性基团；

X是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

A是基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

W是5、6或7元被取代的或未被取代的芳族环或杂环基团；

V是键、任选地被取代的具有1-4个碳原子的烷基或任选地被取代的-O-烷基；

每个R¹独立地选自H、F、Cl、Br、I、-O-甲基、-O--乙基、-O-正丙基、-O--异丙基；-O-正丁基、-O-仲丁基或-O-异丁基；具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)₂基团；具有1-4个碳原子且任选地被N或S取代的烷基；氰基基团；和羧基基团；

R³是酶底物；

“半抗原”是如本文中定义的；

q是0或1；

s是0或在1-4范围内的整数；且

t是0或1。

在一些实施方案中，t是1且V是-CH₂-。在其它实施方案中，t是1且V是-O-CH₂-。在其它实施方案中，t是1且V是-C(R³)₂，其中R³是C₁-C₄烷基。在其它实施方案中，t是1且V是-O-C(R³)₂，其中R³是C₁-C₄烷基。

在一些实施方案中，当V是被取代的-烷基或被取代的-O-烷基时，它被一个或多个吸电子基团取代。在一些实施方案中，所述吸电子基团是卤素、羰基(醛、酮、酯)、氰基基团或CF₃基团。

在一些实施方案中，s是2，R¹是-O-CH₃-，t是1且V是-CH₂-。在其它实施方案中。在一些实施方案中，s是2，R¹是-O-CH₃-，t是1且V是-O-CH₂-。在其它实施方案中，s是2，R¹是-O-CH₃，t是1且V是-C(R³)₂，其中R³是C₁-C₄烷基。在其它实施方案中，s是2，R¹是-O-CH₃，t是1且V是-O-C(R³)₂，其中R³是C₁-C₄烷基。

在一些实施方案中，式(I)的化合物具有式(IF)的结构：

其中

Y选自羰基反应性基团、胺反应性基团或巯基反应性基团；

X是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

V是键、被取代的或未被取代的具有1-4个碳原子的烷基、或被取代的或未被取代的-O-烷基；

R³是酶底物；

“半抗原”是如本文中定义的；

q是0或1；且

t是0或1。

在一些实施方案中，t是1且V是-CH₂-。在其它实施方案中，t是1且V是-O-CH₂-。在其它实施方案中，t是1且V是-C(R³)₂，其中R³是C₁-C₄烷基。在其它实施方案中，t是1且V是-O-C(R³)₂，其中R³是C₁-C₄烷基。

在一些实施方案中，当V是被取代的-烷基或被取代的-O-烷基时，它被一个或多个吸电子基团取代。在一些实施方案中，所述吸电子基团是卤素、羰基(醛、酮、酯)、氰基基团或CF₃基团。

在一些实施方案中，所述掩蔽基团具有式(II)的结构：

其中

每个R¹独立地选自H、F、Cl、Br、I、-O-甲基、-O--乙基、-O-正丙基、-O--异丙基；-O-正丁基、-O-仲丁基或-O-异丁基；具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)₂基团；具有1-4个碳原子且任选地被N或S取代的烷基；氰基基团；和羧基基团。

在一些实施方案中，R²是酶底物、-烷基-酶底物或-O-烷基-酶底物。

在一些实施方案中，每个R¹基团是相同的。在其它实施方案中，每个R¹基团是不同的(即每个R¹包含不同的部分)。例如，第一个R¹基团可以包含卤素，而第二个R¹可以包含烷基。

尽管式(II)描绘了包含6个碳原子的6元芳族环，但是熟练的技术人员会明白，一个或多个杂原子(例如O、N或S)可以被芳族环的一个或多个碳原子取代。

在一些实施方案中，任何离去基团的离去能力取决于半抗原的电子。在一些实施方案中，某些半抗原的电子需要供电子基团以鼓励离去基团能力。在其它实施方案中，所述半抗原需要吸电子基团。例如，取决于被掩蔽的官能团的pKa，一些半抗原需要在掩蔽基团的离去基团上添加供电子基团，而其它半抗原可能需要吸电子基团。不希望受任何特定理论约束，认为具有高pKa值的半抗原官能团倾向于需要供电子基团。这最可能是因为一旦离去基团被排除，在该位置的供电子基团能够通过感应或共振效应直接地稳定得到的离去基团的正电荷。这种情况的一个实例在掩蔽的HQ中见到，其中在没有供电子基团存在下，离去基团不会在没有过高的反应温度(约100℃)的情况下离去。另一方面，据信对于具有低pKa值的半抗原官能团，可能需要吸电子基团。这最可能是因为一旦离去基团被排除，得到的半抗原官能团上的负电荷具有如此高的稳定性，使得在离去基团上可能需要不稳定的电子力来帮助稳定经掩蔽的半抗原免于水解。据信吸电子基团可以使离去基团上的正电荷不稳定，从而使经掩蔽的半抗原对水解更稳定。

取代基R¹和R²可以位于沿着式(II)的环相对于将掩蔽基团偶联至半抗原的基团的任何位置。在一些实施方案中，R²位于将掩蔽基团偶联至半抗原的基团的对位，诸如在式(IIA)中所示：

在式(IIA)的化合物的其它实施方案中，取代基R¹可以独立地位于基团R²的邻位或间位。在一些实施方案中，式(IIA)的每个R¹基团是不同的，即每个R¹基团包含不同的部分。

在其它实施方案中，所述掩蔽基团具有式(IIB)的结构：

在一些实施方案中，式(IIB)的每个R¹基团是不同的，即每个R¹基团包含不同的部分。

在其它实施方案中，所述掩蔽基团具有式(IIC)的结构：

在一些实施方案中，式(IIC)的每个R¹基团是不同的，即每个R¹基团包含不同的部分。

在其它实施方案中，所述掩蔽基团具有式(IID)的结构：

在一些实施方案中，式(IID)的每个R¹基团是不同的，即每个R¹基团包含不同的部分。

不希望受任何特定理论约束，据信掩蔽基团的水解稳定性和离去基团能力当偶联至不同半抗原时可以是不同的。例如，具有安装在相对于磷酸的间位处的-OMe基团的掩蔽基团被认为会给2-羟基喹喔啉(HQ)半抗原提供稳定性和反应性的良好混合，但被认为比安装在硝基吡唑(NP)半抗原上时所期望的相对更不稳定。这通过以下方式弥补：使用具有安装在相对于磷酸基团的邻位的-OMe基团的掩蔽基团。再次不希望受任何特定理论约束，据信在HQ半抗原和掩蔽基团之间形成的O-苄基键比在NP和掩蔽基团之间形成的N-苄基键稳定得多。这类似地通过以下方式弥补：一旦磷酸被裂解，在HQ半抗原上引入在苄基邻位的-OMe基团来帮助“推动”电子穿过环并断开键。NP半抗原相对更不稳定，并且因此它不需要相同的“推动”。

再次不希望受任何特定理论约束，据信不具有-OMe基团的掩蔽基团可能需要非常高的温度来分解(disassemble)。但是，具有在磷酸邻位的-OMe基团的掩蔽基团可能需要适度的温度才能分解；而具有在磷酸基团间位的-OMe基团的掩蔽基团可能能够在室温分解。不希望受任何特定理论约束，据信可能通过向苄基位置添加一个或两个额外的脂族基团来增加稳定性，同时也增加反应性。据信这可以在空间上保护苄基免于水解，同时还在分解后产生更稳定的2°或3°苄基碳阳离子。

如本文中所指出的，酶与掩蔽基团的酶底物部分相互作用后，所述掩蔽基团经历电子变化，使得所述掩蔽基团与经掩蔽的半抗原分离，从而产生未掩蔽的半抗原或非掩蔽的半抗原。图2解释了在碱性磷酸酶与掩蔽基团的磷酸酶底物部分相互作用后在掩蔽的HQ半抗原内发生的电子变化。本领域普通技术人员会明白在其它经掩蔽的半抗原系统中发生类似的电子变化。

如上面所指出的，X可以是键；或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子。在一些实施方案中，X可以包含羰基、胺、酯、醚、酰胺、亚胺、硫酮或巯基基团。在其它实施方案中，X可以包含一个或多个选自胺、羰基、酯、醚、酰胺、亚胺、硫酮或巯基的末端基团。

在一些实施方案中，X具有式(IIIA)的结构：

其中d和e是各自独立地在4-18范围内的整数；Q是键、O、S或N(R^c)(R^d)；R^a和R^b独立地是H、C₁-C₄烷基、F、Cl或N(^Rc)(R^d)；且R^c和R^d独立地是CH₃或H。在一些实施方案中，d和e是各自独立地在1-24范围内的整数。

在其它实施方案中，所述X具有在式(IIIB)中描绘的结构：

其中d和e是各自独立地在1-24范围内的整数；Q是键、O、S或N(R^c)(R^d)；且R^c和R^d独立地是CH₃或H。在其它实施方案中，Q是O。

在其它实施方案中，所述'接头'具有在式(IIIC)中描绘的结构：

其中d和e是各自独立地在1-24范围内的整数。在一些实施方案中，d是2且e在2至24的范围内。

在其它实施方案中，X可以包括一个或多个环氧烷烃或PEG基团(例如PEG2至PEG24)。本领域普通技术人员会明白，随着氧原子的数目增加，化合物的亲水性也可能增加。

不希望受任何特定理论约束，据信接头长度可能影响邻近性信号。例如，制备并试验了包含PEG8、PEG4且不含PEG接头的经掩蔽的半抗原。接头的长度越长，我们在我们的E-cad和B-cat的对照二聚体系统上看到的信号就越多。虽然“更多的信号”似乎总是有用的，在该情况下，这不是因为我们在共同定位但已知不形成二聚体的蛋白标志物(Ki67和Bcl6)上试验时也观察到信号。我们发现不使用PEG接头会消除共定位的对照系统上的信号，同时仍然在已知的二聚体对照系统上提供一些信号。所以，一些经掩蔽的半抗原实施方案不包括PEG基团。

如本文中所指出的，A是基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子。在一些实施方案中，A具有式(IIID)的结构：

其中d和e是各自独立地在2-15范围内的整数；Q是键、O、S或N(R^c)(R^d)；R^a和R^b独立地是H、C₁-C₄烷基、F、Cl或N(^Rc)(R^d)；且R^c和R^d独立地是CH₃或H。在一些实施方案中，d和e是各自独立地在1-12范围内的整数。

在一些实施方案中，所述反应性基团Y是羰基反应性基团。合适的羰基反应性基团包括肼、肼衍生物和胺。在其它实施方案中，所述反应性基团Y是胺反应性基团。合适的胺反应性基团包括活性酯，诸如NHS或磺基-NHS、异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、氧杂环丙烷、碳酸酯、芳基卤化物、亚氨酸酯、酸酐等。在又一些实施方案中，所述反应性基团Y是巯基反应性基团。合适的巯基反应性基团包括不可聚合的Michael受体、卤代乙酰基(诸如碘代乙酰基)、烷基卤化物、马来酰亚胺、氮杂环丙烷、丙烯酰基、乙烯基砜、苯醌、可经历亲核取代的芳族基团诸如氟苯基团(诸如四氟苯和五氟苯基团)和二硫化物基团诸如吡啶基二硫化物基团和用Ellman试剂活化的巯基。

以下提供了经掩蔽的半抗原的具体实例，包括掩蔽的7-(二乙基氨基)香豆素-3-甲酸(DCC)、掩蔽的生物素、掩蔽的硝基吡唑、掩蔽的噻唑磺酰胺(TS)和掩蔽的苯并呋咱(BF)。以下每个经掩蔽的半抗原包含碱性磷酸酶的底物。

在图15中提供了经掩蔽的半抗原的其它实施例，包括作用于经掩蔽的半抗原的酶底物部分的特异性酶。

式(IE)或(IF)的经掩蔽的半抗原的非限制性实例包括：

经掩蔽的半抗原的合成

根据本领域普通技术人员已知的任何方法，可以合成经掩蔽的半抗原。例如，可以从经取代的4-羟基苯甲醛开始制备掩蔽基团。经取代的4-羟基苯甲醛的羟基可被磷酸基团取代，随后将醛还原并且通过Appel反应用卤素取代所得的苯甲醇。然后可以如下将掩蔽基团安装在感兴趣的半抗原上：在碱性条件下使卤素取代的掩蔽基团与半抗原反应(如果半抗原含有多个亲核基团，则可能需要保护化学以选择期望的掩蔽位置)。然后可以使用三甲基甲硅烷基溴使掩蔽基团的经保护的磷酸基团脱保护，随后使经掩蔽的半抗原与反应性基团(即马来酰亚胺)反应以促进与抗体的缀合。

“经掩蔽的HQ半抗原”的合成(参见图1B)示于实施例1和方案3。“经掩蔽的NP半抗原”的合成示于以下方案1。

方案1A:从被取代的4-羟基苯甲醛开始合成经掩蔽的NP半抗原.

合成材料和方法。在运行Empower 3(Waters)的Waters Acquity QDa(ESI)上收集MS数据。使用运行Empower 3(Waters)的Waters XBridge柱，在Waters Alliance e2695上执行分析型HPLC。用运行Empower 3(Waters)的Waters Sunfire柱(Prep C18 OBD 10μm50x250mm)，在Waters 2535上执行制备型HPLC。使用Biotage KP-Sil柱在Biotage IsoleraOne上执行制备色谱法。所有化学物质购自商业供应商并以接收状态使用，除非另外指出。

化合物4.将3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛(1,1.0当量)、碳酸钾(5.0当量)、和2(1.5当量)在DMF(2mL/mmol 1)中的溶液在油浴中在搅拌下加热至60℃保持4h(检查HPLC以证实反应>95％完成)。将反应混合物通过加入1M HCl进行淬灭并将有机层分离和收集。加入额外量的EtOAc并将有机物用1M HCl、饱和NaHCO₃和盐水萃取。将有机层经MgSO₄干燥，并将溶剂在减压下除去以得到作为浅棕色粘稠油的化合物3。将粗制物3溶解在THF(5mL/mmol1)中，随后加入NaBH₄(1.5当量)。将反应物在室温搅拌4h(检查HPLC以证实反应>95％完成)。将反应混合物用EtOAc稀释，随后缓慢地加入1M HCl直到冒泡停止。将有机层分离，随后用1M HCl、饱和NaHCO₃和盐水洗涤。将有机层经MgSO₄干燥并将溶剂在减压下除去以得到浅棕色粘稠油。将残余物溶解在CH₂Cl₂(5mL/mmol 1)中，随后在冰浴中在N₂气氛下冷却至0℃。然后缓慢地加入SOCl₂(2.5当量)，并将反应混合物温热至室温。然后将反应混合物在室温搅拌1h(检查HPLC以证实反应>95％完成)，随后通过加入饱和NaHCO₃进行淬灭。加入额外量的CH₂Cl₂，并将有机物用1M HCl、饱和NaHCO₃和盐水萃取。将有机层经MgSO₄干燥并将溶剂在减压下除去以得到作为浅棕色粘稠油的化合物4。C18H31ClO7P+的MS(ESI)m/z(M+H)+计算值为425.1，实测425.2。

化合物6.向5-硝基-3-吡唑羧酸(5,1.0当量)在DMF(16mL/mmol5)中的搅拌溶液中加入TEA(1.5当量)和DMAP(1.5当量)，随后加入N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(1.5当量)。在形成NHS酯后进行HPLC并加入额外的0.1当量N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯直到反应结束。然后加入N-Boc-乙二胺(1.5当量)并将反应混合物在室温搅拌15min。反应之后进行HPLC并加入额外的0.1当量N-boc-乙二胺直到反应结束。将反应混合物用EtOAc(16mL/mmol 5)稀释，随后缓慢地加入1MHCl(16mL/mmol 5)。将有机层分离，随后用1M HCl、饱和NaHCO₃和盐水洗涤。将有机层经MgSO₄干燥并将溶剂在减压下除去以得到作为白色固体的化合物6。C6H10N5O3+的MS(ESI)m/z(M+H-Boc)+计算值为200.1，实测200.1。

化合物7.向化合物6(1.0当量)、碳酸钠(5.0当量)和四丁基溴化铵(1.5当量)在CHCl₃(2mL/mmol 6)中的溶液中加入化合物4(1.5当量)。将反应容器密封并将反应混合物在油浴中在剧烈搅拌下加热至80℃保持4h(检查HPLC以证实反应>95％完成)。将反应物从油浴取下并冷却至室温。将反应混合物用EtOAc稀释，随后缓慢地加入1MHCl直到冒泡停止。将有机层分离，随后用1M HCl和盐水洗涤。将有机层经MgSO₄干燥并将溶剂在减压下除去以得到浅棕色粘稠油。将粗制的油通过快速色谱法(己烷：EA)纯化以得到作为浅棕色粘稠油的化合物7。C29H47N5O12P+的MS(ESI)m/z(M+H)+计算值为688.3，实测688.5。

化合物10.将化合物7溶解在CH₂Cl₂:TFA的9:1混合物中(5mL/mmol 7)，并将得到的反应混合物在室温搅拌30min(检查HPLC以证实反应>95％完成)。将反应混合物用甲苯稀释，随后在减压下除去溶剂。将残余物悬浮于DMF(2mL/mmol 7)中，随后加入三乙胺(5当量)并最后加入3-马来酰亚胺基丙酸NHS酯(9,1.1当量)。将反应容器密封并将反应混合物在室温剧烈搅拌4h(检查HPLC以证实反应结束)。然后将反应混合物用MeOH稀释并通过制备型RP-HPLC(0.05％TFA在H₂O:MeCN 99:1至5:95中，历时40min)直接纯化以得到作为浅黄色固体的化合物10。C23H₂8N6O13P+的MS(ESI)m/z(M+H)+计算值为627.1，实测627.3。

化合物11a-b.向化合物6(1.0当量)和碳酸钾(5.0当量)在CHCl₃(2mL/mmol 6)中的溶液中加入化合物2(1.5当量)。将反应容器密封并将反应混合物在油浴中在剧烈搅拌下加热至60℃保持4h(检查HPLC以证实反应>95％完成)。将反应物从油浴取下并冷却至室温。将反应混合物用EtOAc稀释，随后缓慢地加入1M HCl直到冒泡停止。将有机层分离，随后用1M HCl和盐水洗涤。将有机层经MgSO₄干燥并将溶剂在减压下除去以得到浅棕色粘稠油。将粗制的油通过快速色谱法(己烷：EA)纯化以得到作为浅棕色粘稠油的化合物11a和11b的1:1混合物。C15H₂9N5O7P+的MS(ESI)m/z(M-Boc+H)+计算值为422.2，实测422.3。

化合物13a-b.将化合物11a和11b(作为来自前一步的1:1混合物；1.0当量)溶解在CH₂Cl₂:TFA的9:1混合物中(5mL/mmol 11a和11b)，并将得到的反应混合物在室温搅拌30min(检查HPLC以证实反应>95％完成)。将反应混合物用甲苯稀释，随后在减压下除去溶剂。将残余物悬浮于DMF(2mL/mmol 7)，随后加入三乙胺(5当量)，并最后加入3-马来酰亚胺基丙酸NHS酯(9,1.1当量)。将反应容器密封并将反应混合物在室温剧烈搅拌4h(检查HPLC以证实反应结束)。然后将反应混合物用MeOH稀释，并通过制备型RP-HPLC(0.05％TFA在H₂O:MeCN 99:1至5:95中，历时40min)直接纯化以得到作为浅黄色固体的化合物13a和13b。C14H18N6O10P+的MS(ESI)m/z(M+H)+计算值为461.1，实测461.1。

方案1B:式(IE)或(IF)的化合物的合成.

经掩蔽的半抗原的缀合物

本公开内容提供了包含经掩蔽的半抗原的新颖缀合物。在一些实施方案中，所述经掩蔽的半抗原缀合至特异性结合实体，例如抗体或核酸探针。在其它实施方案中，所述经掩蔽的半抗原缀合至抗体，如在式(IV)中：

其中

“抗体”和“半抗原”是如本文中定义的；

A是基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

Q是0或1；

n是在1-25范围内的整数，且

Z是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子。在一些实施方案中，Z包含具有式(IIIA)、(IIIB)或(IIIC)中的任一个的结构的基团。

在一些实施方案中，n是在1-8范围内的整数。在其它实施方案中，n是在1-6范围内的整数。在其它实施方案中，n是在1-4范围内的整数。在其它实施方案中，n是在2-5范围内的整数。在其它实施方案中，n是3。在其它实施方案中，n是4。

在一些实施方案中，所述式(IV)的化合物具有化合物(IVA)或(IVB)中的任一个的结构：

其中

“抗体”是如本文中定义的，

“半抗原”是如本文中定义的；

A是基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

Z是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

W是5、6或7元被取代的或未被取代的芳族环或杂环基团；

每个R¹独立地选自H、F、Cl、Br、I、-O-甲基、-O--乙基、-O-正丙基、-O--异丙基；-O-正丁基、-O-仲丁基或-O-异丁基；具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)₂基团；具有1-4个碳原子且任选地被N或S取代的烷基；氰基基团；和羧基基团；

R³是酶底物；

n是在1-25范围内的整数；

q是0或1；且

s是0或在1-4范围内的整数。

在一些实施方案中，所述式(IV)的化合物具有式(IVC)或(IVD)的结构：

其中

“抗体”是如本文中定义的，

“半抗原”是如本文中定义的；

A是基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

W是5、6或7元被取代的或未被取代的芳族环或杂环基团；

Z是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子。

每个R¹独立地选自H、F、Cl、Br、I、-O-甲基、-O--乙基、-O-正丙基、-O--异丙基；-O-正丁基、-O-仲丁基或-O-异丁基；具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)₂基团；具有1-4个碳原子且任选地被N或S取代的烷基；氰基基团；和羧基基团；

V是键、被取代的或未被取代的具有1-4个碳原子的烷基、或被取代的或未被取代的-O-烷基；

R³是酶底物；

n是在1-25范围内的整数，且

q是0或1；

s是0或在1-4范围内的整数；且

t是0或1。

在一些实施方案中，当V是被取代的-烷基或被取代的-O-烷基时，它被一个或多个吸电子基团取代。

在一些实施方案中，所述经掩蔽的半抗原缀合至第一抗体(例如经掩蔽的半抗原缀合至对β-连环蛋白具有特异性的抗体)。在其它实施方案中，所述经掩蔽的半抗原缀合至第二抗体(例如经掩蔽的半抗原缀合至对抗-β-连环蛋白抗体具有特异性的抗体)。

所述经掩蔽的半抗原可以偶联至抗体的任何部分。适合用于共价修饰的抗体的3种官能团包括：(i)胺(-NH₂)，(ii)巯基基团(-SH)，和(iii)碳水化合物残基。这样，本文中公开的经掩蔽的半抗原中的任一种可以偶联至胺残基、巯基残基和碳水化合物残基或它们的任意组合。在一些实施方案中，所述经掩蔽的半抗原偶联至所述抗体的Fc部分。

经掩蔽的半抗原缀合物的合成

根据本领域普通技术人员已知的任何方式，可以合成本公开内容的缀合物。

在一些实施方案中，将经掩蔽的半抗原缀合至抗体的巯基。在一些实施方案中，通过用还原剂诸如二硫苏糖醇(DTT)或二硫赤藓醇(DTE)处理抗体，首先将巯基引入抗体。对于温和的还原剂诸如DTE或DTT，利用约1mM至约40mM之间的浓度(例如，约5mM至约30mM之间或约15mM至约25mM之间的浓度)向抗体引入有限数目的巯基(诸如约2个至约6个)，同时保持抗体完整(这可以通过尺寸排阻色谱法确定)。在用还原剂处理之后，引入过量的带有巯基反应性基团(例如马来酰亚胺基团)的经掩蔽的半抗原以形成各自的经掩蔽的半抗原-抗体缀合物。

在其它实施方案中，将经掩蔽的半抗原缀合至抗体的Fc部分。在一些实施方案中，首先将抗体的Fc部分氧化以形成醛，随后将经掩蔽的半抗原通过经掩蔽的半抗原上的反应性官能团(例如用羰基反应性基团，诸如酰肼基)偶联至抗体的经氧化的Fc部分。

在其它实施方案中，将经掩蔽的半抗原缀合至抗体的赖氨酸残基。如以下合成方案(方案2)所示，在一些实施方案中，首先用过量的Traut氏试剂(2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐)处理抗体，然后添加过量的适当地官能化的经掩蔽的半抗原(例如带有巯基反应性基团诸如马来酰亚胺基团的经掩蔽的半抗原)。

方案2:解释抗体(“Ab”)上的氨基基团与Traut氏试剂之间的反应、随后将得到的中间体与经掩蔽的HQ马来酰亚胺偶联的合成方法.

在合成后，可以将所述缀合物纯化，诸如通过尺寸排阻色谱法(SEC)，然后表征，诸如通过凝胶电泳和/或UV-Vis。

经掩蔽的半抗原抗体缀合物的检测

在一些实施方案中，利用检测试剂来检测经掩蔽的半抗原缀合物或经掩蔽的半抗原缀合物与靶标的复合物。在一些实施方案中，所采用的检测试剂对于与任何经掩蔽的半抗原-缀合物的经掩蔽的半抗原对应的相应的暴露的半抗原具有特异性。因而，术语“相应的暴露的半抗原”或“暴露的半抗原”表示已经用适当的暴露的酶(即可与经掩蔽的半抗原的酶底物部分反应的暴露的酶)“脱掩蔽”以显露“天然”半抗原的经掩蔽的半抗原。“脱掩蔽”或“去遮蔽”的步骤在本文中进一步描述，并至少描绘在图2中。如本文描述的，检测试剂还可以包括被设计用于增加信号的组分，例如信号放大组分或信号放大试剂盒。

在一些实施方案中，对暴露的半抗原具有特异性的检测试剂是对经掩蔽的半抗原缀合物的暴露的半抗原具有特异性的第二抗体，即抗-暴露的半抗原抗体，并且其自身缀合至可检测部分。“可检测部分”是可以产生可检测的(诸如在视觉上、电子地或其它的方面)信号的分子或材料，所述信号指示样品中经掩蔽的半抗原-抗体缀合物和/或暴露的酶-抗体缀合物的存在(即定性分析)和/或浓度(即定量分析)。通过任何已知的或有待发现的机制(包括光子(包括无线电频率、微波频率、红外频率、可见频率和紫外频率光子)的吸收、发射和/或散射)，可以产生可检测信号。

在一些实施方案中，抗-暴露的半抗原抗体的可检测部分包括产色的、荧光的、磷光的和发光的分子和材料，将一种物质转化成另一种物质以提供可检测差异(诸如通过将无色物质转化成有色物质或反之亦然，或通过产生沉淀物或增加样品浊度)的催化剂(诸如酶)，使用额外的可检测地标记的抗体缀合物通过抗体-半抗原结合相互作用可检测的半抗原，以及顺磁和磁性分子或材料。当然，可检测部分本身也可以被间接地检测到，例如如果可检测部分是半抗原，则对该可检测部分具有特异性的另一种抗体可以用于检测可检测部分，如本领域普通技术人员已知的。

在一些实施方案中，所述抗-暴露的半抗原抗体包括选自以下的可检测部分：Cascade Blue乙酰基叠氮化物；Dapoxyl磺酸/羧酸DY-405；Alexa Fluor 405CascadeYellow吡啶基噁唑琥珀酰亚胺基酯(PyMPO)；Pacific Blue DY-415；7-羟基香豆素-3-甲酸DYQ-425；6-FAM氨基亚磷酸酯；萤光黄；Alexa Fluor 430Dabcyl NBD氯化物/氟化物；QSY35DY-485XL；Cy2 DY-490；俄勒冈绿488Alexa Fluor 488BODIPY 493/503C3 DY-480XL；BODIPY FL C3 BODIPY FL C5 BODIPY FL-X DYQ-505；俄勒冈绿514DY-510XL；DY-481XL；6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(JOE)；DY-520XL；DY-521XL；BODIPY R6G C3赤藓红异硫氰酸酯；5-羧基-2',4',5',7'-四溴砜荧光素Alexa Fluor 5326-羧基-2',4,4',5'7,7'-六氯荧光素琥珀酰亚胺基酯(HEX)；BODIPY 530/550C3 DY-530；BODIPY TMR-X DY-555；DYQ-1；DY-556；Cy3 DY-547；DY-549；DY-550；Alexa Fluor555Alexa Fluor546DY-548；BODIPY 558/568C3若丹明红-X QSY 7BODIPY 564/570C3BODIPY 576/589C3羧基-X-罗丹明(ROX)；Alexa Fluor568DY-590；BODIPY 581/591C3 DY-591；BODIPY TR-X Alexa Fluor 594DY-594；羧基萘并荧光素DY-605；DY-610；AlexaFluor610DY-615；BODIPY 630/650-X羊毛罂红；Alexa Fluor 633Alexa Fluor 635琥珀酰亚胺基酯；DY-634；DY-630；DY-631；DY-632；DY-633；DYQ-2；DY-636；BODIPY 650/665-X DY-635；Cy5 Alexa Fluor647DY-647；DY-648；DY-650；DY-654；DY-652；DY-649；DY-651；DYQ-660；DYQ-661；Alexa Fluor 660Cy5.5 DY-677；DY-675；DY-676；DY-678；Alexa Fluor680DY-679；DY-680；DY-682；DY-681；DYQ-3；DYQ-700；Alexa Fluor 700DY-703；DY-701；DY-704；DY-700；DY-730；DY-731；DY-732；DY-734；DY-750；Cy7 DY-749；DYQ-4；和Cy7.5。

荧光团属于几种常见的化学类别，包括香豆素类、荧光素类(或荧光素衍生物和类似物)、若丹明类、试卤灵类、发光团类和花青类。荧光分子的其它实例可在MolecularProbes Handbook—A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,Molecular Probes,Eugene,OR,ThermoFisher Scientific,第11版中找到。在其它实施方案中，所述荧光团选自呫吨衍生物、花青衍生物、方酸菁衍生物、萘衍生物、香豆素衍生物、噁二唑衍生物、蒽衍生物、芘衍生物、噁嗪衍生物、吖啶衍生物、芳基次甲基衍生物和四吡咯衍生物。在其它实施方案中，所述荧光部分选自CF染料(可得自Biotium)、DRAQ和CyTRAK探针(可得自BioStatus)、BODIPY(可得自Invitrogen)、Alexa Fluor(可得自Invitrogen)、DyLight Fluor(例如DyLight 649)(可得自Thermo Scientific,Pierce)、Atto和Tracy(可得自Sigma Aldrich)、FluoProbes(可得自Interchim)、Abberior染料(可得自Abberior)、DY和MegaStokes染料(可得自Dyomics)、Sulfo Cy染料(可得自Cyandye)、HiLyte Fluor(可得自AnaSpec)、Seta、SeTau和Square染料(可得自SETA BioMedicals)、Quasar和Cal Fluor染料(可得自Biosearch Technologies)、SureLight染料(可得自APC、RPEPerCP、Phycobilisomes)(Columbia Biosciences)、和APC、APCXL、RPE、BPE(可得自Phyco-Biotech,Greensea、Prozyme、Flogen)。

在其它实施方案中，所述抗-暴露的半抗原抗体缀合至酶。在这些实施方案中，除了用于解除掩蔽的酶(例如暴露的酶-抗体缀合物的暴露的酶，如本文中进一步描述的)之外，可以用缀合至有关的抗-暴露的半抗原抗体的任何酶产生最终的邻近性信号。在一些实施方案中，合适的酶包括、但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、神经酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或β-内酰胺酶。在其它实施方案中，酶包括氧化还原酶或过氧化物酶(例如HRP)。在这些实施方案中，缀合至抗-暴露的半抗原抗体的酶催化生色底物、共价半抗原、共价荧光团、非共价色原和非共价荧光团向反应性部分的转化，所述反应性部分标记邻近靶标或直接在靶标上的样品。

生色化合物/底物的具体非限制性实例包括二氨基联苯胺(DAB)、4-硝基苯基磷酸酯(pNPP)、坚牢红、溴氯吲哚基磷酸酯(BCIP)、硝基四氮唑蓝(NBT)、BCIP/NBT、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2,2'-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸酯](ABTS)、邻联茴香胺、4-氯萘酚(4-CN)、硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、邻苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(X-Gal)、甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal)、对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、品红、碘硝基四氮唑(INT)、四氮唑蓝和四氮唑紫。DAB(其在有过氧化物酶和过氧化氢存在下被氧化)导致棕色的醇不溶性沉淀物在酶活性部位处的沉积。

在一些实施方案中，所述生色底物是包含潜在反应性部分和产色部分的信号传递缀合物。在一些实施方案中，所述信号传递缀合物的潜在反应性部分被构造成经历催化活化以形成可与样品或与其它检测组分共价地键合的反应性物质。催化活化由一种或多种酶(例如，氧化还原酶和过氧化物酶，如辣根过氧化物酶)驱动，并导致反应性物质的形成。这些反应性物质能够与邻近其发生的产色部分(即靠近酶)反应。信号传递缀合物的具体实例公开在美国专利公开号2013/0260379，其公开内容特此通过引用整体并入本文。

其它底物包括在美国专利号5,583,001、美国申请公开号2012/0171668和PCT/EP2015/0533556中阐述的底物，其公开内容特此通过引用整体并入本文。如以上并入的参考文献所述，偶联至TSA或QM缀合物的合适生色底物或荧光底物包括N,N'-双羧基戊基-5,5'-二磺酸基-吲哚-二羰花青(Cy5)、4-(二甲基氨基)偶氮苯-4'-磺酰胺(Dabsyl)、四甲基罗丹明(Tamra),和罗丹明110(罗丹明)。

在一些实施方案中，选择生色底物、荧光底物或信号传递缀合物，使得任何产色部分的峰可检测波长不彼此重叠并且易于被病理学家或光学检测器(例如扫描仪)检测到。在一些实施方案中，选择产色部分，使得不同产色部分的峰波长相隔至少约50nm。在其它实施方案中，选择产色部分，使得不同产色部分的峰波长相隔至少约70nm。在其它实施方案中，选择产色部分，使得不同产色部分的峰波长相隔至少约100nm。

在其它实施方案中，选择产色部分，使得当引入组织样本时，产色部分提供不同的颜色(例如黄色、蓝色、洋红色)。在一些实施方案中，选择产色部分，使得它们提供彼此之间的良好对比，例如光学可识别的颜色的分离。在一些实施方案中，选择产色部分，使得当彼此邻近放置时，提供与单独观察时产色部分中的任一个的信号或颜色不同的信号或颜色。

使用经掩蔽的半抗原缀合物的邻近检测

如将在本文中更详细地描述的，本公开内容使得能够检测彼此非常邻近的蛋白二聚体或蛋白。蛋白-蛋白相互作用的非限制性实例包括Her1/2/3/4蛋白中的任一种在彼此之间；PD-1与PD-L1；和/或PD-L2、EGFR(Her1)与它的相关配体(AREG、EREG)中的任一种。

不希望受任何特定理论约束，据信所公开的邻近测定法比仅测量蛋白-蛋白相互作用更普遍。实际上，所公开的测定法允许测量结合部分的邻近性。在实践中，结合部分(例如抗体)可以针对在它们之间具有微小距离或没有距离的靶标。这方面的实例可以包括信号传递事件如蛋白的磷酸化。在该情况下，如果一种抗体针对蛋白上的表位(例如HER2)，并且第二种抗体针对所有的磷酸-酪氨酸，则邻近性信号将代表所有磷酸化的HER2蛋白。这类测定比彼此相互作用的蛋白对更加二元化(是/否)。

在一些实施方案中，所述测定法能够检测具有5000nm或更小的邻近性的蛋白二聚体或蛋白。在其它实施方案中，所述测定法能够检测具有2500nm或更小的邻近性的蛋白二聚体或蛋白。在其它实施方案中，所述测定法能够检测具有1000nm或更小的邻近性的蛋白二聚体或蛋白。在其它实施方案中，所述测定法能够检测具有500nm或更小的邻近性的蛋白二聚体或蛋白。

熟练的技术人员会明白，经掩蔽的半抗原缀合物可以用于单一测定法(检测蛋白二聚体或蛋白邻近性)和多路测定法(检测蛋白二聚体或蛋白邻近性并检测总蛋白)。“总蛋白”表示任何给定蛋白的正常IHC可视化，而邻近性信号是参与给定相互作用的该蛋白的部分。例如，并且在PD-1/PD-L1测定的情况下，邻近性信号将仅可视化PD-1和PD-L1之间的相互作用，而总蛋白信号将使所述样品中的所有PD-1可视化。将邻近性评分表达为分子，并且将总蛋白评分表达为分母，或者可以给出参与相互作用的PD-1的分数或百分比。这对于检测干扰蛋白-蛋白相互作用的活性药物成分的诊断可能是重要的，其中蛋白的表达不如相互作用蛋白的数量重要。如上所述，这被认为适用于磷酸化，其中不是仅仅接受磷酸化信号的任意评分，而是可以能够定量多少百分比的给定蛋白被磷酸化。

参考图4，蛋白二聚体的检测发生在两个一般阶段。在第一阶段中，在步骤150处用抗体缀合物标记样品。在第二阶段中，在步骤160处使所述样品与第一检测试剂和任选的第二检测试剂接触。

在一些实施方案中，首先在步骤100处使样品与对靶标具有特异性的暴露的酶-抗体缀合物接触，以形成靶标-暴露的酶-抗体缀合物复合物。随后，在步骤110处使样品与经掩蔽的半抗原-抗体缀合物(诸如式(III)的那些，且对另一靶标具有特异性)接触，以形成靶标-经掩蔽的半抗原-抗体缀合物复合物。熟练的技术人员将会理解，选择可与经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的酶底物部分反应的暴露的酶。熟练的技术人员还会明白，步骤100和110可以以任何顺序进行或可以同时进行。在一些实施方案中，在引入经掩蔽的半抗原-抗体缀合物之前或同时也引入可逆的酶抑制剂。例如，在一些实施方案中，所述经掩蔽的半抗原-抗体缀合物可以用磷酸盐缓冲液配制。

如本文中所指出的，所述经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的经掩蔽的半抗原部分能够变得不被掩蔽以提供相应的暴露的半抗原，即天然半抗原。如图2所示，如果第一靶标101与第二靶标102充分邻近，则经掩蔽的半抗原-抗体缀合物103A将被提供在暴露的酶-抗体缀合物104邻近处(邻近处被标记为105)，使得暴露的酶-抗体缀合物104的暴露的酶可以与经掩蔽的半抗原-抗体缀合物103A的酶底物反应。这又导致第一靶标暴露的半抗原-抗体缀合物复合物(103B)的形成。如图2所示，第一靶标暴露的半抗原-抗体缀合物复合物(103B)能够结合其它特异性结合实体(例如第二抗体106)或被其识别。

在一些实施方案中，所述方法还包括一个或多个“脱掩蔽步骤”，其中改变载玻片上的条件以增强酶活性。在所述测定的抗体缀合物结合部分期间，当缀合物过量时，采取步骤以防止经掩蔽的半抗原的偶然“脱掩蔽”，这会导致假阳性结果。这些步骤包括添加可逆的酶抑制剂(例如防止酶对掩蔽基团的作用)。例如，在碱性磷酸酶(AP)的情况下，这些抑制剂可以包括磷酸盐、苯丙氨酸和EDTA，其据信能够通过不同的机制降低酶活性。在一些实施方案中，通过洗涤除去未结合的抗体缀合物，然后有必要改变载玻片上的条件以有利于最佳的酶活性从而允许“脱掩蔽”发生。每种脱掩蔽的酶都具有它自己的最佳条件(缓冲剂、盐、辅因子、温度)。选择这些“脱掩蔽步骤”以增强所述酶的活性并促进“脱掩蔽”，而不干扰抗体缀合物的特异性结合，所述“脱掩蔽步骤”包括以下中任一个：洗涤步骤，改变在载玻片上存在的溶液或试剂的pH、添加辅因子或改变温度(例如在约37℃至约50℃范围内的温度)的步骤。例如，并且在AP的情况下，使用洗液除去残留的抑制剂(例如磷酸盐)，还使用缓冲剂增加活性(例如Tris，以调节pH至大于约8)，并添加辅因子(例如镁)。在一些实施方案中，这些条件中的每一个都在整个测定的背景下进行优化，例如通过添加浓度在1mM至1M范围内的镁离子而增强AP的活性。但是，在大于100mM的镁离子浓度，抗体结合受到影响，所以这会限制可添加的量。可优化步骤的另一个实例是“脱掩蔽”步骤的温度。酶促步骤之后的“脱掩蔽”事件由热力学驱动，并且可以通过加热来加速。但是，大于60℃的温度可以不利地影响酶活性和抗体缀合物结合。

另一方面，且如图3所示，如果第一靶标101不充分邻近第二靶标102，则经掩蔽的半抗原-抗体缀合物103A不会被提供在暴露的酶-抗体缀合物104邻近处(邻近处被标记为108)。在该情况下，暴露的酶不会与经掩蔽的半抗原-抗体缀合物103A的酶底物反应，且因此经掩蔽的半抗原将保持在被掩蔽或受保护的状态，即不能结合其它特异性结合实体或被其识别。

参考图2、4和12，在一些实施方案中，然后在步骤120处使样品与第一检测试剂(106)接触，所述第一检测试剂对第一靶标暴露的半抗原-抗体缀合物复合物的暴露的半抗原(103B)具有特异性。在一些实施方案中，所述第一检测试剂包括对暴露的半抗原(103B)具有特异性的第二抗体(106)，即抗-暴露的半抗原抗体。在一些实施方案中，所述抗-暴露的半抗原抗体(106)缀合至可检测部分(例如在图2和12中，所述可检测部分是HRP酶，其中所述HRP酶作用于底物，诸如银生色底物(111))。熟练的技术人员当然会明白，第一检测试剂(106)仅在第一靶标暴露的半抗原-抗体缀合物复合物的天然或暴露的半抗原(103B)被暴露的酶-抗体缀合物(104)的暴露的酶显露时才结合。因此，仅在第一靶标和第二靶标(101和102)以及因此抗体缀合物(103A和104)彼此紧密邻近时，在步骤140处才能够检测到来自第一检测试剂(106)的可检测部分的信号(107)。在这里，检测到的信号(107)代表紧密邻近的蛋白二聚体或蛋白/靶标。

在一些实施方案中，可以进行扩增步骤以增加可检测信号。例如，可以引入扩增组分来用额外的报告物部分(例如额外的半抗原或其它“可检测部分”)进一步标记第一靶标暴露的半抗原-抗体缀合物的暴露的半抗原。举例而言，可以引入缀合至扩增半抗原(或在其它实施方案中，缀合至酶)的抗-暴露的半抗原抗体以用多个扩增半抗原标记第一靶标暴露的半抗原-抗体缀合物的暴露的半抗原。随后，可以引入抗-扩增半抗原抗体，其各自缀合至可检测部分。在一些实施方案中，所述抗-扩增半抗原抗体缀合至酶，其中所述酶作用于引入的底物以产生信号(例如生色底物或荧光底物以产生视觉信号)。本文描述的每种TSA和QM缀合物可以用于任何扩增步骤。在某些实施例中，使用OPTIVIEW扩增试剂盒(VentanaMedical Systems,Inc.,Tucson,Ariz.,目录号760-099)实现信号放大。

熟练的技术人员会明白，所述暴露的酶-抗体缀合物的暴露的酶可以起两种功能，即(i)暴露或显露经掩蔽的半抗原；和(ii)与另一种底物(例如生色底物或荧光底物)反应，使得可以检测到与暴露的半抗原(即暴露的半抗原-抗体缀合物复合物)所产生的信号无关的信号。因此，本文公开的系统允许两种蛋白之间的邻近性在针对所述蛋白之一的总蛋白染色的背景下可视化。不希望受任何特定理论约束，据信在另一种蛋白染色的背景下多路化邻近检测的能力是允许具有快速的、引导的载玻片读出的可能性的特征(即，仅查找总蛋白内的邻近性信号)或定量与另一种蛋白相互作用的蛋白的百分比的能力(对邻近性测定评分的方法)。

再次参考图2、4和12，在引入第一检测试剂(106)之后，可以任选地在步骤130处向所述样品引入第二检测试剂，包括第二可检测部分(109)，使得可以检测总蛋白。在一些实施方案中，所述第二可检测部分提供不同于第一可检测部分(107)的信号(112)。在一些实施方案中，所述第二可检测部分包含暴露的酶的底物，例如提供黄色信号(109)的生色底物。在其它实施方案中，所述第二可检测部分包含信号传递缀合物。熟练的技术人员还会明白，步骤120和130可以以任何顺序进行或可以同时进行。

在一些实施方案中，用酶灭活组合物预处理生物样品以使内源性过氧化物酶活性基本上或完全灭活。例如，一些细胞或组织含有内源性过氧化物酶。使用HRP缀合的抗体可以导致高的非特异性的背景染色。通过用本文中公开的酶灭活组合物对样品进行预处理，可减少这种非特异性背景。在一些实施方案中，仅用过氧化氢预处理样品(约1％至约3重量％的适当的预处理溶液)以降低内源性过氧化物酶活性。一旦内源性过氧化物酶活性已经被降低或灭活，可以添加检测试剂盒，随后灭活存在于检测试剂盒中的酶，如上面提供的。公开的酶灭活组合物和方法还可以用作将内源性酶过氧化物酶活性灭活的方法。

在一些实施方案中，如果样本是包埋于石蜡中的样品，那么可以使用适当的脱石蜡流体将样品脱石蜡。在废物除去器除去脱石蜡流体后，可以将任何数量的物质接连地应用于样本。所述物质可以用于预处理(例如蛋白交联、暴露核酸等)、变性、杂交、洗涤(例如严谨洗涤)、检测(例如使视觉或标志物分子与探针连接)、扩增(例如扩增蛋白、基因等)、复染色、盖玻片等。

自动化

本公开内容的测定和方法可以是自动化的并且可以与样本处理设备组合。样本处理设备可以是自动化设备，诸如由Ventana Medical Systems,Inc.销售的BENCHMARK XT器械和SYMPHONY器械。Ventana Medical Systems,Inc.是许多公开了用于进行自动化分析的系统和方法的美国专利的受让方，包括美国专利号5,650,327,5,654,200,6,296,809,6,352,861,6,827,901和6,943,029和美国公开的专利申请号20030211630和20040052685，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。可替换地，可以手工地处理样本。

样本处理设备可以将固定剂应用于样本。固定剂可以包括交联剂(诸如醛，例如甲醛、低聚甲醛和戊二醛，以及非醛交联剂)、氧化剂(例如金属离子和复合物，诸如四氧化锇和铬酸)、蛋白变性剂(例如乙酸、甲醇和乙醇)、未知机制的固定剂(例如氯化汞、丙酮和苦味酸)、组合试剂(例如Carnoy氏固定剂、methacarn、Bouin氏流体、B5固定剂、Rossman氏流体和Gendre氏流体)、微波和其它固定剂(例如排除体积固定和蒸气固定)。

如果样本是包埋于石蜡中的样品，可以使用适当的脱石蜡流体用样本处理设备将样品脱石蜡。在废物除去器除去脱石蜡流体后，可以将任何数量的物质接连地应用于样本。所述物质可以用于预处理(例如蛋白交联、暴露核酸等)、变性、杂交、洗涤(例如严谨洗涤)、检测(例如使视觉或标志物分子与探针连接)、扩增(例如扩增蛋白、基因等)、复染色、盖玻片等。

样本处理设备可以将宽范围的物质应用于样本。所述物质包括、但不限于染色剂、探针、试剂、漂洗剂和/或调理剂。所述物质可以是流体(例如，气体、液体或气体/液体混合物)等。所述流体可以是溶剂(例如，极性溶剂、非极性溶剂等)、溶液(例如，水溶液或其它类型的溶液)等。试剂可以包括、但不限于染色剂、润湿剂、抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体等)、抗原回收流体(例如水基或非水基抗原修复溶液、抗原回收缓冲液等)等。探针可以是分离的核酸或分离的合成寡核苷酸，其连接至可检测标记物。标记可以包括放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光剂或荧光剂、半抗原和酶。

在处理样本之后，用户可以将带有样本的载玻片运输至成像仪。这里使用的成像仪是亮视野成像仪载玻片扫描仪。一个亮视野成像仪是由Ventana Medical Systems,Inc.销售的iScan Coreo^TM亮视野扫描仪。在自动化的实施方案中，所述成像仪是在标题为“IMAGING SYSTEM AND TECHNIQUES”的国际专利申请号PCT/US2010/002772(专利公开号:WO/2011/049608)中所公开的或在2014年2月3日提交的标题为“IMAGING SYSTEMS,CASSETTES,AND METHODS OF USING THE SAME”美国专利申请公开号2014/0178169中所公开的数字病理学装置。国际专利申请号PCT/US2010/002772和美国专利申请公开号2014/0178169通过引用整体并入。在其它实施方案中，所述成像仪包括与显微镜偶联的数字照相机。

复染色

复染色是在样品已经被染色剂染色以检测一个或多个靶标后对样品进行后处理使得其结构在显微镜下更容易可视化的方法。例如，在盖玻片之前任选地使用复染色剂以使免疫组织化学染色更明显。复染剂与原染色剂在颜色上不同。许多复染剂是众所周知的，诸如苏木精、曙红、甲基绿、亚甲蓝、吉姆萨、阿辛蓝和核坚牢红。DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)是可以使用的荧光染料。

在一些实施例中，可以将超过一种染色剂混合在一起以产生复染剂。这提供了灵活性和选择染色剂的能力。例如，可以为具有特定属性但不具有不同期望属性的混合物选择第一染色剂。可以将第二染色剂加入表现出缺少的期望属性的混合物。例如，可以将甲苯胺蓝、DAPI和滂胺天蓝混合在一起以形成复染剂。

检测和/或成像

所公开的实施方案的某些方面或全部可以是自动化的，并且由计算机分析和/或图像分析系统促进。在一些应用中，测量精确的颜色或荧光比率。在一些实施方案中，利用光学显微术进行图像分析。某些公开的实施方案涉及获取数字图像。这可以通过使数字照相机与显微镜偶联来完成。使用图像分析软件分析获得的染色样品的数字图像。可以以几种不同的方式测量颜色或荧光。例如，可以将颜色测量为红色、蓝色和绿色值；色调、饱和度和强度值；和/或通过使用光谱成像照相机测量特定波长或波长范围。也可以定性地和半定量地评价样品。定性评估包括评估染色强度、鉴定阳性染色的细胞和在染色中涉及的细胞内区室，和评价总体样品或载玻片质量。对试验样品进行单独的评价，并且该分析可以包括与已知平均值的对比以确定样品是否表现出异常状态。

试剂盒

在一些实施方案中，本公开内容的经掩蔽的半抗原缀合物可以用作“检测试剂盒”的一部分。一般而言，任何检测试剂盒可以包括一种或多种经掩蔽的半抗原缀合物和用于检测一种或多种经掩蔽的半抗原缀合物的检测试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒包含式(IVC)或(IVD)中的任一个的经掩蔽的半抗原缀合物。

所述检测试剂盒可以包括含有经掩蔽的半抗原缀合物的第一组合物和含有对所述第一组合物具有特异性的检测试剂的第二组合物，使得经由所述检测试剂盒可以检测经掩蔽的半抗原缀合物。在一些实施方案中，所述检测试剂盒包括多个经掩蔽的半抗原缀合物(诸如在缓冲液中混合在一起)，其中所述检测试剂盒还包括对多种经掩蔽的半抗原缀合物中的每一种具有特异性的检测试剂。

当然，根据手工或自动化靶标检测的需要，任意试剂盒可以包括其它试剂，包括缓冲剂；复染剂；酶灭活组合物；脱石蜡溶液等。所述试剂盒还可以包括关于使用试剂盒的任何组分的说明书，包括将试剂盒组分应用于组织样品以实现其中一种或多种靶标的检测的方法。

样品和靶标

样品包括生物组分，并且通常被怀疑包括一种或多种感兴趣的靶分子。靶分子可以是在细胞的表面上，并且所述细胞可以是在混悬液中，或在组织切片中。靶分子还可以是细胞内的，并且在细胞裂解或探针穿透细胞后被检测到。本领域普通技术人员会明白，检测样品中的靶分子的方法将随所使用的样品和探针的类型而变化。收集和制备样品的方法是本领域已知的。

使用普通技术人员在本领域中已知的任何方法，可以制备用于用在本文公开的方法的实施方案中和与本文公开的组合物一起使用的样品，诸如组织或其它生物样品。所述样品可以得自常规筛查的受试者或疑似患有诸如遗传异常、感染或瘤形成等障碍的受试者。所公开的方法的所述实施方案还可以应用于不具有遗传异常、疾病、障碍等的样品，其被称作“正常”样品。除了别的以外，这样的正常样品可用作与其它样品对比的对照。可以为了许多不同目的而分析样品。例如，所述样品可以用在科学研究中或用于疑似疾病的诊断，或用作治疗成功、存活等的预后指标。

样品可以包括可被探针或报告分子特异性地结合的多个靶标。所述靶标可以是核酸序列或蛋白。贯穿本公开内容，当提及靶蛋白时，应当理解，与该蛋白相关的核酸序列也可以用作靶标。在一些实施例中，所述靶标是来自病原体诸如病毒、细菌或细胞内寄生虫的蛋白或核酸分子，诸如来自病毒基因组。例如，可以从与疾病有关(例如与其相关、有因果牵连等)的靶核酸序列产生靶蛋白。

靶核酸序列可以在大小上变化很大。不受限制，核酸序列可以具有可变数目的核酸残基。例如，靶核酸序列可以具有至少约10个核酸残基，或至少约20、30、50、100、150、500、1000个残基。类似地，靶多肽可以在大小上变化很大。不受限制，靶多肽将包括至少一个结合肽特异性抗体或其片段的表位。在一些实施方案中，该多肽可以包括至少两个结合肽特异性抗体或其片段的表位。

在具体的非限制性实例中，靶蛋白由与肿瘤(例如癌症)相关的靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生。在赘生性细胞中，尤其是在癌细胞(诸如B细胞和T细胞白血病、淋巴瘤、乳腺癌、结肠癌、神经癌等)中，已经鉴定了许多染色体异常(包括易位和其它重排、扩增或缺失)。因此，在一些实施例中，靶分子的至少一部分由在样品中细胞的至少一个亚群中扩增或缺失的核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生。

已知癌基因负责几种人恶性肿瘤。例如，涉及位于染色体18q11.2的断点区域的SYT基因的染色体重排是在滑膜肉瘤软组织肿瘤中常见的。可以鉴定t(18q11.2)易位，例如，使用具有不同标记的探针：第一探针包括由从SYT基因向远侧延伸的靶核酸序列产生的FPC核酸分子，并且第二探针包括从SYT基因3′或近侧延伸的靶核酸序列产生的FPC核酸。当在原位杂交程序中使用与这些靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)对应的探针时，在SYT基因区域中缺乏t(18q11.2)的正常细胞会表现出两种融合(由紧密邻近的两个标记产生)信号，从而反映SYT的两个完整副本。具有t(18q11.2)的异常细胞表现出单一融合信号。

在其它实施例中，选择从核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生的靶蛋白，其是在恶性细胞中缺失(丢失)的肿瘤抑制基因。例如，位于染色体9p21上的p16区域(包括D9S1749、D9S1747、p16(INK4A)、p14(ARF)、D9S1748、p15(INK4B)和D9S1752)在某些膀胱癌中缺失。涉及染色体1的短臂(其包括例如SHGC57243、TP73、EGFL3、ABL2、ANGPTL1和SHGC-1322)的远端区域以及染色体19(其包括例如MAN2B1、ZNF443、ZNF44、CRX、GLTSCR2和GLTSCR1)的中心体周围区域(例如19p13-19q13)的染色体缺失是中枢神经系统的某些类型的实体瘤的特征性分子特征。

提供前述实例仅用于例证的目的，且无意成为限制性的。与致瘤性转化和/或生长相关的许多其它细胞遗传学异常是本领域普通技术人员已知的。已经与致瘤性转化相关联并且可用于所公开的方法中的由核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生的靶蛋白还包括EGFR基因(7p12；例如，GENBANK^TM登记号NC-000007，核苷酸55054219-55242525)、C-MYC基因(8q24.21；例如，GENBANK^TM登记号NC-000008，核苷酸128817498-128822856)、D5S271(5p15.2)、脂蛋白脂肪酶(LPL)基因(8p22；例如，GENBANK^TM登记号NC-000008，核苷酸19841058-19869049)、RB1(13q14；例如，GENBANK^TM登记号NC-000013，核苷酸47775912-47954023)、p53(17p13.1；例如，GENBANK^TM登记号NC-000017，互补物，核苷酸7512464-7531642))、N-MYC(2p24；例如，GENBANK^TM登记号NC-000002，互补物，核苷酸151835231-151854620)、CHOP(12q13；例如，GENBANK^TM登记号NC-000012，互补物，核苷酸56196638-56200567)、FUS(16p11.2；例如，GENBANK^TM登记号NC-000016，核苷酸31098954-31110601)、FKHR(13p14；例如，GENBANK^TM登记号NC-000013，互补物，核苷酸40027817-40138734)、以及，例如:ALK(2p23；例如，GENBANK^TM登记号NC-000002，互补物，核苷酸29269144-29997936)、Ig重链、CCND1(11q13；例如，GENBANK^TM登记号NC-000011，核苷酸69165054.69178423)、BCl₂(18q21.3；例如，GENBANK^TM登记号NC-000018，互补物，核苷酸58941559-59137593)、BCL6(3q27；例如，GENBANK^TM登记号NC-000003，互补物，核苷酸188921859-188946169)、MALF1、AP1(1p32-p31；例如，GENBANK^TM登记号NC-000001，互补物，核苷酸59019051-59022373)、TOP2A(17q21-q22；例如，GENBANK^TM登记号NC-000017，互补物，核苷酸35798321-35827695)、TMPRSS(21q22.3；例如，GENBANK^TM登记号NC-000021，互补物，核苷酸41758351-41801948)、ERG(21q22.3；例如，GENBANK^TM登记号NC-000021，互补物，核苷酸38675671-38955488)；ETV1(7p21.3；例如，GENBANK^TM登记号NC-000007，互补物，核苷酸13897379-13995289)、EWS(22q12.2；例如，GENBANK^TM登记号NC-000022，核苷酸27994271-28026505)；FLI1(11q24.1-q24.3；例如，GENBANK^TM登记号NC-000011，核苷酸128069199-128187521)、PAX3(2q35-q37；例如，GENBANK^TM登记号NC-000002，互补物，核苷酸222772851-222871944)、PAX7(1p36.2-p36.12；例如，GENBANK^TM登记号NC-000001，核苷酸18830087-18935219)、PTEN(10q23.3；例如，GENBANK^TM登记号NC-000010，核苷酸89613175-89716382)、AKT2(19q13.1-q13.2；例如，GENBANK^TM登记号NC-000019，互补物，核苷酸45431556-45483036)、MYCL1(1p34.2；例如，GENBANK^TM登记号NC-000001，互补物，核苷酸40133685-40140274)、REL(2p13-p12；例如，GENBANK^TM登记号NC-000002，核苷酸60962256-61003682)和CSF1R(5q33-q35；例如，GENBANK^TM登记号NC-000005，互补物，核苷酸149413051-149473128)。

在其它实施例中，靶蛋白选自与疾病或病症相关的病毒或其它微生物。在细胞或组织样品中的病毒或微生物衍生的靶核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)的检测指示所述生物体的存在。例如，靶标肽、多肽或蛋白可以选自致癌或致病的病毒、细菌或细胞内寄生虫(诸如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和其它疟原虫属物种、利什曼原虫属(种)(Leishmania(sp.))、小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)和兰伯贾第虫(Giardia lamblia)、以及弓形虫属(Toxoplasma)、艾美球虫属(Eimeria)、蒂勒氏菌属(Theileria)和巴倍氏菌属(Babesia)种)的基因组。

在某些实施例中，从来自病毒基因组的核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生靶蛋白。示例性的病毒和相应的基因组序列(在括弧中的GENBANK^TMRefSeq登记号)包括人腺病毒A(NC-001460)、人腺病毒B(NC-004001)、人腺病毒C(NC-001405)、人腺病毒D(NC-002067)、人腺病毒E(NC-003266)、人腺病毒F(NC-001454)、人星状病毒(NC-001943)、人BK多形瘤病毒(V01109；GI:60851)人博卡病毒(NC-007455)、人冠状病毒229E(NC-002645)、人冠状病毒HKU1(NC-006577)、人冠状病毒NL63(NC-005831)、人冠状病毒OC43(NC-005147)、人肠道病毒A(NC-001612)、人肠道病毒B(NC-001472)、人肠道病毒C(NC-001428)、人肠道病毒D(NC-001430)、人红病毒V9(NC-004295)、人泡沫病毒(NC-001736)、人疱疹病毒1(单纯疱疹病毒类型1)(NC-001806)、人疱疹病毒2(单纯疱疹病毒类型2)(NC-001798)、人疱疹病毒3(水痘带状疱疹病毒)(NC-001348)、人疱疹病毒4类型1(爱泼斯坦-巴尔病毒类型1)(NC-007605)、人疱疹病毒4类型2(爱泼斯坦-巴尔病毒类型2)(NC-009334)、人疱疹病毒5菌株AD169(NC-001347)、人疱疹病毒5菌株Merlin菌株(NC-006273)、人疱疹病毒6A(NC-001664)、人疱疹病毒6B(NC-000898)、人疱疹病毒7(NC-001716)、人疱疹病毒8类型M(NC-003409)、人疱疹病毒8类型P(NC-009333)、人免疫缺陷病毒1(NC-001802)、人免疫缺陷病毒2(NC-001722)、人变性肺病毒(NC-004148)、人乳头瘤病毒-1(NC-001356)、人乳头瘤病毒-18(NC-001357)、人乳头瘤病毒-2(NC-001352)、人乳头瘤病毒-54(NC-001676)、人乳头瘤病毒-61(NC-001694)、人乳头瘤病毒-cand90(NC-004104)、人乳头瘤病毒RTRX7(NC-004761)、人乳头瘤病毒类型10(NC-001576)、人乳头瘤病毒类型101(NC-008189)、人乳头瘤病毒类型103(NC-008188)、人乳头瘤病毒类型107(NC-009239)、人乳头瘤病毒类型16(NC-001526)、人乳头瘤病毒类型24(NC-001683)、人乳头瘤病毒类型26(NC-001583)、人乳头瘤病毒类型32(NC-001586)、人乳头瘤病毒类型34(NC-001587)、人乳头瘤病毒类型4(NC-001457)、人乳头瘤病毒类型41(NC-001354)、人乳头瘤病毒类型48(NC-001690)、人乳头瘤病毒类型49(NC-001591)、人乳头瘤病毒类型5(NC-001531)、人乳头瘤病毒类型50(NC-001691)、人乳头瘤病毒类型53(NC-001593)、人乳头瘤病毒类型60(NC-001693)、人乳头瘤病毒类型63(NC-001458)、人乳头瘤病毒类型6b(NC-001355)、人乳头瘤病毒类型7(NC-001595)、人乳头瘤病毒类型71(NC-002644)、人乳头瘤病毒类型9(NC-001596)、人乳头瘤病毒类型92(NC-004500)、人乳头瘤病毒类型96(NC-005134)、人副流感病毒1(NC-003461)、人副流感病毒2(NC-003443)、人副流感病毒3(NC-001796)、人小RNA病毒(NC-001897)、人细小病毒4(NC-007018)、人细小病毒B19(NC-000883)、人呼吸道合胞体病毒(NC-001781)、人鼻病毒A(NC-001617)、人鼻病毒B(NC-001490)、人泡沫逆转录病毒(NC-001795)、人嗜T淋巴细胞病毒1(NC-001436)、人嗜T淋巴细胞病毒2(NC-001488)。

在某些实施例中，从来自致癌病毒诸如爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)或人乳头瘤病毒(HPV，例如，HPV16、HPV18)的核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生靶蛋白。在其它实施例中，从核酸序列(例如，基因组靶核酸序列)产生的靶蛋白来自病原性病毒，诸如呼吸道合胞体病毒、肝炎病毒(例如，丙型肝炎病毒)、冠状病毒(例如，SARS病毒)、腺病毒、多形瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)或单纯疱疹病毒(HSV)。

具体实施方式

实施例1-[4-({[3-({2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺]乙基}氨甲酰基)喹喔啉-2-基]氧基}甲基)-3,5-二甲氧基苯氧基]膦酸的合成(参见方案1A)。

用可被碱性磷酸酶(AP)释放的掩蔽基团(即包含磷酸酶酶底物部分的掩蔽基团)修饰2-羟基喹喔啉(HQ)半抗原。用经掩蔽的半抗原(cHQ)或AP单独标记第二抗-物种抗体(山羊-抗-兔和山羊-抗-小鼠)。因此，可以测试任何一对兔和小鼠第一抗体以确定它们彼此邻近。根据在下面阐述并如方案1A所示的方法合成经掩蔽的HQ，所述方法解释了用于缀合抗体(cHQ-MAL)的具有马来酰亚胺(MAL)反应性基团的经掩蔽的HQ的制备。

方案3:[4-({[3-({2-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺]乙基}氨甲酰基)喹喔啉-2-基]氧基}甲基)-3,5-二甲氧基苯氧基]膦酸的合成

化合物2.将2,6-二甲氧基-4-羟基苯甲醛(5.00g,27.4mmol)和三乙胺(4.17g,5.74mL,41.2mmol)在EtOAc(25mL)中的溶液在冰浴中在搅拌下冷却至0℃。然后历时5min逐滴加入氯磷酸二乙酯(4.73g,27.4mmol)。使反应物温热至室温，随后在室温(“rt”)搅拌约6h(检查HPLC以证实反应大于约90％结束)。将反应混合物通过加入1MHCl(100mL)进行淬灭并将有机层分离和收集。加入额外量的EtOAc(100mL)并将有机物用1M HCl(2x 100mL)、饱和NaHCO₃(3x 100mL)和盐水(100mL)萃取。将有机层经MgSO₄干燥并将溶剂在减压下除去以得到作为浅棕色粘稠油的化合物2(7.95g,91％收率)。

化合物3.将化合物2(7.95g,25.0mmol)在THF(约100mL)中的溶液在冰浴中在搅拌下冷却至约0℃。将NaBH₄(1.42g,37.5mmol)用研钵和研棒粉碎成细粉末并逐份加入，随后在室温搅拌约4h(检查HPLC以证实反应结束)。通过加入1M HCl直到冒泡停止，将反应混合物小心地淬灭。然后将大部分THF在减压下除去。将得到的反应混合物用EtOAc(3x 100mL)萃取。将有机层收集和合并，随后用盐水(约100mL)洗涤并经MgSO₄干燥。然后将溶剂在减压下除去。将得到的浅棕色粘稠油溶解在无水CH₂Cl₂(约50mL)中，随后在冰浴中在N₂气氛下在搅拌下冷却至约0℃。然后历时约5min逐滴加入SOCl₂(4.46g,2.72mL,37.5mmol)。将反应混合物温热至室温，随后在室温搅拌另外1h(检查HPLC以证实反应结束)。通过加入饱和NaHCO₃直到冒泡停止，小心地淬灭反应混合物。将得到的反应混合物用CH₂Cl₂(3x 100mL)萃取。将有机层收集和合并，随后用盐水(100mL)洗涤并经MgSO₄干燥。然后在减压下除去溶剂以得到作为灰白色低熔点固体的化合物3(7.54g,89％收率)。

化合物5.将3-羟基-2-喹喔啉羧酸(3.00g,15.8mmol)溶解在DMF(50mL)中，随后加入4-二甲基氨基吡啶(2.12g,17.4mmol)。将反应混合物在室温搅拌直到4-二甲基氨基吡啶溶解，在此时加入N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(4.45g,17.4mmol)。将反应混合物在室温搅拌30min(检查HPLC以证实反应结束。如果反应没有结束，加入另外的0.1当量部分的DSC直到HPLC表明完全转化)。然后加入N-Boc-乙二胺(3.04g,19.0mmol)和三乙胺(2.40g,3.30mL,23.7mmol)在DMF(10mL)中的溶液，并将反应物在室温搅拌1h(check HPLC for反应结束)。然后将反应混合物倒在剧烈搅拌的1M HCl溶液(250mL)上面。将得到的沉淀物通过真空过滤进行收集，用水洗涤几次，并在高真空下干燥，得到作为黄色固体的化合物5(5.10g,97％收率)。

化合物6.将化合物5(2.50g,7.52mmol)溶解在DMF(50mL)中，随后加入化合物3(3.82g,11.3mmol)和K₂CO₃(5.20g,37.6mmol)。将反应容器密封并在油浴中在剧烈搅拌下加热至55℃保持2h(检查HPLC以证实反应结束。如果反应没有结束，加入另外的0.1当量部分的化合物3直到HPLC表明化合物5的完全消耗)。将反应混合物过滤，并通过加入1M HCl直到冒泡停止，小心地淬灭滤液。将得到的反应混合物用EtOAc(3x 100mL)萃取。将有机层收集和合并，随后用盐水(100mL)洗涤并经MgSO₄干燥。然后在减压下除去溶剂以得到浅黄色粘稠油。将得到的残余物通过快速色谱法(Biotage Snap 50；己烷：EA 1:0至1:4)纯化以得到作为浅黄色固体的化合物6(3.15g,66％收率)。

化合物7.将化合物6(3.15g,4.96mmol)溶解在无水CH₂Cl₂(25mL)中，随后历时5min逐滴加入三甲基甲硅烷基溴(3.80g,3.28mL,24.8mmol)。将容器密封，并将反应混合物在室温搅拌16h(检查HPLC以证实反应结束)。然后加入MeOH(25mL)并在减压下除去溶剂。将得到的固体与CH₂Cl₂(100mL)一起研磨，并通过真空过滤来收集得到的固体，得到作为浅黄色固体的化合物7(2.06,87％收率)。

化合物8.将化合物7(2.06g,4.31mmol)悬浮于DMF(10mL)中，随后加入三乙胺(654mg,900μL,6.46mmol)，并最后加入3-马来酰亚胺基丙酸NHS酯(1.15g,4.31mmol)。将反应容器密封并将反应混合物在室温剧烈搅拌约4h(检查HPLC以证实反应结束)。然后将反应混合物用MeOH(10mL)稀释，并分成5部分通过制备型RP-HPLC(0.05％TFA在H₂O:MeCN 99:1至5:95中，历时40min)直接纯化以得到作为浅黄色固体的化合物8(1.95g,72％收率)。

将马来酰亚胺官能化的HQ(cHQ-MAL)经由二硫键或赖氨酸基团通过两种方法缀合至山羊-抗-兔和山羊-抗-小鼠IgG抗体。在二硫键方法中，将IgG用二硫苏糖醇(DTT)还原，并然后用过量的cHQ-MAL处理。对于赖氨酸方法，将IgG用过量的Traut氏试剂(2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐)处理，然后加入过量的cHQ-MAL。在两种情况下，将缀合物通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化并通过凝胶电泳和紫外-可见光光谱法表征。

实施例2-证实掩蔽基团的阻断

为了证实来自实施例1的经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的掩蔽基团会阻断抗-半抗原抗体结合相应的天然的(即暴露的)半抗原，用单一IHC检测试验了cHQ缀合物。图5解释了一种IHC染色方案，其中用缀合至cHQ的第二抗体即cHQ掩蔽的半抗原-抗体缀合物(103A)检测单一抗原(114)。在引入cHQ掩蔽的半抗原-抗体缀合物(103A)以后，将AP酶(即游离的未缀合的AP)(113)引入以暴露经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的半抗原。得到的暴露的半抗原(103B)能够被抗-半抗原抗体(115)识别。在一些实施方案中，所述抗-半抗原抗体(115)缀合至一种或多种酶(图5解释了与3种HRP酶的缀合)。

参考图6A-6C，小鼠-抗-PSA结合它在前列腺组织上的靶表位，并随后被缀合至cHQ的山羊-抗-小鼠(GAM-cHQ)结合。使用缀合至暴露的HQ的山羊-抗-小鼠(GAM-HQ)产生对照载玻片(例如图6C)。将系列切片暴露于两种不同的条件，即(i)含有游离的(未缀合的)AP、pH调节缓冲液和AP辅因子(镁盐)的溶液；和(ii)不含AP、但是含有pH调节缓冲液和AP辅因子(镁盐)的溶液。图6A解释了用包含AP的溶液处理过的组织；而图6B解释了未处理的组织，即不含AP的溶液。图6C解释了含有用暴露的HQ标记的第二抗体的对照载玻片。在有利于酶的条件下用AP处理过的样品组织具有允许经掩蔽的半抗原的暴露发生的机会(图6A)。阴性样品组织(无AP)不具有使受控的暴露发生的机会(图6B)。这些图清楚地表明，用GAM-cHQ处理过、但是没有暴露于AP的载玻片没有显示阳性染色(图6B)。但是，具有GAM-cHQ和AP的载玻片显示阳性染色(图6A)且匹配未掩蔽的对照载玻片(图6C)。这试验了掩蔽基团的有效性和它对测定条件的稳定性。

实施例3-测量蛋白邻近性

研究了许多已知的阳性的和假定的阴性系统以试验所公开的缀合物能够测量蛋白邻近性的能力。选择E-钙粘着蛋白和β-连环蛋白作为已知的阳性系统，因为生物学决定了这些蛋白在正常细胞中彼此紧密接触。选择Her2/β-连环蛋白和EGFR/β-连环蛋白作为处于相同细胞区室(共定位)但预期不会彼此相互作用(不是近端)且因此在任何邻近测定中不会产生信号的蛋白对。还选择抗体对，使得存在一个兔第一抗体和一个小鼠第一抗体以允许使用抗-物种二级检测。

参考图2、4和12中概述的方案，在引入第一抗体(例如缀合至半抗原的抗体，经掩蔽的半抗原-抗体缀合物，和暴露的酶-抗体缀合物)和第二抗体(例如缀合至酶的抗-半抗原抗体)并随后暴露经掩蔽的半抗原之后，用缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的小鼠-抗-HQ检测暴露的HQ。在此时，DAB(3,3'-二氨基联苯胺)、银或酪胺-色原可以用于可视化邻近性信号。还可以包括HRP/酪胺-半抗原扩增步骤以提高所述系统(例如基于酪胺-HQ的optiView扩增试剂盒)的强度(灵敏度)。

使用自动化的经掩蔽的半抗原邻近测定法的一般程序来试验FFPE病例：使用DISCOVERY EZ Prep(Ventana,p/n 950-100)或DISCOVERY Wash(Ventana,p/n 950-510)的脱石蜡溶液将载玻片脱石蜡。使用DISCOVERY CC1(Ventana,p/n 950-124)在95℃在载玻片上进行热诱导的表位提取一段时间，所述时间取决于两种第一抗体的身份(0-92分钟)。然后将DISCOVERY抑制剂(Ventana,p/n 760-4840)应用于载玻片以淬灭所述样品中的任何内源性过氧化物酶。将兔抗-靶标1抗体与小鼠抗-靶标2抗体一起在37℃共温育16-32分钟(取决于第一抗体的身份)。然后将30μg/mL山羊抗-小鼠碱性磷酸酶缀合物应用于载玻片并温育12分钟。将载玻片冲洗，并将20μg/mL的经掩蔽的半抗原山羊抗-兔缀合物溶液应用于载玻片16分钟。温育后，将500mM tris缓冲溶液pH 10.0和490mM MgCl₂溶液应用于载玻片以使经掩蔽的半抗原脱掩蔽。在HQ的脱掩蔽之后，将小鼠-抗-HQ HRP(Ventana,p/n 760-4820)缀合物应用于载玻片以结合暴露的HQ。在某些情况下，使用Amp HQ酪胺扩增试剂盒(Ventana,p/n 760-052)帮助提高信号强度。如下使邻近蛋白显影：使用Chromomap DAB试剂盒(Ventana,p/n 760-159)，随后用苏木精II(Ventana,p/n 790-2208)和Bluing试剂(Ventana,p/n 760-2037)复染色。

图7A-7C解释了该实验的结果，并且解释了具有正邻近性的蛋白的实施例。图7A解释了用于β-连环蛋白的单一IHC DAB染色(例如利用包含对β-连环蛋白具有特异性的抗体、缀合至酶的抗-物种抗体和DAB的检测技术)。图7B解释了β-连环蛋白和E-钙粘着蛋白的经掩蔽的半抗原邻近性信号(利用被暴露的酶-抗体缀合物起作用的经掩蔽的半抗原-抗体缀合物)。图7C解释了用于E-钙粘着蛋白的单一IHC DAB染色(例如利用包含对E-钙粘着蛋白具有特异性的抗体、缀合至酶的抗-物种抗体和DAB的检测技术)。

图8A-8C解释了IHC DAB染色的结果，并且解释了用本文描述的缀合物和方法检测到的不具邻近性的共定位蛋白的实施例。图8A解释了EGFR的单一IHC DAB染色；图8B解释了EGFR和E-钙粘着蛋白的经掩蔽的半抗原邻近性信号的不存在；和图8C解释了E-钙粘着蛋白的单一IHC DAB染色。

另外，图9A和9B解释了在不同组织类型上的具有和不具有邻近性的共定位蛋白的实施例。在这里，图9A解释了β-连环蛋白和E-钙粘着蛋白的阳性经掩蔽的半抗原邻近性信号，而图9B解释了β-连环蛋白和Her2的经掩蔽的半抗原邻近性信号的缺乏。这些实施例解释了该测定适用于不同的组织类型，但是产生相同类型的结果。

来自上述测定的信号强度输出可以是多种方式“拨入(dialed-in)”。市场上的信号放大的应用容易地应用于本文公开的技术，并且据信容易地增强信号(参见，例如在美国公开号2012/0171668,和PCT/EP2015/0533556中描述的扩增技术，它们的公开内容特此通过引用并入本文)。

如图10A和10B所示，缀合至第二抗体的经掩蔽的半抗原的数目也允许调整测定的灵敏度以配合给定的系统。在该实施例中，图10A解释了用山羊-抗-兔和4(四)cHQ标记进行标记的样品，而图10B解释了用山羊-抗-兔和9(九)种cHQ标记进行标记的样品。在这里，信号强度的相对增加是基于缀合至第二抗体的经掩蔽的半抗原的数目增加，其中图10B清楚地显示了与图10A相比染色强度的增加。

实施例4-用不同的HRP系统进行检测

试验了提供不同可检测信号(例如颜色)的不同HRP系统。例如，图11A和11B解释了用银(11A)和酪胺-TAMRA(11B)的检测。两个系统均能够检测样品中的邻近蛋白靶标。

实施例5-总蛋白和邻近蛋白信号的多路检测

图12是解释一种总蛋白(靶标2，AP-Yellow)和邻近蛋白信号(靶标1+靶标2,HRP-Silver)的多路检测的示意图。可以使用任何类型的HRP检测系统来显示邻近性信号，并且可以使用任何AP检测系统(例如萘酚磷酸酯/坚牢红、BCIP/NBT、醌甲基化物(QM)-色原)来可视化总蛋白。

还已经展示了利用HRP-DAB(图13A)和HRP-Silver并添加用于靶标之一的总蛋白染色剂来检测邻近蛋白(图13B)。这些实验用扁桃体组织上的E-钙粘着蛋白和β-连环蛋白进行。另外，利用E-钙粘着蛋白和β-连环蛋白双染色，图14A和14B解释了使用不同的HRP检测系统来显现邻近性信号以及总蛋白。图14A解释了用HRP-Purple检测到的邻近性和用AP-Yellow检测到的β-连环蛋白，而图13B解释了用HRP-Silver检测到的邻近性和用AP-Yellow检测到的β-连环蛋白。

实施例6-PD1/PD-L1

配体PD-L1与其受体PD-1的结合调节T细胞的活化或抑制。肿瘤细胞可以使用该相互作用来逃避免疫系统。PD-L1/PD-1复合物的检测可以提供比单独地测量任一种蛋白更好的肿瘤内免疫检验点的阻断状态的指示。

图16解释了在NSCLC中PD-1和PD-L1的经掩蔽的半抗原邻近性信号(利用被暴露的酶-抗体缀合物起作用的经掩蔽的半抗原-抗体缀合物)。紫色信号代表PD-L1/PD-1复合物的检测。

使用经掩蔽的半抗原邻近测定法试验NSCLC和扁桃体的FFPE病例。所述病例在DISCOVERY ULTRA仪器上全自动化地运行。使用DISCOVERY EZ Prep(Ventana,p/n 950-100)或DISCOVERY Wash(Ventana,p/n 950-510)的脱石蜡溶液将载玻片脱石蜡。使用DISCOVERY CC1(Ventana,p/n 950-124)在95℃在载玻片上进行热诱导的表位提取64分钟。然后将DISCOVERY抑制剂(Ventana,p/n760-4840)应用于载玻片以淬灭所述样品中的任何内源性过氧化物酶。将兔抗-PD-L1(SP263)(Ventana,p/n 790-4905)与小鼠抗-PD-1(NAT105)(Ventana,p/n 760-4895)一起在37℃共温育32分钟。对于阴性对照，省略了小鼠抗-PD-1。对于剩余的运行，将载玻片在37℃温育。将30μg/mL山羊抗-小鼠碱性磷酸酶缀合物应用于载玻片并温育12分钟。将载玻片冲洗，并将20μg/mL的经掩蔽的半抗原山羊抗-兔缀合物溶液应用于载玻片16分钟。温育后，将500mM tris缓冲溶液pH 10.0和490mM MgCl₂溶液应用于载玻片以使经掩蔽的半抗原脱掩蔽。在HQ的脱掩蔽以后，将小鼠-抗-HQ HRP(Ventana,p/n 760-4820)缀合物应用于载玻片以结合未掩蔽的HQ。使用DISCOVERY Purple试剂盒(Ventana,p/n 760-229)使邻近蛋白可视化。在必要时使用Amp HQ酪胺扩增试剂盒(Ventana,p/n 760-052)帮助提高信号强度。

图17解释了PD-L1和PD-1的经掩蔽的半抗原邻近性信号以及PD-1的总蛋白检测。用DISCOVERY Purple检测邻近蛋白以后，用DISCOVERY Yellow(Ventana,p/n 760-239)检测未掩蔽的酶(碱性磷酸酶)以可视化组织上的PD-1。

图18解释了扁桃体组织中PD-L1和PD-1的经掩蔽的半抗原邻近性信号的阴性对照。从测定省略了PD-1的第一抗体。没有观察到显示检测试剂对蛋白复合物的特异性的信号。

在所有情况下，将载玻片用苏木精II(Ventana,p/n 790-2208)和Bluing试剂(Ventana,p/n 760-2037)复染色。

实施例7-与CD8组合的PD1/PD-L1

图19解释了将PD-L1和PD-1的经掩蔽的半抗原邻近性信号与扁桃体组织中另一种生物标志物的后续检测相组合的一个实施例。在该情况下，在PD-L1/PD1复合物之后检测CD8以产生使参与PD-L1/PD-1相互作用的CD8细胞可视化的测定。对于多路化，如先前所述首先检测PD-1和PD-L1邻近性。将载玻片加热至90℃保持8分钟，以辅助洗脱先前结合的原色。将兔抗-CD8(SP57)(Ventana,p/n 790-4460)应用于载玻片并在37℃温育16分钟。使用UltraMap Rb AP(Ventana,p/n760-4314)、接着使用DISCOVERY Yellow色原体检测抗-CD8。将载玻片用苏木精II(Ventana,p/n 790-2208)和Bluing试剂(Ventana,p/n760-2037)复染色。

实施例8-Her2/Her3

使用经掩蔽的半抗原邻近测定法试验BT-474细胞系的FFPE病例。所述病例在DISCOVERY ULTRA仪器上全自动化运行。使用DISCOVERY EZ Prep(Ventana,p/n 950-100)或DISCOVERY Wash(Ventana,p/n 950-510)的脱石蜡溶液将载玻片脱石蜡。使用DISCOVERYCC1(Ventana,p/n 950-124)在95℃在载玻片上进行热诱导的表位提取64分钟。然后将DISCOVERY抑制剂(Ventana,p/n760-4840)应用于载玻片以淬灭样品中的任何内源性过氧化物酶。将兔抗-Her2(4B5)(Ventana,p/n 790-2991)与小鼠抗-Her3(SPM738)(Spring,p/nE19260)一起在37℃共温育32分钟。然后将30μg/mL山羊抗-小鼠碱性磷酸酶缀合物应用于载玻片并温育12分钟。将载玻片冲洗，并将20μg/mL的经掩蔽的半抗原山羊抗-兔缀合物溶液应用于载玻片16分钟。温育后，将500mM tris缓冲溶液pH 10.0和490mM MgCl₂溶液应用于载玻片以使经掩蔽的半抗原脱掩蔽。在HQ的脱掩蔽以后，将小鼠-抗-HQ HRP(Ventana,p/n 760-4820)缀合物应用于载玻片以结合未掩蔽的HQ。使用Amp HQ酪胺扩增试剂盒(Ventana,p/n760-052)帮助提高信号强度。如下使临近蛋白可视化：使用Chromomap DAB试剂盒(Ventana,p/n 760-159)，随后用苏木精II(Ventana,p/n790-2208)和Bluing试剂(Ventana,p/n 760-2037)复染色。

图20A-20C解释了该实验的结果，并解释了具有正邻近性的蛋白的实施例。图20A解释了用于Her2的单一IHC DAB染色(例如利用包含对Her2具有特异性的抗体、缀合至酶的抗-物种抗体和DAB的检测技术)。图20B解释了Her2和Her3的经掩蔽的半抗原邻近性信号(利用被暴露的酶-抗体缀合物起作用的经掩蔽的半抗原-抗体缀合物)。图20C解释了用于Her3的单一IHC DAB染色(例如利用包含对Her3具有特异性的抗体，缀合至酶的抗-物种抗体和DAB的检测技术)。

实施例9-蛋白邻近性的测量

研究了许多已知的阳性的和假定的阴性系统以试验所公开的缀合物能够测量蛋白邻近性的能力。选择E-钙粘着蛋白和β-连环蛋白作为已知的阳性系统，因为生物学决定了这些蛋白在正常细胞中彼此紧密接触。还选择抗体对，使得存在一个兔第一抗体和一个小鼠第一抗体以允许使用抗-物种二级检测。

参考图21中概述的方案，在引入第一抗体和第二抗体(例如缀合至酶的抗-物种抗体和缀合至经掩蔽的半抗原的抗-物种抗体)并随后暴露经掩蔽的半抗原之后，用缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的小鼠-抗-NP检测暴露的NP。在此时，DAB(3,3'-二氨基联苯胺)、银或酪胺-色原可以用于可视化邻近性信号。还可以包括HRP/酪胺-半抗原扩增步骤以提高所述系统(例如基于酪胺-HQ的optiView扩增试剂盒)的强度(灵敏度)。

使用自动化的经掩蔽的半抗原邻近测定法的一般程序来试验FFPE病例：使用DISCOVERY EZ Prep(Ventana,p/n 950-100)或DISCOVERY Wash(Ventana,p/n 950-510)的脱石蜡溶液将载玻片脱石蜡。使用DISCOVERY CC1(Ventana,p/n 950-124)在95℃在载玻片上进行热诱导的表位提取一段时间，所述时间取决于两种第一抗体的身份(0-92分钟)。然后将DISCOVERY抑制剂(Ventana,p/n 760-4840)应用于载玻片以淬灭样品中的任何内源性过氧化物酶。将兔抗-靶标1抗体与小鼠抗-靶标2抗体一起在37℃共温育16-32分钟(取决于第一抗体的身份)。然后将30μg/mL山羊抗-小鼠碱性磷酸酶缀合物应用于载玻片并温育12分钟。将载玻片冲洗，并将20μg/mL的经掩蔽的半抗原山羊抗-兔缀合物溶液应用于载玻片16分钟。温育后，将500mM tris缓冲溶液pH 10.0和490mM MgCl₂溶液应用于载玻片以使经掩蔽的半抗原脱掩蔽。在NP的脱掩蔽之后，将小鼠-抗-NP HRP(Ventana,p/n 760-4820)缀合物应用于载玻片以结合暴露的HQ。在某些情况下，使用Amp HQ酪胺扩增试剂盒(Ventana,p/n 760-052)帮助提高信号强度。如下使邻近蛋白显影：使用Chromomap DAB试剂盒(Ventana,p/n760-159)，随后用苏木精II(Ventana,p/n 790-2208)和Bluing试剂(Ventana,p/n 760-2037)复染色。

使用经掩蔽的半抗原邻近测定法试验扁桃体的FFPE病例。所述病例在VENTANADISCOVERY ULTRA或VENTANA Benchmark XT仪器上全自动化地运行。使用DISCOVERY EZPrep(Ventana,p/n950-100)或DISCOVERY Wash(Ventana,p/n 950-510)的脱石蜡溶液将载玻片脱石蜡。使用DISCOVERY CC1(Ventana,p/n 950-124)在95℃在载玻片上进行热诱导的表位提取64分钟。然后将DISCOVERY抑制剂(Ventana,p/n 760-4840)应用于载玻片以淬灭样品中的任何内源性过氧化物酶。将兔抗-E-钙粘着蛋白(EP700Y)(Ventana,p/n 760-4440)与小鼠抗-β-连环蛋白(14)(Ventana,p/n 760-4242)一起在37℃共温育32分钟。将30μg/mL山羊抗-小鼠碱性磷酸酶缀合物应用于载玻片并温育12分钟。将载玻片冲洗，并将20μg/mL的经掩蔽的半抗原山羊抗-兔缀合物溶液应用于载玻片16分钟。温育后，将500mM tris缓冲溶液pH 10.0和490mM MgCl₂溶液应用于载玻片以使经掩蔽的半抗原脱掩蔽。在NP的脱掩蔽以后，将小鼠-抗-NP HRP缀合物应用于载玻片以结合未掩蔽的NP。使用Amp HQ酪胺扩增试剂盒(Ventana,p/n760-052)提高信号强度。如下使邻近蛋白显影：使用Chromomap DAB试剂盒(Ventana,p/n 760-159)，随后用苏木精II(Ventana,p/n 790-2208)和Bluing试剂(Ventana,p/n 760-2037)复染色。

图22A-22B解释了该实验的结果，并解释了具有正邻近性的蛋白的实施例。两个图解释了β-连环蛋白和E-钙粘着蛋白的经掩蔽的半抗原邻近性信号(利用被暴露的酶-抗体缀合物起作用的经掩蔽的半抗原-抗体缀合物)。图22A解释了用式(IC)或(ID)的经掩蔽的半抗原观察到的正邻近性信号，而图22B解释了用式(IE)或(IF)的经掩蔽的半抗原观察到的正邻近性信号。在两个样品之间没有观察到特异性信号的差异。

实施例10-证实掩蔽基团的阻断

为了证实经掩蔽的半抗原-抗体缀合物的掩蔽基团存在并阻断抗-半抗原抗体与相应的天然(即未掩蔽的)半抗原的结合，用单一IHC检测试验了cNP缀合物。为了检测非常低水平的暴露事件，在具有非常高表达水平的FFPE样品上选择具有非常高表达水平的生物标志物(例如在扁桃体组织上的λ蛋白和在SKBR3细胞系上的Her2蛋白)。图3解释了一种IHC染色方案，其中用缀合至cNP的第二抗体即cNP掩蔽的半抗原-抗体缀合物(105)检测单一抗原(101)。在引入cNP掩蔽的半抗原-抗体缀合物(105)以后，引入抗-半抗原抗体(109)。在一些实施方案中，将所述抗-半抗原抗体(109)缀合至一种或多种酶(图3解释了与3种HRP酶的缀合)。

所述病例在VENTANA DISCOVERY ULTRA或VENTANA Benchmark XT仪器上全自动化运行。使用DISCOVERY EZ Prep(Ventana,p/n 950-100)或DISCOVERY Wash(Ventana,p/n950-510)的脱石蜡溶液将载玻片脱石蜡。对于λ测定，使用蛋白酶1(Ventana,p/n760-2018)在37℃在载玻片上执行酶促的表位提取4分钟。对于Her2测定，使用DISCOVERY CC1(Ventana,p/n 950-124)在95℃在载玻片上执行热诱导的表位提取64分钟。然后将DISCOVERY抑制剂(Ventana,p/n 760-4840)应用于载玻片以淬灭样品中的任何内源性过氧化物酶。将兔抗-λ(Ventana,p/n 760-2515)或兔-抗-Her2(Ventana,p/n760-2991)在37℃温育32分钟。将载玻片冲洗，并将20μg/mL的经掩蔽的半抗原山羊抗-兔缀合物溶液应用于载玻片16分钟。温育后，将小鼠-抗-NP HRP缀合物应用于载玻片以结合任何暴露的NP。使用Amp HQ酪胺扩增试剂盒(Ventana,p/n 760-052)提高信号强度。如下使邻近蛋白显影：使用Chromomap DAB试剂盒(Ventana,p/n 760-159)，随后用苏木精II(Ventana,p/n 790-2208)和Bluing试剂(Ventana,p/n760-2037)复染色。

参考图24A和24C，兔-抗-Her2(4B5)结合它在SKBR3细胞上的靶表位，且随后被缀合至式(IC)-(IF)cNP的经掩蔽的半抗原的山羊-抗-兔(GAR-cNP)结合(参见，例如，式(IVA)-(IVD)的缀合物。图4A解释了用式(IC)或(ID)的经掩蔽的半抗原处理过的组织，且观察到的信号指示不完全掩蔽。图4C解释了用式(IE)或(IF)的经掩蔽的半抗原处理过的组织，且任何信号的不存在指示完全掩蔽。

参考图24B和24D，兔-抗-λ结合它在扁桃体组织上的靶表位，且随后被缀合至式(IC)-(IF)cNP的经掩蔽的半抗原的山羊-抗-兔(GAR-cNP)结合。图4B解释了用式(IC)或(ID)的经掩蔽的半抗原处理过的组织，且观察到的信号指示不完全掩蔽。图4D解释了用式(IE)或(IF)的经掩蔽的半抗原处理过的组织，且任何信号的不存在指示完全掩蔽。

实施例11-掩蔽基团的稳定性

申请人已经发现，式(IE)和(IF)的某些经掩蔽的半抗原具有与式(IC)或(ID)的经掩蔽的半抗原相比增强的稳定性。例如，和参考图25，意外地发现，化合物8、13a和13b具有与化合物14相比增强的稳定性。如在化合物8和14之间，且不希望受任何特定理论约束，据信，离去基团和酶物质之间的-O-烷基的添加会增加经掩蔽的半抗原的稳定性。实际上，如在约第65天测得的，对于化合物14，脱掩蔽百分比是约20％，而对于化合物8，脱掩蔽百分比小于10％。对于不包括芳基离去基团的化合物13a和13b，在约65天以后的脱掩蔽百分比分别是约4.5％和约2.5％。尽管这些脱掩蔽量可能不是数量级差异，甚至更小的差异在诊断产业中是重要的，其中假阳性结果可能严重地阻碍由医学从业人员提供的后续患者护理。

实际上，申请人认为，脱掩蔽量的减小会降低假阳性结果的量。作为实例，当将化合物14的经掩蔽的半抗原储存约65天时，特定百分比的经掩蔽的半抗原将“丧失”它的掩蔽基团。熟练的技术人员会明白，缺失掩蔽基团的经掩蔽的半抗原将与完整的经掩蔽的半抗原分子一起溶解，并同时引入生物样品中。缺失掩蔽基团的经掩蔽的半抗原的抗体部分将结合靶标，因而用半抗原标记靶标(其又可以被抗-半抗原抗体识别)(参见，例如，图23)。熟练的技术人员会明白，用这样的缺失掩蔽基团的经掩蔽的半抗原标记靶标可能在任何蛋白邻近测定法中产生假阳性(参见图2中所示的将经掩蔽的半抗原脱掩蔽的作用机理)。通过减少缺失掩蔽基团的经掩蔽的半抗原的量，可能减少、减轻或阻止假阳性信号的产生。

在本说明书中提及的和/或在申请数据单中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开通过引用整体并入本文。如果必要的话，可以修改实施方案的方面以采用不同的专利、申请和公开的概念来提供其它实施方案。

尽管已经参考许多示例性实施方案描述了本公开内容，但是应当理解，本领域技术人员可以设计众多其它的修改和实施方案，它们将落入本公开内容的原理的精神和范围内。更具体地，在不脱离本公开内容的精神的前提下，在前述公开内容、附图和所附权利要求的范围内的主题组合排列的组成部分和/或排列中，合理变动和修改是可能的。除了组成部分和/或排列的变动和修改以外，替代性应用也将是本领域技术人员显而易见的。

Claims (10)

1.具有式(I)的结构的经掩蔽的半抗原：

其中

Y是羰基反应性基团、胺反应性基团或巯基反应性基团；

X是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-30个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

“半抗原”是选自以下的半抗原：吡唑类；硝基苯基化合物类；苯并呋咱类；苯并呋喃类；三萜类；脲类；硫脲类；鱼藤酮和鱼藤酮衍生物类；噁唑类；噻唑类；香豆素和香豆素衍生物类；硝基芳基类；环木酚素类；生物素、地高辛配基、荧光素、2-羟基喹喔啉和二硝基苯基；

A是基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团，并且任选地具有一个或多个选自O、N或S的杂原子；

q是0或1；且

“掩蔽基团”具有式(II)的结构：

其中

R¹独立地选自H、F、Cl、Br、I、-O-甲基、-O-乙基、-O-正丙基、-O-异丙基；-O-正丁基、-O-仲丁基或-O-异丁基；具有1-4个碳原子的-S-烷基；具有1-4个碳原子的-O-烷基；具有1-4个碳原子的-N(H)-烷基；具有1-6个碳原子的-N-(烷基)₂基团；具有1-4个碳原子且任选地被N或S取代的烷基；氰基基团；和羧基基团；且

R²是酶底物，所述酶底物选自磷酸基团、酯基、酰胺基、硫酸基团、糖苷基团、脲基团和硝基。

2.权利要求1的经掩蔽的半抗原，其中所述所述掩蔽基团具有式(IIB)的结构：

或式(IIC)的结构：

或式(IID)的结构：

且

其中R²选自磷酸基团、酯基、酰胺基、硫酸基团、糖苷基团、脲基团和硝基。

3.权利要求2的半抗原，其中每个R¹基团是不同的。

4.权利要求1的半抗原，其中X具有式(IIIA)的结构：

其中d和e是各自独立地在4-18范围内的整数；Q是键、O、S或N(R^c)(R^d)；R^a和R^b独立地是H、C₁-C₄烷基、F、Cl或N(R^c)(R^d)；且R^c和R^d独立地是CH₃或H。

5.具有式(IA)的经掩蔽的半抗原：

其中

Y是羰基反应性基团、胺反应性基团或巯基反应性基团；

X具有式(IIIA)的结构：

其中d和e是各自独立地在1-24范围内的整数；Q是键、O、S或N(R^c)(R^d)；R^a和R^b独立地是H、C₁-C₄烷基；且R^c和R^d独立地是CH₃或H；

“半抗原”是选自以下的半抗原：吡唑类；硝基苯基化合物类；苯并呋咱类；苯并呋喃类；三萜类；脲类；硫脲类；鱼藤酮；噁唑类；噻唑类；香豆素；硝基芳基类；环木酚素类；生物素、地高辛配基、荧光素、2-羟基喹喔啉和二硝基苯基；

A是键或基团，所述基团包含分支的或未分支的、被取代的或未被取代的、饱和的或不饱和的具有1-15个碳原子的脂族基团；

“酶底物”选自磷酸基团、酯基、酰胺基、硫酸基团、糖苷基团、脲基团和硝基；且

“离去基团”选自被取代的或未被取代的呋喃、吡咯、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、异噁唑、噻唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪、2H-吡喃、4H-吡喃、2H-噻喃、4H-噻喃、噁嗪或噻嗪。

6.权利要求5的经掩蔽的半抗原，其中所述“离去基团”被卤素取代。

7.权利要求5的经掩蔽的半抗原，其中所述“离去基团”被具有1-4个碳原子的-O-烷基取代。

8.权利要求5的经掩蔽的半抗原，其中d和e是各自独立地在4-18范围内的整数。

9.权利要求5的经掩蔽的半抗原，其中X具有式(IIIC)的结构：

其中d和e是各自独立地在1-24范围内的整数。在一些实施方案中，d是2且e在2至24的范围内。

10.权利要求9的经掩蔽的半抗原，其中d和e是1。

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