CN116337829A - 一种高通道荧光辐射差分显微成像方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高通道荧光辐射差分显微成像方法和装置，包括激光器、分束器、光纤模式选择模块、光场调整模块、显微成像模块、探测模块和控制单元，通过光纤模式选择模块分时选通空间位置重叠的N个空心激发光斑和N个实心激发光斑，N个激发光斑、光场调整模块、显微成像模块与探测模块包含的N根探测光纤一一对应构成N个独立的FED显微成像通道，可以并行获取待测样品的结构信息，提升FED的成像速度。

Description

一种高通道荧光辐射差分显微成像方法和装置

技术领域

本发明属于超分辨成像技术，尤其是涉及一种高通道荧光辐射差分(Fluorescence Emission Difference，FED)显微成像方法和装置。

背景技术

光学显微镜在生命科学、材料科学等领域具有非常重要的地位，可以直观地观察样品的微观结构。但是，受光学衍射极限的限制，光学显微镜的空间分辨率一般大于λ/2。为此，结构光照明显微技术、随机光学重构显微技术、受激辐射损耗显微技术等超分辨技术在近几十年不断涌现。其中，荧光辐射差分(FED)显微技术利用数字处理实心斑激发和空心斑激发获取的两幅图像，可以获得超分辨的显微图像。而且，该技术具有非常好的普适性，相对其他超分辨技术对荧光染料、荧光标记、激光功率等要求较低。

早期，FED显微成像技术首先利用高斯型实心激发光斑获取一幅样品的荧光共聚焦显微图像，然后利用donut型空心光斑获取另一幅样品的荧光共聚焦显微图像，最后通过数字处理技术重构出超分辨图像。由于对样品分时进行了两次点扫描模式的共聚焦显微成像，成像速度偏慢，所以FED显微成像质量易受成像环境的振动、温度等因素影响。

为了提高成像速度，利用阵列探测器接收样品的荧光信号，通过信号处理将阵列探测器中心区域接收的信号对应虚拟实心斑激发信号，而边缘区域接收的信号对应虚拟空心斑激发的荧光信号，可以较快获得FED超分辨图像。

通过错开实心斑激发光束和空心斑激发光束的入射角度，可以在样品内同时形成一对空间位置有一定偏差的实心激发斑和空心激发斑，利用两个独立探测器分别接收实心激发斑和空心激发斑激发的荧光信号，能够2倍提高单通道FED显微成像的速度。

通过空间光调制器(SLM)对入射激发光偏振态的选择性，利用同一束激发光的s分量和p分量分别入射到SLM的不同空间区域进行不同调制，也可以在样品内同时获得一对空间位置有一定偏差的实心激发斑和空心激发斑，实现光路系统更加稳定、调解更加方便的单通道快速FED显微成像。

但是，以上所有方法都属于单通道FED显微成像，对成像速度的提升依然有限。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种高通道荧光辐射差分显微成像方法和装置，构成多通道并行FED显微成像，提升FED显微成像速度。

为实现上述发明目的，实施例提供的一种高通道荧光辐射差分显微成像装置，包括：

激光器(1)，用于提供至少一个中心波长的激发光束(8)；

分束器(2)，用于将激发光束(8)分成激发子光束(9)和(10)并导入至光纤模式选择模块(3)的实心斑激发和空心斑激发这两个激发光传输通道；

光纤模式选择模块(3)，用于分时选通两个激发光传输通道，由光纤阵列输出多路独立的实心斑激发光束和空心斑激发光束；

光场调整模块(4)，用于对光纤模式选择模块(3)输出的多路光束进行光场调整，以形成线状激发光斑阵列；还用于将从显微成像模块(5)获得的多路荧光信号成像到探测模块(6)；

显微成像模块(5)，用于将线状激发光斑阵列成像到待测样品，并采集样品经激发产生的荧光信号；

探测模块(6)，用于采用探测器阵列并行接收多路荧光信号并转换为电信号；

控制单元(7)，用于控制光纤模式选择模块(3)、显微成像模块(5)工作，还用于采集探测模块(6)的电信号并进行超分辨成像；

通过光纤模式选择模块(3)分时输出N路空心激发光束或N路实心激发光束，N路激发光束、光场调整模块(4)、显微成像模块(5)与探测模块(6)包含的N根探测光纤一一对应构成N个独立的FED显微成像通道，以并行获取待测样品的结构信息。

在一个可选的实施方式中，所述分束器(2)根据激发光束的偏振特征选择能量分束或偏振分束，当选择能量分束时，分束器(2)采用能量分束器，包括分光棱镜或分光片，当选择偏振分束时，分束器(2)采用偏振分束器，包括偏振分光棱镜，当激光器(1)为带尾纤输出时，分束器(2)采用1*2的光纤分束器。

在一个可选的实施方式中，所述光纤模式选择模块(3)包括分别对应实心斑激发和空心斑激发这两个激发光传输通道的光纤模式选择单元(11)和(12)，光纤模式选择单元(11)和(12)各包含1个声光调制器(AOM)和1个光纤模式选择器，两个AOM均作为光开关，用于分别控制实心斑激发和空心斑激发的选通时序，以实现两种激发光斑模式的高速切换，两个光纤模式选择器用于分别选择N路实心斑输出光纤和N路空心斑输出光纤，并分别通过AOM控制分时输出N路独立的实心斑激发光束和N路独立的空心斑激发光束；

其中，光纤模式选择单元(11)包含的光纤模式选择器选择1*N单模光纤分束器、N个输出端的1*2单模光纤耦合器组合、N个输出端的1*4单模光纤耦合器组合、或者N个输出端的1*2与1*4单模光纤耦合器组合；

光纤模式选择单元(12)包含的光纤模式选择器选择1*N单模光纤分束器与N个光纤模式选择耦合器、N个输出端的1*2单模光纤耦合器组合与N个光纤模式选择耦合器、N个输出端的1*4单模光纤耦合器组合与N个光纤模式选择耦合器、或者N个输出端的1*2与1*4单模光纤耦合器组合与N个光纤模式选择耦合器，其中，光纤模式选择耦合器由单模光纤和少模光纤构成。

在一个可选的实施方式中，在光纤模式选择模块(3)包含的光纤阵列端面(21)处，采用光纤夹具固定光纤模式选择模块(3)的N路实心斑输出光纤和N路空心斑输出光纤的端面，使每一路实心斑输出光纤和每一路空心斑输出光纤构成一组，对应一个FED显微成像通道的可分时控制激发光点源。

在一个可选的实施方式中，所述光场调整模块(4)包括光束准直单元(22)、会聚透镜(23)、透镜(25)、二色镜(26)、透镜(27)、会聚透镜(30)；

所述光束准直单元(22)控制光纤模式选择模块(3)的光纤阵列端面(21)输出的N路实心斑激发光束和N路空心斑激发光束相互平行准直输出；

所述会聚透镜(23)控制分时选通的N路实心斑激发光束或N路空心斑激发光束形成空间位置重叠的线状激发光斑阵列(24)，其中，线状激发光斑阵列(24)由选通的N个实心激发光斑或选通的N个空心激发光斑组成；

所述透镜(25)和透镜(27)控制线状激发光斑阵列(24)成像为线状激发光斑阵列(28)，该线状激发光斑阵列(28)通过显微成像模块(5)再次成像，实现线状激发照明；

所述二色镜(26)设于透镜(25)和透镜(27)之间，用于将激发光束和荧光信号分离；

所述透镜(27)、二色镜(26)和会聚透镜(30)依次对显微成像模块(5)获得的多路荧光信号进行分路传输，包括通过透镜(27)准直显微成像模块(5)输出的N路独立荧光信号，通过二色镜(26)分离激发光束和荧光信号光束，通过会聚透镜(30)会聚N路荧光信号光束进入探测模块(6)。

在一个可选的实施方式中，所述显微成像模块(5)至少包括扫描单元和显微物镜，其中，显微物镜用于将线状激发光斑阵列(28)成像到被测样品内，形成线状激发光斑阵列(29)，并且接收激发光场所产生的荧光信号；扫描单元通过数据线与控制单元(7)相连，实现外部通信控制，用于根据控制单元(7)的扫描命令引导线状激发光斑阵列(29)在样品上二维或三维扫描移动。

在一个可选的实施方式中，所述光束准直单元(22)选择微透镜阵列；所述会聚透镜(23)选择柱面透镜。

在一个可选的实施方式中，所述探测模块(6)包括光纤阵列端面(31)、探测光纤阵列和探测器阵列，光纤阵列端面(31)接收的多路荧光信号通过探测光纤阵列分别导入探测器阵列，以转换为多路电信号。

在一个可选的实施方式中，所述控制单元(7)控制光纤模式选择模块(3)工作时，向光纤模式选择模块(3)发送指令选通实心斑激发和空心斑激发的激发光传输通道，控制实心斑激发和空心斑激发对应的成像顺序；

所述控制单元(7)控制显微成像模块(5)工作时，向显微成像模块(5)的扫描单元发送扫描指令，控制线状激发光斑阵列(29)对样品进行二维/三维扫描；

所述控制单元(7)采集探测模块(6)的电信号并进行超分辨成像时，根据扫描时序获取基于电信号得到的实心斑激发样品图像和空心斑激发样品图像后，利用FED技术重构和显示样品的超分辨显微图像。

为实现上述发明目的，实施例还提供了一种高通道荧光辐射差分显微成像方法，该方法采用上述装置，包括以下步骤：

通过激光器(1)提供至少一个中心波长的激发光束(8)；

通过分束器(2)将激发光束(8)分成激发子光束(9)和(10)并导入至光纤模式选择模块(3)的实心斑激发和空心斑激发这两个激发光传输通道；

通过光纤模式选择模块(3)分时选通两个激发光传输通道，由光纤阵列输出多路独立的实心斑激发光束和空心斑激发光束；

通过光场调整模块(4)对光纤模式选择模块(3)输出的多路光束进行光场调整，以形成线状激发光斑阵列；还用于将从显微成像模块(5)获得的多路荧光信号成像到探测模块(6)；

通过显微成像模块(5)将线状激发光斑阵列成像到待测样品，并采集样品经激发产生的荧光信号；

通过探测模块(6)包含的探测器阵列并行接收多路荧光信号并转换为电信号；

通过控制单元(7)控制光纤模式选择模块(3)、显微成像模块(5)工作，采集探测模块(6)的电信号并进行超分辨成像。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果至少包括：

1)通过光纤模式选择模块由多路实心光斑和空心光斑分时激发，结合探测模块的阵列探测器并行接收构成多路FED显微成像通道，可以提升FED的成像速度。

2)利用AOM高速分时选择激发通道，光纤选择激发光模式(实心光斑和空心光斑)，可以使装置的光路结构更加稳定和紧凑，减小外界环境对FED显微成像的影响。

3)利用光纤夹具和光场调整模块使每组空心和实心激发光斑的空间位置重叠，可以提升FED显微成像的视场。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。

图1是实施例提供的高通道荧光辐射差分显微成像装置的结构示意图；

图2是实施例提供的激发光纤阵列端面的结构示意图；

图3是实施例提供的探测光纤阵列端面的结构示意图；

图4是实施例提供的高通道荧光辐射差分显微成像方法的流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。

如图1所示，实施例提供的高通道FED显微成像装置，包括激光器1、分束器2、光纤模式选择模块3、光场调整模块4、显微成像模块5、探测模块6和控制单元7。该装置的成像基本原理是FED显微成像技术，通过实心光斑激发和空心光斑激发获取的两幅共焦荧光显微图像，利用差分技术获得超分辨荧光信息。装置的结构布置是通过光线模式选择模块3分时输出N路空心激发光束或N路实心激发光束，N路激发光束、光场调整模块4、显微成像模块5与探测模块6包含的N根探测光纤一一对应构成N个独立的FED显微成像通道，可以并行获取待测样品的结构信息，提升FED的成像速度。关键是光纤模式选择模块3包含的两个AOM高速分时选通两个激发光传输通道，使得能够稳定输出N路空心激发光束和N路实心激发光束，光场调整模块4使每组选通的空心激发光斑和实心激发光斑的空间位置高度重叠传输，光纤模式选择模块3包含的激发光纤端面与探测模块6包含的探测光纤端面对准构成多路FED成像通道的N路激发光输出端口和N路信号光探测端口。下面针对每部分进行详细说明：

实施例中，激光器1用于提供至少一个中心波长的激发光束8，即提供一束单色或多色激发光束，能够在成像原理上使本发明更好适用于被检测样品的不同光学特征，实现一种或多种荧光染料标记的高通量FED显微成像，以便可以更加全面地研究或观测被测样品的动态信息。优选地，激光器1可以选择单一波长激光器、波长调谐激光器或白光激光器。当激光器1输出光束是向自由空间输出时，需要由望远系统组成的光束扩束器，将输出光束准直成平行光束。

实施例中，分束器2用于将激发光束8分成激发子光束9和10并导入至光纤模式选择模块3的实心斑激发和空心斑激发这两个激发光传输通道。其中，对于激光器1输出的准直平行激发光束，分束器2可以根据激发光束的偏振特征选择能量分束或偏振分束，当选择能量分束时，分束器2采用能量分束器，包括分光棱镜或分光片，当选择偏振分束时，分束器2采用偏振分束器，包括偏振分光棱镜，对于激光器1采用尾纤输出激发光束，分束器2采用1*2的光纤分束器。具体地，当采用能量分束器时，能量分束器将激发光束8按照1:1的能量比分成激发子光束9和10。

实施例中，光纤模式选择模块3用于分时选通两个激发光传输通道，由光纤阵列输出多路独立的实心斑激发光束和空心斑激发光束。光纤模式选择模块3包括分别对应实心斑激发和空心斑激发这两个激发光传输通道的光纤模式选择单元11和12。光纤模式选择单元11和12各包含1个声光调制器(AOM)和1个光纤模式选择器，两个AOM均作为光开关，用于分别控制激发光束进入两个激发传输通道的工作时间，即分别控制实心斑激发和空心斑激发的选通时序，以实现两种激发光斑模式的高速切换，两个光纤模式选择器用于分别选择N路实心斑输出光纤和N路空心斑输出光纤，并分别通过AOM控制分时输出N路独立的实心斑激发光束和N路独立的空心斑激发光束。

其中，光纤模式选择单元11包含的光纤模式选择器选择1*N单模光纤分束器、N个输出端的1*2单模光纤耦合器组合、N个输出端的1*4单模光纤耦合器组合、或者N个输出端的1*2与1*4单模光纤耦合器组合，以输出N路实心光斑激发光束。

光纤模式选择单元12包含的光纤模式选择器选择1*N单模光纤分束器与N个光纤模式选择耦合器、N个输出端的1*2单模光纤耦合器组合与N个光纤模式选择耦合器、N个输出端的1*4单模光纤耦合器组合与N个光纤模式选择耦合器、或者N个输出端的1*2与1*4单模光纤耦合器组合与N个光纤模式选择耦合器，以输出N路空心光斑激发光束。其中，光纤模式选择耦合器由单模光纤和少模光纤构成，单模光纤直接控制输出单路实心斑激发光束，单个光纤模式选择耦合器控制能够输出单路空心斑激发光束。

光纤耦合器用作按照能量比把激光光束分成多路等强度的激发光束，1*2的光纤分束器输出两个激发光传输通道，优选光纤输入/输出型AOM，控制实心斑激发和空心斑激发的选通时序。对于实心激发模式，优选由单模光纤构成的1*N光纤耦合器输出N路独立的实心激发光束；对于空心激发模式，优选由单模光纤和少模光纤构成的光纤模式选择耦合器，由N根少模光纤输出独立的空心激发光束。

为了简化系统光路的结构和提高系统的稳定性，AOM优选采用光纤输入和输出型。如图2所示，系统中，采用光纤夹具固定光纤模式选择模块3的N路实心斑输出光纤和N路空心斑输出光纤的端面，使每一路实心斑输出光纤和每一路空心斑输出光纤构成一组，对应一个FED显微成像通道的可分时控制激发光点源。实施例中，优选低热膨胀系数的光纤夹具。

具体地，举例说明，如图1和图2所示，光纤模式选择单元11输出4路独立的实心光斑激发光束13，14，15，16，而光纤模式选择单元12输出4路独立的donut型空心光斑激发光束17，18，19，20。用光纤夹具把传输4路实心光斑激发光束13，14，15，16和空心光斑激发光束17，18，19，20的光纤束固定在光纤阵列端面21，使输出空心光斑和实心光斑的每两条光纤构成一组，例如13和17构成一组，一组对应一个FED显微成像通道的激发光源。

实施例中，光场调整模块4用于对光纤模式选择模块3输出的多路光束进行准直和光场调整，以形成线状分布的N个并行激发光斑阵列，还用于将从显微成像模块5获得的多路荧光信号成像到探测模块6。如图1所示，光场调整模块4包括光束准直单元22、会聚透镜23、透镜25、二色镜26、透镜27、会聚透镜30。

其中，光束准直单元22控制光纤阵列端面21输出的N路实心斑激发光束和N路空心斑激发光束相互平行准直输出。会聚透镜23控制分时选通的N路实心斑激发光束或N路空心斑激发光束形成空间位置重叠的线状激发光斑阵列24，其中，线状激发光斑阵列24由选通的N个实心激发光斑或选通的N个空心激发光斑组成。透镜25和透镜27提供适当的放大率，控制线状激发光斑阵列24成像为线状激发光斑阵列28，以便能通过显微成像模块5获得相邻激发光斑干扰小的线状激发光斑阵列29。

二色镜26设于透镜25和透镜27之间，用于将激发光束和荧光信号分离。透镜27、二色镜26和会聚透镜30依次对显微成像模块5获得的多路荧光信号进行分路传输，具体通过透镜27准直显微成像模块5输出的N路独立荧光信号，通过二色镜26分离激发光束和荧光信号光束，通过会聚透镜30会聚N路荧光信号光束进入探测模块6的光纤阵列端面31。

根据空心激发光斑和实心激发光斑的数值孔径角、模场半径、光纤间距和工作波长，光束准直单元22优选微透镜阵列，能够准直每组空心斑激发光束和实心斑激发光束，且使两种光斑模式的输出光束相互平行；会聚透镜23优选柱面透镜，能够会聚上述每组准直的空心斑激发光束和实心斑激发光束在焦平面的同一空间位置，形成线状激发光斑阵列24。根据显微成像系统的入瞳和视场大小，透镜25和透镜27构成成像系统，将线状激发光斑阵列24成像为大小和间距合适的线状激发光斑阵列28；透镜27和会聚透镜30构成成像系统将显微成像模块5输出的荧光信号成像到探测模块6的光纤阵列端面31。

实施例中，显微成像模块5用于将线状激发光斑阵列28成像到被测样品，构成相邻的光斑间距不小于一个艾里斑大小的线状激发光斑阵列29，该线状激发光斑阵列29产生多点并行激发区域对被测样品进行激发，被测样品在激发下产生荧光信号，并且接收荧光信号以成像方式输入光场调整模块4。

其中，显微成像模块5至少包括扫描单元和显微物镜。其中，显微物镜用于将线状激发光斑阵列28成像到被测样品内，形成相邻激发光斑干扰小的线状激发光斑阵列29，并且接收激发光场所产生的荧光信号。扫描单元通过数据线与控制单元7相连，实现外部通信控制，用于根据控制单元7的扫描命令引导线状激发光斑阵列29在样品上二维或三维扫描移动。

在成像原理上，线状激发光斑阵列的照明区域和线状排布的探测光纤阵列输入端面相互共轭，则每个激发光斑和对应的一根探测光纤构成一个共聚焦成像模式，即构成一个FED显微成像通道。通过分时选通N路实心斑激发或N路空心斑激发，结合线状激发光斑阵列的扫描，可以快速获得实心斑激发对应的样品显微图像和空心斑激发对应的样品图像，快速重构出样品的超分辨图像，即多通道FED显微成像。

实施例中，探测模块6用于采用探测器阵列并行接收多路荧光信号并转换为电信号。如图1所示，探测模块6包括光纤阵列端面31、由探测光纤32，33，34，35组成的阵探测光纤列以及由探测器36，37，38，39组成的探测器阵列，光纤阵列端面31接收多路荧光信号并分割成多个独立探测通道，通过探测光纤阵列将接收的多路荧光信号分别导入探测器阵列，以转换为多路电信号。如图3所示，探测光纤阵列呈线形排列。

光纤阵列端面31与光纤阵列端面21一样，也采用光纤夹具固定，光纤夹具的结构根据激发和接收光纤的数值孔径、外径和模斑半径，以及光场调整模块4和显微成像模块5决定的成像分辨率和范围进行设计，使每个FED显微成像通道内的实心激发光斑和空心激发光斑空间重叠，且相邻FED显微成像通道对应的激发光斑在样品内的间距至少大于一个艾里斑直径，使每个FED显微成像通道的荧光信号经显微成像模块5和光场调整模块4高效耦合进入探测光纤阵列。

为了提高信噪比，探测光纤32，33，34，35优选多模光纤。当采用多个独立的探测器接收信号，各根探测光纤分别直接连接相应探测器的端面光纤接口。探测器36，37，38，39选择具有N个独立的检测器或者是包含N个探测单元的面阵探测器。当采用包含N个探测单元的面阵探测器时，根据面阵探测的探测单元面积、探测光纤的模式半径和数值孔径，探测模块6至少还需要配置远心光学成像系统，通过远心光学成像系统控制把探测光纤32，33，34，35输出的每路信号能以合适的信噪比被面阵探测器36，37，38，39接收。N个独立的检测器优先选择N个接收器端面可以直接连接光纤的PMT或APD，PMT或APD阵列探测器具有单光子探测能力，结合光子计数可以对样品进行荧光寿命成像，可以进一步扩展系统功能，对待检测样品进行FED模式下的荧光寿命成像。包含N个探测单元的面阵探测器优先选择APD阵列或多像素光子计数器(MPPC)。探测模块6通过数据线与控制单元7相连，实现数据采集和传输功能。

实施例中，控制单元7包括计算机、数据采集卡、扫描控制卡、扫描器驱动电路和AOM驱动电路，用于控制光纤模式选择模块3、显微成像模块5工作，还用于采集探测模块6的电信号并进行超分辨成像。具体地，控制单元7控制光纤模式选择模块3工作时，向光纤模式选择模块3的AOM发送激发光斑模式切换指令以选通实心斑激发和空心斑激发的激发光传输通道，并控制实心斑激发和空心斑激发对应的成像顺序。控制单元7控制显微成像模块5工作时，向显微成像模块5的扫描单元发送扫描指令，控制线状激发光斑阵列29对样品进行二维/三维扫描。控制单元7采集探测模块6的电信号并进行超分辨成像时，根据扫描时序获取基于电信号得到的实心斑激发对应的样品显微图像和空心斑激发对应的样品显微图像后，利用FED技术重构和显示样品的超分辨显微图像。

利用上述的成像装置，一种高通量FED显微成像方法用激光器1提供至少一束单色照射光束，经分束器2导向光纤模式选择模块3的两个传输通道；通过光纤模式选择模块3的两个AOM分时选择实心斑激发和空心斑激发的通道，经光纤耦合器和光纤模式选择耦合器的组合分别输出N路实心激发光束和N路空心激发光束；用光纤夹具固定光纤模式选择模块3的2N个激发光纤端面，使每一个实心激发斑输出端和相应的每一个空心激发斑输出端构成一组；由光场调整模块4准直分时选通的N路实心激发光束或N路空心激发光束，使每一组实心斑和空心斑的空间位置重叠形成线状激发光斑阵列；用显微成像模块5将线状激发光斑阵列成像到样品内部，并且接收样品内部被激发区域的荧光信号；由光场调整模块4把显微成像模块5输出的各独立荧光信号准直、分束和聚焦到探测光纤阵列的输入端面；用N根探测光纤直接连接分离的N个探测器输入端面，或者用远心成像系统把探测光纤输出端面成像到面阵探测器接收面；用显微成像模块5的扫描单元使线状激发光斑阵列29在样品内进行二维或三维扫描移动，多通道并行获取样品的图像信息；用控制单元7给AOM发送时间选通指令，给扫描单元发送扫描命令，采集探测模块输出的电信号，根据FED技术重构和显示样品的超分辨图像。

实施例还提供了一种高通道荧光辐射差分显微成像方法，该方法采用图1所示的装置，如图4所示，包括以下步骤：

,通过激光器1提供至少一个中心波长的激发光束8；

通过分束器2将激发光束8分成激发子光束9和10并导入至光纤模式选择模块3的实心斑激发和空心斑激发这两个激发光传输通道；

通过光纤模式选择模块3分时选通两个激发光传输通道，由光纤阵列输出多路独立的实心斑激发光束和空心斑激发光束；

通过光场调整模块4对光纤模式选择模块3输出的多路光束进行光场调整，以形成线状激发光斑阵列；还用于将从显微成像模块5获得的多路荧光信号成像到探测模块6；

通过显微成像模块5将线状激发光斑阵列成像到待测样品，并采集样品经激发产生的荧光信号；

通过探测模块6包含的探测器阵列并行接收多路荧光信号并转换为电信号；

通过控制单元7控制光纤模式选择模块3、显微成像模块5工作，采集探测模块6的电信号并进行超分辨成像。

上述实施例提供的装置和方法，利用分时选通实心和空心激发光斑阵列并行激发，结合探测器阵列同步并行接收，实现高通道数的FED显微成像。使用AOM分时选通实心和空心激发光束通道，由光纤模式选择产生实心和空心激发光束，利用光纤夹具固定激发光纤阵列和探测光纤阵列的空间位置，采用探测器阵列接收激发阵列产生的荧光信号阵列，实现实心和空心激发光斑阵列的分时激发和阵列荧光信号的并行探测，构成多路FED显微成像通道。该装置在激发和探测端使用光纤阵列传输，一方面使光路结构稳定，另一方面使每路FED显微成像通道的实心和空心激发光斑共路，从而提高成像精度和速度，有助于观察或测量细胞的动态过程。

以上所述的具体实施方式对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的最优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高通道荧光辐射差分显微成像装置，其特征在于，包括：

激光器(1)，用于提供至少一个中心波长的激发光束(8)；

分束器(2)，用于将激发光束(8)分成激发子光束(9)和(10)并导入至光纤模式选择模块(3)的实心斑激发和空心斑激发这两个激发光传输通道；

光纤模式选择模块(3)，用于分时选通两个激发光传输通道，由光纤阵列输出多路独立的实心斑激发光束和空心斑激发光束；

光场调整模块(4)，用于对光纤模式选择模块(3)输出的多路光束进行光场调整，以形成线状激发光斑阵列；还用于将从显微成像模块(5)获得的多路荧光信号成像到探测模块(6)；

显微成像模块(5)，用于将线状激发光斑阵列成像到待测样品，并采集样品经激发产生的荧光信号；

探测模块(6)，用于采用探测器阵列并行接收多路荧光信号并转换为电信号；

控制单元(7)，用于控制光纤模式选择模块(3)、显微成像模块(5)工作，还用于采集探测模块(6)的电信号并进行超分辨成像；

通过光纤模式选择模块(3)分时输出N路空心激发光束或N路实心激发光束，N路激发光束、光场调整模块(4)、显微成像模块(5)与探测模块(6)包含的N根探测光纤一一对应构成N个独立的荧光辐射差分显微成像通道，以并行获取待测样品的结构信息。

2.根据权利要求1所述的高通道荧光辐射差分显微成像装置，其特征在于，所述分束器(2)根据激发光束的偏振特征选择能量分束或偏振分束，当选择能量分束时，分束器(2)采用能量分束器，包括分光棱镜或分光片，当选择偏振分束时，分束器(2)采用偏振分束器，包括偏振分光棱镜，当激光器(1)为带尾纤输出时，分束器(2)采用1*2的光纤分束器。

3.根据权利要求1所述的高通道荧光辐射差分显微成像装置，其特征在于，所述光纤模式选择模块(3)包括分别对应实心斑激发和空心斑激发这两个激发光传输通道的光纤模式选择单元(11)和(12)，光纤模式选择单元(11)和(12)各包含1个声光调制器(AOM)和1个光纤模式选择器，两个AOM均作为光开关，用于分别控制实心斑激发和空心斑激发的选通时序，以实现两种激发光斑模式的高速切换，两个光纤模式选择器用于分别选择N路实心斑输出光纤和N路空心斑输出光纤，并分别通过AOM控制分时输出N路独立的实心斑激发光束和N路独立的空心斑激发光束；

其中，光纤模式选择单元(11)包含的光纤模式选择器选择1*N单模光纤分束器、N个输出端的1*2单模光纤耦合器组合、N个输出端的1*4单模光纤耦合器组合、或者N个输出端的1*2与1*4单模光纤耦合器组合；

光纤模式选择单元(12)包含的光纤模式选择器选择1*N单模光纤分束器与N个光纤模式选择耦合器、N个输出端的1*2单模光纤耦合器组合与N个光纤模式选择耦合器、N个输出端的1*4单模光纤耦合器组合与N个光纤模式选择耦合器、或者N个输出端的1*2与1*4单模光纤耦合器组合与N个光纤模式选择耦合器，其中，光纤模式选择耦合器由单模光纤和少模光纤构成。

4.根据权利要求3所述的高通道荧光辐射差分显微成像装置，其特征在于，在光纤模式选择模块(3)包含的光纤阵列端面(21)处，采用光纤夹具固定光纤模式选择模块(3)的N路实心斑输出光纤和N路空心斑输出光纤的端面，使每一路实心斑输出光纤和每一路空心斑输出光纤构成一组，对应一个荧光辐射差分显微成像通道的可分时控制激发光点源。

5.根据权利要求1所述的高通道荧光辐射差分显微成像装置，其特征在于，所述光场调整模块(4)包括光束准直单元(22)、会聚透镜(23)、透镜(25)、二色镜(26)、透镜(27)、会聚透镜(30)；

所述光束准直单元(22)控制光纤模式选择模块(3)的光纤阵列端面(21)输出的N路实心斑激发光束和N路空心斑激发光束相互平行准直输出；

所述会聚透镜(23)控制分时选通的N路实心斑激发光束或N路空心斑激发光束形成空间位置重叠的线状激发光斑阵列(24)，其中，线状激发光斑阵列(24)由选通的N个实心激发光斑或选通的N个空心激发光斑组成；

所述透镜(25)和透镜(27)控制线状激发光斑阵列(24)成像为线状激发光斑阵列(28)，该线状激发光斑阵列(28)通过显微成像模块(5)再次成像，实现线状激发照明；

所述二色镜(26)设于透镜(25)和透镜(27)之间，用于将激发光束和荧光信号分离；

所述透镜(27)、二色镜(26)和会聚透镜(30)依次对显微成像模块(5)获得的多路荧光信号进行分路传输，包括通过透镜(27)准直显微成像模块(5)输出的N路独立荧光信号，通过二色镜(26)分离激发光束和荧光信号光束，通过会聚透镜(30)会聚N路荧光信号光束进入探测模块(6)。

6.根据权利要求1所述的高通道荧光辐射差分显微成像装置，其特征在于，所述显微成像模块(5)至少包括扫描单元和显微物镜，其中，显微物镜用于将线状激发光斑阵列(28)成像到被测样品内，形成线状激发光斑阵列(29)，并且接收激发光场所产生的荧光信号；扫描单元通过数据线与控制单元(7)相连，实现外部通信控制，用于根据控制单元(7)的扫描命令引导线状激发光斑阵列(29)在样品上二维或三维扫描移动。

7.根据权利要求1所述的高通道荧光辐射差分显微成像装置，其特征在于，所述光束准直单元(22)选择微透镜阵列；所述会聚透镜(23)选择柱面透镜。

8.根据权利要求1所述的高通道荧光辐射差分显微成像装置，其特征在于，所述探测模块(6)包括光纤阵列端面(31)、探测光纤阵列和探测器阵列，光纤阵列端面(31)接收的多路荧光信号通过探测光纤阵列分别导入探测器阵列，以转换为多路电信号。

9.根据权利要求1所述的高通道荧光辐射差分显微成像装置，其特征在于，所述控制单元(7)控制光纤模式选择模块(3)工作时，向光纤模式选择模块(3)发送指令选通实心斑激发和空心斑激发的激发光传输通道，控制实心斑激发和空心斑激发对应的成像顺序；

所述控制单元(7)控制显微成像模块(5)工作时，向显微成像模块(5)的扫描单元发送扫描指令，控制线状激发光斑阵列(29)对样品进行二维/三维扫描；

所述控制单元(7)采集探测模块(6)的电信号并进行超分辨成像时，根据扫描时序获取基于电信号得到的实心斑激发样品图像和空心斑激发样品图像后，利用荧光辐射差分技术重构和显示样品的超分辨显微图像。

10.一种高通道荧光辐射差分显微成像方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1-9任一项所述的装置，包括以下步骤：

通过激光器(1)提供至少一个中心波长的激发光束(8)；

通过分束器(2)将激发光束(8)分成激发子光束(9)和(10)并导入至光纤模式选择模块(3)的实心斑激发和空心斑激发这两个激发光传输通道；

通过光纤模式选择模块(3)分时选通两个激发光传输通道，由光纤阵列输出多路独立的实心斑激发光束和空心斑激发光束；

通过光场调整模块(4)对光纤模式选择模块(3)输出的多路光束进行光场调整，以形成线状激发光斑阵列；还用于将从显微成像模块(5)获得的多路荧光信号成像到探测模块(6)；

通过显微成像模块(5)将线状激发光斑阵列成像到待测样品，并采集样品经激发产生的荧光信号；

通过探测模块(6)包含的探测器阵列并行接收多路荧光信号并转换为电信号；

通过控制单元(7)控制光纤模式选择模块(3)、显微成像模块(5)工作，采集探测模块(6)的电信号并进行超分辨成像。

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