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CN116286975A - 一种基于dCas9的c-NHEJ定点抑制系统及应用 - Google Patents

一种基于dCas9的c-NHEJ定点抑制系统及应用 Download PDF

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CN116286975A
CN116286975A CN202310143821.XA CN202310143821A CN116286975A CN 116286975 A CN116286975 A CN 116286975A CN 202310143821 A CN202310143821 A CN 202310143821A CN 116286975 A CN116286975 A CN 116286975A
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CN202310143821.XA
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谢安勇
冯依力
刘嗣诚
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Yimuhe Hangzhou Biotechnology Co ltd
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Zhejiang University ZJU
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Abstract

本发明公开了一种基于dCas9的c‑NHEJ定点抑制系统及在提升HR介导的基因编辑效率中的应用，所述系统包括：(1)元件1：用于在真核细胞内定点诱导DSB的核酸酶及其伴随元件；(2)元件2：用于结合DNA断裂末端的dCas9‑sgRNA；(3)元件3：用于HR介导的基因编辑的同源模板。所述系统协同作用提高基因编辑效率。本发明提供了定点、高效抑制c‑NHEJ修复途径，同时定点、高效提升HR修复效率，有效提升HR介导的CRISPR基因编辑效率，同时降低脱靶效应。

Description

一种基于dCas9的c-NHEJ定点抑制系统及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种基于dCas9的经典型非同源末端连接(c-NHEJ)定点抑制系统及应用。
(二)背景技术
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，成簇规律间隔短回文重复序列)基因编辑技术源自细菌和古细菌的一种免疫防御机制，由Cas核酸酶和单向导RNA(sgRNA)两个元件组成。Cas核酸酶与sgRNA组装成稳定复合物后开始寻找基因组上靶序列，一旦发现原间隔序列临近基序PAM，Cas核酸酶将与PAM互作，并解旋DNA双链，以便sgRNA上的间隔序列与其中的单链靶DNA互补配对，形成RNA-DNA杂交链。随后，被激活的Cas核酸酶将分别切割RNA-DNA杂交链中的DNA链和单链非靶DNA链，产生一个DNA双链断裂(DSB)。通过操纵细胞内源的DSB修复途径，将产生一定比例的基因编辑目的产物，实现基因编辑的目的。
Cas核酸酶诱导的DSB主要利用细胞内两条进化上保守的修复途径同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)来修复。HR主要活跃于细胞周期的S和G2期，主要利用姊妹染色单体为同源模板，修复DNA复制偶联的DSB。NHEJ则是在整个细胞周期都能运作，通过连接DNA断裂的两个末端修复DNA。NHEJ主要是由几个核心因子执行完成，这几个核心因子包括KU70/KU80、DNA-PKcs、XRCC4/DNA ligase 4等，这条NHEJ途径通常称为经典型NHEJ(classical NHEJ，c-NHEJ)。然而，当有的NHEJ核心因子不能及时参与时，NHEJ依然可以依赖于其它因子或替代因子完成，但效率降低，删除或插入的频率增加、长度加长，且连接更需要微同源序列(microhomology，MH)的帮助。为了区别c-NHEJ，我们称这条途径替代型EJ(alternativeendjoining，a-EJ)。在修复DSB时，这三条修复途径可以相互竞争。因为KU70/KU80是真核细胞中含量最高的蛋白之一，DSB末端的结合力也强，因此，c-NHEJ在这三条修复途径中占主导地位，抑制c-NHEJ将明显提高HR和a-EJ的利用度。正如此，利用小分子抑制剂(比如DNA-PKcs的抑制剂NU7441、NU7926、M3814、KU0060648和DNA ligase 4抑制剂SCR7)抑制c-NHEJ是目前提升HR介导的基因编辑效率的一个主要策略。
在基因编辑中Cas核酸酶可以脱靶切割，产生脱靶效应，严重影响基因编辑的精准度和安全性。为了降低脱靶，许多研究团队通过定向进化和理性设计，构建出许多脱靶率低、基因编辑特异性高的SpCas9变体。然而，这些设计也伴随一定程度的基因编辑效率下降。为了提高这些SpCas9变体的基因编辑效率，c-NHEJ小分子抑制剂应该是一个可以利用的选择。然而，我们发现，当利用c-NHEJ小分子抑制剂提升HR介导的CRISPR/Cas基因编辑效率时，这些小分子也能作用在脱靶位点，提高a-EJ的效率，加重脱靶效应。因此，只有定点抑制c-NHEJ的策略，而不是全细胞非靶向抑制，才能既提高靶点的CRISPR/Cas基因编辑效率，同时避免脱靶效应的恶化。
我们的研究发现，由于Cas9核酸酶诱导DSB的过程非常独特，特别是靶点切割后Cas9可能在有的靶点末端滞留相当长的时间，影响修复因子的末端结合，最终影响修复途径选择和基因编辑结果。尽管已有研究认为，dCas9的靶点结合可以松弛相邻染色质结构，增加该区域内CRISPR核酸酶的靶点识别和切割，于是提高NHEJ和HR介导的基因编辑效率，但考虑到dSpCas9-sgRNA与靶点的结合能力强(解离常数Kd约为0.2-4nM)，一个显然的猜测是dSpCas9-sgRNA可以通过占位竞争，阻断DSB修复因子的末端结合，抑制包括HR、c-NHEJ和a-EJ的DSB修复途径。而且，相对于其他DSB修复因子，KU70/KU80的末端结合能力更强(解离常数Kd约为0.15-0.4nM)，dSpCas9-sgRNA的竞争更可能针对其他因子而不是KU70/KU80，对KU70/KU80依赖的c-NHEJ影响会更小。然而，当我们将dCas9(包括SpCas9和dSaCas9)靶向结合到DNA断裂末端，我们却发现，通过占位竞争，dCas9可以阻断c-NHEJ因子KU70/KU80的末端结合，但却不阻断HR因子Mre11的末端结合，于是定点抑制c-NHEJ，提高HR效率，避免脱靶效应加重。如下的发明内容正是按此设计并得以测试和验证。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种基于dCas9的非同源末端连接(c-NHEJ)定点抑制系统及应用，该系统提高了HR效率，实现HR介导的基因编辑效率的提升而又不引起脱靶效应恶化的目的，解决了CRISPR基因编辑技术中存在的效率低和脱靶严重的问题，特别是克服c-NHEJ小分子抑制剂在基因编辑应用中脱靶加重的问题。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种基于dCas9的c-NHEJ定点抑制系统，所述系统包括：(1)元件1：用于在真核细胞内定点诱导DSB的核酸酶及其伴随元件；(2)元件2：用于结合DNA断裂末端的dCas9-sgRNA；(3)元件3：用于HR介导的基因编辑的同源模板。所述系统协同作用提高基因编辑效率。
所述用于在真核细胞内定点诱导DSB的核酸酶及其伴随元件是由Cas核酸酶及其伴随sgRNA的编码DNA序列组成，比如I-SceI、SpCas9-sgRNA、SaCas9-sgRNA、LbCas12a-sgRNA和各类SpCas9-sgRNA变体等。
所述用于结合DNA断裂末端的dCas9-sgRNA由编码dCas9及其sgRNA的DNA序列组成；将阻断KU70/KU80的末端结合，定点抑制c-NHEJ，推动HR修复，比如来自化脓性链球菌的dCas9(dSpCas9)及其伴随sgRNA(dSpCas9-sgRNA)和来自金黄色葡萄球菌的dCas9(dSaCas9)及其伴随sgRNA(dSaCas9-sgRNA)。所述的dSpCas9-sgRNA适用于与定点诱导DSB的非SpCas9核酸酶联用，dSaCas9-sgRNA适用于与定点诱导DSB的非SaCas9核酸酶联用。
所述用于HR介导的基因编辑的同源模板，可以是内源的同源序列，也可以是外源提供的两端携带同源序列、其间含目的序列的双链DNA序列或单链DNA序列。
本发明还提供一种所述基于dCas9的c-NHEJ定点抑制系统在提升HR介导的基因编辑效率中的应用，所述基因编辑效率包括基因靶向敲入效率或基因校正效率。
所述细胞内定点抑制c-NHEJ、提升HR介导的基因编辑效率的c-NHEJ定点抑制系统按方法构建：
1)选择靶向位点：根据基因编辑的目标，在目的细胞基因组中选定基因编辑的靶向位点，比如选择小鼠胚胎干细胞的Rosa26内源位点为基因敲入的靶点。
2)设计元件1：根据基因编辑靶向位点选定CRISPR核酸酶、设计伴随sgRNA的靶向间隔序列，构建CRISPR核酸酶及其sgRNA表达质粒，以便转染目的细胞，在目的细胞内表达，定点诱导DSB，进行基因编辑。CRISPR核酸酶包括LbCas12a、SaCas9和SpCas9及其变体，但不限于这三种类型；这些CRISPR核酸酶的伴随sgRNA骨架各不相同。如果元件1选择LbCas12a或SaCas9，其伴随sgRNA的设计如标准设计方法。如果元件1选择SpCas9或其变体eSpCas9或Cas9-HF1，其伴随sgRNA和截短的18-nt sgRNA的设计也如标准设计方法。
3)设计元件2：根据定点诱导DSB的CRISPR核酸酶类型，选择靶向结合DSB末端临近序列的dCas9类型，并根据DSB断口附近序列设计dCas9伴随sgRNA的靶向间隔序列，按照标准方法构建伴随sgRNA的表达质粒，sgRNA靶向位置在DSB断口上下游100bp距离之内，但不能与元件1的靶向序列有重合；在细胞内与定点诱导DSB的CRISPR核酸酶-sgRNA共表达的dCas9-sgRNA将被引导到DSB末端附近，结合其靶序列，占位阻断KU70/KU80的末端结合，定点抑制c-NHEJ，提高HR介导的基因编辑效率；dCas9类型与定点诱导DSB的CRISPR核酸酶的搭配原则遵循：dSpCas9及其伴随sgRNA与非SpCas9核酸酶搭配，而dSaCas9及其伴随sgRNA与非SaCas9核酸酶搭配。
4)设计元件3：选定基因编辑靶向位点后，根据基因编辑的目的，即校正序列或敲入特定基因，设计同源序列模板(设计单链同源序列时，同源臂长度一般两侧各为30-70bp；设计双链同源序列时，同源臂长度一般两侧各为400bp左右或更长，比如400-800bp)；比如，为了校正小鼠胚胎干细胞Rosa26位点的I-Sce-GFP基因，根据I-Sce-GFP基因序列，设计双链或单链校正序列，校正序列两侧携带双链或单链同源序列，作为同源序列模板；如果需要在小鼠胚胎干细胞Rosa26位点靶向插入GFP基因，根据基因敲入靶向位点设计、构造两侧各包含800bp同源序列的质粒，在两侧同源序列中间插入2.3kb GFP基因及其表达框，作为外源同源序列模板。
所述基于dCas9的c-NHEJ定点抑制系统在提升HR介导的基因编辑效率的操作步骤如下：在24孔板中，将元件2(dCas9-sgRNA表达质粒)，联合元件1(靶点切割的CRISPR核酸酶-sgRNA表达质粒)和元件3(同源模板)作为转染总DNA，瞬时转染目的细胞(比如小鼠胚胎干细胞)，在转染3-10天后进行流式检测或抗性选择，检测基因编辑效率；在转染的DNA中，元件1和元件2与元件3质量比为1:1:2。以在小鼠胚胎干细胞Rosa26位点中靶点敲入GFP基因为例，24孔板的转染体系设置如下：每孔DMEM培养基200μL，总细胞数1x105个；转染总DNA(元件1、元件2和元件3)量0.5μg，溶解到33μL的OptiMEM(#11058021，Gibco)，与含1.2μLLipofectamine2000(#11668019，Invitrogen)的33μL的OptiMEM混合，静置20min，随后加到24孔板的一个孔中，与细胞完全混合；转染6h后添加DMEM培养基至1000μL，24h后更换全新培养基，10天后回收细胞进行流式分析GFP靶向敲入效率。在转染的DNA中，元件1(核酸酶切割体系)和元件2(dSpCas9-sgRNA)结合体系各占一半，分配质量各为0.125μg，DNA同源模板为0.25μg。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
1、定点、高效抑制c-NHEJ修复途径。dCas9具备强劲的结合力和持久的滞留能力，在DNA末端能够通过有效占位竞争，阻断KU70/KU80的DSB末端识别与结合，进一步阻碍DNA-PKcs和XRCC4-DNA ligase 4的招募，抑制c-NHEJ。但dCas9的占位竞争并不阻断反而推动HR因子Mre11的DSB末端识别与结合，于是不抑制HR。因此，针对I-SceI、LbCas12a和SaCas9核酸酶定点诱导的DSB，可以设计sgRNA将dSpCas9准确地结合在断点附近，阻断c-NHEJ对末端的识别，抑制c-NHEJ修复途径。而针对SpCas9-sgRNA变体定点诱导的DSB，可以设计sgRNA将dSaCas9准确地结合在断点附近，达到相似的c-NHEJ抑制效果。
2、定点、高效提升HR修复效率。dCas9结合在DSB末端抑制c-NHEJ，原本需要c-NHEJ修复的DSB一部分将改用HR修复途径，于是HR修复效率得以提升。正常情形下绝大部分DSB的修复依赖于c-NHEJ，因此c-NHEJ的抑制将明显提升HR效率，这个结果也得以证实。
3、有效提升HR介导的CRISPR基因编辑效率，包括靶向基因校正和基因敲入效率。在CRISPR基因编辑中，HR介导的基因编辑效率偏低，严重限制其应用与推广。基于dCas9的c-NHEJ定点抑制可以有效提升HR介导的CRISPR基因编辑效率，包括靶向基因校正和基因敲入的效率。
4、基于dCas9的c-NHEJ定点抑制不加剧CRISPR基因编辑的脱靶效应。脱靶效应是CRISPR基因编辑应用中面临的一个严重问题。为了提高HR介导的CRISPR基因编辑效率，一个主要现有技术是利用c-NHEJ小分子抑制剂，比如DNA-PKcs的抑制剂NU7441、NU7926、M3814、KU0060648和DNA ligase 4抑制剂SCR7。但是，全局性的c-NHEJ小分子抑制剂将推动脱靶位点的a-EJ的利用率，加剧脱靶效应，同时c-NHEJ小分子抑制剂的全局性效应会产生一定的细胞毒性。相反，基于dCas9的c-NHEJ定点抑制不影响脱靶位点的修复途径选择，因此该策略特异性高，不加重脱靶效应，可以取代c-NHEJ小分子抑制剂，既能提升HR介导的CRISPR基因编辑效率，又能避免脱靶效应的恶化。
(四)附图说明
图1是本发明基于dCas9的c-NHEJ定点抑制系统的三部分元件示意图。
图2是本发明基于dCas9的c-NHEJ定点抑制系统在基因编辑中应用的示意图。A代表元件2采用dSpCas9时的作用示意图；B代表元件2采用dSaCas9时的作用示意图。
图3是本发明中的dCas9与c-NHEJ因子Ku70/Ku80和HR因子Mre11的末端结合竞争图。A代表元件2(dCas9-sgRNA)在靶向位点附近滞留时产生与NHEJ修复因子Ku70/Ku80和HR因子Mre11的竞争作用示意图；B代表在DNA断口距离不同的位置设计PCR引物定量富集DNA片段的示意图；C代表染色质免疫沉淀检测元件2(dCas9)在DNA断口距离不同位置的DNA片段富集柱形图；D代表Ku80在DNA断口距离不同位置的DNA片段富集柱形图；E代表Mre11在DNA断口距离不同位置的DNA片段富集柱形图。
图4是实施例2基于dCas9的c-NHEJ的定点抑制图。A代表NHEJ报告系统示意图及在元件1附近不同位置加入元件2的示意图；B代表采用LbCas12a作为元件1时元件2对c-NHEJ的抑制情况；C代表采用SaCas9作为元件1时元件2对c-NHEJ的抑制情况。B和C中每个sgRNA括号内的数字代表其距离元件1诱导的断点的距离。
图5是实施例3基于dCas9的HR的定点提升图。A代表HDR报告系统采用元件1在I-SceI识别位点附近诱导产生DSB示意图。B代表元件2在HDR报告系统上结合位点示意图。C代表采用I-SceI作为元件1时，抑制剂及元件2对HDR修复效率的影响；D代表采用LbCas12a作为元件1时，抑制剂及元件2对HDR修复效率的影响；E代表采用SaCas9作为元件1时，抑制剂及元件2对HDR修复效率的影响。C-E中每个sgRNA括号内的数字代表其距离元件1诱导的断点的距离。
图6是实施例4基于dSpCas9的基因靶向校正定点提升图。A代表基因校正I-SceI-GFP报告系统。B代表采用LbCas12a作为元件1时，c-NHEJ抑制剂NU7441和元件2对基因靶向校正效率影响的FACS检测图。C代表采用SaCas9作为元件1时，NU7441和元件2对基因靶向校正效率影响的FACS检测图。
图7是实施例5基于dSpCas9的基因靶向敲入定点提升图。A代表定向在小鼠细胞Rosa26位点插入GFP基因的示意图。B代表元件2在不同位置对元件1(LbCas12a-gR6d、LbCas12a-gR13c)诱导的基因靶向敲入效率提升效应的FACS检测图。C代表元件2在不同位置对元件1(SaCas9-gR6e、SaCas9-gR6f)诱导的基因靶向敲入效率提升效应的FACS检测图。
图8是实施例6脱靶效应影响图。A代表c-NHEJ抑制剂NU7441和元件2对SaCas9-gSaHR脱靶效应影响的FACS检测图。B代表NU7441和元件2对LbCas12a-gR-6d脱靶效应影响的FACS检测图。C代表NU7441和元件2对SaCas9-gR-6f脱靶效应的影响。
图9是实施例7基于dSaCas9的基因靶向校正定点提升图。A代表HDR报告系统采用元件1(即I-SceI和SpCas9变体)在I-SceI识别位点附近诱导产生DSB示意图。两个dSaCas9的伴随sgRNA靶向位点也标记。B代表利用dSaCas9作为元件2对SpCas9变体eSpCas9、SpCas9-HF1和SpCas9-截断sgRNA诱导HDR的影响，每个sgRNA括号内的数字代表其距离元件1诱导的断点的距离。C代表基因校正I-SceI-GFP报告系统及基因校正示意图。D代表dSaCas9-sgRNA作为元件2对元件1(即eSpCas9-gHRC2)诱导的基因基因靶向校正效率影响的FACS检测图。E代表dSaCas9-sgRNA作为元件2对元件1(即SpCas9-HF1-gHRC2)诱导的基因基因靶向校正效率影响的FACS检测图。F代表dSaCas9-sgRNA作为元件2对元件1(即SpCas9-gHRC4-T17)诱导的基因基因靶向校正效率影响的FACS检测图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例中核苷酸序列说明：
SEQ ID NO.1：NHEJ报告系统(pPGK+Koz-ATG+ATG-GFP)。
SEQ ID NO.2：HDR报告系统(TrGFP+pPGK+I-SceIGFP)。
SEQ ID NO.3：修改的I-SceI-GFP基因纠正报告系统(pPGK+I-SceIGFP)。
SEQ ID NO.4：用于基因纠正的单链DNA(ODNs I-SceIGFP)。
SEQ ID NO.5：用于基因纠正的双链DNA核心序列(dsDNATrGFP)。
SEQ ID NO.6：用于基因靶向敲入的模板序列1，包含同源序列(mRosa26#6pCMV-GFP)。
SEQ ID NO.7：用于基因靶向敲入的同源序列2，包含同源序列(mRosa26#13pCMV-GFP)。
SEQ ID NO.8：未装载SpCas9-sgRNA靶向序列的骨架序列(SpCas9-U6)；
SEQ ID NO.9：未装载SaCas9-sgRNA靶向序列的骨架序列(SaCas9-U6)。
实施例1：dCas9末端结合定点抑制c-NHEJ的原理
根据图1和图2，参见图3中A，元件2(dCas9)在靶向位点附近滞留时产生与NHEJ修复因子Ku70/Ku80和HR因子Mre11的竞争作用，具体实验如下：
在HDR报告系统(TrGFP+pPGK+I-SceIGFP，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)上设计LbCas12a蛋白-gLbCas12a-HR(元件1)的靶向切割位点(gLbCas12a-HR的间隔序列如ATTACCCTGTTATCCCTACGATG所示)，并在DSB断口的上游处-54bp～-31bp设计dCas9-gGw4(元件2)的结合位点(gGw4间隔序列如CCTCGAACTTCACCTCGGCG)。将元件1和元件2转染携带HDR报告系统的小鼠胚胎干细胞。将0.5μg转染DNA与33μL OPTI-MEM混合成为A液，将1.2μLLipofectamine 2000与33μL OPTI-MEM混合成为B液。混合A液与B液混合孵育20min后，与200μL含有1x105个细胞的DMEM培养液混合，在24孔板中进行培养。细胞培养条件为37℃，二氧化碳浓度为5％。转染质粒24h后收集细胞，进行常规的染色质免疫共沉淀(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)。具体地，ChIP实验使用
Figure BDA0004088447520000052
Plus EnzymaticChromatin IP Kit(#9003，CST)进行。首先，收集1x107个细胞，用1％甲醛在37℃固定10min，随后加入0.125M甘氨酸在室温孵育5min终止反应。细胞用1mL Buffer A悬浮，冰上孵育10min，随后3000rpm在4℃离心5min，获得沉淀。沉淀用Buffer B重悬并清洗一次，随后用100μL Buffer B重悬，并加入0.5μL Micrococcal nuclease在37℃消化10min，将DNA消化成150-600bp大小。加入10μL 0.5M EDTA终止消化反应，12000g在4℃离心5min，获得沉淀。使用100μL ChIP Buffer重悬，并利用超声打破核膜，12000g在4℃离心10min，移去沉淀。将100μL含有染色质片段的上清液加入400μL ChIP Buffer，取出10μL作为input对照。剩余液体加入1μg抗体(Ku80抗体、Flag标签抗体、Mre11抗体；以及对照IgG抗体，如下所述)，4℃孵育12h。随后加入20μL Protein G磁珠，4℃孵育2h。将样本放置于磁力架上吸附磁珠，移去上清液，用1mL低盐液洗磁珠3次，1mL高盐液洗磁珠1次，最终获得富集目标染色质的磁珠。每个染色质沉淀样本和input对照加入150μL ChIP Elution Buffer，65℃孵育30min，利用磁力架吸附磁珠，获得洗脱液。洗脱液中加入6μL 5M NaCl和2μL ProteinaseK，65℃孵育2h解交联。随后用DNA纯化柱提取富集的DNA片段。在DNA断口距离不同的位置(DSB断点上下游3kb距离内)设计PCR引物(表1)，定量富集DNA片段考察相应蛋白在DNA上结合的水平(图3中B)。
表1用于qPCR检测靶点DNA富集的引物：
Figure BDA0004088447520000051
Figure BDA0004088447520000061
(1)dCas9的Flag抗体
如上述方法所述，在携带HDR报告系统的小鼠胚胎干细胞中转染元件1与元件2，24h收集细胞进行ChIP实验。利用Flag抗体富集元件2(dCas9-sgRNA)的Flag-dSpCas9及元件2结合的靶点DNA。如图3中C所示，在转染元件1(即LbCas12a-gLbCas12a-HR)诱导DSB断裂的细胞中，如果没有sgRNA介导Flag-dCas9的靶点结合，Flag抗体无法富集任何DNA片段，表明没有dCas9结合在HDR报告系统的DNA序列上(如dSpCas9-Ctrl IP：Flag对dSpCas9-CtrlIP：IgG所示)。在元件1切割靶点时如果元件2(即dSpCas9-gGW4)存在，Flag-dSpCas9在HDR报告系统的元件1(LbCas12a-gLbCas12a-HR)切割DNA的位置上游-253bp～-148bp和-102bp～-33bp两处显著富集，表明元件2(即dSpCas9-gGW4)有效结合在靶点发挥作用(图3中C，如dSpCas9-gGW4 IP：Flag对dSpCas9-gGW4 IP：IgG所示)。
(2)Ku80抗体
如上述方法所述，在携带HDR报告系统的小鼠胚胎干细胞中转染元件1与元件2，24h收集细胞进行ChIP实验。利用Ku80的抗体进行DNA片段富集，Ku80抗体富集的DNA片段代表了Ku80在HDR报告系统上的结合位置。在转染元件1(即LbCas12a-gLbCas12a-HR)诱导DSB断裂的细胞中，如果没有sgRNA介导Flag-dCas9的靶点结合，即元件2不完整时，Ku80在DNA游离端的-253bp～-148bp和-102bp～-33bp两处显著富集(图3中D，dSpCas9 Ctrl IP：Ku80对dSpCas9 Ctrl IP：IgG所示)。如果转染的元件2完整，元件2(即dSpCas9-gGW4)结合到元件1(即LbCas12a-gLbCas12a-HR)切割DNA产生的DSB游离端的靶点，Ku80在游离端的结合明显下降(-253bp～-148bp和-102bp～-33bp)，说明元件2(即dSpCas9-gGW4)的结合阻碍了Ku70/Ku80复合物对DNA末端的结合(图3中D，如dSpCas9-gGW4 IP：Ku80对dSpCas9-gGW4 IP：IgG所示)。
(3)Mre11抗体
如上述方法所述，在携带HDR报告系统的小鼠胚胎干细胞中转染元件1与元件2，24h收集细胞进行ChIP实验。利用Mre11的抗体进行DNA片段富集，Mre11抗体富集的DNA片段代表了Mre11在HDR报告系统上的结合位置。在转染元件1(即LbCas12a-gLbCas12a-HR)诱导DSB断裂的细胞中，如果没有sgRNA介导Flag-dCas9的靶点结合，即元件2不完整时，Mre11在断裂点两侧都有少量富集，特别是在-888bp～-801bp和769bp～899bp处富集较为显著(图3中E，dSpCas9 Ctrl IP：Mre11对dSpCas9 Ctrl IP：IgG所示)。如果转染的元件2完整，元件2(即dSpCas9-gGW4)结合到元件1(即LbCas12a-gLbCas12a-HR)切割DNA产生的DSB游离端的靶点，Mre11在元件2(即dSpCas9-gGW4)结合端的富集显著提升，尤其是在-2736～-2608bp，-1825～-1675bp和-888～-801bp处，提升可高达10倍，说明元件2(即dSpCas9-gGW4)的结合不仅不阻断、反而推动DSB末端的Mre11招募(图3中E，如dSpCas9-gGW4 IP：Mre11对dSpCas9-gGW4 IP：IgG所示)。
实施例2：dCas9末端结合抑制c-NHEJ参与末端DSB修复
利用dCas9强劲的结合能力，将dCas9-sgRNA结合在DNA的断裂末端，可以阻止c-NHEJ因子对DNA末端的识别，从而抑制c-NHEJ参与末端DSB修复。为了测试这一策略，我们利用LbCas12a和SaCas9诱导DSB产生，利用dCas9-sgRNA结合损伤末端，考察断裂点NHEJ修复水平，同时与DNA-PKcs抑制剂处理效果进行比较，具体实验步骤如下：
利用NHEJ报告系统(pPGK+Koz-ATG+ATG-GFP，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)进行测试，该报告系统包含一个GFP模块(即ATG-GFP模块)。正常条件下，NHEJ报告系统由“Koz-ATG”(即Koz-ATG模块)起始翻译，编码产生移码GFP，细胞并不发出荧光。利用核酸酶在“Koz-ATG”和“ATG-GFP”之间诱导DSB后，细胞通过NHEJ修复时将有一定几率将GFP正确移码，从而使细胞发出绿色荧光。在利用LbCas12a和SaCas9诱导DSB的同时，在断口附近设计多组结合DNA末端的dCas9-sgRNA(sgRNA见表2，包括gEJc1、gEJc2、gEJc3、gEJc4、gEJc6、gEJc7、gEJc8、gEJc9、gEJw1、gEJw2、gEJw8、gEJw9)，阻断c-NHEJ的进行(图4中A)。绿色荧光细胞的比例可以用流式细胞术进行测量，绿色荧光细胞比例也代表了m-NHEJ修复的相对效率。
表2 sgRNA的靶点靶向的间隔序列
Figure BDA0004088447520000071
(1)DNA-PKcs抑制剂
在24孔板中进行细胞转染，转染元件1包括0.5μg LbCas12a-sgRNA或0.5μg的SaCas9-sgRNA。
将0.5μg的转染DNA(元件1)共1μL，溶解到33μL的OptiMEM(#11058021，Gibco)，与含1.2μL lipofectamine 2000(#11668019，Invitrogen)的33μL的OptiMEM混合，共68.2μL转染混合液，室温静置20min。同时准备含NHEJ报告系统的小鼠胚胎干细胞的悬浮液，加入200μL含1x105个细胞的悬浮液到24孔板的一个孔中。随后将室温静置20min的转染混合液68.2μL加入到含200μL细胞悬浮液的孔中，均匀混合。在37℃培养箱中培养6h后，加入含终浓度1mL/L的DMSO或终浓度5μM的DNA-PKcs抑制剂NU7441(TopScience Cat#T6276)的DMEM培养基，继续培养24h。随后更换含相同浓度药物的新鲜培养基1mL。72h后收集细胞并通过流式细胞仪检测GFP荧光效率。作为C-NHEJ的抑制剂，NU7441能够显著抑制LbCas12a和SaCas9诱导的m-NHEJ效率，抑制效率分别为40％和25％(图4中B、C的gCtrl柱)。由于LbCas12a和SaCas9具备较强的再切割能力，因此绝大部分m-NHEJ产物是有c-NHEJ途径介导的。
(2)dSpCas9-sgRNA
在DNA断裂点上下游200bp距离之内设计多组dCas9-sgRNA(表2)进行末端结合，考察dCas9末端阻断对LbCas12a和SaCas9诱导m-NHEJ效率的影响。各dCas9识别PAM序列前3位和前4位之间到LbCas12a和SaCas9诱导断点之间的距离定义为dCas9末端结合的距离，在柱状图的X轴上标注。
在24孔板中进行细胞转染，每孔转染0.25μg元件1(LbCas12a-sgRNA或SaCas9-sgRNA)和0.25μg元件2(dSpCas9-sgRNA)。将需要转染的DNA(元件1和元件2)量0.5μg(共1μL)溶解到33μL的OptiMEM(#11058021，Gibco)，与含1.2μL lipofectamine 2000(#11668019，Invitrogen)的33μL的OptiMEM混合，共68.2μL转染混合液，室温静置20min。同时准备含NHEJ报告系统的小鼠胚胎干细胞的悬浮液，加入200μL含1x105个细胞的悬浮液到24孔板的一个孔中。随后将室温静置20min的转染混合液68.2μL加入到含200μL细胞悬浮液的孔中，均匀混合。在37℃培养箱中培养6h后每孔加入800μL新鲜DMEM培养基，转染24h后更换新鲜DMEM培养基1mL。72h后收集细胞并通过流式细胞仪检测GFP荧光效率。与DNA-PKcs效果一致，利用gEJC6、gEJC7、gEJC8、gEJW8或gEJW9将dCas9结合在LbCas12a切割位点下游，以及利用gEJC1、gEJC2、gEJW1、gEJC3、gEJW2或gEJC4将dCas9结合在LbCas12a切割位点上游，可以显著降低LbCas12a诱导的m-NHEJ效率，抑制效率在40％-80％(图4中B)。在SaCas9诱导的m-NHEJ中，gEJC2、gEJW1、gEJC3、gEJW2、gEJC4、gEJC6、gEJC7、gEJC8、gEJW8或gEJW9也能有效抑制m-NHEJ效率，抑制效果在30％-60％(图4中C)。
我们可以发现，将绝大多数dCas9-sgRNA结合在LbCas12a或SaCas9诱导断裂的两侧，距离在100bp之内，都能有效的降低LbCas12a和SaCas9诱导的m-NHEJ效率，最高达到4倍。这种效果与DNA-PKcs抑制剂处理LbCas12a和SaCas9诱导的m-NHEJ的表现也一致。这些结果证明，dCas9-sgRNA结合在DNA断裂末端两侧可以抑制c-NHEJ的发生。
实施例3：dCas9末端结合抑制c-NHEJ推动HDR
抑制c-NHEJ途径将推动HDR途径的发生，因此我们将测试dCas9末端结合能否推动HDR效率。HDR效率可用HDR报告系统(TrGFP+pPGK+I-SceIGFP，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)进行测试，该报告系统包含两个GFP模块，一个是5’缺失的GFP(TrGFP)，作为重组时的同源模板(报告系统上游含缺口的长方形)，类似于元件3，但HDR报告系统自身带有；另一个为包含I-SceI位点的GFP(报告系统下游长方形)，因此正常情况下，细胞不会发出任何荧光。利用核酸酶在I-SceI位点附近诱导DSB，细胞可以通过HDR途径，利用相邻的姊妹染色单体的TrGFP同源序列作为模板(紫色箭头所指处)，通过HDR生成绿色荧光细胞(wtGFP)，因此绿色荧光细胞的比例代表了HDR的相对效率(图5中A)。
在24孔板中进行细胞转染，转染元件1包括0.5μg的I-SceI、0.5μg的LbCas12a-sgRNA或0.5μg的SaCas9-sgRNA。将需要转染的DNA量0.5μg(共1μL)溶解到33μL的OptiMEM(#11058021，Gibco)，与含1.2μL Lipofectamine 2000(#11668019，Invitrogen)的33μL的OptiMEM混合，共68.2μL转染混合液，室温静置20min。同时准备含HDR报告系统的小鼠胚胎干细胞的悬浮液，加入200μL含1x105个细胞的悬浮液到24孔板的一个孔中。随后将室温静置20min的转染混合液68.2μL加入到含200μL细胞悬浮液的孔中，均匀混合。在37℃培养箱中培养6h后每孔分别加入800μL含终浓度1mL/L的DMSO或终浓度5μM的NU7441(TopScienceCat#T6276)的DMEM培养基，转染24h后更换含相同浓度药物的新鲜DMEM培养基1mL。72h后收集细胞并通过流式细胞仪检测GFP荧光效率。结果显示DNA-PKcs抑制剂处理有效提升HDR效率(图5中C、D、E中gCtrl)。
同样，我们设计多组dCas9-sgRNA(图5中B，sgRNA见表2，包括gGC1至gGC8、gGC11-至gGC18、gGW1、gGW3至gGW5、gGW7至gGW11)，在HDR报告系统上测试dCas9末端结合能否推动HDR途径发生。各dCas9识别PAM序列前3位和前4位之间到I-SceI、LbCas12a或SaCas9诱导断点之间的距离定义为dCas9末端结合的距离，在柱状图的X轴上标注。24孔细胞每孔转染0.25μg元件1(I-SceI、LbCas12a-sgRNA或SaCas9-sgRNA)和0.25μg元件2(dSpCas9-sgRNA)，共1μL。将需要转染的0.5μg DNA(元件1和元件2)(共1μL)溶解到33μL的OptiMEM(#11058021，Gibco)，与含1.2μL Lipofectamine 2000(#11668019，Invitrogen)的33μL的OptiMEM混合，共68.2μL转染混合液，室温静置20min。同时准备含HDR报告系统的小鼠胚胎干细胞的悬浮液，加入200μL含1x105个细胞的悬浮液到24孔板的一个孔中。随后将室温静置20min的转染混合液68.2μL加入到含200μL细胞悬浮液的孔中，均匀混合。在37℃培养箱中培养6h后分别加入800μL新鲜DMEM培养基，转染24h后更换新鲜DMEM培养基1mL。72h后收集细胞并通过流式细胞仪检测GFP荧光效率。在设计的25组dCas9-sgRNA中，dCas9结合在多个位点都能提升HDR效率。在I-SceI诱导的HDR中，dCas9末端结合后HDR效率最多能提升5.5倍；dCas9末端结合也将LbCas12a和SaCas9诱导的HDR效率最高提升3倍(图5中C-E)。这种提升效果和DNA-PKcs抑制剂处理一致，有的还优于DNA-PKcs抑制效果。一般来说，dCas9阻断位置离DNA断点越近，阻断效果越佳，其提升HDR效率的能力也越强。距离断裂点越远，效果逐渐减弱，甚至消失，原因有可能是距离断裂点较远处，DNA-PKcs几乎不结合，因此dCas9阻断也不起任何效果。
实施例4：dCas9末端结合抑制c-NHEJ提升HDR介导的基因校正
dCas9末端结合可以抑制c-NHEJ途径并推动末端HDR修复，我们将测试dCas9末端结合策略能否应用于提升基于HDR的基因校正。采用I-SceI-GFP基因校正报告系统(pPGK+I-SceIGFP，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)来测试基因校正的效率，正常情况下，I-SceI-GFP表达没有活性的GFP，因此细胞并不发出荧光。在I-SecI附近诱导断裂，并提供外源模板，包括寡脱氧核苷酸(ssODN)或双链DNA(dsDNA)(虚线框中所示)。外源模板携带部分正确的GFP序列，细胞以外源模板上同源序列进行HDR修复后，细胞将表达GFP荧光蛋白，通过FACS检测获得基因校正效率(图6中A)。I-SceI-GFP基因校正报告系统在原有HDR报告系统基础上删除了TrGFP基因，因而在HDR修复时必须通过外源导入元件3作为修复模板。测试时采用单链短片段DNA(ssODN)和双链环形DNA(dsDNA)两种方式导入同源模板。
为了比较元件2和DNA-PKcs小分子抑制剂的作用效果，我们先测试DNA-PKcs小分子抑制剂。24孔板细胞转染元件1(LbCas12a或SaCas9)在I-SceI-GFP基因的I-SceI识别位点附近切割，转染元件3(ssODN、dsDNA)作为修复模板。在转染的DNA中核酸酶切割体系LbCas12a-sgRNA或SaCas9-sgRNA为0.25μg，寡脱氧核苷酸同源模板(ssODN，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)为0.125μg，双链DNA同源模板(dsDNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)为0.25μg。将需要转染的DNA(元件1和元件3)(共1μL)溶解到33μL的OptiMEM(#11058021，Gibco)，与含1.2μL Lipofectamine 2000(#11668019，Invitrogen)的33μL的OptiMEM混合，共68.2μL转染混合液，室温静置20min。同时准备含基因校正报告系统的小鼠胚胎干细胞的悬浮液，加入200μL(含1x105个细胞)的悬浮液到24孔板的一个孔中。随后将室温静置20min的转染混合液68.2μL加入到含200μL细胞悬浮液的孔中，均匀混合。在37℃培养箱中培养6h后，每孔分别加入800μL含终浓度1mL/L的DMSO或终浓度5μM的NU7441(TopScience Cat#T6276)的DMEM培养基，转染24h后更换含相同浓度药物的新鲜DMEM培养基1mL。72h后通过流式细胞仪检测GFP荧光，GFP+细胞频率代表了细胞进行基因靶向校正效率。无论是ssODN还是dsDNA作为模板，LbCas12a和SaCas9诱导的基因校正效率大约在1-2％之间，利用DNA-PKcs抑制剂处理能略微提升基因校正效率(图6中B,C，NU7441对DMSO)。
末端结合dSpCas9-gGW4或dSpCas9-gGC13可以有效提升LbCas12a诱导的HDR，而dSpCas9-gGC7和dSpCas9-gGC13可以有效提升SaCas9诱导的HDR，那么我们也利用这些dCas9-sgRNA，考察末端阻断对基因校正效率的影响。元件1(LbCas12a或SaCas9)在I-SceI-GFP基因的I-SceI识别位点附近切割，并将元件2(dSpCas9)结合在断点附近，同时提供元件3(ODNs或dsDNA)。转染时包含元件1、元件2和元件3，质粒质量按1:1:2分配，共0.5μg(1μL)。将需要转染的DNA(元件1、元件2和元件3)(共1μL)溶解到33μL的OptiMEM(#11058021，Gibco)，与含1.2μL Lipofectamine 2000(#11668019，Invitrogen)的33μL的OptiMEM混合，共68.2μL转染混合液，室温静置20min。同时准备含基因校正报告系统的小鼠胚胎干细胞的悬浮液，加入200μL(含1x105个细胞)的悬浮液到24孔板的一个孔中。24孔细胞每孔转染0.125μg元件1(LbCas12a-sgRNA或SaCas9-sgRNA)和0.125μg元件2(dSpCas9-sgRNA)，寡脱氧核苷酸(ssODN)同源模板为0.25μg，双链DNA同源模板为0.25μg。随后将室温静置20min的转染混合液68.2μL加入到含200μL细胞悬浮液的孔中，均匀混合。在37℃培养箱中培养6h后每孔分别加入800μL新鲜DMEM培养基，转染24h后更换新鲜DMEM培养基1mL。72h后收集细胞并通过流式细胞仪检测GFP荧光效率。结果表明，dSpCas9-gGW4或dSpCas9-gGC13结合在末端，将显著提升LbCas12a介导的基因校正效率，其中ODNs组提升幅度近4倍，dsDNA组提升幅度近2倍(图6中B)。同样地，SaCas9诱导的基因校正在dSpCas9-gGC7和dSpCas9-gGC13的阻断下也有明显提升，在ODNs和dsDNA组中提升近2倍(图6中C)。
实施例5：dCas9末端结合提升大片段DNA精准靶向整合基因组的效率
我们检测dCas9末端结合能否提升大片段DNA靶向整合基因组的效率，具体实验操作如下：
选择小鼠基因组内源位点Rosa26作为基因整合的位点，可利用LbCas12a和SaCas9在细胞内该基因组位点诱导DSB产生，元件3包含800bp的小鼠Rosa26同源序列，中间插入含pCMV启动子的完整GFP基因。当元件1在小鼠Rosa26位点诱导DSB时，细胞有一定概率将元件3作为同源模板进行HDR修复，从而稳定表达GFP基因。将2.3kb长度的pCMV-β-globin-GFP表达模块作为精准靶向整合基因组的报告基因，在其两侧各装入切割位点两侧800bp长度的同源序列，并将该双链环状DNA作为模板(该报告基因表达模块如SEQ ID No.6所示，两侧的同源序列如SEQ ID No.7所示)。LbCas12a和SaCas9诱导DSB利用同源模板进行HDR修复，可以将GFP表达模块整合到基因组上，使得细胞永久表达GFP绿色荧光(图7中A)。
我们在LbCas21a和SaCas9的切割位点两侧分别设计了dCas9的结合sgRNA，用于DNA末端阻断。24孔板细胞转染元件1(LbCas12a或SaCas9-sgRNA)在mRosa26基因内切割，利用元件2(dSpCas9-sgRNA)靶向结合切口上游和下游各3个不同位点，同时提供元件3(双链环形DNA)作为同源模板。转染时元件1、元件2和元件3的质粒质量按1:1:2分配。元件1的伴随sgRNA序列如表3所示，元件2的伴随sgRNA序列如表2所示，元件3核心序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。24孔细胞每孔转染0.125μg元件1(LbCas12a-sgRNA或SaCas9-sgRNA)和0.125μg元件2(dSpCas9-sgRNA)，元件3的双链DNA同源模板为0.25μg，总共0.5μg(1μL)。将需要转染的DNA(元件1、元件2和元件3)(共1μL)溶解到33μL的OptiMEM(#11058021，Gibco)，与含1.2μL Lipofectamine 2000(#11668019，Invitrogen)的33μL的OptiMEM混合，共68.2μL转染混合液，室温静置20min。同时准备小鼠胚胎干细胞的悬浮液，加入200μL(含1x105个细胞)的悬浮液到24孔板的一个孔中。随后将室温静置20min的转染混合液68.2μL加入到含200μL细胞悬浮液的孔中，均匀混合。在37℃培养箱中培养6h后每孔分别加入800μL新鲜DMEM培养基，转染24h后更换新鲜DMEM培养基1mL。随后，每48h进行细胞传代，10d后通过流式细胞仪检测GFP荧光，所获的GFP+细胞频率代表细胞基因靶向敲入效率。
表3 sgRNA靶点靶向的间隔序列
sgRNA名 序列
gSa-Gc2 GGCAACATCCTGGGGCACAAGC
gSa-Gw6 CGCCCTCGAACTTCACCTCGGC
gSa-Gw7 CCTTCAGCTCGATGCGGTTCAC
gSa-Gw8 GTTGTACTCCAGCTTGTGCCC
gSaEJ AGGATGGATCCTAGGGATAA
gSaHR TGAAGGGCATCGTAGGGATAA
gSa-R-6e TAAATGTGGTATCTTTAGAACC
gSa-R-6f GTATCTTTAGAACCAAGGGTCT
gLbCas12a-EJ CCCTGTTATCCCTAGGATCCATC
LbCas12a-HR ATTACCCTGTTATCCCTACGATG
LbCas12a-R-6d GAACCAAGGGTCTTAGAGTTTTA
gLbCas12a-R-13c ACCATTAGGGCAAATGGCAACAT
在Rosa26位点中，LbCas12a-gR6d、SaCas9-gR6e和SaCas9-gR6f诱导的基因整合效率在1％-2％之间，LbCas12a-gR13c诱导的基因整合效率相对较低，大约在0.1％左右。只转入GFP模板而不诱导靶点切割的对照组中，10天后本底的GFP阳性细胞比例接近于0，说明大片段DNA序列通过HDR途径定向整合至靶位点(图7中B,C)。将dSpCas9-gR1结合在LbCas12a-gR6d诱导DSB的下游末端，可以将基因整合效率从1.6％提升至2.3％；dSpCas9-gR2则将LbCas12a-gR13c诱导的基因整合效率从0.15％提升至0.3％(图7中B)。在SaCas9-gR6e诱导的基因整合中，gL1、gR1、gR2和gR3引导的dSpCas9末端结合都能不同程度地提升整合效率，从2.1％提升至2.7-3.2％；而gL1和gR3介导的dSpCas9末端结合将SaCas9-gR6f诱导的基因整合效率从2.6％提升至3.5-4.0％(图7中C)。
实施例6：dCas9阻断对脱靶效应的影响
我们考察了dCas9阻断对脱靶效应的影响。与DNA-PK抑制剂不同，dCas9断裂末端靶向结合理论上不会对脱靶位点产生影响。为此，我们选择基因整合时LbCas12a-gR-6d和SaCas9-gR-6f的切割位点，检测脱靶效应。
在24孔细胞中转染元件1(LbCas12a-gR6d或SaCas9-gR6f)在小鼠Rosa26基因位点切割。使用CRISPOR网站预测脱靶位点，对切口附近DNA进行深度测序检测脱靶位点发生碱基突变的概率。转染的DNA中核酸酶切割体系LbCas12a-sgRNA或SaCas9-sgRNA为0.5μg(共1μL)，溶解到33μL的OptiMEM(#11058021，Gibco)，与含1.2μL lipofectamine 2000(#11668019，Invitrogen)的33μL的OptiMEM混合，共68.2μL转染混合液，室温静置20min。同时准备小鼠胚胎干细胞的悬浮液，加入200μL(含1x105个细胞)的悬浮液到24孔板的一个孔中。随后将室温静置20min的转染混合液68.2μL加入到含200μL细胞悬浮液的孔中，均匀混合。在37℃培养箱中培养6h后，每孔分别加入800μL含终浓度1mL/L的DMSO或终浓度5μM的NU7441(TopScience Cat#T6276)的DMEM培养基，转染24h后更换含相同浓度药物的新鲜DMEM培养基1mL。
在dSpCas9末端结合实验中，转染时包含元件1和元件2，质粒质量按1:1分配。24孔板中每孔转染0.25μg元件1(LbCas12a-sgRNA或SaCas9-sgRNA)和0.25μg元件2(dSpCas9-sgRNA)。共68.2μL转染混合液，室温静置20min。同时准备小鼠胚胎干细胞的悬浮液，加入200μL(含1x105个细胞)的悬浮液到24孔板的一个孔中。随后将室温静置20min的转染混合液68.2μL加入到含200μL细胞悬浮液的孔中，均匀混合。在37℃培养箱中培养6h后，每孔分别加入800μL新鲜DMEM培养基，转染24h后更换新鲜DMEM培养基1mL。72h后回收细胞，分离纯化基因组DNA，PCR扩增靶点和所测试脱靶的切口附近250bp序列，通过PE150方式进行二代DNA测序，常规生物信息学分析，明确准靶和脱靶效率。准靶位点(SaCas9+gSaHR、LbCas12a+gR-6d和SaCas9+gR-6f)与其对应的脱靶位点的PCR扩增引物序列如表4所示。
表4用于检测准靶位点和脱靶位点编辑效率的引物
Figure BDA0004088447520000121
DNA-PKcs抑制剂处理会略微降低靶点的编辑效率，提示LbCas12a和SaCas9具备再切割能力；而在脱靶位点，DNA-PKcs抑制剂对脱靶编辑效率要么不产生影响，要么有所提升。利用dSpCas9进行末端结合时，准靶位置的编辑效率略有下降，提示dSpCas9抑制了靶点c-NHEJ途径的参与；但是，dSpCas9结合对脱靶位置的编辑效率不产生任何影响(图8中A-C)。将脱靶位点编辑效率除以准靶位点编辑效率得到该位点的脱靶效应。结果表明，DNA-PKcs抑制剂会对脱靶效应产生加剧作用，而dSpCas9末端结合的策略不会加重脱靶效应(图8中A-C)。因此本发明是一种定向的、有效的提升HR介导的基因整合效率的新技术，不增加脱靶效应是本发明优于传统NHEJ抑制剂的一大重要功能体现。
实施例7：dSaCas9末端结合调控DSB修复途径选择
除了利用dSpCas9进行末端结合调控DSB修复途径选择，该策略可应用不同CRISPR系统进行扩展，例如联合HDR报告系统(图9中A)，利用dSaCas9进行末端结合提升HDR效率。由于SpCas9结合末端能力比SaCas9强，因此dSaCas9只能针对SpCas9变体(eSpCas9l和SpCas9-HF1)和使用截短的17-nt sgRNA搭配SpCas9诱导的DSB修复进行末端调控。将上述dSaCas9结合在SpCas9变体(即eSpCas9-gHRC2和SpCas9-HF1-gHRC2)和SpCas9搭配截短的17-nt sgRNA(即SpCas9-gHRC4-T17)诱导的DSB末端，可以测试dSaCas9的末端结合对SpCas9变体诱导的HDR效率的影响。
于是，我们在24孔细胞板每孔转染0.25μg元件1(eSpCas9-gHRC2、SpCas9-HF1-gHRC2或SpCas9-gHRC4-T17)和0.25μg元件2(dSaCas9及伴随sgRNA gSaGW7和gSaGC2，见表3)，共1μL。具体地，将需要转染的0.5μg DNA(元件1和元件2)(共1μL)溶解到33μL的OptiMEM(#11058021，Gibco)，与含1.2μL Lipofectamine 2000(#11668019，Invitrogen)的33μL的OptiMEM混合，共68.2μL转染混合液，室温静置20min。同时准备含HDR报告系统的小鼠胚胎干细胞的悬浮液，加入200μL含1x105个细胞的悬浮液到24孔板的一个孔中。随后将室温静置20min的转染混合液68.2μL加入到含200μL细胞悬浮液的孔中，均匀混合。在37℃培养箱中培养6h后分别加入800μL新鲜DMEM培养基，转染24h后更换新鲜DMEM培养基1mL。72h后收集细胞并通过流式细胞仪检测GFP荧光效率。我们发现，dSaCas9-gSaGC2将eSpCas9，SpCas9-HF1和SpCas9-gHRC4-T17诱导的HDR效率分别提升2倍，4倍和2倍，表现出较好的提升效果(图9中B)。这表明dSaCas9末端结合也起到促进HDR的局部c-NHEJ抑制剂的作用，也展示出dCas9末端结合提升HDR效率策略的极强灵活性和扩展性。
在含有I-SceI-GFP基因校正报告系统的细胞中我们进一步测试基于dSaCas9的末端结合策略在HDR介导的基因校正中的应用(图9中C)。选择SpCas9突变体(即eSpCas9-gHRC2和SpCas9-HF1-gHRC2)和使用截短sgRNA的SpCas9(即SpCas9-gHRC4-T17)诱导断裂，以ODNs或dsDNA质粒作为同源模板进行基因校正。24孔板中每孔转染0.125μg元件1(eSpCas9-gHRC2、SpCas9-HF1-gHRC2或SpCas9-gHRC4-T17)和0.125μg元件2(dSaCas9-sgRNA)，单链DNA同源模板(ssODN)为0.125μg，双链DNA同源模板(dsDNA)为0.25μg，转染DNA体积总量为1μL。元件1采用的伴随sgRNA gHRC2和gHRC4-T17靶点靶向的间隔序列如表2所示，元件2采用的伴随sgRNA靶点靶向的间隔序列如表3所示，元件3序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示。
具体地，将需要转染的1μL DNA(元件1和元件2)(共1μL)溶解到33μL的OptiMEM(#11058021，Gibco)，与含1.2μL Lipofectamine 2000(#11668019，Invitrogen)的33μL的OptiMEM混合，共68.2μL转染混合液，室温静置20min。同时准备含I-SceI-GFP基因校正报告系统的小鼠胚胎干细胞的悬浮液，加入200μL含1x105个细胞的悬浮液到24孔板的一个孔中。随后将室温静置20min的转染混合液68.2μL加入到含200μL细胞悬浮液的孔中，均匀混合。在37℃培养箱中培养6h后分别加入800μL新鲜DMEM培养基，转染24h后更换新鲜DMEM培养基1mL。72h后收集细胞并通过流式细胞仪检测GFP荧光效率。dSaCas9-gSaGC2末端结合使得eSpCas9和SpCas9-HF1诱导的基因敲入效率显著提升了4倍，与使用DNA-PKcs抑制剂NU7441处理效果一致(图9中D，E)。使用截短的gHRC4-T17，dSaCas9末端结合也提高了SpCas9诱导的基因校正入效率，提升约2倍，比DNA-PKcs抑制剂NU7441处理效果略差(提高3倍)(图9中F)。这些结果表明，dSaCas9的末端结合可以有效提升高保真SpCas9突变体介导的基因校正效率，扩展了基于dCas9的局部NHEJ抑制剂策略的基因敲入应用。

Claims (10)

1.一种基于dCas9的c-NHEJ定点抑制系统，其特征在于，所述系统包括：(1)元件1：用于在真核细胞内定点诱导DSB的核酸酶及其伴随元件；(2)元件2：用于结合DNA断裂末端的dCas9-sgRNA；(3)元件3：用于HR介导的基因编辑的同源模板。
2.如权利要求1所述的基于dCas9的c-NHEJ定点抑制系统，其特征在于，所述用于在真核细胞内定点诱导DSB的核酸酶及其伴随元件是由Cas核酸酶及其伴随sgRNA的编码DNA序列组成。
3.如权利要求1或2所述的基于dCas9的c-NHEJ定点抑制系统，其特征在于，所述用于在真核细胞内定点诱导DSB的核酸酶及其伴随元件包括I-SceI、SpCas9-sgRNA、SpCas9-sgRNA变体、SaCas9-sgRNA、LbCas12a-sgRNA。
4.如权利要求1所述的基于dCas9的c-NHEJ定点抑制系统，其特征在于，所述用于结合DNA断裂末端的dCas9-sgRNA包括dSpCas9-sgRNA或dSaCas9-sgRNA。
5.如权利要求1所述的基于dCas9的c-NHEJ定点抑制系统，其特征在于，所述用于HR介导的基因编辑的同源模板为内源的同源序列或外源提供的两端携带同源序列、其间含目的序列的双链DNA序列或单链DNA序列。
6.一种权利要求1所述基于dCas9的c-NHEJ定点抑制系统在提升HR介导的基因编辑效率中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因编辑效率包括基因靶向敲入效率或基因校正效率。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述c-NHEJ定点抑制系统按如下方法构建：
1)选择靶向位点：根据基因编辑的目标，在目的细胞基因组中选定基因编辑的靶向位点；
2)设计元件1：根据基因编辑靶向位点选定CRISPR核酸酶，设计伴随sgRNA的靶向间隔序列，构建CRISPR核酸酶及其sgRNA表达质粒；
3)设计元件2：根据定点诱导DSB的CRISPR核酸酶类型，选择靶向结合DSB末端临近序列的dCas9类型，并根据DSB断口附近序列设计dCas9伴随sgRNA的靶向间隔序列；
4)设计元件3：选定基因编辑靶向位点后，根据基因编辑的目的，设计同源序列模板。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤2)sgRNA靶向位置在DSB断口上下游100bp距离之内，但不能与元件1的靶向序列有重合。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤4)同源序列模板设计单链同源序列时，同源臂长度一般两侧各为30-70bp；设计双链同源序列时，同源臂长度一般两侧各为400-800bp。
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