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CN116286502A - 一种通过氮转化菌群抑制铜绿微囊藻生长繁殖的方法 - Google Patents

一种通过氮转化菌群抑制铜绿微囊藻生长繁殖的方法 Download PDF

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CN116286502A
CN116286502A CN202310153717.9A CN202310153717A CN116286502A CN 116286502 A CN116286502 A CN 116286502A CN 202310153717 A CN202310153717 A CN 202310153717A CN 116286502 A CN116286502 A CN 116286502A
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CN
China
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nitrogen
flora
culture
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microcystis aeruginosa
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Application number
CN202310153717.9A
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杨小龙
邓自发
邬浩
张婷
陈子涵
周贝贝
崔军
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Nantong University
Original Assignee
Nantong University
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Publication date
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Abstract

本发明公开了一种通过氮转化菌群抑制铜绿微囊藻生长繁殖的方法，包括：氮转化菌群的活化、复壮；铜绿微囊藻的培养及生长液制备；铜绿微囊藻‑氮转化菌群的共培养。本发明中的氮转化菌群能高效、快速地去除环境中的氮素，并使铜绿微囊藻的光合活性和色素合成受到明显抑制，无法开展有效光合作用进行生长、繁殖，可为开发有效的微生物除藻菌剂，通过原位生物强化脱氮技术抑制蓝藻生长及蓝藻水华暴发提供技术支持。

Description

一种通过氮转化菌群抑制铜绿微囊藻生长繁殖的方法
技术领域
本发明涉及一种抑制铜绿微囊藻生长繁殖的方法。
背景技术
蓝藻水华依然是目前全世界普遍关注的重大环境问题。近几十年来，我国的太湖、滇池、巢湖和长江流域，由铜绿微囊藻、水华鱼腥藻等引起的蓝藻水华频发，这不仅造成水生生态系统与生物资源的巨大破坏，其消亡后释放的藻毒素及其衍生污染物还可通过食物链积累、传递，对生物体组织器官造成急性或慢性损伤、甚至癌变，给人类健康构成严重威胁。
蓝藻依靠色素吸收光能进行光合作用而生长繁殖，氮素是蓝藻生长不可或缺的主要营养物之一。广泛的研究显示，水体氮含量的增加与蓝藻水华发生的频次、量级和持久性成正相关，是微囊藻水华形成和持续扩张的主要原因。相反，氮素匮乏则导致蓝藻的伪空泡合成减少，细胞下沉，加速其水华消散。水体中的氮素可被其中的氮转化细菌通过氨氧化、硝化、反硝化等作用转化，不断去除。如氨氧化菌可将NH4 +氧化为NO2 -，硝化细菌再将NO2 -氧化为NO3 -，反硝化菌则可进一步将NO3 -转化为NO、N2等气体。但江河湖泊等自然水体中的氮转化细菌丰度和数量较低，不能有效去除氮素，导致水体的富营养化程度加剧。
通过投加生物菌剂进行强化处理，是一种有效增强原位去除污染物的新兴技术，近年来倍受关注。但在自然界中，氮转化细菌存在自养型和异养型两类。由于自养型细菌的生长周期较长、生物量小、很难分离纯化得到单一菌株，因此人们广泛筛选得到的氮转化细菌为异养型细菌。然而，异养菌的生长易受到蓝藻的化感抑制，且异养菌都有个致命的缺陷，即在生长过程和氮转化过程中需要大量的有机碳。尽管许多水体富营养化，但其营养水平无法像培养基一样，并不能满足异养菌的生长，这限制了异养型氮转化细菌在开发生物菌剂强化技术来抑制蓝藻生长中的应用。
氮的转化过程是在氨氧化细菌、硝化细菌、反硝化细菌的协作和分工下完成的，这些微生物常聚集生长、形成一个菌群。已有研究证实，菌群拥有全谱微生物组合，比单菌具有更宽的降解谱系、更高的去除能力和更稳定的降解活性。然而，目前利用氮转化菌群强化除氮，通过有效削减水体中过剩氮量来抑制蓝藻生长繁殖的技术，还鲜见报道。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术，提出一种能够快速去除水体氮素并有效抑制铜绿微囊藻生长繁殖的方法。
技术方案：一种通过氮转化菌群抑制铜绿微囊藻生长繁殖的方法，包括：
1)氮转化菌群的活化：取超低温冰箱保存的氮转化菌群保藏液，溶解后无菌接入氮转化菌群液体培养基中，恒温振荡培养5天后，培养液无菌转入新鲜氮转化菌群液体培养基培养5～7天，即得活化的氮转化菌群；
2)氮转化菌群的复壮：取步骤1)中活化的氮转化菌群，以5～10％接种量无菌接入新鲜氮转化菌群培养基，恒温振荡培养5～7天；期间，用纳氏试剂比色法测定培养液中氮含量，计算氮去除率；如此反复培养2～3次，当氮去除率大于90％时，视为氮转化菌群的复壮完成，离心收集菌体，菌体用无菌水洗涤后制成菌悬液；
3)铜绿微囊藻的培养：将铜绿微囊藻FACHB-905种子液无菌接入BG11培养基中，恒温光照培养25天后，无菌接入新鲜的BG11培养基培养10～12天；之后，以20％接种量、0.6L培养体系进行扩大培养，细胞生长至对数生长中期时，离心收集藻体，无菌水洗涤后用复合培养基悬浮藻体，制成藻悬液；
4)铜绿微囊藻生长液的制备：将步骤3)制备的藻悬液，无菌接入复合培养基，利用血球计数法，调整藻浓度为1.8～2.0×106cells/mL，制成铜绿微囊藻生长液；
5)铜绿微囊藻-氮转化菌群的共培养：将步骤2)中制备的菌悬液，接入步骤4)制备的铜绿微囊藻生长液中，菌悬液的添加量为5～20％，以不接菌的铜绿微囊藻为对照，恒温光照培养4天；培养过程中，取样测定培养液氮含量、藻细胞光合活性和色素含量变化。
进一步的，步骤1)、2)中所述的恒温振荡培养条件为温度设定28℃、振荡速度160r/min。
进一步的，步骤3)、5)中所述的恒温光照培养条件为培养条件设定为25±1℃、60μmolphotons/m2·s光强、12h/12h光暗周期。
进一步的，步骤1)中的氮转化菌群培养基配方为：每1L去离子水中含有乙酸钠1.0g，(NH4)2SO40.5g，NaNO30.5g，Na2CO31.5g，CaCO31.5g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO40.02g，EDTANa2206μg，FeSO4·7H2O154μg，Na2MoO4·2H2O2μg，ZnSO4·7H2O2μg，CuSO4·5H2O0.4μg，CoCl2·6H2O0.04μg。
进一步的，步骤3)中的标准BG11培养基配方为：每1L去离子水中含有NaNO31.5g，MgSO4·7H2O75mg，K2HPO440mg，CaCl2·7H2O36mg，Na2CO320mg，柠檬酸6mg，柠檬酸铁铵6mg，H3BO42.86mg，MnCl2·4H2O1.86mg，EDTANa21mg，Na2MoO4·2H2O0.39mg，ZnSO4·7H2O0.22mg，CuSO4·5H2O0.08mg，Co(NO3)2·6H2O0.05mg。
进一步的，步骤3)、5)中的复合培养基配方为：每1L去离子水中含有NH4Cl0.0～0.038g，NaNO30.0～0.06g，MgSO4·7H2O0.12g，KH2PO40.07g，CaCO30.07g，丁二酸钠0.02～0.10g，K2HPO40.027g，CaCl2·7H2O0.024g，，Na2CO30.013mg，NaHCO30.5g，MnSO40.007g，柠檬酸6mg，柠檬酸铁2mg，H3BO41.9mg，EDTANa20.75mg，Na2MoO4·2H2O0.26mg，ZnSO4·7H2O0.15mg，CuSO4·5H2O0.05mg，FeSO4·7H2O0.05mg，CoCl20.002mg。
有益效果：氮转化菌群对铜绿微囊藻的生长、光合能力和繁殖有明显的抑制作用，处理过程中藻细胞无法合成光合色素进行有效光合作用，几天后藻细胞逐渐破裂、死亡；氮转化菌群可耐受低营养的水体环境，其活性不被铜绿微囊藻的化感作用所抑制；氮转化菌群可实现不同氮污染水体中氮素的高效、快速去除。本发明可为开发有效的生物菌剂强化控藻技术奠定基础。
附图说明
图1为不添加氮转化菌群和添加氮转化菌群处理过程中铜绿微囊藻的色素含量和光合活性及培养基中氮含量的变化；
图2为不添加氮转化菌群(对照组)和添加氮转化菌群(处理组)处理铜绿微囊藻的生长表现；
图3为培养4天后不加菌的对照组与添加氮转化菌群处理组中铜绿微囊藻的细胞形态学特征比较；
图4为不同氮源下生长的铜绿微囊藻中添加氮转化菌群处理过程中的细胞色素含量和光合活性及培养基中氮含量的变化；
图5为不同C/N比下生长的铜绿微囊藻中添加氮转化菌群处理过程中的细胞色素含量和光合活性及培养基中氮含量的变化。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做更进一步的解释。
实施例1
1)依据配方配制氮转化菌群培养基，121℃、0.1MPa下湿热蒸汽灭菌30min后，加入过滤除菌的Na2CO3后用于氮转化菌群培养。取-80℃冰箱中保存的氮转化菌群保藏液，溶解后无菌接入上述准备的100mL氮转化菌群液体培养基中，置于28℃、160r/min振荡培养，5天后将培养液全部无菌转入新的氮转化菌群液体培养基培养5～7天，即得活化的氮转化菌群。
2)将步骤1)中活化的氮转化菌群，以10％接种量接入新的100mL氮转化菌群培养基中，培养期间每隔3天用纳氏试剂比色法测定培养液中氮含量，计算氮去除率，如此反复转接培养2～3次。在氮去除率大于90％时，即得到复壮后的氮转化菌群。采用4℃、8000r/min离心收集菌体，无菌水洗涤2次后用50mL复合培养基悬浮菌体，制成菌悬液，备用于氮转化菌群对铜绿微囊藻的生长抑制实验。
3)依据配方配制BG11培养基，高压蒸汽灭菌后用于蓝藻培养。选择最具代表性的蓝藻水华藻种——铜绿微囊藻作为实验对象，从中科院水生所淡水藻种库采购铜绿微囊藻藻种，购买后无菌接入上述准备的30mLBG11培养基中，置于光照培养箱，25±1℃、60μmolphotons/m2·s光强、12h/12h光暗周期培养25～30天。培养期间，每天上午9点、下午5点手动摇瓶1次，保证充足的溶解氧、充分混匀，并交换培养瓶所放位置，以减少培养箱光强分布不均对藻生长的影响。培养结束后，再以20％(v/v)接种量无菌接入100mLBG11培养基，培养10～12天；之后，同样以20％接种量接入添加0.6LBG11培养基的1L三角瓶中进行扩大培养，待藻生长至对数生长期时(约10～12天)，15℃、8000r/min离心收集藻体，无菌水洗涤2次后用50mL复合培养基悬浮藻体，制成藻悬液，备用于铜绿微囊藻生长液制备。
4)以NH4 +-N+NO3 --N为氮源、氮浓度为10mg/L、C/N比为5，即NH4Cl0.019g、NaNO30.03g、乙酸钠0.05g，配制复合培养基。配制好的复合培养基分装于12个1L三角瓶，每瓶装0.6L，灭菌后用于铜绿微囊藻生长液培养。将步骤3)制备的藻悬液无菌接入上述12个包含复合培养基的1L三角瓶中，摇匀后取1mL藻液，利用血球计数板计数藻细胞数量，使培养基中藻密度控制在1.8～2.0×106cells/mL，备用于氮转化菌群对铜绿微囊藻的生长抑制实验。
5)将步骤4)中制备的含有铜绿微囊藻生长液的12个三角瓶，分为1个对照组(不加菌)和3个处理组(菌群添加量分别为5％、10％和20％)，每组各3个。取步骤2)中制备的菌悬液以对应的添加量接入实验组的三角瓶中。在对照组的3个瓶中接入不加菌的复合培养基。然后，将12个三角瓶同步骤3)培养条件，置于光照培养箱培养4天。在培养的第0天、第1天、第2天和第4天，取样30mL，测定培养液中的氮含量、藻细胞的光合活性和色素含量。实验结束时(第4天)，取样5mL，离心收集藻体后做扫描电镜分析，观察藻细胞形态学变化。
6)结果：如图1所示结果表明，氮转化菌群的加入对铜绿微囊藻的生长繁殖有明显的抑制作用，随着处理时间的延长，其抑制效果愈加显著。在处理的第4天，不加菌的对照组，藻细胞色素含量显著增加、比第0天增加了163％，光合活性显著增大并保持恒定、比第0天增加了34.3％，培养基氮含量比第0天下降了33.2％。而添加5％、10％和20％菌群处理的实验组：藻细胞色素合成受到明显抑制，4天后色素含量比第0天分别降低了24.4％、30.4％和31.8％；藻细胞光合活性急速下降，4天后光合活性降到无法检出；培养基的氮含量比第0天分别下降了79.8％、88.2％和100％。从图2和图3也可以看出，添加菌群处理后，藻细胞受损、破裂，出现大量细胞破裂后碎片，叶绿素降解，藻液逐渐变黄变白。
以上步骤中，步骤1)中的氮转化菌群培养基配方为：每1L去离子水中含有乙酸钠1.0g，(NH4)2SO40.5g，NaNO30.5g，Na2CO31.5g，CaCO31.5g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO40.02g，EDTANa2206μg，FeSO4·7H2O154μg，Na2MoO4·2H2O2μg，ZnSO4·7H2O2μg，CuSO4·5H2O0.4μg，CoCl2·6H2O0.04μg，pH8.0。
步骤3)中的标准BG11培养基配方为：每1L去离子水中含有NaNO31.5g，MgSO4·7H2O75mg，K2HPO440mg，CaCl2·7H2O36mg，Na2CO320mg，柠檬酸6mg，柠檬酸铁铵6mg，H3BO42.86mg，MnCl2·4H2O1.86mg，EDTANa21mg，Na2MoO4·2H2O0.39mg，ZnSO4·7H2O0.22mg，CuSO4·5H2O0.08mg，Co(NO3)2·6H2O0.05mg，pH为7.1。
步骤3)、5)中的复合培养基配方为：每1L去离子水中含有NH4Cl0.0～0.038g，NaNO30.0～0.06g，MgSO4·7H2O0.12g，KH2PO40.07g，CaCO30.07g，丁二酸钠0.02～0.10g，K2HPO40.027g，CaCl2·7H2O0.024g，，Na2CO30.013mg，NaHCO30.5g，MnSO40.007g，柠檬酸6mg，柠檬酸铁2mg，H3BO41.9mg，EDTANa20.75mg，Na2MoO4·2H2O0.26mg，ZnSO4·7H2O0.15mg，CuSO4·5H2O0.05mg，FeSO4·7H2O0.05mg，CoCl20.002mg，pH为7.5。
实施例2
1)依据配方配制氮转化菌群培养基，121℃、0.1MPa下湿热蒸汽灭菌30min后，加入过滤除菌的Na2CO3后用于氮转化菌群培养。取-80℃冰箱中保存的氮转化菌群保藏液，无菌接入上述准备的100mL氮转化菌群液体培养基中，置于28℃、160r/min振荡培养，5天后将培养液全部转入新的氮转化菌群培养基培养5～7天，即得活化的氮转化菌群。
2)将步骤1)中活化的氮转化菌群，以10％接种量无菌接入新的100mL氮转化菌群培养基中，培养期间每隔3天用纳氏试剂比色法测定培养液氮含量，计算氮去除率，如此反复转接培养2～3次。在氮去除率大于90％时，即得到复壮后的氮转化菌群。采用4℃、8000r/min离心收集菌体，无菌水洗涤2次后用50mL复合培养基悬浮菌体，制成菌悬液，备用于氮转化菌群对铜绿微囊藻的生长抑制实验。
3)依据配方配制BG11培养基，高压蒸汽灭菌后用于蓝藻培养。选择最具代表性的蓝藻水华藻种——铜绿微囊藻作为实验对象，从中科院水生所淡水藻种库采购铜绿微囊藻藻种，购买后无菌接入上述准备的30mLBG11培养基中，置于光照培养箱，25±1℃、60μmolphotons/m2·s光强、12h/12h光暗周期培养25～30天。培养期间，每天上午9点、下午5点手动摇瓶1次，保证充足的溶解氧、充分混匀，并交换培养瓶所放位置，以减少培养箱光强分布不均对藻生长的影响。培养结束后，再以20％(v/v)接种量无菌接入100mLBG11培养基，培养10～12天；之后，同样以20％接种量接入添加0.6LBG11培养基的1L三角瓶中进行扩大培养，待藻生长至对数生长期时(约10～12天)，15℃、8000r/min离心收集藻体，无菌水洗涤2次后用50mL复合培养基悬浮藻体，制成藻悬液，备用于铜绿微囊藻生长液制备。
4)分别以NH4 +-N、NO3 --N、NH4 +-N+NO3 --N为氮源，氮浓度为10mg/L、C/N比为5，配制复合培养基。每种氮源下的复合培养基，分装于3个1L三角瓶，每瓶装0.6L，在高压蒸汽灭菌后用于铜绿微囊藻生长液培养。将步骤3)制备的藻悬液无菌接入上述9个包含复合培养基的1L三角瓶中，摇匀后取1mL藻液，利用血球计数板计数藻细胞数量，使培养基中藻密度控制在1.8～2.0×106cells/mL，备用于氮转化菌群对铜绿微囊藻的生长抑制实验。
5)将步骤4)中制备的含有铜绿微囊藻生长液的9个三角瓶，按氮源不同分为3组，每组各3个。取步骤2)中制备的菌悬液以5％添加量接入三角瓶中，然后将9个三角瓶同步骤3)培养条件，置于光照培养箱培养4天。在培养的第0天、第1天、第2天和第4天，取样30mL，测定培养液中的氮含量、藻细胞的光合活性和色素含量。实验结束时(第4天)，取样5mL，离心收集藻体后做扫描电镜分析，观察藻细胞形态学变化。
6)结果：如图4所示结果表明，在分别以NH4 +-N、NO3 --N、NH4 +-N+NO3 --N为氮源的铜绿微囊藻生长液中，添加5％的氮转化菌群处理，对藻的生长、繁殖均有较好的抑制作用，且在NH4 +-N+NO3 --N的氮源下效果最为显著，这说明菌群适应于不同氮污染环境下铜绿微囊藻水华的防治。NH4 +-N下，处理4天后藻细胞色素含量比第0天下降了35.1％、光合活性下降了34.1％、培养基的氮被100％去除。NO3 --N下，处理4天后藻细胞色素含量有所增加(增加51.6％)，但显著低于不加菌的对照组(增加157.8％)；光合活性比第0天轻微增加(增加5.8％)，但显著低于不加菌的对照组(增加41.2％)；培养基的氮含量比第0天下降了81.3％。NH4 +-N+NO3 --N下，处理效果与实例1结果基本相似。
以上步骤中，步骤1)中的氮转化菌群培养基配方为：每1L去离子水中含有乙酸钠1.0g，(NH4)2SO40.5g，NaNO30.5g，Na2CO31.5g，CaCO31.5g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO40.02g，EDTANa2206μg，FeSO4·7H2O154μg，Na2MoO4·2H2O2μg，ZnSO4·7H2O2μg，CuSO4·5H2O0.4μg，CoCl2·6H2O0.04μg，pH8.0。
步骤3)中的标准BG11培养基配方为：每1L去离子水中含有NaNO31.5g，MgSO4·7H2O75mg，K2HPO440mg，CaCl2·7H2O36mg，Na2CO320mg，柠檬酸6mg，柠檬酸铁铵6mg，H3BO42.86mg，MnCl2·4H2O1.86mg，EDTANa21mg，Na2MoO4·2H2O0.39mg，ZnSO4·7H2O0.22mg，CuSO4·5H2O0.08mg，Co(NO3)2·6H2O0.05mg，pH为7.1。
步骤3)、5)中的复合培养基配方为：每1L去离子水中含有NH4Cl0.0～0.038g，NaNO30.0～0.06g，MgSO4·7H2O0.12g，KH2PO40.07g，CaCO30.07g，丁二酸钠0.02～0.10g，K2HPO40.027g，CaCl2·7H2O0.024g，，Na2CO30.013mg，NaHCO30.5g，MnSO40.007g，柠檬酸6mg，柠檬酸铁2mg，H3BO41.9mg，EDTANa20.75mg，Na2MoO4·2H2O0.26mg，ZnSO4·7H2O0.15mg，CuSO4·5H2O0.05mg，FeSO4·7H2O0.05mg，CoCl20.002mg，pH为7.5。
实施例3
1)依据配方配制氮转化菌群培养基，121℃、0.1MPa下湿热蒸汽灭菌30min后，加入过滤除菌的Na2CO3后用于氮转化菌群培养。取-80℃冰箱中保存的氮转化菌群，无菌接入上述准备的100mL氮转化菌群培养基中，置于28℃、160r/min振荡培养，5天后将培养液全部转入新的氮转化菌群培养基培养5～7天，即得活化的氮转化菌群。
2)将步骤1)中活化的氮转化菌群，以10％接种量接入新的100mL氮转化菌群培养基中，培养期间每隔3天测定培养液氮含量，计算氮去除率，如此反复转接培养2～3次。在氮去除率大于90％时，即得到复壮后的氮转化菌群。采用4℃、8000r/min离心收集菌体，无菌水洗涤2次后用50mL复合培养基悬浮菌体，制成菌悬液，备用于氮转化菌群对铜绿微囊藻的生长抑制实验。
3)依据配方配制BG11培养基，高压蒸汽灭菌后用于蓝藻培养。选择最具代表性的蓝藻水华藻种——铜绿微囊藻作为实验对象，从中科院水生所淡水藻种库采购铜绿微囊藻藻种，购买后无菌接入上述准备的30mLBG11培养基中，置于光照培养箱，25±1℃、60μmolphotons/m2·s光强、12h/12h光暗周期培养25～30天。培养期间，每天上午9点、下午5点手动摇瓶1次，保证充足的溶解氧、充分混匀，并交换培养瓶所放位置，以减少培养箱光强分布不均对藻生长的影响。培养结束后，再以20％(v/v)接种量无菌接入100mLBG11培养基，培养10～12天；之后，同样以20％接种量接入添加0.6LBG11培养基的1L三角瓶中进行扩大培养，待藻生长至对数生长期时(约10～12天)，15℃、8000r/min离心收集藻体，无菌水洗涤2次后用50mL复合培养基悬浮藻体，制成藻悬液，备用于铜绿微囊藻生长液制备。
4)用NH4 +-N+NO3 --N作为氮源、氮浓度设定为10mg/L，通过调整培养基中乙酸钠的含量，分别制备C/N为2.5、5、10的复合培养基。每种C/N下的复合培养基，分装于3个1L三角瓶，每瓶装0.6L，在高压蒸汽灭菌后用于铜绿微囊藻生长液培养。将步骤3)制备的藻悬液无菌接入上述6个包含复合培养基的1L三角瓶中，摇匀后取1mL藻液，利用血球计数板计数藻细胞数量，使培养基中藻密度控制在1.8～2.0×106cells/mL，备用于氮转化菌群对铜绿微囊藻的生长抑制实验。
5)将步骤4)中制备的含有铜绿微囊藻生长液的9个三角瓶，按培养基的C/N不同分为3个组，每组各3个。取步骤2)中制备的菌悬液以5％添加量接入三角瓶中，然后将9个三角瓶同步骤3)培养条件，置于光照培养箱培养4天。在培养的第0天、第1天、第2天和第4天，取样30mL，测定培养液中的氮含量、藻细胞的光合活性和色素含量。实验结束时(第4天)，取样5mL，离心收集藻体后做扫描电镜分析，观察藻细胞形态学变化。
6)结果：如图5所示结果表明，分别在C/N比＝2.5、5、10的培养基中，添加5％的氮转化菌群处理，对铜绿微囊藻的生长起到很好的抑制作用。在C/N比＝2.5的营养环境下，氮转化菌群对铜绿微囊藻生长的抑制效果有所需降低，处理4天后藻细胞色素含量比第0天增加了37.7％、光合活性下降了63.1％、培养基中83％以上的氮被去除；在C/N比＝5和C/N比＝10的营养环境下，氮转化菌群可以显著抑制藻的色素合成和光合作用，使其无法进行有效生长，在处理4天后藻细胞色素含量比第0天下降了24.8～35.3％、光合活性下降了100％、培养基中91％以上的氮被去除。这说明氮转化菌群可耐受低营养环境并保持较强的除氮和抑制铜绿微囊藻生长的能力，环境适应性强，未来在自然水体的蓝藻水华防治应用上具有较大潜力。
以上步骤中，步骤1)中的氮转化菌群培养基配方为：每1L去离子水中含有乙酸钠1.0g，(NH4)2SO40.5g，NaNO30.5g，Na2CO31.5g，CaCO31.5g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O0.2g，MnSO40.02g，EDTANa2206μg，FeSO4·7H2O154μg，Na2MoO4·2H2O2μg，ZnSO4·7H2O2μg，CuSO4·5H2O0.4μg，CoCl2·6H2O0.04μg，pH8.0。
步骤3)中的标准BG11培养基配方为：每1L去离子水中含有NaNO31.5g，MgSO4·7H2O75mg，K2HPO440mg，CaCl2·7H2O36mg，Na2CO320mg，柠檬酸6mg，柠檬酸铁铵6mg，H3BO42.86mg，MnCl2·4H2O1.86mg，EDTANa21mg，Na2MoO4·2H2O0.39mg，ZnSO4·7H2O0.22mg，CuSO4·5H2O0.08mg，Co(NO3)2·6H2O0.05mg，pH为7.1。
步骤3)、5)中的复合培养基配方为：每1L去离子水中含有NH4Cl0.0～0.038g，NaNO30.0～0.06g，MgSO4·7H2O0.12g，KH2PO40.07g，CaCO30.07g，丁二酸钠0.02～0.10g，K2HPO40.027g，CaCl2·7H2O0.024g，，Na2CO30.013mg，NaHCO30.5g，MnSO40.007g，柠檬酸6mg，柠檬酸铁2mg，H3BO41.9mg，EDTANa20.75mg，Na2MoO4·2H2O0.26mg，ZnSO4·7H2O0.15mg，CuSO4·5H2O0.05mg，FeSO4·7H2O0.05mg，CoCl20.002mg，pH为7.5。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种通过氮转化菌群抑制铜绿微囊藻生长繁殖的方法，其特征在于，包括：
1)氮转化菌群的活化：取超低温冰箱保存的氮转化菌群保藏液，溶解后无菌接入氮转化菌群液体培养基中，恒温振荡培养5天后，培养液无菌转入新鲜氮转化菌群液体培养基培养5～7天，即得活化的氮转化菌群；
2)氮转化菌群的复壮：取步骤1)中活化的氮转化菌群，以5～10％接种量无菌接入新鲜氮转化菌群培养基，恒温振荡培养5～7天；期间，用纳氏试剂比色法测定培养液中氮含量，计算氮去除率；如此反复培养2～3次，当氮去除率大于90％时，视为氮转化菌群的复壮完成，离心收集菌体，菌体用无菌水洗涤后制成菌悬液；
3)铜绿微囊藻的培养：将铜绿微囊藻FACHB-905种子液无菌接入BG11培养基中，恒温光照培养25天后，无菌接入新鲜的BG11培养基培养10～12天；之后，以20％接种量、0.6L培养体系进行扩大培养，细胞生长至对数生长中期时，离心收集藻体，无菌水洗涤后用复合培养基悬浮藻体，制成藻悬液；
4)铜绿微囊藻生长液的制备：将步骤3)制备的藻悬液，无菌接入复合培养基，利用血球计数法，调整藻浓度为1.8～2.0×106cells/mL，制成铜绿微囊藻生长液；
5)铜绿微囊藻-氮转化菌群的共培养：将步骤2)中制备的菌悬液，接入步骤4)制备的铜绿微囊藻生长液中，菌悬液的添加量为5～20％，以不接菌的铜绿微囊藻为对照，恒温光照培养4天；培养过程中，取样测定培养液氮含量、藻细胞光合活性和色素含量变化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)、2)中所述的恒温振荡培养条件为温度设定28℃、振荡速度160r/min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)、5)中所述的恒温光照培养条件为培养条件设定为25±1℃、60μmol photons/m2·s光强、12h/12h光暗周期。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的氮转化菌群培养基配方为：每1L去离子水中含有乙酸钠1.0g，(NH4)2SO40.5g，NaNO30.5g，Na2CO31.5g，CaCO31.5g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO40.02g，EDTANa2206μg，FeSO4·7H2O 154μg，Na2MoO4·2H2O 2μg，ZnSO4·7H2O 2μg，CuSO4·5H2O 0.4μg，CoCl2·6H2O 0.04μg。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中的标准BG11培养基配方为：每1L去离子水中含有NaNO31.5g，MgSO4·7H2O 75mg，K2HPO440mg，CaCl2·7H2O36mg，Na2CO320mg，柠檬酸6mg，柠檬酸铁铵6mg，H3BO42.86mg，MnCl2·4H2O 1.86mg，EDTANa21mg，Na2MoO4·2H2O0.39mg，ZnSO4·7H2O 0.22mg，CuSO4·5H2O 0.08mg，Co(NO3)2·6H2O 0.05mg。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)、5)中的复合培养基配方为：每1L去离子水中含有NH4Cl 0.0～0.038g，NaNO30.0～0.06g，MgSO4·7H2O 0.12g，KH2PO40.07g，CaCO30.07g，丁二酸钠0.02～0.10g，K2HPO40.027g，CaCl2·7H2O 0.024g，，Na2CO30.013mg，NaHCO30.5g，MnSO40.007g，柠檬酸6mg，柠檬酸铁2mg，H3BO41.9mg，EDTANa20.75mg，Na2MoO4·2H2O 0.26mg，ZnSO4·7H2O 0.15mg，CuSO4·5H2O 0.05mg，FeSO4·7H2O 0.05mg，CoCl20.002mg。
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