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CN116284337A - 以冷沉淀peg沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法 - Google Patents

以冷沉淀peg沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法 Download PDF

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CN116284337A
CN116284337A CN202310340705.7A CN202310340705A CN116284337A CN 116284337 A CN116284337 A CN 116284337A CN 202310340705 A CN202310340705 A CN 202310340705A CN 116284337 A CN116284337 A CN 116284337A
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邓坤
谢长福
刘健
钱兴乐
陈昱宏
洪福星
刘畅
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Tonrol Biopharmaceutical Co ltd
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Tonrol Biopharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明提供了以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，涉及医药技术领域，包括以下步骤：S1：以冷沉淀为起始原料，进行洗涤和溶解，获得溶解液；S2：向溶解液中加入配制的PEG溶液进行搅拌静置，收集上清过滤；S3：将过滤后液体在搅拌下加入配制的S/D溶液，灭活后加入注射用水终止灭活；本发明以冷沉淀为原料，利用PEG沉淀结合色谱层析法制备血管性血友病因子，制备过程中工艺简单，PEG沉淀经济有效，单步凝胶吸附，有效提高产品纯度，包含两步病毒灭活步骤，可灭活已知的脂包膜/非脂包膜病毒，临床病毒安全性得到极大的保障，且采用Fractogel‑EMD‑TMAE凝胶能够有效吸附目标蛋白。

Description

以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法。
背景技术
血管性血友病因子(vonWillebrandfactor，VWF)以下简称VWF，是一种多聚体血浆糖蛋白，其分子量从250kDa到2000万kDa不等，以超分子量多聚体形式存在，形成血浆中己知的最大分子量可溶性蛋白，大小不等的多聚体，对维持VWF正常生物活性具有重要意义，正常人血浆中平均含量10mg/L(0.5～2IU/mL)，一级结构含2050个氨基酸残基，半衰期12～18小时，血浆VWF在原发性止血中起着重要作用，VWF可同时与胶原纤维和血小板结合，当血管破裂时大量血小板以VWF为中介，粘附在胶原纤维上，形成血栓，得以止血；
VWF的国内生产工艺的研究主要有：中国专利(申请号202010556926.4)提供了一种以血浆为原料，经氢氧化铝凝胶吸附沉淀，一步层析法制备人血管性血友病因子/人凝血因子Ⅷ复合物的工艺，未能纯化出单一人血管性血友病因子，且氢氧化铝凝胶的使用会给制品带来铝离子超标的风险；中国专利(申请号201610077346.0)提供了一种从冷沉淀提取凝血因子Ⅷ的废料中制备vWF的工艺，以冷沉淀为起始原料，经二步阴离子交换层析和一步亲和层析，过程复杂且亲和凝胶成本较高，因此，本发明提出以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提出以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，该以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法制备过程中工艺简单，PEG沉淀经济有效，单步凝胶吸附，有效提高产品纯度，临床病毒安全性得到极大的保障，能够有效吸附目标蛋白。
为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，包括以下步骤：
S1：以冷沉淀为起始原料，进行洗涤和溶解，获得溶解液；
S2：向溶解液中加入配制的PEG溶液进行搅拌静置，收集上清过滤；
S3：将过滤后液体在搅拌下加入配制的S/D溶液，灭活后加入注射用水终止灭活；
S4：收集灭活后溶液，用透析液透析若干遍，去除PEG，获得透析浓缩液；
S5：用Fractogel-EMD-TMAE凝胶进行色谱层析，包括上样、洗涤、洗脱；
S6：收集洗脱后溶液，用透析液透析若干遍，获得VWF原液，经过配制、除菌、灌装、冻干，得VWF产品。
进一步改进在于：所述S1包括：
S11：冷沉淀洗涤，从人血浆中分离出的冷沉淀为起始原料，将冷沉淀切碎，加入到2～3倍2～3℃，pH为6.8～7.0的0.02Mol/LTris溶液中，搅拌10～30min，离心后收集沉淀；
S12：冷沉淀溶解，收集S11中沉淀，用6倍沉淀重量的含0.02Mol/LTris、3IU/ml肝素钠溶液，pH为6.8～7.0，温度24～26℃，搅拌溶解2h。
进一步改进在于：冷沉淀洗涤液配方为：0.02mol/LTris，溶解液配方为0.02mol/LTris、3IU/ml肝素钠，用0.5mol/L的盐酸溶液调节pH至6.8-7.0。
进一步改进在于：所述S2包括：
S21：向溶解液中加入配制的PEG溶液，使最终PEG终浓度为8％；
S22：加入PEG后用1.0mol/LHCl溶液调PH值至5.70～5.80，温度：6～8℃搅拌0.5h；
S23：静置0.5h后离心，收集上清过滤。
进一步改进在于：PEG溶液配方为：PEG400030Kg、Tris0.24kg，补加注射用水至100Kg，用1.0mol/LHCl溶液调PH值至5.70～5.80。
进一步改进在于：所述S3包括：
S31：将过滤后液体按重量10:1比例在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液，使吐温-80最终含量为1％，磷酸三丁酯最终含量为0.3％；
S32：在24～26℃保温6h，灭活后液体加入注射用水终止灭活。
进一步改进在于：S/D溶液为Tween-80和磷酸三丁酯，使用前进行预配，预配浓度的重量体积百分比为11％：3.3％。
进一步改进在于：所述S5包括：
S51：用Fractogel-EMD-TMAE凝胶装填柱子，用平衡液进行平衡；
S52：上样，将步骤(四)中透析后液体进行上样，上样量为凝胶体积的5～8倍，上样速度为80cm/h；
S53：洗涤，上样结束后，用洗涤液进行洗涤；
S54：洗脱，用洗脱液进行洗脱。
进一步改进在于：平衡液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.1～0.3mol/L氯化钠，pH6.8～7.2；洗涤液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.1～0.3mol/L氯化钠、0.2～0.3mol/L甘氨酸，pH6.8～7.2；洗脱液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.5～1.0mol/L氯化钠、0.2～0.3mol/L甘氨酸，将洗脱液超滤透析至电导率10～30Ms/cm，pH6.8～7.2。
进一步改进在于：所述S6中，透析液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.1～0.3mol/L甘氨酸，0.001～0.003mol/LCaCl2，用0.5mol/L的HCl溶液调节pH至6.8～7.2，且S6中，将原液VWF：CBA效价35±5IU/ml进行配制，冻干结束后进行100℃干热灭活。
本发明的有益效果为：
1、本发明以冷沉淀为原料，利用PEG沉淀结合色谱层析法制备血管性血友病因子，制备过程中工艺简单，PEG沉淀经济有效，单步凝胶吸附，有效提高产品纯度，包含两步病毒灭活步骤，可灭活已知的脂包膜/非脂包膜病毒，临床病毒安全性得到极大的保障，且采用Fractogel-EMD-TMAE凝胶能够有效吸附目标蛋白。
2、本发明的溶解液配方能够有效保护目标蛋白；平衡液能够有效平衡凝胶，去除杂蛋白，吸附目标蛋白；洗涤液、洗脱液能够有效洗涤去杂蛋白，有效收取目标蛋白；透析液能够有效保护目标蛋白活性。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为本发明的上样洗涤洗脱层析图谱示意图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例一
根据图1、2所示，本实施例提出了以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，包括以下步骤：
S1：以冷沉淀为起始原料，进行洗涤和溶解，获得溶解液；
S11：冷沉淀洗涤，从人血浆中分离出的冷沉淀为起始原料，将冷沉淀切碎，加入到2～3倍2～3℃，pH为6.8～7.0的0.02Mol/LTris溶液中，搅拌10～30min，离心后收集沉淀；
S12：冷沉淀溶解，收集S11中沉淀，用6倍沉淀重量的含0.02Mol/LTris、
3IU/ml肝素钠溶液，pH为6.8～7.0，温度24～26℃，搅拌溶解2h。
其中，冷沉淀洗涤液配方为：0.02mol/LTris，溶解液配方为
0.02mol/LTris、3IU/ml肝素钠，用0.5mol/L的盐酸溶液调节pH至6.8-7.0。
S2：向溶解液中加入配制的PEG溶液进行搅拌静置，收集上清过滤；
S21：向溶解液中加入配制的PEG溶液，使最终PEG终浓度为8％；
S22：加入PEG后用1.0mol/LHCl溶液调PH值至5.70～5.80，温度：6～
8℃搅拌0.5h；
S23：静置0.5h后离心，收集上清过滤。
其中，PEG溶液配方为：PEG400030Kg、Tris0.24kg，补加注射用水至100Kg，用1.0mol/LHCl溶液调PH值至5.70～5.80。
S3：将过滤后液体在搅拌下加入配制的S/D溶液，灭活后加入注射用水终止灭活；
S31：将过滤后液体按重量10:1比例在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液，使吐温-80最终含量为1％，磷酸三丁酯最终含量为0.3％；
S32：在24～26℃保温6h，灭活后液体加入注射用水终止灭活。
其中，S/D溶液为Tween-80和磷酸三丁酯，使用前进行预配，预配浓度的重量体积百分比为11％：3.3％。
S4：收集灭活后溶液，用透析液透析若干遍，去除PEG，获得透析浓缩液；
S5：用Fractogel-EMD-TMAE凝胶进行色谱层析，包括上样、洗涤、洗脱；
S51：用Fractogel-EMD-TMAE凝胶装填柱子，用平衡液进行平衡；
S52：上样，将步骤(四)中透析后液体进行上样，上样量为凝胶体积的5～8倍，上样速度为80cm/h；
S53：洗涤，上样结束后，用洗涤液进行洗涤；
S54：洗脱，用洗脱液进行洗脱。
其中，平衡液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.1～0.3mol/L氯化钠，pH6.8～7.2；洗涤液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.1～0.3mol/L氯化钠、0.2～0.3mol/L甘氨酸，pH6.8～7.2；洗脱液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.5～1.0mol/L氯化钠、0.2～0.3mol/L甘氨酸，将洗脱液超滤透析至电导率10～30Ms/cm，pH6.8～7.2。
S6：收集洗脱后溶液，用透析液透析若干遍，获得VWF原液，经过配制、除菌、灌装、冻干，得VWF产品。其中，透析液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.1～0.3mol/L甘氨酸，0.001～0.003mol/LCaCl2，用0.5mol/L的HCl溶液调节pH至6.8～7.2，且S6中，将原液VWF：CBA效价35±5IU/ml进行配制，冻干结束后进行100℃干热灭活。
实施例二
根据图1、2所示，本实施例提出了以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，包括以下步骤：
(一)冷沉淀溶解
(1)以冷沉淀为原料，将300g冷沉淀切碎，加入到600g 3℃，pH为6.8的0.02Mol/LTris溶液中，搅拌溶解20min，离心收集沉淀；
(2)收集步骤(1)中沉淀280g，用1680g 0.02Mol/L Tris、3IU/ml肝素钠溶液，pH为6.8，温度24～26℃，搅拌溶解2小时；
(二)PEG沉淀
向步骤(2)1960g溶解液，加入配制好的568g PEG溶液，使最终PEG浓度为8％；加入PEG后用1.0mol/LHCl溶液调PH值至5.70，温度：6～8℃搅拌0.5小时，静置0.5小时后离心，收集上清过滤。其中，PEG沉淀上清VWF：CBA效价为5.1IU/ml。
(三)S/D病毒灭活
步骤(二)中过滤后液体2400g，在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液240g，使吐温-80最终含量为1％，磷酸三丁酯最终含量为0.3％，在25℃保温6h。S/D溶液使用前进行预配，吐温-80和磷酸三丁酯预配浓度的重量体积百分比为11％：3.3％。
灭活后液体2640g，加入注射用水终止灭活。
(四)超滤去除PEG
收集步骤(三)灭活后溶液，用透析液透析5～6遍，获得透析浓缩液。
(五)Fractogel-EMD-TMAE凝胶色谱层析
(a)Fractogel-EMD-TMAE凝胶400mL装填柱子，用平衡液进行平衡；所述平衡液为0.02mol/L枸橼酸钠、0.2mol/L氯化钠，pH 7.0。所述凝胶购自美国通用电气公司(GE)。
(b)上样，将步骤(三)中灭活后液体2640g以80cm/h上样速度进行上样。
(c)洗涤，上样结束后，用洗涤液进行洗涤；所述洗涤液为0.02mol/L枸橼酸钠、0.2mol/L氯化钠、0.2mol/L甘氨酸，pH 7.0。。
(d)洗脱，用洗脱液进行洗脱；所述0.02mol/L枸橼酸钠、1.0mol/L氯化钠、0.2mol/L甘氨酸，pH 7.0。
(六)超滤透析
收集步骤(d)中洗脱后溶液600g，用透析液透析5遍，至电导率20Ms/cm，pH 7.0，获得透析浓缩液100g，即为VWF原液，VWF原液VWF：CBA效价为80IU/ml。所述透析液为0.02mol/L枸橼酸钠、0.2mol/L甘氨酸，0.002mol/L CaCl2。
(七)冻干及干热
将步骤(五)得到的浓缩液按VWF：CBA效价35±5IU/ml进行配制，冻干；冻干结束后进行100℃干热灭活30min，获得VWF产品。
图2是凝胶色谱层析谱图，可以看出，采用上述洗涤液洗涤能够有效去除杂蛋白，洗脱液洗脱能够有效洗下目标蛋白，达到纯化目标蛋白的目的。
实验数据：各中间步骤VWF：CBA效价
步骤 VWF：CBA效价(IU/ml)
冷沉淀溶解液 2.05
PEG沉淀后上清 5.1
洗脱液 17.5
原液 80
成品 30
本发明以冷沉淀为原料，利用PEG沉淀结合色谱层析法制备血管性血友病因子，制备过程中工艺简单，PEG沉淀经济有效，单步凝胶吸附，有效提高产品纯度，包含两步病毒灭活步骤，可灭活已知的脂包膜/非脂包膜病毒，临床病毒安全性得到极大的保障，且采用Fractogel-EMD-TMAE凝胶能够有效吸附目标蛋白。
本发明溶解液配方为：0.02mol/L Tris、3IU/ml肝素钠，用0.5mol/L的盐酸溶液调节pH至6.8～7.2，能够有效保护目标蛋白；平衡液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.1～0.3mol/L氯化钠、pH 6.8～7.2，能够有效平衡凝胶，去除杂蛋白，吸附目标蛋白；洗涤液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.1～0.3mol/L氯化钠、0.2～0.3mol/L甘氨酸，pH 6.8～7.2，洗脱液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.5～1.0mol/L氯化钠、0.2～0.3mol/L甘氨酸，pH6.8～7.2，能够有效洗涤去杂蛋白，有效收取目标蛋白；透析液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.1～0.3mol/L甘氨酸，0.001～0.003mol/L CaCl2，用0.5mol/L的HCl溶液调节pH至6.8～7.2，能够有效保护目标蛋白活性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：以冷沉淀为起始原料，进行洗涤和溶解，获得溶解液；
S2：向溶解液中加入配制的PEG溶液进行搅拌静置，收集上清过滤；
S3：将过滤后液体在搅拌下加入配制的S/D溶液，灭活后加入注射用水终止灭活；
S4：收集灭活后溶液，用透析液透析若干遍，去除PEG，获得透析浓缩液；
S5：用Fractogel-EMD-TMAE凝胶进行色谱层析，包括上样、洗涤、洗脱；
S6：收集洗脱后溶液，用透析液透析若干遍，获得VWF原液，经过配制、除菌、灌装、冻干，得VWF产品。
2.根据权利要求1所述的以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，其特征在于：所述S1包括：
S11：冷沉淀洗涤，从人血浆中分离出的冷沉淀为起始原料，将冷沉淀切碎，加入到2～3倍2～3℃，pH为6.8～7.0的0.02Mol/LTris溶液中，搅拌10～30min，离心后收集沉淀；
S12：冷沉淀溶解，收集S11中沉淀，用6倍沉淀重量的含0.02Mol/LTris、3IU/ml肝素钠溶液，pH为6.8～7.0，温度24～26℃，搅拌溶解2h。
3.根据权利要求2所述的以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，其特征在于：冷沉淀洗涤液配方为：0.02mol/LTris，溶解液配方为0.02mol/LTris、3IU/ml肝素钠，用0.5mol/L的盐酸溶液调节pH至6.8-7.0。
4.根据权利要求2所述的以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，其特征在于：所述S2包括：
S21：向溶解液中加入配制的PEG溶液，使最终PEG终浓度为8％；
S22：加入PEG后用1.0mol/LHCl溶液调PH值至5.70～5.80，温度：6～8℃搅拌0.5h；
S23：静置0.5h后离心，收集上清过滤。
5.根据权利要求4所述的以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，其特征在于：PEG溶液配方为：PEG400030Kg、Tris0.24kg，补加注射用水至100Kg，用1.0mol/LHCl溶液调PH值至5.70～5.80。
6.根据权利要求4所述的以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，其特征在于：所述S3包括：
S31：将过滤后液体按重量10:1比例在搅拌下缓慢加入配制好的S/D溶液，使吐温-80最终含量为1％，磷酸三丁酯最终含量为0.3％；
S32：在24～26℃保温6h，灭活后液体加入注射用水终止灭活。
7.根据权利要求6所述的以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，其特征在于：S/D溶液为Tween-80和磷酸三丁酯，使用前进行预配，预配浓度的重量体积百分比为11％：3.3％。
8.根据权利要求6所述的以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，其特征在于：所述S5包括：
S51：用Fractogel-EMD-TMAE凝胶装填柱子，用平衡液进行平衡；
S52：上样，将步骤(四)中透析后液体进行上样，上样量为凝胶体积的5～8倍，上样速度为80cm/h；
S53：洗涤，上样结束后，用洗涤液进行洗涤；
S54：洗脱，用洗脱液进行洗脱。
9.根据权利要求8所述的以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，其特征在于：平衡液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.1～0.3mol/L氯化钠，pH6.8～7.2；洗涤液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.1～0.3mol/L氯化钠、0.2～0.3mol/L甘氨酸，pH6.8～7.2；洗脱液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.5～1.0mol/L氯化钠、0.2～0.3mol/L甘氨酸，将洗脱液超滤透析至电导率10～30Ms/cm，pH6.8～7.2。
10.根据权利要求1所述的以冷沉淀PEG沉淀及色谱层析法制备血友病因子的方法，其特征在于：所述S6中，透析液为0.01～0.05mol/L枸橼酸钠、0.1～0.3mol/L甘氨酸，0.001～0.003mol/LCaCl2，用0.5mol/L的HCl溶液调节pH至6.8～7.2，且S6中，将原液VWF：CBA效价35±5IU/ml进行配制，冻干结束后进行100℃干热灭活。
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