CN116271037A - Acot2的上调剂在促进肝脏部分切除术后肝再生及肝功能恢复中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，提供了ACOT2的上调剂在促进肝脏部分切除术后肝再生及肝功能恢复中的应用，具体提供ACOT2的促表达剂在制备肝脏部分切除术后促进肝再生及肝功能恢复药物中的应用以及包含该ACOT2的促表达剂的药物组合物。本发明开拓了ACOT2基因功能的新发现，ACOT2在肝切术后表达增高对肝再生具有一定的保护性作用，或可作为潜在的预警术后肝功能损伤程度和肝再生能力的标志物及促进术后肝再生的治疗靶点。通过使用本发明的干预方式，靶向性对肝脏脂代谢过程加速脂滴的分解消耗，从而促进肝功能和肝体比的恢复。

Description

ACOT2的上调剂在促进肝脏部分切除术后肝再生及肝功能恢 复中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及基因功能和肝再生治疗领域，具体涉及ACOT2基因的新功能及调控方式的发现，以及ACOT2的上调剂在促进肝脏部分切除术后肝功能恢复及肝再生进程中的应用。

背景技术

肝脏具有强大的再生能力，部分切除术后可恢复接近原有体积大小。肝脏在维持固有稳态和损伤后再生的过程中，成熟肝细胞展现了优越的组织修复更新能力。肝脏作为人体最大的实质性代谢器官，调控着机体对碳水和脂类等营养物质的合成、代谢、储存以及再分布等过程。虽然大多数器官中细胞增殖与代谢功能的执行并不兼容，但是在肝再生的过程中，肝脏依旧保持着原有的重要的糖脂代谢功能。近几十年的研究已经对肝再生过程中包括IL-6，TGFα和HGF等在内的重要细胞因子的调控机制进行了深入探究，然而，对肝再生过程中肝细胞糖脂代谢和增殖之间的关系认识仍存在诸多不足，且没有给予足够重视，尚未有针对脂肪酸氧化过程而促进肝脏术后再生修复的治疗靶点。

在肝再生早期，葡萄糖耗竭而不能成为主要的供能底物时，肝脏获得ATP的方式则依赖脂肪酸氧化。此时，血糖降低以及胰岛素与胰高血糖素的比值下降会刺激脂肪组织脂解和游离脂肪酸向肝脏的输出，导致血液中游离脂肪酸增加。随后，肝脏摄取脂肪酸增加导致一过性脂肪变性(transient steatosis)，这一现象是肝再生的关键。破坏脂滴堆积将影响后续再生过程。脂滴中的脂质通过增强的β氧化被消耗，加速肝细胞的肥大(hypertrophy)和有丝分裂(division)。脂肪酸β氧化在肝再生过程中具有十分重要的作用，当线粒体β氧化关键分子PPARα和CPT-1水平减少时，出现脂质堆积增加和DNA复制延迟的现象，甚至出现氧化应激损伤及肝细胞的凋亡。而保护或激活CPT-1的活性则可以逆转脂毒性损伤。线粒体β氧化会产生大量还原当量供呼吸链反应产生ATP，以及乙酰辅酶A参与后续三羧酸循环，产生的NADPH还用于维持谷胱甘肽依赖的抗氧化系统。因此，如何保障线粒体功能的完整以及β氧化的顺利进行在肝再生过程中尤为重要(Gazit V,Weymann A,Hartman E,Finck BN,Hruz PW,Tzekov A,Rudnick DA.Liver regeneration is impairedin lipodystrophic fatty liver dystrophy mice.Hepatology.2010；52:2109-17；EzakiH,YoshidaY,Saji Y,Takemura T,Fukushima J,Matsumoto H,Kamada Y,WadaA,Igura T,Kihara S,Funahashi T,Shimomura I,Tamura S,et al.Delayed liver regenerationafterpartial hepatectomy in adiponectin knockout mice.Biochem Biophys ResCommun.2009；378:68-72；Xiao W,Ren M,Zhang C,Li S,An W.Amelioration ofnonalcoholic fatty liver disease by hepatic stimulator substanceviapreservation ofcarnitine palmitoyl transferase-1activity.Am J Physiol CellPhysiol.2015；309:C215-27)。

脂酰辅酶A硫酯酶(ACOTs)是将脂酰辅酶A水解生成游离脂肪酸(FFA)和辅酶A(CoA-SH)的一类酶，特异性作用于含有辅酶A的脂质以失活脂肪酸。现有的研究证据表明，它们控制着线粒体和过氧化物酶体的脂酰辅酶A的氧化速率，同时也能调节细胞器间的脂肪酸运输。脂酰辅酶A硫酯酶家族通过对过氧化物酶体增殖物(PP)的反应性大致分为两大类：I类ACOTs对PP的反应性强，分子量在40kDa左右；II类ACOTs对PP的反应性各异，分子量在110-150kDa。ACOT2属于I类ACOTs，主要位于线粒体，对长链脂酰辅酶A具有特异性作用。目前对其报道多局限于骨骼肌、心肌和脂肪组织以及禁食的状况下，尚未有关于ACOT2在小鼠体内敲低或敲除的研究，并且无ACOT2在肝脏部分切除术后肝再生过程中作用的相关报道。

ACOT2在体内的表达受转录因子PPAR的调控。PPAR全称是过氧化物酶体增殖激活物受体，属于核受体亚家族。PPARα的靶基因主要参与糖脂代谢，也有部分参与炎症调节通路。据以往文献报道，PPARα控制着微粒体、过氧化物酶体以及线粒体脂肪酸氧化、脂肪酸结合与活化、脂肪酸的延长与去饱和、甘油三酯的合成与分解、胆汁酸的代谢等大量脂代谢相关通路与基因。

此外，RNA甲基化形成N6-甲基腺苷的过程是真核生物丰度最高的mRNA内部修饰，在多种生理学过程中对基因表达起到广泛调控。m6A修饰通过多亚基的甲基化酶复合物(writers)以高度特异性的方式将该修饰添加于部分转录本的特定位点。该复合物主要由METTL3-METTL14组成的异二聚体为核心，是绝大部分mRNA的m6A甲基化酶。而m6A的去甲基化酶(erasers)，包括FTO和ALKBH5。被m6A修饰的mRNA则被募集的m6A结合蛋白(readers)识别，包括YTHDF1/2/3、YTHDC1/2及IGF2BP1/2/3等，影响着mRNA的可变剪切、核转运、翻译、降解及稳定性等方面(Geula S,Moshitch-Moshkovitz S,Dominissini D,Mansour AA,KolN,Salmon-Divon M,Hershkovitz V,Peer E,MorN,Manor YS,Ben-Haim MS,Eyal E,YungerS,et al.Stem cells.m6AmRNA methylation facilitates resolution ofnaivepluripotency toward differentiation.Science.2015；347:1002-6；Wang X,Feng J,XueY,Guan Z,Zhang D,Liu Z,Gong Z,Wang Q,Huang J,Tang C,Zou T,Yin P.Structuralbasis ofN(6)-adenosine methylation by the METTL3-METTL14 complex.Nature.2016；534:575-8；Wang X,Lu Z,Gomez A,Hon GC,Yue Y,Han D,Fu Y,Parisien M,Dai Q,Jia G,Ren B,Pan T,He C.

N6-methyladenosine-dependent regulation ofmessenger RNAstability.Nature.2014；505:117-20)。甲基化修饰及相关酶与脂代谢紧密相关，目前被报道对肝脏脂代谢的影响广泛存在于真核生物，其对于ACOT2的影响作用鲜见报道。

发明内容

本发明依托上述研究进行，针对肝脏部分切除术后可能发生的肝功能受损和肝体比恢复延迟的现象，提供ACOT2上调在术后肝再生修复中的促进作用以及该基因受到双重调控途径的发现，并进一步提供了腺相关病毒注射影响ACOT2表达促进肝脏部分切除术后肝功能恢复的应用。

发明人经过广泛而深入的研究，发现Acot2可能参与肝切后肝再生的脂代谢过程并与脂滴的消解密切相关，进一步研究发现过表达Acot2后，小鼠肝脏Acot2蛋白水平显著增加，能够显著降低肝损伤相关指标谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)，并且肝体比增加。进一步对该基因的调控途径进行研究：转录层面上，PPARα:RXRα形成的异二聚体复合物是Acot2增加的条件；深入研究发现，通过m6A修饰调节可上调ACOT2转录水平，第一种方式为降低m6A甲基化修饰酶Mettl14的含量，第二种方式为降低m6A甲基化阅读蛋白YTHDF2表达水平。

本发明所采用的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供了ACOT2的促表达剂在制备肝脏部分切除术后促进肝再生及肝功能恢复药物中的应用。

优选的，ACOT2的促表达剂为直接或间接过表达ACOT2的试剂。直接过表达ACOT2的试剂选自过表达ACOT2的重组表达载体或上调ACOT2蛋白活性的物质；所述间接过表达ACOT2的试剂选自过表达转录因子PPARα或降低ACOT2 mRNA的m6A修饰水平的试剂。

其中，过表达ACOT2的重组表达载体包括过表达ACOT2基因转录本的质粒、腺相关病毒或CRISPR/Cas9基因编辑工具；

过表达转录因子PPARα的试剂为PPARα:RXRα形成的异二聚体复合物；所述降低ACOT2 mRNA的m6A修饰水平的试剂为降低m6A甲基化修饰酶Mettl14含量的试剂。

具体的，降低Mettl14酶含量的试剂(shRNA)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～10任一项所述。

相反地，降低ACOT2的试剂为过表达m6A阅读蛋白YTHDF2基因转录本的质粒。

本发明中，间接过表达ACOT2属于ACOT2基因的双重调控途径的发现，第一调控途径为提供转录层面上调ACOT2表达的途径，包括为过表达转录因子PPARα(NCBI Gene ID：19013)，如通过质粒载体导入细胞，优选PPARα:RXRα形成的异二聚体复合物的质粒重组表达载体。第二调控途径为通过m6A修饰上调ACOT2转录水平，该途径又分为两种方式：

(1)敲低m6A甲基化修饰酶METTL14(NCBI Gene ID:210529)；

(2)敲低m6A甲基化阅读蛋白YTHDF2(NCBI Gene ID:213541)。

进一步的，所述的敲低为通过慢病毒为载体感染细胞。

优选的，肝脏部分切除术为半肝切除术或联合肝脏分割和门静脉结扎的分阶段肝切除术。具体而言，促进肝再生及肝功能恢复药物为减少胞内脂质堆积、降低谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平、促进肝细胞有丝分裂和增加肝体比的药物。

本发明的第二方面，提供了一种促进肝再生及肝功能恢复的药物组合物，包括活性组分以及药学上可接受的载体，活性组分包括直接或间接过表达ACOT2的试剂，具体种类选择如上所述。

本发明的有益保障及效果如下：

1、本发明开拓了ACOT2基因功能的新发现，ACOT2在肝切术后表达增高对肝再生具有一定的保护性作用，ACOT2或可作为潜在的预警术后肝功能损伤程度和肝再生能力的标志物及促进术后肝再生的治疗靶点。

2、通过使用本发明的干预方式，靶向性对肝脏脂代谢过程加速脂滴的分解消耗，从而促进肝功能和肝体比的恢复。

3、本发明提供了肝切术后调控ACOT2含量的两种方式，即PPARα的转录激活和m6A-RNA甲基化修饰参与的转录后调控。

附图说明

图1为实施例1中肝部分切除术后肝再生早期ACOT2的表达变化检测：(A)Acot家族成员术前与肝切术后24h转录水平变化；(B)Acot2在肝再生早期各时间点的转录水平变化。n.s.no significant difference无显著性差异；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

图2为实施例2中小鼠尾静脉注射AAV8腺相关病毒后ACOT2的表达情况：(A)AAV8-shAcot2或AAV8-oeAcot2及其对照病毒注射后小鼠肝脏Acot2的免疫印迹结果。shAcot2，敲低Acot2组；oeAcot2，过表达Acot2组。

图3为实施例3中ACOT2敲低或过表达对小鼠肝脏再生的影响：(A)小鼠肝脏敲低Acot2对肝体比、肝细胞增殖及肝损伤指标的影响；(B)小鼠肝脏过表达Acot2对肝体比和肝损伤指标的影响。shAcot2，敲低Acot2组；oeAcot2，过表达Acot2组。PH，肝切术；n.s.nosignificant difference无显著性差异；*P<0.05。

图4为实施例4中肝切后肝再生中转录因子PPARα调控ACOT2的转录表达：(A)细胞水平PPARα与ACOT2的变化关系；(B)小鼠肝切后12h和禁食处理下，Pparα与Acot2的变化关系；(C)过表达Pparα与Rxrα与Acot2的变化。n.s.no significant difference无显著性差异；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

图5为实施例5中肝切后肝再生组织中Acot2的m6A修饰变化与其含量变化相关：(A)小鼠肝切术后m6A修饰水平变化；(B)小鼠肝切术后相关甲基化修饰酶的变化。Ctrl，对照组；Sham，假手术组；PH12h，肝切后12h组；IP，免疫共沉淀；Input，阳性对照。n.s.nosignificant difference无显著性差异；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

图6为实施例6中甲基化酶Mettl14调控Acot2 mRNA的m6A修饰及转录与蛋白水平含量：(A)Mettl14肝脏条件性敲除鼠的肝脏Acot2的免疫印迹结果；(B)Mettl14肝脏条件性敲除鼠的肝脏Acot2的qPCR结果；(C)Mettl14肝脏条件性敲除鼠的肝脏PPARα的qPCR结果；(D)Mettl14肝脏条件性敲除鼠的肝脏PPARα的免疫印迹结果；(E)Mettl14肝脏条件性敲除鼠的Acot2的免疫荧光和免疫组化结果。WT，野生型小鼠；KO，Mettl14肝脏条件性敲除小鼠。*P<0.05；**P<0.01。

图7为实施例7中体外实验METTL14与ACOT2转录及蛋白水平的表达关系：(A)AML12与HepG2的METTL14敲低效果；(B)敲低METTL14后AML12与HepG2的ACOT2变化。shNC，对照组；shM14，敲低METTL14组。Ctrl，对照组；Ketogenic，生酮培养基处理组。n.s.no significantdifference无显著性差异；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

图8为实施例8中YTHDF2是ACOT2 m6A修饰的阅读蛋白之一：(A)AML12与HepG2进行Anti-YTHDF2 RIP后ACOT2的PCR结果；(B)过表达YTHDF2后ACOT2变化；(C)敲低Mettl14后进行YTHDF2 RIP的结果。shNC，对照组；shM14，敲低METTL14组。oeVec，空载对照组；oeYTHDF2，YTHDF2过表达组。n.s.no significant difference无显著性差异；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

具体实施方式

下面结合本发明的实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1肝部分切除术后肝再生早期ACOT2的表达变化检测

一、实验方法：

1、小鼠2/3PHx手术：

小鼠肝脏部分切除术操作同既往文献报道。用1％戊巴比妥钠麻醉小鼠后，正中线开腹，将小鼠2/3肝叶(左外叶和中叶)通过结扎相应的分支血管进行切除，保留右上、右下和尾状叶，关腹观察。上述处理后，于特定的时间点取材，冻存或固定。

2、荧光定量PCR

(1)组织总RNA提取：

该部分选用RNA快速提取试剂盒，试剂盒的使用方法简述如下：首先，将液氮速冻过的组织切取30mg置于100ul生理盐水中，加入小钢珠后于-10℃的组织研磨仪中研磨2min；短暂离心后将液体转移到新的ep管中，加入500ulRA2液，立即上下颠倒混匀至溶液澄清，室温静置1min；将RA2处理后的样本转移至纯化柱中，12000rpm转速4℃离心1min，弃废液；向纯化柱中加入500ulWash Buffer，12000rpm 4℃离心1min，弃废液；如上再洗涤一次；空纯化柱再次离心1min；将纯化柱转移至新的1.5ml收集管，加入50ul Elute Buffer，静置1min，14000rpm离心1min；最后，用Nanodrop测量RNA的浓度和质量，冻存于-80℃。

(2)反转录：

本研究均使用去除gDNA的反转录试剂，使用方法如下：去除基因组DNA：在冰上配制反应体系：1ug总RNA，4ul 4x genome wiper，DEPC处理水补齐16ul；所使用的反应条件：42℃保温2min，置于冰上冷却。反转录过程的反应体系为上述体系中再加入4ul 5xHiScript Enzyme Mix，反应条件为37℃15min，85℃5sec，最后降至4℃。

(3)实时定量荧光PCR：

在冰上配制反应体系：SYBR GREEN MIX 10ul；Forward Primer(10uM)0.4ul；Reverse Primer(10uM)0.4ul；cDNA 2ul；无菌ddH₂O 7.2ul，共20ul；反应条件为：预变性阶段(1cycle)95℃5min；循环阶段(40cycle)变性95℃10sec，退火/延伸60℃30sec；熔解曲线阶段(1cycle)。最后利用ΔΔCt法计算基因的表达量。

二、实验结果：

我们检查了小鼠Acot家族中位于线粒体的脂酰辅酶A硫酯酶的转录水平变化，试图探究在脂质大量进入肝脏，且能量供需平衡极度波动的再生早期，Acot家族蛋白是否参与线粒体β氧化过程并发挥作用。在目前报道的6个位于线粒体的Acots当中，Acot2显著增加，而Acot11和13显著下降(图1A)，表明线粒体上的Acots可能与肝再生过程相关。

基于上述发现，我们对变化显著的3个Acot基因做了更密集的时间点的检测，发现三者中Acot2的变化趋势与脂滴的动态变化非常吻合，即术后4h开始增加，在8h逐渐增多，12h达到最大，而后逐渐减少，在48h趋于恢复(图1B)。因此，我们认为Acot2可能参与肝切后肝再生的脂代谢过程并与脂滴的消解密切相关。

实施例2建立ACOT2肝脏特异性敲低或过表达小鼠

一、实验方法：

1、尾静脉注射腺相关病毒(AAV8-shAcot2或AAV8-oeAcot2)：

表1Acot2的shRNA序列汇总

对照组为插入无义序列的pscAV-U6-CMV-GFP，腺相关病毒处理组(AAV8-shAcot2)为4条序列的混合物或CMV启动子后插入Acot2(NCBI Gene ID：171210)的CDS区序列加FLAG标签(AAV8-oeAcot2)，所有AAV产品由维真公司合成。用生理盐水将处理组和对照组的病毒滴度稀释至5×10¹²vg/ml，每只小鼠通过尾静脉注射200ul，注射成功后分笼标记。待14天喂养后再行肝脏部分切除术处理(同前所述)。

2、敲低或过表达效果验证：

通过提取组织进行免疫印迹实验，检测ACOT2蛋白在肝脏的敲低或过表达效果。本研究中所涉及的组织及细胞蛋白提取均使用雅酶PC201试剂盒，使用方式简述如下：

(1)组织蛋白提取：

将小鼠肝脏从活体取下后用1XPBS溶液快速冲洗，蘸去多余水分后装于已标记的冻存管中，立即丢入液氮中速冻，后保存于-80℃；提取蛋白前，在变性裂解液中按100：1加入PMSF和蛋白酶抑制剂，于冰上快速切取15-20mg左右的肝组织，置于200ul裂解液中，加入2颗小钢珠，在组织研磨仪中研磨2min至无肉眼可见的组织块；将研磨完毕的组织悬液加入纯化柱，室温静置2min后，于4℃离心机以14000rpm速度离心2min；纯化后的组织裂解产物加入适量5xloadingbuffer，混匀后于100℃煮10min；最后将样品分装后于-80℃冻存。

(2)蛋白定量：

将上述纯化后的裂解产物取5ul用20ul生理盐水稀释后加入96孔板用于蛋白定量；用生理盐水稀释2mg/ml标准BSA成2、1.5、1、0.75、0.5mg/ml各25ul制作标准曲线加入96孔板；将显色试剂A液与B液以50:1的比例混合，每孔200ul加入96孔板，37℃孵育30min后用酶标仪检测562nm波长处的吸光度。根据标准曲线计算蛋白样品的浓度。

(3)免疫印迹：

将4-20％的梯度预制胶安装于电泳槽中，用上述的蛋白样品每孔统一上样30-50ug，补满MOPS runningbuffer后恒压150V泳动1小时。将电泳完毕的胶板取下，拆开塑料板将胶置于纯净ddH₂O中；裁剪所需大小的PVDF膜，并置于甲醇中激活，而后浸泡于PVDF膜平衡液中；制作“三明治”，即由正极至负极依次为：海绵-膜-胶-海绵，使用快速湿转仪的标准模式用Transferbuffer转膜15min。将转膜完毕的PVDF膜从“三明治”中取出并快速置于5％脱脂牛奶或超敏封闭液中，封闭2小时。封闭结束后，用PBST洗膜三遍，每遍5min；如使用超敏封闭液则无需洗膜；将膜裁剪出所需分子量大小的条带置于孵育盒中，加入稀释好的一抗，4℃孵育过夜。将孵育完一抗的条带从4℃冰箱取出，回收一抗，PBST洗膜三遍后，加入对应的荧光二抗，室温避光孵育1小时。最后，将孵育完二抗的条带用PBST洗膜三遍，置于多色荧光凝胶成像分析仪下成像。检测过程中所用的试剂如下表2所示：

表2免疫印迹检测过程中所用试剂汇总

二、实验结果：

参见图2，AAV8-shAcot2组小鼠肝脏Acot2蛋白水平显著减少，而AAV8-oeAcot2组的Acot2蛋白水平显著增加。

实施例3ACOT2敲低或过表达对小鼠肝脏再生的影响

一、实验方法：

1、肝重、体重、肝体比的测量

在肝再生的特定时间点称取小鼠体重，然后处死小鼠，取出肝脏，1xPBS冲洗余血后，蘸尽多余水份，称重小鼠肝脏。肝体比＝肝重(g)/体重(g)。

2、血生化检测

小鼠在处理终点使用摘眼球取血法取血，取血前麻醉小鼠。室温凝血20min后，4℃3000rpm离心20min，取上清保存于-80℃。所检测的指标中，谷丙转氨酶、谷草转氨酶使用全自动生化分析仪进行测量。谷丙转氨酶的测量使用丙氨酸底物法、谷草转氨酶的测量使用天冬氨酸底物法。

二、实验结果：

我们合成了敲低Acot2的腺相关病毒进行小鼠尾静脉注射，注射14天后进行肝切手术。我们发现在野生型小鼠肝切术后24h(PH24h)以及36h(PH36h)，AAV-shAcot2的小鼠Ki67染色阳性肝细胞也显著少于对照组，提示肝实质细胞增殖峰的延迟，并且肝体比略小于对照组。而肝脏损伤相关指标ALT和AST却显著高于对照组。此外，肝细胞内的脂滴较对照组堆积较多(图3A)。而尾静脉注射过表达Acot2的病毒后，能降低肝损伤相关指标ALT和AST，并且肝切后24h(PH24h)的肝体比较对照组稍高(图3B)。

实施例4过表达转录因子PPARα上调ACOT2

一、实验方法：

1、小鼠禁食：

小鼠禁食方式同既往文献所述，即去除食物但自由饮水24h。禁食处理完成后取血及取肝脏进行固定或冻存。

2、小鼠肝切(同前所述)

3、细胞培养实验

(1)HepG2及293T细胞培养：

使用普通DMEM高糖培养基加入10％FBS和1％青霉素-链霉素溶液(P/S)，置于37℃温箱5％CO2环境中培养，约2-3天以1:3-1:5比例传代。细胞冻存使用无血清冻存液，冻于-80℃冰箱或液氮中。细胞于37℃水浴常规复苏。

(2)AML12细胞培养：

基础培养基使用DMEM/F12培养基，加入10％胎牛血清和1％青霉素链霉素溶液，再加入ITS溶液(10ug/ml胰岛素+5.5ug/ml转铁蛋白+5ng/ml硒)，以及终浓度40ng/ml的地塞米松进行常规培养。传代比例1:3。其余同上。

(3)生酮培养基配制：

生酮培养基参考既往文献，AML12的基础培养基去除血清和胰岛素加入50uM的WY-14643和2mM的辛酸钠，培养特定的时间。

4、细胞总RNA提取：

该部分使用TRIzol法进行RNA提取，方法简述如下：

弃细胞培养液，用1x PBS缓冲液洗涤1遍，立即加入1mlTRIzol，晃动培养皿使细胞充分裂解；将TRIzol吸取至无RNase的1.5mlep管中，室温静置5min；随后，加入200ul氯仿，盖紧管盖用力震荡15s，室温静置5min后于12000g4℃离心15min；将分层的匀浆液吸取无色上清层转移至新的ep管，并加入800ul的异丙醇，上下颠倒混匀后于室温静置10min，12000g4℃离心10min；弃上清，用1ml75％乙醇清洗沉淀，7500g4℃离心5min；弃上清，干燥沉淀10min后，溶解于30-50ulDEPC处理水中；最后，用Nanodrop测量RNA的浓度和质量，冻存于-80℃。

5、细胞蛋白提取：

将细胞用胰酶消化后离心收集，用冰PBS溶液重悬离心一次；用使用前加入PMSF和蛋白酶抑制剂的裂解液，根据细胞量调整裂解液使用量。重悬细胞沉淀至无团块；后续步骤同组织蛋白提取。

6、荧光定量PCR和免疫印迹(同前所述)，所用试剂参见表3：

表3 荧光定量PCR和免疫印迹所用试剂汇总

7、质粒构建

小鼠Ppara过表达质粒所选用的载体pcDNA3.1/V5-His A，所选用的酶切位点为BamH I和Xho I，小鼠Rxra过表达质粒所选用的载体为pCMV-N-Flag，所选用的酶切位点为EcoR I和BgI II。

(1)PCR基因片段：

根据NCBI所查找的目的基因CDS区序列以及所使用的载体进行PCR引物设计；然后，冰上配制反应体系：2X PhantaMax Master Mix 25ul；上游引物(10uM)2ul；下游引物(10uM)2ul；cDNA 2ul；ddH₂O补齐50ul；按下述条件进行反应：预变性(1cycle)95℃3min；循环(35cycle)变性95℃15sec→退火60℃15sec→延伸72℃1min/kb；彻底延伸(1cycle)72℃5min；反应完毕后，PCR产物置于4℃保存待用。

(2)载体线性化：

冰上配制反应体系：pcDNA3.1质粒1ug，BamH I 1ul，Xho I 1ul，10X Kbuffer2ul，灭菌水补齐20ul；pCMV-N-Flag 1ug，QuickCut EcoR I 1ul，QuickCut BgI II 1ul，10X QuickCut Buffer 2ul，灭菌水补齐20ul；根据片段化载体的酶切位点选择Buffer和酶切时间：其中EcoR I和BgI II为QuickCut限制酶，在通用缓冲液(10X QuickCut Buffer)中的活性均为100％，综合二者反应时间，选择37℃水浴保温15min；而BamH I和Xho I为普通限制酶，Xho I在H和Kbuffer中活性均为100％，而BamH I在H buffer中活性80％，Kbuffer活性100％，综上二者选择Kbuffer 37℃水浴保温1h；反应完毕置于4℃待用。

(3)胶回收纯化：

上述PCR产物和线性化载体通过胶回收纯化。将前述的PCR产物和线性化载体进行琼脂糖胶电泳，电泳完毕将对应位置的胶切出，吸净多余水分，并用干净的刀片切碎，置于新的1.5mlep管中；用空管去皮，称量胶重；加入克数对应体积的Buffer GDP。55℃水浴加热10min至所有胶块充分溶解，期间上下颠倒检查溶解程度；将试剂盒所提供的吸附柱置于2ml收集管中，一次转移700ul的胶溶解液，12000rpm离心1min，弃废液，直至所有胶溶解液通过吸附柱；加入300ul Buffer GDP，静置1min，12000rpm离心1min；加入700ul BufferGW，压紧管盖上下颠倒2-3次，12000rpm离心1min；再重复一次；弃废液后空管12000rpm离心2min；将吸附柱转移至新管，在膜中央加入30ul洗脱液，室温静置2min后12000rpm离心1min；所得到的纯化产物用Nanodrop进行浓度测量。

(4)重组反应：

将纯化后的PCR产物和线性化载体进行重组反应。计算重组反应所需的PCR产物及线性化载体的用量：PCR产物(ng)＝0.02xbp；载体(ng)＝0.04xbp；再根据胶回收步骤中的浓度测量结果计算体积分别为X和Y；然后，在冰上配制反应体系：插入片段Xul；线性化载体Yul；5xCE II buffer 4ul；Exnase II 2ul，ddH₂O补齐20ul，吹打混匀；最后，37℃反应30min，后置于冰上。

(5)转化涂板：

冰上融化DH5α，将5ul重组反应产物加入50ulDH5α中，轻轻吸吹混匀，冰上静置30min；42℃水浴热激45sec，冰上冷却2min；加入950ulLB培养基，37℃220rpm摇菌1h，期间预热含有抗性的固体平板；5000rpm离心5min，弃900ul上清，用余下100ul重悬，均匀涂板；最后，置于37℃温箱培养12h。

(6)测序：

挑选平板单克隆，LB中加入相应抗生素，小摇5ml后抽取1ml送菌液测序。

(7)质粒抽提：

用到中量及大量抽提，原理均为碱裂法，所用步骤依据所用试剂盒说明，概述如下：过夜培养200ml加入相应抗生素的菌液，离心后收集沉淀；溶液I充分重悬菌液，避免结块；加入碱性SDS溶液II裂解菌液，轻柔颠倒，注意时长；加入酸溶液III中和碱性溶液，沉淀部分蛋白与绝大部分基因组DNA；通过滤器过滤或离心取得上清；上清液使用ETR溶液或类似物冰浴，防止内毒素与树脂结合，以去除内毒素；纯化柱纯化质粒，最终洗脱并回收于无菌的1.5mlep管中；检测质粒的浓度和质量。

二、实验结果：

首先，我们在之前的两种动物模型中检测了PPARα的含量变化，发现在肝切后12h和禁食后24h均存在PPARA转录本的增加(图4B)。此外，我们在人293T及HepG2细胞上通过生酮培养基中辛酸钠的梯度添加产生了ACOT2的梯度变化，在这一梯度变化下，PPARA依旧与ACOT2呈现共同上调的趋势(图4A)。因此，我们认为二者之间可能存在调控。鉴于PPARα在脂肪酸代谢中的强大转录功能，我们构建了Ppara的过表达质粒，通过转染小鼠肝细胞，检测Acot2的含量变化。AML12细胞在转染Ppara后含量显著增加，然而Acot2只变化了1.1倍且无显著性。在此基础上我们又过表达了PPARα的异二聚体RXRα，通过PCR和WB检测了Acot2的含量，发现相较于转染对照质粒过表达双转录因子使Acot2有近4倍的增加(图4C)。所以，我们认为PPARα:RXRα形成的异二聚体复合物是Acot2增加的条件。

实施例5肝切术后肝再生中ACOT2 mRNA的m6A修饰发生变化

一、实验方法：

1、m6A-RIP

(1)RNA片段化：

首先使用TRIzol法提取组织(60-80mg肝组织)总RNA，共需约300ug总RNA，检测浓度后用DEPC处理水调整RNA浓度约1ug/uL；分装上述总RNA入200ulPCR管，即18ul/管，共17管。每管加入10X Fragmentation Buffer各2ul，吹打混匀后短暂离心，置于冰上；预热热循环仪于94℃，每次处理5管，盖盖加热5min后从模块上取下，立即加入2ul 0.5M EDTA，震荡后离心，放于冰上。重复该操作至所有RNA均片段化完毕；将所有片段化后的RNA收集至1.5mlep管中，加入30ul3M乙酸钠(pH5.2)，1.6ul20mg/ml的糖原以及750ul无水乙醇，上下颠倒混匀后置于-80℃过夜沉淀核酸；取出后15000g 4℃离心25min，小心弃上清，加入1ml75％乙醇洗涤沉淀，15000g 4℃离心15min；小心吸弃上清，风干沉淀后溶于335ulDEPC处理水；用Nanodrop检测片段化后RNA浓度，并用1.5％琼脂糖胶检测RNA大小分布(100nt为主)；测量完毕，分装30ul(10％Input)进入新管，标记为Input，冻存于-80℃；剩余部分后续待IP用。

(2)免疫沉淀：

将5×IP buffer用DEPC处理水稀释，每个样品准备5ml1x IP buffer；按样品个数准备新的1.5mlep管，并做好标记。将protein A/G磁珠充分重悬后每管加入50ul，再用500ul IP buffer充分重悬，轻轻吹打混匀几次；将1.5ml装有磁珠的ep管置于磁力架上1min，吸弃上清，再置于冰上；重复上述两步再洗一遍；用200ul 1x IP buffer重悬磁珠，加入10ug抗m6A抗体，室温旋转孵育30min；孵育完毕后短暂离心ep管，后置于磁力架上1min，吸弃上清；用500ul 1X IP buffer轻轻洗涤磁珠三次，最后一次洗涤完毕后只留磁珠，盖紧管盖置于冰上；配制IP反应体系：300ug片段化后的RNA，RNase抑制剂10ul，5X IP buffer200ul，DEPC处理水补齐1ml，并加入上步包被好m6A抗体的磁珠中，彻底重悬磁珠。4℃旋转孵育过夜；将孵育完毕的磁珠取下，用500ul 1X IP buffer重复洗涤3次，置于冰上立马进行洗脱操作。

(3)洗脱：

实验前将20mM的m6A5’单磷酸钠盐溶解于1.3mLDEPC处理水，150ul/管分装并保存于-20℃，临用前解冻；配制Elution Buffer(每个样品)：45ul 5X IP buffer，75ul 20mMm6A盐，3.5ul RNase抑制剂，101.5ulDEPC处理水，共225ul；将100ul洗脱液加入I步洗涤完毕的磁珠中，轻柔充分重悬磁珠。置于4℃恒温振荡金属浴550rpm持续振荡1h；振荡完毕短暂离心ep管，置于磁力架上1min，将洗脱下来的片段化RNA转移到新的1.5mlep管中；重复该操作，一共获得200ul洗脱产物。

(4)RNA纯化：

使用RNeasy(mini)试剂盒纯化RNA，步骤如下：将上述200ul洗脱产物转移至15ml离心管，并加入700ul Buffer RLT混合均匀；再加入1400ul 98％乙醇，吸吹混匀；将700ul的样品加入RNeasy MinElute纯化柱(提前置于2ml收集管中)，10000rpm离心30s，弃废液。重复该步至所有样品均通过纯化柱；将RNeasy MinElute纯化柱转移到新的2ml收集管中，加入500ul Buffer RPE 10000rpm离心30s洗纯化柱膜，弃废液；纯化柱中加入80％乙醇500ul，10,000rpm离心2min，弃废液；纯化柱开盖12000rpm离心5min，弃废液；将纯化柱置于新的1.5ml收集管，向膜中央加入14ulDEPC处理水，盖紧管盖，15000rpm离心1min洗脱RNA。

(5)PCR分析：

该实验使用One Step TB

PrimeScript^TM，即反转录与PCR在同一体系，反转录引物与PCR引物相同。冰上配制反应体系：2X One Step TB Green RT-PCR Buffer 4，10ul；Prime Script 1Step Enzyme Mix 2，0.8ul；Forward Primer(10uM)，0.8ul；ReversePrimer(10uM)，0.8ul；ROX Reference Dye(50X)，0.4ul；总RNA，2ul；DEPC处理水，5.2ul；共20ul；反应条件为：阶段一、二为反转录反应(1cycle)：42℃5min；95℃10sec；阶段三为PCR反应(40cycle)：95℃5sec；60℃30sec；阶段四为熔解曲线阶段；得出的Ct值通过如下公式计算：％Input＝2(-ΔCt[normalized IP])，-ΔCt[normalized IP]＝CtIP-(CtInput-Log2[Input Dilution Factor])，其中Input Dilution Factor＝10。

2、组织蛋白的提取和免疫印迹(同前所述)，所用试剂参见表4：

表4组织蛋白的提取和免疫印迹所用试剂汇总

二、实验结果：

通过对处理后小鼠肝脏组织的m6A-RIP-PCR实验，我们发现Acot2的m6A修饰丰度显著下降(肝切12h组vs对照组，p<0.0001；禁食组vs对照组，P<0.0001)(图5A)。结合已报道的m6A修饰的甲基化酶，我们进一步通过免疫印迹检测了主要的甲基化修饰酶Mettl3、Mettl14、Fto和Ythdf2在肝切12h情况下的含量变化，发现Mettl14为变化最显著的甲基化酶(图5B)。

实施例6敲除Mettl14减少Acot2 mRNA的m6A修饰增加其转录水平与蛋白含量

1、Mettl14-flox；Alb-cre敲除鼠的构建

我们所构建的敲除鼠是白蛋白(Albumin)启动子控制cre酶介导的Mettl14第二个外显子区域的切除。

2、基因型鉴定

(1)脚趾编号：

小鼠出生后三周进行离乳和分笼，同时进行剪脚趾编号，编号方法为左前爪标记各位，右前爪标十位，双后爪从左至右标记百位。将所剪的脚趾和鼠尾一同置于干净的1.5ml ep管中，冻存于-20℃待DNA提取及基因型鉴定。

(2)组织DNA提取，所用试剂参见表5：

表5组织DNA提取所用试剂汇总

如上表配置SNET buffer，取适量按50:1的比例加入蛋白酶K。混匀后以200ul/管的用量加入含有鼠尾和脚趾的ep管中。后置于56℃的温箱中过夜裂解；取出后室温静置5min，颠倒混匀2次，于13000rpm常温离心10min，将上清转移至新ep管中；加入200ul/管的异丙醇，上下翻转混匀10次左右，出现白色絮状物，于12000rpm常温离心10min，弃上清；每管加入500ul的75％乙醇清洗沉淀，于12000rpm室温离心5min，吸净上清，风干10min；加入100ul/管ddH₂O溶解DNA，并置于60℃的金属浴中加热2h促进溶解。期间弹拨ep管混匀并检查溶解程度；Nanodrop检测基因组DNA的浓度和质量。

(3)PCR：

按照所使用的基因型鉴定产品配置25ul反应体系：小鼠基因组DNA100ng，上下游引物(10uM)各1uL，2×HieffPCR Master Mix 12.5uL，其余用ddH₂O补齐；反应条件为：预变性(1cycle)94℃反应5min；变性94℃反应30sec，退火60℃反应30sec，延伸72℃反应30sec/kb，循环35cycle；终延伸(1cycle)72℃反应10min。

(4)DNA电泳：

配制1％-3％琼脂糖凝胶，加热后充分溶解，冷却至50℃左右加入10,000x的核酸染料，混匀后倒入模具冷却；每孔加入10ul上述PCR反应的产物，120V恒压电泳20min，在紫外凝胶成像仪下进行成像拍照；依次核对flox和cre的条带，确认小鼠最终基因型。

3.荧光定量PCR、免疫印迹及m6A-RIP-PCR实验步骤(同前所述)

二、实验结果：

我们在Mettl14肝脏条件性敲除的小鼠中，取组织进一步验证Mettl14与Acot2的相关关系。荧光定量PCR及免疫印迹实验均提示在敲除鼠的肝脏组织中，Acot2的转录及蛋白水平显著上升(图6A和B)。通过荧光定量PCR及免疫印迹检测了基因敲除鼠中Pparα的含量变化，却发现Mettl14的敲除并未引发Pparα的上调(图6C和D)。因此，我们认为Mettl14引发的Acot2上调可能不通过Pparα。我们使用m6A-RIP方法检测了Mettl14条件性敲除鼠Acot2的m6A修饰情况，发现Mettl14敲除鼠的肝脏中该基因的m6A水平大幅减少(图6B)。我们通过免疫组化及免疫荧光的方式进一步证实了Acot2在敲除鼠中增多，并发现Acot2的荧光信号主要来自于体积较大的肝细胞中，并存在近中央静脉含量居多的区域化分布模式(图6E)。表明在肝实质细胞中敲除Mettl14引起的是实质细胞本身Acot2的含量变化而非其余非实质细胞。并且，Mettl14通过影响Acot2的m6A修饰而影响其表达。

实施例7体外敲低Mettl14增加ACOT2转录水平与蛋白含量

一、实验方法：

1、细胞慢病毒稳转株的构建

将慢病毒冰浴融化，留取本次实验所需用量，剩余分装后冻存于-80℃；感染前一日用6孔板铺板细胞，用完全培养基培养过夜；感染当天，先用完全培养基1:24稀释HitransA，再根据MOI加入病毒混匀；吸弃旧培养基，加入含有HitransA和病毒的新培养液，培养48h；更换新的培养基继续培养48h，显微镜下通过荧光检查感染效果；1:1000加入嘌呤霉素2mg/ml筛选感染后的细胞2周，通过PCR和免疫印迹验证效果。慢病毒靶向的敲低序列如下表6：

表6慢病毒靶向的敲低序列

注：所有病毒产品由吉凯公司合成

2、RNA的提取与qPCR(同前所述)

3、蛋白的提取与免疫印迹(同前所述)

二、实验结果：

我们选用了小鼠肝细胞AML12及人的肝母细胞瘤HepG2进行体外培养，并检测这两种细胞中Acot2的表达情况。我们发现相较于AML12细胞，HepG2细胞的ACOT2含量更高，而且AML12的Acot2含量与正常的野生型小鼠的含量低表现较为一致。针对小鼠的Mettl14和人的METTL14我们分别设计了3条敲低序列进行慢病毒包被，然后分别感染AML12以及HepG2细胞，通过嘌呤霉素筛选出成功感染的细胞。筛选并培养2周后，我们对敲低效果进行了检测，可见在人和小鼠的细胞中均实现了有效的敲低(<40％)，小鼠细胞中更低至10％(图7A)。在证实敲低效果后，我们检测了Acot2的变化，发现在HepG2中，shMettl14细胞的ACOT2含量增加至对照组的1.6倍(P＝0.0098)，而AML12细胞在正常状况下无显著变化。考虑AML12细胞Acot2的本底表达含量较低，我们采取了第一部分使用的生酮培养基，即向AML12细胞中添加辛酸钠和WY14643刺激。我们发现生酮培养基可以诱发shNC组Acot2的明显增加，shMettl14组的Acot2表达量为对照组的近3倍(图7B)。表明当AML12细胞Acot2的mRNA水平大幅增加时，Mettl14对Acot2的影响会更加显著(P<0.0001)。

实施例8过表达YTHDF2减少ACOT2转录水平

一、实验方法：

1、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)

(1)细胞裂解：配制RIP裂解液：每100ul RIP裂解中需添加蛋白酶抑制剂0.5ul及RNase抑制剂0.25ul，根据离心后沉淀体积准备等体积的RIP裂解液；用预冷的1xPBS3ml洗涤贴壁细胞2次，加入5ml冰PBS后用细胞刮子将贴壁细胞刮下，转移至15ml离心管，用另外5ml冰PBS再一次洗皿，收集残余的细胞并转移至离心管；1500rpm在4℃离心5min收集细胞，弃上清；加入与细胞沉淀等体积RIP裂解液充分重悬沉淀，吸吹混匀至均质。冰上裂解5min，然后分装成约200ul/管，冻于-80℃。

(2)准备磁珠：充分重悬磁珠，标记RIP反应的管子，每管加入50ul磁珠；用500ulRIP Wash Buffer清洗磁珠两遍，最后用100ul重悬；向磁珠中加入5ug的抗体(目的抗体Anti-YTHDF2或IgG)，室温孵育30min；孵育完毕后短暂离心，将ep管置于磁力架上1min，吸弃上清；用500ul Wash Buffer清洗两次，最后用500ul重悬磁珠置于冰上等待后续操作。

表7检测过程中所用的抗体

(3)免疫沉淀：准备IP buffer：每900ul IP buffer由860ul RIP Wash buffer加入35uL0.5M EDTA以及5uL RNase抑制剂组成，每个样品需900ulIP buffer；将前述重悬的磁珠置于磁力架1min，吸弃上清，加入900uL的IP buffer；快速融化第一部分的细胞裂解物，在4℃以14000rpm离心10min，将200ul上清各取100ul分别加入抗体-磁珠复合物或IgG-磁珠复合物中，此时IP体系共1ml；取剩余裂解物上清10ul加入新的1.5mlep管，并标记为Input，冻存于-80℃；将IP反应管置于4℃旋转孵育过夜；孵育完毕短暂离心，置于磁力架上1min后吸弃上清；用500ul预冷的Wash buffer清洗磁珠复合物共6次。

(4)RNA纯化：准备蛋白酶Kbuffer：150ul蛋白酶Kbuffer通过向117ul RIP Washbuffer中依次添加15ul 10％SDS及18ul 10mg/ml的蛋白酶K制成。每个样品需要150ul蛋白酶Kbuffer；将(3)中的磁珠用150ul蛋白酶Kbuffer重悬，而Input则融化后添加107ul RIPWash Buffer，15ul 10％SDS和18ul蛋白酶K；将所有添加好蛋白酶K的管子置于55℃振荡金属浴振荡30min以消化蛋白；孵育完毕后，将ep管置于磁力架上，将150ul上清转移至新管，并加入250ulRIP wash buffer；每管加入400ul苯酚-氯仿-异戊醇(125:24:1)混合物，振荡15s后，室温离心14000rpm 10min分相；将上层约350ul水相转移至新的离心管，加入400ul氯仿，重复振荡和离心操作；将上层约300ul水相转移至新管，加入50ul盐溶液I，15ul盐溶液II，5ul沉淀增强剂，最后加入850ul无水乙醇，混匀后置于-80℃过夜沉降RNA；14000rpm4℃离心30min，小心弃上清；用80％乙醇清洗沉淀，14000rpm 4℃离心15min，弃上清风干沉淀；用12ulDEPC处理水溶解沉淀，并置于冰上。

(5)反转录及PCR分析：

反转录和PCR操作同前荧光定量PCR部分所述，IP产物全部反转录。根据公式计算％(IP/Input)＝2^(CtInput-CtIP)*DF*100，DF＝用于INPUT的RNA量/用于IP的RNA量，％(IgG/Input)计算同理，Fold Enrichment(富集倍数)＝％(IP/Input)/％(IgG/Input)。

二、实验结果：

我们构建了YTHDF2的过表达质粒转染HepG2细胞，我们发现过表达组中Acot2的含量降低(图8B)。进一步，我们使用抗YTHDF2的抗体在AML12和HepG2两株细胞正常培养情况下均进行RIP试验，发现相较于IgG组，使用YTHDF2抗体能富集到更多的Acot2，并且在小鼠细胞AML12中富集倍数更为显著(图8A)。除此之外，我们用Mettl14敲低株进行YTHDF2的RIP实验，通过PCR证实，YTHDF2进行RIP在Mettl14敲低株中富集到更少的Acot2(图8C)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (9)

1.ACOT2的促表达剂在制备肝脏部分切除术后促进肝再生及肝功能恢复药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

其中，所述ACOT2的促表达剂为直接或间接过表达ACOT2的试剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

其中，所述直接过表达ACOT2的试剂选自过表达ACOT2的重组表达载体或上调ACOT2蛋白活性的物质；

所述间接过表达ACOT2的试剂选自过表达转录因子PPARα或降低ACOT2mRNA的m6A修饰水平的试剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

其中，所述过表达ACOT2的重组表达载体包括过表达ACOT2基因转录本的质粒、腺相关病毒或CRISPR/Cas9基因编辑工具；

所述过表达转录因子PPARα的试剂为PPARα:RXRα形成的异二聚体复合物；

所述降低ACOT2mRNA的m6A修饰水平的试剂为降低m6A甲基化修饰酶Mettl14含量的shRNA。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

其中，所述降低Mettl14酶含量的shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～10任一项所述。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

其中，所述肝脏部分切除术为半肝切除术或联合肝脏分割和门静脉结扎的分阶段肝切除术。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

其中，所述促进肝再生及肝功能恢复药物为减少胞内脂质堆积、降低谷丙转氨酶和谷草转氨酶的水平、促进肝细胞有丝分裂和增加肝体比的药物。

8.一种促进肝再生及肝功能恢复的药物组合物，其特征在于，包括活性组分以及药学上可接受的载体，所述活性组分包括直接或间接过表达ACOT2的试剂。

9.根据权利要求8所述的促进肝再生及肝功能恢复的药物组合物，其特征在于：

所述直接过表达ACOT2的试剂选自过表达ACOT2的重组表达载体或上调ACOT2蛋白活性的物质；

所述间接过表达ACOT2的试剂选自过表达转录因子PPARα或降低ACOT2mRNA的m6A修饰水平的试剂。

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