CN116237099B - 线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片。该芯片具有三层结构，其中：下层为集成微电极阵列的玻璃基板，用于电阻抗谱测量和线虫转向。中间层为流体通道层，由线虫注入通道、存储腔室、转向通道、电阻抗谱测量腔室、流体输出通道依次连接。测量介质注入通道位于所述线虫转向控制通道与电阻抗测量腔室之间。上层为气阀通道层，其中存储腔室控制阀用于控制线虫进出存储腔室。转向通道控制阀，用于控制线虫进入测量腔室。线虫捕获阀用于控制电阻抗谱测量腔室内线虫的捕获和释放。采用以上技术方案，可以基于微流控技术实现线虫原位电阻抗谱测量，具有可定向、可定位、可高速测量的特点。

Description

线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片

技术领域

本发明属于微流控芯片与微纳加工领域，尤其涉及一种线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片。

背景技术

微流控技术是一种精确操控微流体的技术，其研究的空间特征尺度范围通常在1微米至1毫米之间。基本的微流控技术具有容量小、体积小、能耗小、装置集成度高等特点。该技术一般通过微纳加工特定的微流控芯片实现，是一个包括了工程学，流体力学，电磁学，光学，化学，微加工和生物工程等学科的多交叉领域。现阶段集成微电极阵列的微流控芯片成为微生物-电子学研究的有效手段，已经应用在DNA分子检测、单细胞检测、微组织球体检测、模式生物检测等众多领域，发展迅速且具有较大的科研潜力。

秀丽隐杆线虫是一种生物学研究中常用的模式动物，其广泛用于细胞凋亡、衰老、神经系统、减数分裂等研究领域。直接应用秀丽隐杆线虫的研究曾三次获诺贝尔奖，具有巨大的科研价值。相比于其他模式生物，因具有以下特点，秀丽隐杆线虫成为研究生物体衰老、有性繁殖等领域的理想模型。

（1）体型小，繁殖能力强，可在室温条件下大批量繁殖。

（2）寿命短，3-4天即可发育为成虫，平均寿命约为2-3周；

（3）虫体透明，易于显微观测其内部结构和荧光修饰；

（4）完成全基因组测序，易于进行基因分析和基因修饰，且约40%基因与人类同源；

（5）具有性染色体，可以进行遗传学研究和减数分裂等有性繁殖等研究。

电阻抗谱（electrical impedance spectroscopy，EIS）是一种非侵入式、无标记、多参数的检测技术。该方法通过对待测系统施加扫频交流激励，并检测响应信号，能够精确、定量地分析系统的复阻抗。目前电阻抗谱广泛应用于电化学分析、食品安全检测、环境监测、腐蚀机理研究、生物医学研究等众多领域。其中生物医学研究领域，在生物大分子、细胞、组织、模式生物等多层次均有应用。

现阶段虽然基于微流控的原位电阻抗谱检测已经广泛应用于细胞研究，但是针对线虫研究的电阻抗谱检测仍处在基础阶段。主要存在以下问题，首先线虫运动对阻抗测量影响较大，且固定难度较大，测量精度难以保证。其次线虫体型细长，单一电极对难以精确测量线虫各部位阻抗。而且原位电阻抗谱检测的通量较低，测量效率难以保证。因此，为了实现高效、高精度、多位点的线虫原位电阻抗谱检测，有必要开发一种集成微电极阵列、测量流水线、线虫固定阀的线虫原位电阻抗谱检测微流控芯片。

发明内容

本发明目的在于提供一种线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片,以解决线虫运动对阻抗测量影响较大，且固定难度较大，测量精度难以保证，其次线虫体型细长，单一电极对难以精确测量线虫各部位阻抗，而且原位电阻抗谱检测的通量较低，测量效率难以保证的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明的具体技术方案如下：

一种线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片，包括玻璃基板层、流体通道层、气阀通道层；其中玻璃基板层、流体通道层、气阀通道层进行螺钉连接；

玻璃基板层作为整个芯片的底座用于支撑上层结构，并在上方集成微电极阵列；

流体通道层包括线虫注入通道、存储腔室、转向通道、电阻抗谱测量腔室、流体输出通道；其中线虫注入通道、存储腔室、转向通道、电阻抗谱测量腔室、流体输出通道依次连接；测量介质注入通道连接于转向通道与电阻抗谱测量腔室之间；

存储腔室用于存放待测量线虫样本；

转向通道用于线虫在通道内自由转向；

电阻抗谱测量腔室用于与下方电极构成间接接触结构；

气阀通道层包括存储腔室控制阀、转向通道控制阀、线虫捕获阀、线虫固定阀，其中：

存储腔室控制阀有2个，分别位于存储腔室两侧狭缝上方，用于控制线虫进出存储腔室；

转向通道控制阀，位于转向通道与电阻抗谱测量腔室之间的狭缝上方，用于控制线虫进入电阻抗谱测量腔室；

线虫捕获阀，位于电阻抗谱测量腔室和流体输出通道之间的狭缝上方，用于控制电阻抗谱测量腔室内线虫的捕获和释放；

线虫固定阀，位于整个电阻抗谱测量腔室正上方，气阀通道宽度宽于电阻抗谱测量腔室，用于固定进入测量通道的线虫；

微电极阵列包括位于芯片四周的方形电极引脚，用于连接测量电路；以及位于电阻抗谱测量腔室和转向通道周围的功能结构；

功能结构分为两组，第一组为转向电极对位于转向通道的两侧，用于控制线虫转向，第二组为电阻抗谱测量电极位于电阻抗谱测量腔室周围，用于测量不同位置的线虫电阻抗谱；

存储腔室和两侧的存储腔室控制阀组成线虫存储区；线虫存储区完成线虫的一次性注入和存储；入口侧的存储腔室控制阀开启、出口侧的存储腔室控制阀关闭时，线虫注入；入口侧的存储腔室控制阀关闭、出口侧的存储腔室控制阀开启时，线虫进入转向通道；

转向通道、转向电极对、转向通道控制阀组成线虫转向区；线虫转向区对即将进入电阻抗谱测量区的线虫进行快速转向；

电阻抗谱测量腔室、测量介质注入通道、电阻抗谱测量电极、线虫捕获阀、线虫固定阀组成电阻抗谱测量区；电阻抗谱测量区对线虫多个位点进行原位电阻抗谱测量；

线虫存储区、线虫转向区和电阻抗谱测量区构成测量流水线。

进一步的，气阀通道层由聚二甲基硅氧烷PDMS通过软光刻工艺制备。

进一步的，微电极阵列，其材料为Cr-Au（铬-铜）或TiW-Pt（钨钛-铂）其中的一种。

进一步的，存储腔室呈圆形；所述转向通道为条形结构，宽度为成年线虫体宽的二倍；电阻抗谱测量腔室为条形结构，宽度需宽于成年线虫体宽，在该腔室两侧均匀分布有多对狭缝。

进一步的，线虫注入通道、存储腔室、转向通道、电阻抗谱测量腔室、流体输出通道之间的连接处均呈倒三角形，用于配合控制阀开闭流道；倒三角形狭缝限制线虫只能单条通过狭缝。

进一步的，玻璃基板层、流体通道层和气阀通道层的固定连接方式采用多层键合的方式，其中玻璃基板层位于底层，流体通道层位于中间层，气阀通道层位于上层。

进一步的，集成了微电机阵列的玻璃基板层与流体通道层之间由氮化硅钝化层进行隔离，流体通道层与气阀通道层之间由聚二甲基硅氧烷PDMS薄膜进行隔离。

进一步的，微电极阵列，其中电阻抗谱测量电极中的侧向电极采用液态电极方式，即电极与测量腔室不直接接触，而是通过流体通道的狭缝间接接触；

本发明的线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片，具有以下优点：本发明通过微纳加工技术设计并加工芯片，并将微流控技术与电阻抗谱技术结合起来。在设计结构上采用了多层设计，并引入流水线思想。实现了高效、高精度、多位点的线虫的原位电阻抗谱检测。

附图说明

图1为本发明提供的线虫原位电阻抗检测微流控芯片的结构示意图；

图2为本发明玻璃基板和电极二维结构图；

图3为本发明流体通道二维结构图；

图4为本发明气动薄膜阀通道二维结构图；

图5为本发明电阻抗测量区三维结构图；

图6为本发明电阻抗测量区三维结构的A-A向剖面图；

图中标记说明：1、玻璃基板层；2、线虫注入通道；3、线虫存储区；4、存储腔室；5、线虫转向区；6、转向通道；7、测量介质注入通道；8、转向电极对；9、电阻抗谱测量腔室；10、电阻抗谱测量区；11、流体输出通道；12、电阻抗谱测量电极；13、线虫捕获阀；14、线虫固定阀；15、转向通道控制阀；16、存储腔室控制阀；601、气阀通道层；602、流体通道层。

具体实施方式

为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，下面结合附图，对本发明一种线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片做进一步详细的描述。

参阅图1，其为本发明实施中提供的线虫原位电阻抗检测微流控芯片的结构示意图。

在结构上包括玻璃基板层1、流体通道层602、气阀通道层601。其中：

玻璃基板层1作为整个芯片的底座用于支撑上层结构，并在上方集成微电极阵列。

微电极阵列包括位于芯片四周的方形电极引脚，用于连接测量电路；以及位于电阻抗谱测量腔室9和转向通道6周围的功能结构；

功能结构分为两组，第一组为转向电极对8位于转向通道6的两侧，用于控制线虫转向，第二组为电阻抗谱测量电极12位于电阻抗谱测量腔室9周围，用于测量不同位置的线虫电阻抗谱；

微电极阵列，其材料为Cr-Au，其中Cr为种子层，厚度为50nm，Au为电极层，厚度为150nm；

微电极阵列，上方沉积500nm厚氮化硅薄膜，用作钝化层。

微电极阵列，其中电阻抗谱测量电极12中的侧向电极采用液态电极方式，即电极与测量腔室不直接接触，而是通过流体通道的狭缝间接接触。

流体通道层602包括：线虫注入通道2、存储腔室4、转向通道6、电阻抗谱测量腔室9、流体输出通道11依次连接。测量介质注入通道7连接于转向通道6与电阻抗谱测量腔室9之间。其中：

存储腔室4呈圆形，用于存放待测量线虫样本；

转向通道6为条形结构，宽度约为成年线虫体宽的二倍，方便线虫在通道内自由转向；

电阻抗谱测量腔室9为条形结构，宽度略宽于成年线虫体宽，在沟道两侧均匀分布有8对狭缝，用于与下方电极构成间接接触结构。

线虫注入通道2、存储腔室4、转向通道6、电阻抗谱测量腔室9、流体输出通道11之间的连接处均呈倒三角形，用于配合控制阀开闭流道。倒三角形狭缝有利于限制线虫只能单条通过狭缝。

气阀通道层601包括：存储腔室控制阀16、转向通道控制阀15、线虫捕获阀13、线虫固定阀14，其中：

存储腔室控制阀16有2对，分别位于存储腔室4两侧倒三角形狭缝上方，用于控制线虫进出存储腔室。

转向通道控制阀15，位于转向通道6与电阻抗谱测量腔室9之间的狭缝上方，用于控制线虫进入电阻抗谱测量腔室9 。

线虫捕获阀13，位于电阻抗谱测量腔室9和流体输出通道11之间的狭缝上方，用于控制电阻抗谱测量腔室9内线虫的捕获和释放。

线虫固定阀14，位于整个电阻抗谱测量腔室9正上方，气阀通道宽度略宽于电阻抗谱测量腔室9，用于固定进入测量通道的线虫。

一种用于线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片，在制造工艺上采用多层键合的方式，其中集成了微电机阵列的玻璃基板层1与流体通道层602之间由氮化硅钝化层进行隔离，流体通道层602与气阀通道层601之间由PDMS薄膜进行隔离。

玻璃基板层1的微电极阵列由AZ5214光刻胶经过光刻显影，再经过Au电子束蒸发获得。最后通过氮化硅沉积和离子反应刻蚀获得钝化层。

流体通道层602与气阀通道层601，均由PMDS（聚二甲基硅氧烷），经软光刻工艺制备，具体包括硅烷化模具的准备、PDMS和固化剂的比例与混合、脱气去除气泡、在模具上浇注PDMS、PDMS烘烤、PDMS剥离模具、PDMS切割与打孔。其中模具采用SU-8阳模。

流体通道层602浇筑PDMS时，需通过匀胶机控制厚度，且该层的剥离需在流体通道层602与气阀通道层601键合后进行。

玻璃基板层1、流体通道层602和气阀通道层601的键合工艺，需进行等离子体活化，之后通过各层上的对准标记采用键合机进行键合，再90℃加热30分钟。

本发明在功能上包括线虫存储区3、线虫转向区5、电阻抗谱测量区10。三者构成测量流水线，可以在上一条测量电阻抗的同时完成下一条线虫的转向，待上一条线虫完成测量的排出同时下一条线虫即可进入测量通道，周而复始。

线虫存储区3包括存储腔室4和两侧的存储腔室控制阀16。该区域的主要功能是完成大批量线虫的一次性注入和存储。入口侧的控制阀开启、出口侧的控制阀关闭时，线虫注入。入口侧的控制阀关闭、出口侧的控制阀开启时，线虫进入转向通道。

线虫转向区5包括：转向通道6、转向电极对8、转向通道控制阀15。该区域主要功能是对即将进入电阻抗谱测量区10的线虫进行快速转向。该方案利用了线虫趋电性，即线虫会趋向于电势低的方向，在测量区域施加从左向右的电场可以快速引导线虫向右侧移动。并通过转向控制阀，保证线虫完成转向后再进入电阻抗谱测量区10。

电阻抗谱测量区10包括：电阻抗谱测量腔室9、测量介质注入通道7、电阻抗谱测量电极12、线虫捕获阀13、线虫固定阀14，该区域的主要功能是对线虫多个位点进行原位电阻抗谱测量。其中线虫捕获阀13与线虫固定阀14配合使用捕获线虫并确保线虫在测量过程中保持稳定，测量介质注入通道7注入测量介质和其他的实验所需溶液。电阻抗谱测量电极12循环扫描线虫不同位点的电阻抗谱。测量完毕后开启线虫捕获阀与线虫固定阀释放线虫。循环转向测量过程即可完成线虫的大批量线虫的快速原位电阻抗谱测量。

可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims (8)

1.一种线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片，其特征在于，包括玻璃基板层（1）、流体通道层（602）、气阀通道层（601）；其中玻璃基板层（1）、流体通道层（602）、气阀通道层（601）进行螺钉连接；

所述玻璃基板层（1）作为整个芯片的底座用于支撑上层结构，并在上方集成微电极阵列；

所述流体通道层（602）包括线虫注入通道（2）、存储腔室（4）、转向通道（6）、电阻抗谱测量腔室（9）、流体输出通道（11）；其中线虫注入通道（2）、存储腔室（4）、转向通道（6）、电阻抗谱测量腔室（9）、流体输出通道（11）依次连接；测量介质注入通道（7）连接于转向通道（6）与电阻抗谱测量腔室（9）之间；

所述存储腔室（4）用于存放待测量线虫样本；

所述转向通道（6）用于线虫在通道内自由转向；

所述电阻抗谱测量腔室（9）用于与下方电极构成间接接触结构；

所述气阀通道层（601）包括存储腔室控制阀（16）、转向通道控制阀（15）、线虫捕获阀（13）、线虫固定阀（14），其中：

所述存储腔室控制阀（16）有2个，分别位于存储腔室（4）两侧狭缝上方，用于控制线虫进出存储腔室（4）；

转向通道控制阀（15），位于转向通道（6）与电阻抗谱测量腔室（9）之间的狭缝上方，用于控制线虫进入电阻抗谱测量腔室（9）；

线虫捕获阀（13），位于电阻抗谱测量腔室（9）和流体输出通道（11）之间的狭缝上方，用于控制电阻抗谱测量腔室（9）内线虫的捕获和释放；

线虫固定阀（14），位于整个电阻抗谱测量腔室（9）正上方，气阀通道宽度宽于电阻抗谱测量腔室（9），用于固定进入测量通道的线虫；

所述微电极阵列包括位于芯片四周的方形电极引脚，用于连接测量电路；以及位于电阻抗谱测量腔室（9）和转向通道（6）周围的功能结构；

所述功能结构分为两组，第一组为转向电极对（8）位于转向通道（6）的两侧，用于控制线虫转向，第二组为电阻抗谱测量电极（12）位于电阻抗谱测量腔室（9）周围，用于测量不同位置的线虫电阻抗谱；

所述存储腔室（4）和两侧的存储腔室控制阀（16）组成线虫存储区（3）；线虫存储区（3）完成线虫的一次性注入和存储；入口侧的存储腔室控制阀（16）开启、出口侧的存储腔室控制阀（16）关闭时，线虫注入；入口侧的存储腔室控制阀（16）关闭、出口侧的存储腔室控制阀（16）开启时，线虫进入转向通道（6）；

所述电阻抗谱测量腔室（9）、测量介质注入通道（7）、电阻抗谱测量电极（12）、线虫捕获阀（13）、线虫固定阀（14）组成电阻抗谱测量区（10）；电阻抗谱测量区（10）对线虫多个位点进行原位电阻抗谱测量；

所述转向通道（6）、转向电极对（8）、转向通道控制阀（15）组成线虫转向区（5）；线虫转向区（5）对即将进入电阻抗谱测量区（10）的线虫进行快速转向；

所述线虫存储区（3）、线虫转向区（5）和电阻抗谱测量区（10）构成测量流水线。

2.根据权利要求1所述的线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片，其特征在于，所述气阀通道层（601）由聚二甲基硅氧烷PDMS通过软光刻工艺制备。

3.根据权利要求1所述的线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片，其特征在于，所述微电极阵列，其材料为Cr-Au或TiW-Pt其中的一种。

4.根据权利要求1所述的线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片，其特征在于，所述存储腔室（4）呈圆形；所述转向通道（6）为条形结构，宽度为成年线虫体宽的二倍；所述电阻抗谱测量腔室（9）为条形结构，宽度需宽于成年线虫体宽，在该腔室两侧均匀分布有多对狭缝。

5.根据权利要求1所述的线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片，其特征在于，所述线虫注入通道（2）、存储腔室（4）、转向通道（6）、电阻抗谱测量腔室（9）、流体输出通道（11）之间的连接处均呈倒三角形，用于配合控制阀开闭流道；倒三角形狭缝限制线虫只能单条通过狭缝。

6.根据权利要求1所述的线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片，其特征在于，玻璃基板层（1）、流体通道层（602）和气阀通道层（601）的固定连接方式采用多层键合的方式。

7.根据权利要求1所述的线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片，其特征在于，集成了微电机阵列的玻璃基板层（1）与流体通道层（602）之间由氮化硅钝化层进行隔离，流体通道层（602）与气阀通道层（601）之间由聚二甲基硅氧烷PDMS薄膜进行隔离。

8.根据权利要求1所述的线虫原位电阻抗谱检测的微流控芯片，其特征在于，所述微电极阵列，其中电阻抗谱测量电极（12）中的侧向电极采用液态电极方式，即电极与测量腔室不直接接触，而是通过流体通道的狭缝间接接触。