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CN116212044A - 抗人Trop2抗体-喜树碱类药物偶联物及其医药用途 - Google Patents

抗人Trop2抗体-喜树碱类药物偶联物及其医药用途 Download PDF

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CN116212044A
CN116212044A CN202211536600.0A CN202211536600A CN116212044A CN 116212044 A CN116212044 A CN 116212044A CN 202211536600 A CN202211536600 A CN 202211536600A CN 116212044 A CN116212044 A CN 116212044A
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CN
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alkyl group
substituted
alkyl
compound
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朱义
卓识
万维李
张勇
于天姿
李刚锐
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Original Assignee
Chengdu Bailidote Biological Pharmaceutical Co ltd
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Publication date
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Abstract

将靶向于人Trop2的抗体与喜树碱类药物进行偶联，形成质量稳定、均一性优良的抗体‑毒素偶联物，其毒素比抗体比例(DAR)为6.0‑8.0。此抗体‑毒素偶联物具有通式Ⅰ所示的结构，其中Ab指的是靶向Trop2的抗体，与连接子‑喜树碱类药物偶联。同时，本发明还披露了此ADC药物的制备、纯化方法，以及在肿瘤治疗的应用。本发明还涉及可与Ab偶联形成抗体‑毒素偶联物的连接子‑药物化合物。
Figure DDA0003977943700000011

Description

抗人Trop2抗体-喜树碱类药物偶联物及其医药用途
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种抗人Trop2抗体与喜树碱类药物形成的抗体-药物偶联物，以及该抗体-药物偶联物的制备方法和应用。本发明还涉及可与Ab偶联形成抗体-毒素偶联物的连接子-药物化合物。
背景技术
人滋养层细胞表面抗原2(Human trophoblast cell surface antigen 2，hTROP2)是由TACSTD2基因编码的单次跨膜Ⅰ型细胞膜蛋白，首次由M.Lipinski等人在研究正常人体及癌变滋养层细胞时发现。在随后的研究过程中，hTROP2分子也被称为能被将胃癌细胞株免疫而得到的小鼠单克隆抗体GA733识别的而肿瘤抗原GA733-1，以及通过非小细胞肺癌细胞免疫而得到的小鼠单克隆抗体RS7-3G11识别的表皮糖蛋白，至1995年该基因被克隆后，证实它们为同一种分子。
hTROP2蛋白全长323个氨基酸残基，包含N末端26个氨基酸残基组成的胞内结构域、C末端248个氨基酸组成的胞外结构域，以及23个氨基酸残基组成的跨膜结构域。其中，hTROP2在胞外结构域的第33、120、168和208位氨基酸残基处有4个N糖基化位点。TROP2基因属于TACSTD基因家族，与该基因家族的另一个成员人滋养层细胞表面抗原1(hTROP1)约有50％的同源性。
目前，hTROP2蛋白的生理学配体和分子功能都尚不明确，但在肿瘤细胞中能够调控钙信号的传导。hTROP2胞内结构域中具有PIP2(4,5-二磷酸磷脂酰肌醇)结合序列，通过Ca2+依赖性激酶的蛋白激酶C可将第303位丝氨酸残基磷酸化，第303位丝氨酸残基的磷酸化会导致PIP2被磷脂酶C(PLC)水解为IP3(三磷酸肌醇)和DAG(二酰甘油)，进而能够实现调控细胞内钙信号传导的过程。
临床标本免疫组织化学分析表明，hTROP2在正常组织中仅在某些上皮细胞有限表达，但在宫颈癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌等多种上皮细胞癌症种类中过量表达。有报道显示，hTROP2的表达水平与肿瘤的侵袭能力、恶性程度以及病人的不良预后密切相关。同时，在肿瘤的起始和发展过程中，hTROP2可作为前列腺癌干细胞的标志物。目前，使用Trop-2作为肿瘤治疗的靶标，抗Trop-2的抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugate,ADC)正在用于多种转移性肿瘤，包括三阴乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)、非小细胞肺癌和小细胞肺癌的治疗。美国临床肿瘤学会(ASCO)在2016年公布了IMMU-132治疗三阴乳腺癌的相关研究，IMMU-132是一种将单克隆抗体RS7和SN-38药物连接在一起的抗体偶联药物,RS7能够特异性靶向hTROP2，hTROP2被发现在80％以上的三阴性乳腺癌肿瘤细胞中大量表达。
喜树碱(CPT)是一种DNA拓扑异构酶Ⅰ(TOPI)抑制剂,喜树碱衍生物能够抑制拓扑异构酶Ⅰ而实现抗肿瘤作用。拓扑异构酶Ⅰ在DNA翻译和转录过程中能够催化单链DNA断裂和连接，使DNA超螺旋松弛，从而促进复制和转录，而拓扑异构酶Ⅰ抑制剂SN-38可以通过阻断DNA链再连接造成DNA损伤，从而抑制DNA复制和转录诱导细胞凋亡。在人源化RS7抗体靶向Trop-2的ADC临床研究中，IMMU-132使用的是中等稳定的连接子，IMMU-132在人血清中SN-38释放的半衰期约为24h，在人和小鼠中的消除半衰期约为11h，消除速率较快，平均滞留时间约为15.4h，预示着在临床治疗中，IMMU-132的用药频率会较高。同时，在诸如SN-38等拓扑异构酶抑制剂的使用过程中，IMMU-132常伴有严重的副反应，如腹泻产生。而使用更为稳定的连接子预计会延长平均滞留时间和降低用药。因此，进一步研究更为安全有效的靶向Trop-2技术迫在眉睫。
抗体药物偶联物(Antibody drug conjugate,ADC)由抗体(Antibody)、细胞毒性小分子药物(Drug)以及连接抗体和药物的连接子(Linker)三部分组成，小分子药物通过化学偶联的方式结合到抗体蛋白上。ADC药物通过抗体特异性识别，引导小分子药物到达癌细胞靶点，通过内吞效应进入癌细胞，释放出细胞毒性药物，从而特异性杀死癌细胞。临床研究证明，ADC药物在血液中相对稳定且药效高，并且能够有效降低小分子细胞毒性药物对健康组织的毒害，是目前抗癌药物研究的热点。Trop-2作为多种上皮细胞癌症种类中特异高表达的蛋白，更是一个极佳的ADC候选靶点。
发明内容
发明人在对ADC类药物综合理解的基础上，公开了一种抗人Trop2抗体-药物偶联物及其制备方法，包含所述偶联物的药物组合物以及所述偶联物或药物组合物的用途。本发明还涉及可与抗人Trop2抗体偶联形成抗体-毒素偶联物的连接子-药物化合物。
本发明的第一方面公开一种如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
Figure BDA0003977943680000021
其中：
Ab为靶向人Trop2的抗体或其抗原结合片段；
L1非限制性地选自：
Figure BDA0003977943680000022
优选L1为
Figure BDA0003977943680000023
优选L1为
Figure BDA0003977943680000031
L2具有如下式A所示的结构，
Figure BDA0003977943680000032
其中Y为支架，选自C1-C6烷基、取代C1-C6烷基或C3-C8环烷基；优选Y为C1-C6烷基；Ac为亲水结构单元；与Y相连的2号碳具有R构型或S构型的绝对手性；
L3存在或者不存在，当存在时，L3选自PEG亲水单元：
Figure BDA0003977943680000033
选自1-10的整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，优选2-8的整数；
L4为酶切单元；
L5为连接单元；
式I中与N相连的1号手性碳原子具有R构型或者S构型的绝对手性；
R选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R选自氢原子或C1-C6烷基；
R1选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羧基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R1选自氢原子或C1-C6烷基；
更优选R1选自C1-C6烷基；
R2选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羧基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R2选自氢原子、卤素或C1-C6烷基；
更优选R2选自卤素；
X选自-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-O-、-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-NH-或-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-S-；
优选X选自-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-O-；
Ra和Rb各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C6-C10芳基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选Ra和Rb各自独立地选自氢原子、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基或C6-C10芳基C1-C6烷基；
或者，Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；优选Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基；
R3、R4相同或者不同，且分别独立地为氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、氨基、氰基、硝基、羟C1-C6烷基、C3-C8环烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；
优选R3、R4分别独立地为氢原子或C1-C6烷基；
或者，R3、R4及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；
m选自0-4的整数(例如0、1、2、3或4)，优选为0、1；n选自1-10的整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab为靶向TROP2的抗体或其抗原结合片段。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体包含：两条IgG1重链；两条κ轻链。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体的κ轻链包含如SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示的CDR，IgG1重链包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的CDR。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体由重链和轻链组成，所述的轻链包含核酸编码序列分别为SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29的CDRL1、CDRL2和CDRL3，所述的重链包含核酸编码序列分别为SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQID NO：23的CDRH1、CDRH2和CDRH3。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体由重链和轻链组成，所述的重链包含序列为SEQ ID NO：13的重链可变区，所述的轻链包含序列为SEQ ID NO：14的轻链可变区。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体由重链和轻链组成，所述的重链可变区包含核酸编码序列为SEQ ID NO：33的重链可变区，所述的轻链可变区包含核酸编码序列为SEQ ID NO：34的轻链可变区。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体重链氨基酸序列为SEQ IDNO：17，抗体轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：18。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体重链核酸编码序列为SEQID NO：37，抗体轻链的核酸编码序列为SEQ ID NO：38。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体包含：两条IgG1重链；两条κ轻链。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体的κ轻链包含如SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12所示的CDR，IgG1重链包含如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的CDR。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体由重链和轻链组成，所述的轻链包含核酸编码序列分别为SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的CDRL1、CDRL2和CDRL3，所述的重链包含核酸编码序列分别为SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQID NO：26的CDRH1、CDRH2和CDRH3。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体由重链和轻链组成，所述的重链包含序列为SEQ ID NO：15的重链可变区，所述的轻链包含序列为SEQ ID NO：16的轻链可变区。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体由重链和轻链组成，所述的重链可变区包含核酸编码序列为SEQ ID NO：35的重链可变区，所述的轻链可变区包含核酸编码序列为SEQ ID NO：36的轻链可变区。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体重链氨基酸序列为SEQ IDNO：19，抗体轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：20。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体重链核酸编码序列为SEQID NO：39，抗体轻链的核酸编码序列为SEQ ID NO：40。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，所述X非限制性地选自以下结构或其异构体：
Figure BDA0003977943680000051
其中左侧波浪线与喜树碱衍生物部分相连，右侧波浪线与L5相连。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开如通式Ⅰ所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：L4非限制性地选自由氨基酸构成的肽残基，
其中任选地，所述氨基酸进一步被选自氘原子、卤素、羟基、氰基、氨基、硝基、羧基、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和C3-C8环烷基或者取代C3-C8环烷基中的一个或多个取代基所取代；
优选地，所述肽残基为由一个、两个或者多个选自苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、赖氨酸(K)、瓜氨酸(C)、丝氨酸(S)、谷氨酸(E)或者天冬氨酸(D)中的氨基酸形成的肽残基；
更优选地，所述肽残基为为由甘氨酸(G)-甘氨酸(G)-苯丙氨酸(F)-甘氨酸(G)组成的四肽残基。
特别优选地，所述肽残基为-GGFG-。
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：
L5非限制性地选自-NR5(CR6R7)q-或者化学键，q选自0-6的整数(例如0、1、2、3、4、5或6)；
R5、R6和R7相同或者不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选地，R5、R6和R7各自独立地选自氢原子或C1-C6烷基；
更优选地，R5、R6和R7各自独立地选自氢原子。
在某些实施方案中，L1非限制性地选自：
Figure BDA0003977943680000061
在本发明第一方面的一些实施方式中，公开如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述连接单元-L1-L2-L3-L4-L5-非限制性地选自以下结构；
Figure BDA0003977943680000062
Figure BDA0003977943680000071
优选为
Figure BDA0003977943680000072
其中：
Ac为亲水结构单元；
R5、R6和R7相同或者不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选地，R5、R6和R7各自独立地选自氢原子或C1-C6烷基；
更优选地，R5、R6和R7各自独立地选自氢原子；
与N相连的2号碳原子具有R构型或者S构型的绝对手性；
左侧波浪线与抗体或其抗原结合片段部分相连，右侧波浪线与X相连；
o选自1-10的整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。
本发明的第二方面公开一种如通式Ⅱ所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
Figure BDA0003977943680000073
其中：
Ab为靶向人Trop2的抗体或其抗原结合片段；
L1为连接单元与Ab连接，非限制性地选自：
Figure BDA0003977943680000081
L1优选为
Figure BDA0003977943680000082
L1优选为
Figure BDA0003977943680000083
L3存在或者不存在，当L3存在时，L3选自
Figure BDA0003977943680000084
o选自1-10的整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，优选2-8的整数；
Ac为亲水结构单元；
1位、2位及3位手性碳原子具有R绝对构型或S绝对构型两种手性构型；
R选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R选自氢原子或C1-C6烷基；
R1选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羧基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R1选自氢原子或C1-C6烷基；
更优选R1选自C1-C6烷基；
R2选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羧基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R2选自氢原子、卤素或C1-C6烷基；
更优选R2选自卤素；
X选自-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-O-、-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-NH-或-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-S-；
优选X选自-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-O-；
Ra和Rb各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选Ra和Rb各自独立地选自氢原子、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基或C6-C10芳基C1-C6烷基；
或者，Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；优选Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基；
R3、R4相同或者不同，且分别独立地为氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、氨基、氰基、硝基、羟C1-C6烷基、C3-C8环烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；
优选R3、R4分别独立地为氢原子或C1-C6烷基；
或者，R3、R4及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；
m选自0-4的整数(例如0、1、2、3或4)，优选为0、1；
n选自1-10的整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。
在本发明的第一方面和第二方面的一些实施方式中，公开所述的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述Ac具有如下式B所示结构，
Figure BDA0003977943680000091
其中：
Z非限制性地选自亲水结构羧基、磷酸、聚磷酸、亚磷酸、磺酸、亚磺酸或聚乙二醇(PEG)中的一种或多种所组成的组；
优选Z选自亲水结构羧基、磷酸或聚乙二醇(PEG)；
Y’为任选的连接氨基和Z的支架；优选Y’为C1-C6亚烷基(例如亚甲基)；
Ac通过支架Y与结构式I中已标示的2位碳相连。
在本发明的第一方面和第二方面的一些实施方式中，公开所述的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述Ac非限制性地选自甘氨酸、(D/L)丙氨酸、(D/L)亮氨酸、(D/L)异亮氨酸、(D/L)缬氨酸、(D/L)苯丙氨酸、(D/L)脯氨酸、(D/L)色氨酸、(D/L)丝氨酸、(D/L)酪氨酸、(D/L)半胱氨酸、(D/L)胱氨酸、(D/L)精氨酸、(D/L)组氨酸、(D/L)蛋氨酸、(D/L)天冬酰胺、(D/L)谷氨酰胺、(D/L)苏氨酸、(D/L)天冬氨酸、(D/L)谷氨酸、天然或非天然氨基酸衍生物或以下结构或其异构体，
Figure BDA0003977943680000092
优选
Figure BDA0003977943680000093
在本发明的第一方面和第二方面的一些实施方式中，公开所述的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述Ac非限制性地选自甘氨酸、磷酸、(D/L)谷氨酸或聚乙二醇亲水结构。
在本发明的第一方面和第二方面的一些实施方式中，公开所述的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述
Figure BDA0003977943680000101
具有如下式d所示的结构；
Figure BDA0003977943680000102
其中：
R选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R选自氢原子或C1-C6烷基；
R1选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羧基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R1选自氢原子或C1-C6烷基；
更优选R1选自C1-C6烷基；
R2选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羧基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R2选自氢原子、卤素或C1-C6烷基；
更优选R2选自卤素；
Ra和Rb各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选Ra和Rb各自独立地选自氢原子、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基或C6-C10芳基C1-C6烷基；
优选Ra和Rb各自独立地选自氢原子、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C6-C10芳基；优选Ra和Rb各自独立地选自氢原子、甲基、乙基、三氟甲基、环丙基甲基、苯基；
或者，Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；优选Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基(例如C3-C5环烷基)；
1位手性碳原子具有R绝对构型或S绝对构型两种手性构型；
m选自0或1。
在本发明的第一方面和第二方面的一些实施方式中，公开所述的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述结构式d非限制性的选自以下化合物：
Figure BDA0003977943680000111
Figure BDA0003977943680000121
在本发明的某些实施方案中，L1可以包含丁二酰亚胺基团。在这些实施方案中，配体-药物偶联物在易水解条件下可以发生水解，水解部位即为连接单元的丁二酰亚胺基团。当配体中包含多个连接子-药物时，随水解程度不同，可出现以下情形：
丁二酰亚胺基团完全不水解，即丁二酰亚胺基团均为闭环形式
Figure BDA0003977943680000122
Figure BDA0003977943680000123
丁二酰亚胺基团不完全水解，即部分丁二酰亚胺基团为闭环形式
Figure BDA0003977943680000124
Figure BDA0003977943680000131
而另一部分丁二酰亚胺基团为开环形式
Figure BDA0003977943680000132
Figure BDA0003977943680000133
丁二酰亚胺基团完全水解，即丁二酰亚胺基团均为开环形式
Figure BDA0003977943680000134
Figure BDA0003977943680000135
因此，当ADC中同时存在多个含丁二酰亚胺基团的L1(即，Ab连接有多个含丁二酰亚胺基团的药物-连接子)时，这些丁二酰亚胺基团可以均为闭环形式、部分为开环形式或者全部为开环形式。
可以理解的是，本申请中尽管ADC的化学结构式中出现的丁二酰亚胺基团为闭环形式，但实际上涵盖了丁二酰亚胺全部闭环、部分开环和全部开环这三种情形。
本发明的第三方面公开一种连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：具有如下式Ⅲ所示的结构，
Figure BDA0003977943680000136
其中：
R选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
Ra选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
Rb选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
或者，Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；
优选Ra和Rb各自独立地选自氢原子、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C6-C10芳基；优选Ra和Rb各自独立地选自氢原子、甲基、乙基、三氟甲基、环丙基甲基、苯基；
或者，Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；优选Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基(例如C3-C5环烷基)；
L3存在或者不存在，当L3存在时，选自
Figure BDA0003977943680000141
o选自1-10的整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；
1位或2位手性碳原子具有R绝对构型或S绝对构型两种手性；
Ac为亲水结构单元；
m选自0或1。
在本发明的第三方面的一些实施方式中，公开所述的连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述Ac具有如下式B所示结构，
Figure BDA0003977943680000142
其中：
Z非限制性地选自亲水结构羧基、磷酸、聚磷酸、亚磷酸、磺酸、亚磺酸或聚乙二醇(PEG)中的一种或多种所组成的组；
Y’为任选的连接氨基和Z的支架；优选Y’为C1-C6亚烷基(例如亚甲基)；
Ac通过支架Y与结构式I中已标示的2位碳相连。
在本发明的第三方面的一些实施方式中，公开所述的连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述Ac非限制性地选自甘氨酸、(D/L)丙氨酸、(D/L)亮氨酸、(D/L)异亮氨酸、(D/L)缬氨酸、(D/L)苯丙氨酸、(D/L)脯氨酸、(D/L)色氨酸、(D/L)丝氨酸、(D/L)酪氨酸、(D/L)半胱氨酸、(D/L)胱氨酸、(D/L)精氨酸、(D/L)组氨酸、(D/L)蛋氨酸、(D/L)天冬酰胺、(D/L)谷氨酰胺、(D/L)苏氨酸、(D/L)天冬氨酸、(D/L)谷氨酸、天然或非天然氨基酸衍生物或以下结构，
Figure BDA0003977943680000143
在本发明的第三方面的一些实施方式中，公开所述的连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：Ac非限制性地选自甘氨酸、磷酸、(D/L)谷氨酸或聚乙二醇亲水结构。
在本发明的第三方面的一些实施方式中，公开所述的连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述连接子-药物化合物非限制性地选自以下结构或其异构体，
Figure BDA0003977943680000151
Figure BDA0003977943680000161
Figure BDA0003977943680000171
Figure BDA0003977943680000181
其中：o选自1-10的整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。
本发明第三方面公开的所述连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可作为中间体，用于与配体Ab偶联形成第一方面、第二方面所述式I或式Ⅱ的配体-喜树碱类衍生物偶联物。
本发明的第四方面公开一种制备如第一方面、第二方面所述的通式Ⅰ或通式Ⅱ所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的方法，其特征在于：包含以下步骤，
Figure BDA0003977943680000191
通过还原的抗体或者其抗原结合片段与连接子-药物化合物偶联反应，得到如通式Ⅰ或通式Ⅱ所示配体-喜树碱类衍生物偶联物；
1位、2位或3位手性碳原子具有R构型或S构型的绝对手性；
Ab、L1、L2、L3、L4、L5、X、R、R1、R2及n如前文所述。
本申请还涉及第三方面公开所述的连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物作为中间体在制备配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物中的用途。在某些实施方案中，所述配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物为本发明的第一方面、第二方面和第四方面的配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在某些实施方案中，所述制备按照第四方面公开的制备方法进行。
在本发明的第一方面、第二方面和第四方面的一些实施方式中，公开所述的配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物非限制性地选自以下结构或其丁二酰亚胺开环结构或其异构体，
Figure BDA0003977943680000192
Figure BDA0003977943680000201
Figure BDA0003977943680000211
Figure BDA0003977943680000221
Figure BDA0003977943680000231
Figure BDA0003977943680000241
Figure BDA0003977943680000251
Figure BDA0003977943680000261
Figure BDA0003977943680000271
Figure BDA0003977943680000281
Figure BDA0003977943680000291
Figure BDA0003977943680000301
其中：
hu4D3为靶向人Trop2的抗体或其抗原结合片段；
n选自1-10的整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。
在本发明的第一方面、第二方面和第四方面的一些实施方式中，公开所述的配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物非限制性地选自以下结构或其丁二酰亚胺开环结构或其异构体，
Figure BDA0003977943680000302
Figure BDA0003977943680000311
Figure BDA0003977943680000321
Figure BDA0003977943680000331
Figure BDA0003977943680000341
Figure BDA0003977943680000351
Figure BDA0003977943680000361
Figure BDA0003977943680000371
Figure BDA0003977943680000381
Figure BDA0003977943680000391
Figure BDA0003977943680000401
其中：
hu7F11为靶向人Trop2的抗体或其抗原结合片段；
n选自1-10的整数(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。
在本发明的第一方面、第二方面和第三方面的一些实施方式中，公开所述的配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述药学上可接受的盐包括与结构式中酸性官能团形成的钠盐、钾盐、钙盐或镁盐以及与结构中碱性官能团形成的醋酸盐、三氟乙酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、硝酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、乳酸盐、油酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。
本发明的第五方面公开一种药物组合物，其包含第一方面、第二方面所述的配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或第三方面所述的连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及任选的药学上可接受的载体。
本发明的第六方面公开一种药物制剂，其包含第一方面、第二方面所述的配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或第三方面所述的连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
本发明的第七方面公开第一方面、第二方面所述的配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或第三方面所述的连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，或第五方面所述的药物组合物和/或第六方面所述的药物制剂，在制备用于治疗或预防癌症或者肿瘤的药物中的用途；
或者，第一方面、第二方面所述的配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或第三方面所述的连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，或第五方面所述的药物组合物和/或第六方面所述的药物制剂，用于治疗或预防癌症或者肿瘤；
优选地，癌症或者肿瘤表达有TROP2；
更优选地，癌症或者肿瘤选自腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、肺癌、结肠癌、三阴乳腺癌、直肠癌、结直肠癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、多形性胶质细胞瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病等实体瘤或血液瘤。
本发明的第八方面公开一种治疗或预防癌症或者肿瘤的方法，包括向有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的第一方面或第二方面所述配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或第三方面所述连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，或第五方面所述的药物组合物和/或第六方面所述的药物制剂；
优选地，癌症或者肿瘤表达有TROP2；
更优选地，癌症或者肿瘤选自腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、肺癌、结肠癌、三阴乳腺癌、直肠癌、结直肠癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、多形性胶质细胞瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病等实体瘤或血液瘤。
在本发明的以上各个方面及其实施方式中，
“C1-C6烷基”以及各种涉及“C1-C6烷基”的复合基团(例如，“取代C1-C6烷基”、“氘代C1-C6烷基”)中的“C1-C6烷基”可以替换为“C1-C20烷基”、“C1-C12烷基”或“C1-C10烷基”；
“C3-C8环烷基”以及各种涉及“C3-C8环烷基”的复合基团中的“C3-C8环烷基”可以替换为“C3-C20环烷基”或“C3-C10环烷基”；
“C1-C6烷氧基”以及各种涉及其的复合基团中的“C1-C6烷氧基”可以替换为“C1-C20烷氧基”、“C1-C12烷氧基”或“C1-C10烷氧基”；
“C6-C10芳基”以及各种涉及其的复合基团中的“C6-C10芳基”可以替换为“C6-C12芳基”；
“3-7元杂环基”以及各种涉及其的复合基团中的“3-7元杂环基”可以替换为“3-20元杂环基”、“3-12元杂环基”或“3-10元杂环基”。
有益效果
本发明提供的抗人Trop2抗体-药物偶联物，是一款人源化抗人Trop2抗体与喜树碱类药物偶联得到的抗体-药物偶联物，与现有的同类型药物相比，具有良好的分子稳定性和良好的临床前药效，预期有优秀的临床治疗效果。
附图说明
图1A说明SEC-HPLC检测DS1062a(DAR＝4)聚集情况。
图1B说明SEC-HPLC检测ADC-1聚集情况。
图1C说明SEC-HPLC检测ADC-2聚集情况。
图1D说明SEC-HPLC检测ADC-6聚集情况。
图1E说明SEC-HPLC检测ADC-10聚集情况。
图2A说明RP-HPLC检测DS1062a(DAR＝4)药物-抗体偶联比(DAR)。
图2B说明RP-HPLC检测ADC-1药物-抗体偶联比(DAR)。
图2C说明RP-HPLC检测ADC-2药物-抗体偶联比(DAR)。
图2D说明RP-HPLC检测ADC-12药物-抗体偶联比(DAR)。
图2E说明RP-HPLC检测ADC-6药物-抗体偶联比(DAR)。
图2F说明RP-HPLC检测ADC-10药物-抗体偶联比(DAR)。
图3A说明DS1062a保持了与TINA1抗体对抗原TROP2同等亲和力。
图3B说明ADC-1保持了与TINA1抗体对抗原TROP2同等亲和力。
图3C说明ADC-2保持了与hu4D3抗体对抗原TROP2同等亲和力。
图3D说明ADC-12保持了与hu4D3抗体对抗原TROP2同等亲和力。
图3E说明ADC-6保持了与hu4D3抗体对抗原TROP2同等亲和力。
图3F说明ADC-10保持了与hu4D3抗体对抗原TROP2同等亲和力。
图4说明ADC及对应抗体在BXPC-3细胞上的药效评价。
图5A说明ADC-6、ADC-10、ADC-12均在BXPC3单瘤模型中的体内药效均优于DS1062a和ADC-1。
图5B说明ADC-1、ADC-6、ADC-12和DS1062a在A431+SW620异质瘤中的体内药效实验结果。
图6A说明裸抗hu4D3、hu7F11及化合物d3、d38、d39、d44在人源肿瘤细胞株N87的实验模型中的肿瘤抑制体外活性。
图6B说明裸抗hu4D3、hu7F11及化合物d3、d38、d39、d44在人源肿瘤细胞株SW620的实验模型中的肿瘤抑制体外活性。
图6C说明裸抗hu4D3、hu7F11及化合物d3、d38、d39、d44在人源肿瘤细胞株HCC827的实验模型中的肿瘤抑制体外活性。
图6D说明裸抗hu4D3、hu7F11及化合物d3、d38、d39、d44在人源肿瘤细胞株FaDu的实验模型中的肿瘤抑制体外活性。
图6E说明裸抗hu4D3、hu7F11及化合物d3、d38、d39、d44在人源肿瘤细胞株A431+SW620的实验模型中的肿瘤抑制体外活性。
图7A说明ADC-47、ADC-70、ADC-72、ADC-73、ADC-112、ADC-176、ADC-178、ADC-179在人源肿瘤细胞株N87的实验模型中的肿瘤抑制体外活性。
图7B说明ADC-47、ADC-70、ADC-72、ADC-73、ADC-112、ADC-176、ADC-178、ADC-179在人源肿瘤细胞株SW620的实验模型中的肿瘤抑制体外活性。
图7C说明ADC-47、ADC-70、ADC-72、ADC-73、ADC-112、ADC-176、ADC-178、ADC-179在人源肿瘤细胞株HCC827的实验模型中的肿瘤抑制体外活性。
图7D说明ADC-47、ADC-70、ADC-72、ADC-73、ADC-112、ADC-176、ADC-178、ADC-179在人源肿瘤细胞株FaDu的实验模型中的肿瘤抑制体外活性。
图7E说明ADC-47、ADC-70、ADC-72、ADC-73、ADC-112、ADC-176、ADC-178、ADC-179在人源肿瘤细胞株A431+SW620的实验模型中的肿瘤抑制体外活性。
具体实施方式
缩写和定义
除非另有说明，否则如本文所用的以下术语和短语旨在具有以下含义。当本文中使用商标名称时，除非上下文中另有指明，否则商标名称包括所述商标名称产品的产品配方、通用药物和活性成分。
除非有相反陈述，本文权利要求书和说明书中使用的术语具有下述含义。
术语“配体”是能识别和结合目标细胞相关的抗原或受体的大分子化合物。配体的作用是将药物呈递给与配体结合的目标细胞群，这些配体包括但不限于蛋白类激素、凝集素、生长因子、抗体或其他能与细胞结合的分子。在本发明实施方式中，配体表示为Ab，配体可通过配体上的杂原子与连接单元形成连接键，优选为抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体或鼠源抗体；优选为单克隆抗体。
配体单元是与靶标部分特异性结合的靶向剂。所述配体能够特异性结合至细胞组分或结合至细胞组分或结合至其他感兴趣的靶标分子。靶标部分或靶标通常在细胞表面上。在一些方面中，配体单元的作用是将药物单元递送至配体单元与之相互作用的特定靶细胞群。配体包括但不限于蛋白质、多肽和肽，以及非蛋白质如糖。合适的配体单元包括，例如，抗体，例如全长(完整)抗体及其抗原结合片段。在配体单元是非抗体靶向试剂的实施方式中，其可以是肽或多肽，或非蛋白质分子。这类靶向试剂的示例包括干扰素、淋巴因子、激素、生长因子和集落刺激因子、维生素、营养转运分子、或任何其他细胞结合分子或物质。在一些实施方式中，连接子共价连接至配体的硫原子。在一些方面中，硫原子是半胱氨酸残基的硫原子，其形成抗体的链间二硫键。在另一方面中，硫原子是已经导入配体单元的半胱氨酸残基的硫原子，其形成抗体的链间二硫键。在另一方面中，硫原子是已经导入配体单元的半胱氨酸残基的硫原子(例如，通过定点诱变或化学反应)。在其他方面中，连接子结合的硫原子选自形成抗体的链间二硫键的半胱氨酸残基或已经引入配体单元的半胱氨酸残基(例如，通过定点诱变或化学反应)。在一些实施方式中，按照Kabat{[Kabat E.A等，(1991)]《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(Sequences of proteins of Immunological Interest)，第五版，NIH出版物91-3242}中的EU索引编号系统。
如本文所用，“抗体”或“抗体单元”在其所属的范围内，包括抗体结构的任何部分。这一单元可以结合，反应性关联，或者络合一个受体，抗原或者靶向细胞群体具有的其它受体单元。抗体可以是任何蛋白或蛋白类分子，它可以结合、络合或者与待治疗或生物改造的细胞群体的一部分发生反应。本发明中组成抗体药物偶联物的抗体保持其原有野生状态时的抗原结合能力。因此，本发明中的抗体能够专一性地与抗原结合。涉及的抗原包括，例如，肿瘤相关抗原(TAA)，细胞表面受体蛋白和其他细胞表面分子，细胞存活调节因子，细胞增殖调节因子，与组织生长与分化相关的分子(如已知或预知的具有功能性的)，淋巴因子，细胞因子，参与细胞循环调节的分子，参与血管生成的分子，以及与血管生成有关的分子(如已知或预知的具有功能性的)。肿瘤相关因子可以是簇分化因子(如CD蛋白)。
应用在抗体药物偶联物中的抗体包括，但不局限于，针对细胞表面受体和肿瘤相关抗原的抗体。这样的肿瘤相关抗原是业内所熟知的，可以通过业内熟知的抗体制备方法和信息来制备。为了开发可用于癌症诊断与治疗的有效的细胞水平目标物，研究人员力图找寻跨膜或其他肿瘤相关多肽。这些目标物能够特异性的表达在一种或多种癌细胞表面，而在一种或多种非癌细胞表面表达很少或不表达。通常，相对于非癌细胞表面而言，这样的肿瘤相关多肽在癌细胞表面更加过度表达。确认这样的肿瘤相关因子，可大大提高基于抗体治疗癌症的专一靶向特性。为方便起见，为业内所熟知的抗原相关信息标示如下，包括名称，其他名称，基因库登录号。与肿瘤相关抗原对应的核酸和蛋白序列可参见公开数据库，例如Genbank。抗体靶向对应的肿瘤相关抗原包括所有的氨基酸序列变种和同种，与参考文献中确认的序列具有至少70％,80％,85％,90％或者95％的同源性，或者具备与引用文献中的肿瘤相关抗原序列具有完全一致的生物性质和特征。
术语“抑制”或“的抑制”指，减少了可检测的量，或完全阻止。
术语“癌症”指的是以失调的细胞生长为特征的生理病症或疾病。“肿瘤”包括癌细胞。
术语“自身免疫疾病”是源自针对个体自身的组织或蛋白质的疾病或紊乱。
术语“药物”是指细胞毒性药物，药物表示为d，能在肿瘤细胞内具有较强破坏其正常生长的化学分子。细胞毒性药物原则上在足够高的浓度下都可以杀死肿瘤细胞，但是由于缺乏特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，也会导致正常细胞的凋亡，导致严重的副作用。该术语包括毒素，如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu176的放射性同位素)，毒性药物，化疗药物，抗生素和核溶酶，优选为毒性药物。
术语“连接子”或“连接片段”或“连接单元”是指一端与配体连接而另一端与药物相连的化学结构片段或键，也可以连接其他接头后再与药物相连。
接头，包括延伸物、间隔物和氨基酸单元，可以通过本领域己知方法合成，诸如US2005-0238649A1中所记载的。接头可以是便于在细胞中释放药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等Cancer Research52:127-131,1992)；美国专利No.5,208,020。
按照在细胞内药物释放的机制，如本文所用，“连接子”或“抗体药物偶联物的连接子”可被分为两类：不可断裂连接子和可断裂连接子。对于含有不可断裂连接子的抗体-药物偶联物，其药物释放机制为：偶联物与抗原结合并被细胞内吞后，抗体在溶酶体中被酶解，释放出由小分子药物，连接子，和抗体氨基酸残基共同组成的活性分子。由此带来的药物分子结构改变并不减弱其细胞毒性，但由于活性分子是带电荷的(氨基酸残基)，从而导致其不能渗入邻近细胞。因此，此类活性药物不能杀死邻近不表达靶向抗原(抗原阴性细胞)的肿瘤细胞(旁观者效应，bystander effect)(Ducry等，2010，Bioconjugate Chem.21:5-13)。对于含有可断裂连接子的抗体-药物偶联物，其药物释放机制为：偶联物与抗原结合并被细胞内吞后，在目标细胞内断裂并释放出活性成分(小分子药物本身)。可断裂连接子主要分为：化学敏感型连接子和酶敏感型连接子。化学敏感型连接子可以由于血浆和细胞质或肿瘤微环境性质的不同而选择性的断裂。这样的性质包括pH值，谷胱甘肽浓度等。对pH值敏感的连接子，在血液的中性或弱碱性环境下相对稳定(pH7.3-7.5)，但是在弱酸性的肿瘤微环境(pH5.0-6.5)和溶酶体(pH4.5-5.0)内将会被水解，例如腙，碳酸酯，缩醛，缩酮类。由于酸断裂连接子有限的血浆稳定性，基于此类连接子的抗体-药物偶联物通常具有较短的半衰期(2-3天)。这种较短的半衰期在一定程度上限制了pH敏感连接子在新一代抗体药物偶联物中的应用。对于谷胱甘肽敏感的连接子，又称二硫键连接子。药物释放是基于细胞内谷胱甘肽的高浓度(毫摩尔范围)与血液中相对较低的谷胱甘肽浓度(微摩尔范围)差异引起的。对于肿瘤细胞而言尤其如此，其低含氧量导致还原酶的活性增强，因而导致更高的谷胱甘肽浓度。二硫键具有热力学稳定性，因此在血浆中具有较好的稳定性。酶不稳定连接子，如肽连接子，能够更好地控制药物释放。肽连接子能够被溶酶体内蛋白酶，如组织蛋白酶(Cathepsin B)等有效地切断。这种肽连接被认为在血浆循环中非常稳定，这是因为细胞外不合宜的pH值及血清蛋白酶抑制剂导致蛋白酶通常在细胞外不具备活性。鉴于较高的血浆稳定性和良好的细胞内断裂选择性和有效性，酶不稳定连接子被广泛用做抗体-药物偶联物的可断裂连接子。
术语“抗体-药物偶联物”，指抗体通过稳定的连接单元与具有生物活性的药物相连。在本发明中“配体-药物偶联物”优选为抗体-药物偶联物(antibody drug conjugate,ADC)，指把单克隆抗体或者抗体片段通过稳定的连接单元与具有生物活性的毒性药物相连。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.boil.Chem.1968,243,3558.中所述。
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团(即“C1-C20烷基”)，优选含有1至12个碳原子的烷基(即“C1-C12烷基”)，更优选含有1至10个碳原子的烷基(即“C1-C10烷基”)，最优选含有1至6个碳原子的烷基(即“C1-C6烷基”)。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基。
术语“取代烷基”指烷基中的氢被取代基团取代，除非文中另有说明，烷基的取代基可以是选自下组的多种基团：-卤素、-OR’、-NR’R”、-SR’、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NH-C(NH2)＝NH、-NR’C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NR’S(O)2R”、-CN和-NO2，取代基数量为0至(2m’+1)，其中m’为该基团中碳原子的总数。R’、R”和R”’各自独立的指代氢、未取代的C1-8烷基、未取代的C6-C12芳基(或C6-C10芳基)、由1-3个卤素取代的C6-C12芳基(或C6-C10芳基)、未取代的C1-8烷基、C1-8烷氧基或C1-8硫代烷氧基、或未取代的C6-C12芳基(或C6-C10芳基)-C1-4烷基。R’和R”连接于同一个氮原子时，它们可与该氮原子一起形成3-，4-，5-，6-或7-元环。例如，-NR’R”包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。
术语“亚烷基”指饱和的直链或支链脂肪族烃基，其具有2个从母体烷的相同碳原子或两个不同的碳原子上除去两个氢原子所衍生的残基，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子，更优选含有1至6个碳原子的亚烷基。亚烷基的非限制性实例包括但不限于亚甲基(-CH2-、1,1-亚乙基(-CH(CH3)-)、1,2-亚乙基(-CH2CH2)-、1,1-亚丙基(-CH(CH2CH3)-)、1,2-亚丙基(-CH2CH(CH3)-)、1,3-亚丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)和1,5-亚丁基(-CH2CH2CH2CH2CH2-)等。亚烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选独立地任选选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基和氧代基中的一个或多个取代基所取代。
术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(环烷基)，其中烷基或环烷基的定义如上所述。C1-C6烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子(即“C3-C20环烷基”)，优选包含3至12个碳原子(即“C3-C12环烷基”)，更优选包含3至10个碳原子(即“C3-C10环烷基”)，最优选包含3至8个碳原子(即“C3-C8环烷基”)。单环环烷基(例如，“C3-C8环烷基”)的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。
术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子(即“3-20元杂环基”)，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或S(O)m(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。优选包含3至12个环原子(即“3-12元杂环基”)，其中1～4个是杂原子；更优选环烷基环包含3至10个环原子(即“3-10元杂环基”)。单环杂环基(例如，3-7元杂环基)的非限制性实例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。
术语“环烷基烷基”指烷基被一个或多个环烷基取代，优选被一个环烷基取代，其中烷基如上所定义，其中环烷基如上所定义。例如，C3-C8环烷基C1-C6烷基。
术语“卤代烷基”指烷基被一个或多个卤素取代，其中烷基如上所定义。例如，卤代C1-C6烷基。
术语“氘代烷基”指烷基被一个或多个氘原子取代，其中烷基如上所定义。例如，氘代C1-C6烷基。
术语“C6-C12芳基”指的是具有6-12个碳原子的碳环芳族体系的基团。
术语“C6-C10芳基”指的是具有6-10个碳原子的碳环芳族体系的基团，例如苯基、萘基等。
术语“5-10元杂芳基”是指芳族的杂环，通常为具有1至3个选自N、O或S的杂原子的5-、6-、7-、8-、9-、10-元的杂环；杂芳基环可以任选地进一步稠合或连接于芳族和非芳族的碳环和杂环。所述5-10元杂芳基的非限制性的实例为例如吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲哚基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噻噁唑基、吡咯基、苯基-吡咯基、呋喃基、苯基-呋喃基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、噻吩基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并1,3-二氧戊环(苯并二噁茂)、异二氢吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、喹啉基、异喹啉基、1,2,3-三唑基、1-苯基-1,2,3-三唑基、2,3-二氢吲哚基、2,3-二氢苯并呋喃基、2,3-二氢苯并噻吩基、苯并吡喃基、2,3-二氢苯并噁嗪基、2,3-二氢喹喔啉基等。
术语“取代C6-C10芳基”或“取代5-10元杂芳基”或“取代3-7元杂环基”指的是芳基或者杂芳基或者杂环基中的氢被取代基团取代，除非文中另有说明，芳基或者杂芳基或者杂环基的取代基可以是选自下组的多种基团：-卤素、-OR’、-NR’R”、-SR’、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NH-C(NH2)＝NH、-NR’C(NH2)＝NH、-NH-C(NH2)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NR’S(O)2R”、-CN和-NO2，取代基数量为0至(2m’+1)，其中m’为该基团中碳原子的总数。R’、R”和R”’各自独立的指代氢、未取代的C1-8烷基、未取代的C6-C12芳基(或C6-C10芳基)、由1-3个卤素取代的C6-C12芳基(或C6-C10芳基)、未取代的C1-8烷基、C1-8烷氧基或C1-8硫代烷氧基、或未取代的C6-C12芳基(或C6-C10芳基)-C1-4烷基。R’和R”连接于同一个氮原子时，它们可与该氮原子一起形成3-，4-，5-，6-或7-元环。例如，-NR’R”包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。
术语“羟基”指-OH基团。
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
术语“氨基”指-NH2。术语“硝基”指-NO2。
术语“酰胺基"指-C(O)N(烷基)或(环烷基)，其中烷基、环烷基如上所定义。
术语“羧酸酯基"指-C(O)O(烷基)或(环烷基)，其中烷基、环烷基如上所定义。
本发明还包括各种氘化形式的式Ⅰ。与碳原子连接的各个可用的氢原子可独立地被氘原子替换。本领域技术人员能够参考相关文献合成氘化形式的式Ⅰ。在制备氘代形式的式Ⅰ时可使用市售的氘代起始物质，或它们可使用常规技术采用氘代试剂合成，氘代试剂的非限制性实例包括:氘代硼烷、三氘代硼烷四氢呋喃溶液、氘代氢化锂铝、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。
术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。本发明所述的抗体优选为针对靶细胞上细胞表面抗原的特异性抗体，非限制性实施例为以下抗体：抗EGFRvIII抗体、抗DLL-3抗体、抗PSMA抗体、抗CD70抗体、抗MUC16抗体、抗ENPP3抗体、抗TDGF1抗体、抗ETBR抗体、抗MSLN抗体、抗TIM-1抗体、抗LRRC15抗体、抗LIV-1抗体、抗CanAg/AFP抗体、抗cladin 18.2抗体、抗Mesothelin抗体、抗HER2(ErbB2)抗体、抗EGFR抗体、抗c-MET抗体、抗SLITRK6抗体、抗KIT/CD117抗体、抗STEAP1抗体、抗SLAMF7/CS1抗体、抗NaPi2B/SLC34A2抗体、抗GPNMB抗体、抗HER3(ErbB3)抗体、抗MUC1/CD227抗体、抗AXL抗体、抗CD166抗体、抗B7-H3(CD276)抗体、抗PTK7/CCK4抗体、抗PRLR抗体、抗EFNA4抗体、抗5T4抗体、抗NOTCH3抗体、抗Nectin 4抗体、抗TROP-2抗体、抗CD142抗体、抗CA6抗体、抗GPR20抗体、抗CD174抗体、抗CD71抗体、抗EphA2抗体、抗LYPD3抗体、抗FGFR2抗体、抗FGFR3抗体、抗FRα抗体、抗CEACAMs抗体、抗GCC抗体、抗Integrin Av抗体、抗CAIX抗体、抗P-cadherin抗体、抗GD3抗体、抗Cadherin 6抗体、抗LAMP1抗体、抗FLT3抗体、抗BCMA抗体、抗CD79b抗体、抗CD19抗体、抗CD33抗体、抗CD56抗体、抗CD74抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD37抗体、抗CD138抗体、抗CD352抗体、抗CD25抗体或抗CD123抗体中一个或多个。
术语“溶剂化物”或“溶剂化合物”指本发明的配体-药物偶联物与一种或多种溶剂分子形成可药用的溶剂化物，溶剂分子的非限制性实例包括水、乙醇、乙腈、异丙醇、DMSO、乙酸乙酯。
术语“载药量”是指式Ⅰ中每个抗体上加载的细胞毒性药物平均数量，也可以表示为药物量和抗体量的比值，药物载量的范围可以是每个抗体(Ab)连接0-12个，优选1-10个细胞毒性药物(d)。在本发明的实施方式中，载药量表示为n,示例性的可以为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10的均值。可用常规方法如UV/可见光光谱法，质谱，ELISA试验和HPLC特征鉴定偶联反应后每个ADC分子的药物品均数量。
本发明的一个实施方式中，细胞毒性药物通过连接单元偶联在抗体链间打开的半胱氨酸巯基-SH和/或定点突变的半胱氨酸残基的巯基-SH上，一般地，偶联反应中能与抗体偶联的药物分子数将小于或等于理论上的最大值。
可以用以下非限制性方法控制配体细胞毒性药物偶联物的载量，包括：
(1)控制连接试剂和单抗的摩尔比，
(2)控制反应时间和温度，
(3)选择不同的反应试剂。
常规的药物组合物的制备见中国药典。
术语“药学上可接受的盐”或“可药用盐”是指本发明配体-药物偶联物的盐，或本发明中所述的化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，本发明配体-药物偶联化合物至少含有一个羧基，因此可以与碱形成盐，药学上可接受的盐的非限制性实例包括：钠盐、钾盐、钙盐或镁盐等。
术语“药学上可接受的盐”或“可药用盐”是指本发明抗体-药物偶联物的盐，或本发明中所述的化合物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性，本发明配体-药物偶联化合物至少含有一个氨基，因此可以与酸形成盐，药学上可接受的盐的非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。
“酸性氨基酸”指氨基酸的等电点小于7，酸性氨基酸分子中往往带有一个或多个羧基等酸性基团，在结构中可有效电离为负离子形式而增加亲水性。酸性氨基酸可以为天然的，也可为非天然的氨基酸。
“天然氨基酸”指由生物合成的氨基酸。天然氨基酸一般情况下是L-型的，但也有少数例外，比如甘氨酸，包括天然的和生物体合成的。
“非天然氨基酸”指通过合成手段所获得的氨基酸。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例只用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比例、比率、或份数按重量计。
实施例1
化合物M1的合成：
Figure BDA0003977943680000491
于5000mL单口瓶中加入N-芴甲氧羰基-甘氨酸-甘氨酸(100g,282mmol,1.0eq)，四乙酸铅(175g,395mmol,1.4eq)，2000mL干燥四氢呋喃和670mL甲苯，搅拌均匀，氮气保护，加热至85℃反应2.5h。TLC监控，原料反应完后，冷却至室温，过滤，滤液减压浓缩，残余物经柱色谱纯化，得化合物M1(87g)；LC-MS：[M+NH4]+＝386.0。
实施例2
化合物M3的合成：
Figure BDA0003977943680000492
于1000mL单口瓶中加入化合物SM-2(按照专利CN108452321A公布的方法合成)(40g,96mmol,1.0eq)，三乙胺(26.7mL,2.0eq)，甲苯(400mL)，升温至120℃下回流反应2h。TLC监测基本完全反应，降温至50℃下减压旋除溶剂。用乙酸乙酯(150mL)，水(40mL)溶解，冰浴搅拌下用1M HCl调pH至2-3，分液。水层用乙酸乙酯再萃取一次，合并有机层，加入无水硫酸钠干燥。过滤后，浓缩得到淡黄色油状粗品，粗品经柱层析纯化(DCM:MeOH＝40:1)，得到化合物M2(26.6g)；LC-MS：[M+H]+＝399.3。
于1000mL单口瓶，加入化合物M2(26.5g，60.5mmol,1.0eq)、五氟苯酚(12.2g,66.5mmol,1.1eq)、DCC(13.7g,66.5mmol,1.1eq)及THF(300mL)，室温反应30min(采用TLC监测)，过滤滤去不溶物。反应液直接经制备纯化，制备液水泵减压水浴35℃浓缩除去乙腈，冻干得到化合物M3(31.5g)，收率64％；LC-MS：[M+H]+＝565.1。
实施例3
化合物ent-M3的合成：
Figure BDA0003977943680000501
参照实施例2合成路线，得到化合物ent-M3(27.8g)；LC-MS：[M+H]+＝565.2。
实施例4
化合物1的合成：
Figure BDA0003977943680000502
第一步：化合物1a
于250mL单口瓶中，加入M1(6g,16.3mmol)，100mL THF，对甲苯磺酸一水合物(0.31g,1.63mmol)，搅拌冷却至0℃，滴加羟乙酸苄酯(5.4g,32.6mmol)，滴毕自然升温至室温反应(反应约2-4h)，TLC监控。反应结束，加入饱和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余物经硅胶柱纯化(PE:EA＝10:1-5:1-1:1)得1a(4g)，收率52％；LC-MS：[M+H]+＝475.18。
第二步：化合物1b
于25mL单口瓶，加入1a(2g,4.2mmol)，10mL DMF，0℃搅拌，加入DBU(766mg,5.04mmol)，反应1h，TLC监测Fmoc脱保护完成后，待用；
另取25mL单口瓶中加入M4(参考专利CN111051330 A公布的方法制备)(1.73g,4.2mmol)，PyBOP(2.61g,5.04mmol)，HOBt(680mg,5.04mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(830uL,5.04mmol)，继续搅拌30min，将上述反应液加至反应瓶中，升至室温反应。HPLC监测反应结束后，反应液经制备液相纯化，得到产品制备液，制备液经二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到固体1b(1.7g)，收率63％；LCMS：[M+H]+＝648.26。
第三步：化合物1c
于25mL单口瓶中加入1b(900mg,1.39mmol)，15mL DMF溶清后，加入900mg 5％Pd/C，氢化反应2h，反应完毕，过滤，得滤液，未经纯化直接用于下一步反应。
第四步：化合物1d
将粗产品1c置于冰水浴中，加入DIPEA(235uL,1.39mmol)，再加入化合物M3(784mg,1.39mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到1d(504mg)；LC-MS：[M+H]+＝804.4。
第五步：化合物1e
于50mL单口瓶中加入1d(500mg,0.62mmol)，M5(310mg,0.62mmol)，PyBOP(448mg,0.86mmol)，HOBt(116mg,0.86mmol)及15mL DMF,冰水浴下加入DIPEA(378uL,2.29mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物1e的制备液，制备液冻干得到1e(210mg)；LC-MS：[M+H]+＝1221.6。
第六步：化合物1
于25mL单口瓶中加入1e(100mg,0.081mmol)，溴化锌(368mg,1.63mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物1(60mg)；LC-MS：[M+H]+＝1065.3。
实施例5
化合物2的合成：
Figure BDA0003977943680000511
参照实施例4合成路线，得到化合物2(51mg)；LC-MS：[M+H]+＝1065.3。
实施例6
化合物3的合成：
Figure BDA0003977943680000521
第一步：化合物3a
于250mL单口瓶中，加入M1(6g,16.3mmol)，100mL THF，对甲苯磺酸一水合物(0.31g,1.63mmol)，搅拌冷却至0℃，滴加2-羟基-2-甲基丙酸苄酯(6.3g,32.6mmol)，滴毕自然升温至室温反应(反应约2-4h)，TLC监控。反应结束，加入饱和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余物经硅胶柱纯化(PE:EA＝10:1-5:1-2:1)得3a(4.2g)，收率52％；LC-MS：[M+H]+＝503.3。
第二步：化合物3b
于25mL单口瓶，加入3a(2g,4.0mmol)，10mL DMF，0℃搅拌，加入DBU(760mg,5.0mmol)，反应1h，TLC监测Fmoc脱保护完成后，待用；
另取25mL单口瓶中加入M4(1.65g,4.0mmol)，PyBOP(2.59g,5.0mmol)，HOBt(675mg,5.0mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(823uL,5.04mmol)，继续搅拌30min，将上述反应液加至反应瓶中，升至室温反应。HPLC监测反应结束后，反应液经制备液相纯化，得到产品制备液，制备液经二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到固体3b(1.4g)，收率53％；LC-MS：[M+H]+＝676.2。
第三步：化合物3c
于25mL单口瓶中加入3b(700mg,1.04mmol)，10mL DMF溶清后，加入700mg 5％Pd/C，氢化反应1.5h，反应完毕，过滤，得滤液，未经纯化直接用于下一步反应。
第四步：化合物3d
将粗产品3c置于冰水浴中，加入DIPEA(210uL,1.25mmol)，再加入化合物M3(704mg,1.25mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到3d(486mg)；LC-MS：[M-H]-＝830.5。
第五步：化合物3e
于50mL单口瓶中加入3d(300mg,0.36mmol)，M5(180mg,0.36mmol)，PyBOP(260mg,0.5mmol)，HOBt(67mg,0.5mmol)及10mL DMF,冰水浴下加入DIPEA(219.5uL,1.33mmol)，升至室温反应3h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物3e的制备液，制备液冻干得到3e(157mg)；LC-MS：[M+H]+＝1249.6。
第六步：化合物3
于25mL单口瓶中加入3e(100mg,0.08mmol)，溴化锌(360mg,1.6mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物3(64mg)；LC-MS：[M+H]+＝1093.1。
实施例7
化合物4的合成：
Figure BDA0003977943680000531
参照实施例6合成路线，得到化合物4(60mg)；LC-MS：[M+H]+＝1093.2。
实施例8
化合物5A的合成：
Figure BDA0003977943680000532
第一步：化合物5a
于25mL单口瓶中加入M1(500mg，1.4mmol，1.0eq),对甲苯磺酸一水合物(26mg，0.1mmol，0.1eq)及10mL THF，搅拌均匀后，降至0℃，再缓慢加入L-乳酸苄酯(1.2g,7.0mmol,5eq)，加完后升至室温反应。TLC监控，反应结束后，加入饱和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余物经反相柱纯化得5a(400mg)；
LC-MS：[M+NH4]+＝506.2。
1H NMR(400Mz,CDCl3/CD3OD):1.39(3H,d,J＝6.8Hz),3.78(2H,t,J＝4.0Hz),4.17-4.27(2H,m),4.42(2H,d,J＝4.0Hz),4.72-4.85(2H,m),5.11-5.58(2H,m),5.43(1H,s),7.06(1H,t,J＝8.0Hz),7.25-7.33(6H,m),7.38(2H,t,J＝8.0Hz),7.57(2H,d,J＝8.0Hz),7.75(2H,d,J＝8.0Hz).。
第二步：化合物5b
于25mL单口瓶中加入化合物5a(400mg,0.8mmol,1.0eq)和4mL DMF，搅拌均匀后，降至0℃，再缓慢加入DBU(137mg,0.9mmol,1.1eq)，加完后升至室温反应。TLC监控，反应结束，记为反应液①；
另取25mL单口瓶中加入M4(372mg,0.9mmol,1.1eq)，PyBOP(852mg,1.6mmol,2.0eq)和3mL DMF，室温搅拌5分钟，加入反应液①，室温反应，HPLC监测。反应完毕，反应液经高效液相纯化得化合物5b(326mg)；LC-MS：[M+NH4]+＝679.2。
第三步：化合物5c
于100mL单口瓶中加入5b(4.0g,6.05mmol,1.0eq)，DMF(60mL)溶解，再加入5％Pd/C(4g)，室温氢化反应4h(采用HPLC监测反应进程)。过滤Pd/C，滤液未经浓缩，直接置于冰水浴(约0℃)中，待用。
第四步：化合物5d
将粗产品5c置于冰水浴中，加入DIPEA(1.1mL,1.1eq)，再加入化合物M3(3.4g,6.05mmol)，加毕升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到5d(3.15g)；LC-MS：[M-H]-＝816.3。
第五步：化合物5e
于100mL单口瓶中加入5d(2.07g,2.53mmol,1.0eq)，M5(1.35g,2.53mmol,1.0eq)，PyBOP(1.98g,3.79mmol,1.5eq)，HOBt(0.51g,3.79mmol,1.5eq)及DMF(40mL)，冰水浴下加入DIPEA(1.05mL,1.5eq)，升至室温反应2h(采用HPLC监测)。反应液直接经制备纯化，制备液水泵减压水浴35℃浓缩除去乙腈，冻干得到化合物5e(1.92g)，收率61％；LC-MS：[M+H]+＝1235.4。
第六步：化合物5A
于100mL单口瓶中加入化合物5e(1.0g,0.8mmol,1.0eq)，35mL硝基甲烷，溶解后再加入溴化锌(3.64g,16mmol,20.0eq)，油浴40℃(提前预热稳定)反应30min，水泵减压水浴45℃浓缩除去硝基甲烷，得黄色残余物固体(采用HPLC监测)。经酸法制备，得到化合物5A的制备液，制备液经水泵减压水浴35℃浓缩旋除乙腈，冻干得到化合物5A(786mg)收率90％。
LC-MS：[M+H]+＝1079.4；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.39–9.02(m,1H),8.70(t,J＝6.5Hz,1H),8.64(t,J＝5.7Hz,1H),8.56(d,J＝8.8Hz,1H),8.34(t,J＝5.7Hz,1H),8.16(d,J＝8.2Hz,1H),8.01(t,J＝5.5Hz,1H),7.71(d,J＝10.9Hz,1H),7.30(s,1H),7.28–7.15(m,4H),7.14(s,2H),5.53(dd,J＝14.5,6.4Hz,1H),5.49–5.34(m,2H),5.22(d,J＝18.8Hz,1H),5.09(d,J＝18.7Hz,1H),5.03(dd,J＝9.6,3.9Hz,1H),4.73(dd,J＝9.9,6.9Hz,1H),4.59(dd,J＝10.1,6.5Hz,1H),4.49(ddd,J＝13.2,8.6,4.4Hz,1H),4.14(dd,J＝13.3,6.6Hz,2H),3.93(s,2H),3.84(dd,J＝16.5,6.3Hz,1H),3.76(dd,J＝16.9,5.7Hz,2H),3.70(d,J＝5.2Hz,2H),3.60(dd,J＝16.7,5.4Hz,1H),3.52(dd,J＝16.4,5.1Hz,1H),3.45(dd,J＝12.8,10.1Hz,1H),3.25–3.15(m,1H),3.14–3.05(m,1H),3.01(dd,J＝13.7,4.1Hz,1H),2.73(dd,J＝13.5,9.8Hz,1H),2.54–2.47(m,1H),2.33(s,2H),2.17(d,J＝5.5Hz,2H),1.91–1.79(m,2H),1.33(d,J＝6.6Hz,2H),0.87(t,J＝7.3Hz,2H).。
实施例9
化合物5B的合成：
Figure BDA0003977943680000551
第一步：化合物5d-1
于25mL单口瓶中加入化合物5b(300mg,0.45mmol,1.0eq)，DMF(3mL)，搅拌溶清，加入5％Pd/C(300mg)，氢气置换三次，氢化反应2h，HPLC监测反应结束。反应结束后，过滤除去Pd/C，将滤液降温至0-5℃，加入DIPEA(65mg,0.5mmol,1.1eq)，再向滤液加入ent-M3(255mg,0.45mmol)，加毕，升至20±5℃反应1h，HPLC监测反应结束。反应结束后，经HPLC制备纯化，收集产品制备液，冻干得到化合物5d-1(200mg)，收率54％；LC-MS：[M-H]-＝816.3。
第二步：化合物5e-1
于25mL单口瓶中加入化合物5d-1(200mg,0.24mmol,1.0eq)、M5(127mg,0.24mmol，1.0eq)、PyBOP(187mg,0.36mmol,1.2eq)、HOBt(48mg,0.36mmol,1.2eq)及DMF(6mL)，冰水浴降至0-5℃，加入DIPEA(62mg,0.48mmol,2.0eq)，加毕，升至20±5℃反应2h，HPLC监测反应结束。反应液直接HPLC制备纯化，收集产品制备液，冻干得到化合物5e-1(162.8mg)；LC-MS：[M+H]+＝1235.4。
第三步：化合物5B
于25mL单口瓶中依次加入化合物5e-1(110mg,0.089mmol，1.0eq)，ZnBr2(400mg,1.78mmol,20.0eq)和CH3NO2(10mL)，加毕，升至40℃反应0.5h，停止反应，反应液直接45℃减压旋干后得到黄色固体，取样HPLC监测反应。旋干的固体直接HPLC制备纯化，收集产品制备液，冻干得到化合物5B(73.4mg)，收率76.5％；LC-MS：[M+H]+＝1079.4。
实施例10
化合物6A的制备：
Figure BDA0003977943680000552
参照实施例8合成路线，得到化合物6A(71mg)；LC-MS:[M+H]+＝1079.4。
实施例11
化合物6B的制备：
Figure BDA0003977943680000561
参照实施例9合成路线，得到化合物6B(59mg)；LC-MS：[M+H]+＝1079.4。
实施例12
化合物7A和7B的制备：
Figure BDA0003977943680000562
第一步：化合物7a
于250mL单口瓶中加入M1(10g,27.1mmol),3,3,3-三氟乳酸苄酯(参照专利WO2020063673A1公布的方法制备)(12.7g,54.3mmol)，醋酸锌(9.96g,54.3mmol)及100mL甲苯，加热至100℃反应4h。反应完毕，降至室温，过滤除去不溶物，滤液浓缩得粗品。粗品经硅胶柱层析纯化(PE:EA＝10:1-5:1-2:1)得到目标物5.15g，收率35.1％；LC-MS：[M+H]+＝543.17。
第二步：化合物7b
于50mL单口瓶中加入7a(5g,9.2mmol)及15mL DMF，溶清后，冰水浴下，加入DBU(1.68g,11mmol)，反应1h，记为反应液①；
另取50mL单口瓶，加入M4(3.8g,9.2mmol)，PyBOP(5.75g,11mmol)，HOBt(1.49g,11mmol)及10mL DMF，溶清后，冰水浴下，加入DIPEA(1.82mL,11mmol)，继续反应30min，加入反应液①，升至室温反应2h。HPLC监测反应进程，反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得制备液。制备液经二氯甲烷萃取、饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩得到固体4.1g，收率62.3％；LC-MS：[M+H]+＝716.25。
第三步：化合物7d
于25mL单口瓶中加入7b(900mg,1.26mmol)，15mL DMF溶清后，加入900mg 5％Pd/C，氢化反应2h，反应完毕，过滤，将滤液置于冰水浴中，加入DIPEA(228uL,1.38mmol)，再加入M3(712mg,1.26mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到产品525mg，收率47.9％；LC-MS：[M-H]-＝870.33。
第四步：化合物7e
于50mL单口瓶中加入7d(500mg,0.57mmol)，M5(305mg,0.57mmol)，PyBOP(448mg,0.86mmol)，HOBt(116mg,0.86mmol)及15mL DMF,冰水浴下加入DIPEA(378uL,2.29mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物7e-1和化合物7e-2的制备液，制备液分别冻干得到150mg化合物7e-1，LC-MS：[M+H]+＝1289.46；220mg化合物7e-2，LC-MS：[M+H]+＝1289.46。
第五步：化合物7A
Figure BDA0003977943680000571
于25mL单口瓶中加入7e-1(100mg,0.077mmol)，溴化锌(349mg,1.55mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体52mg；TOF结果：1133.3613。
第六步：化合物7B
Figure BDA0003977943680000572
于25mL单口瓶中加入7e-2(100mg,0.077mmol)，溴化锌(349mg,1.55mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体63mg；TOF结果：1133.3668。
实施例13
化合物8A和8B的合成：
Figure BDA0003977943680000581
第一步：化合物8d
于25mL单口瓶中加入7c(900mg,1.83mmol)，20mL DMF溶清后，加入DIPEA(303uL,1.83mmol)，再加入ent-M3(1034mg,1.83mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到产品613mg，收率38.5％；LC-MS：[M-H]-＝870.32。
第二步：化合物8e-1和化合物8e-2
于50mL单口瓶中加入8d(500mg,0.57mmol)，M5(305mg,0.57mmol)，PyBOP(448mg,0.86mmol)，HOBt(116mg,0.86mmol)及15mL DMF,冰水浴下加入DIPEA(378uL,2.29mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物8e-1和化合物8e-2的制备液，制备液分别冻干得到140mg化合物8e-1，210mg化合物8e-2。化合物8e-1的LC-MS：[M+H]+＝1289.47；化合物8e-2的LC-MS：[M+H]+＝1289.47。
第三步：化合物8A
Figure BDA0003977943680000582
于25mL单口瓶中加入化合物8e-1(100mg,0.077mmol)，溴化锌(349mg,1.55mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体50mg；TOF结果：1133.3623。
第四步：化合物8B
Figure BDA0003977943680000583
于25mL单口瓶中加入化合物8e-2(100mg,0.077mmol)，溴化锌(349mg,1.55mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体58mg；TOF结果：1133.3653。
实施例14
化合物9A的合成：
Figure BDA0003977943680000591
第一步：化合物9a
于250mL单口瓶中，加入M1(6g,16.3mmol)，100mL THF，对甲苯磺酸一水合物(0.31g,1.63mmol)，搅拌冷却至0℃，滴加2-羟基-2-环丙基乙酸苄酯(参照专利US20050020645 A1公布的方法制备)(6.3g,32.6mmol)，滴毕自然升温至室温反应(反应约2-4h)，TLC监控。反应结束，加入饱和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余物经硅胶柱纯化(PE:EA＝10:1-5:1-2:1)得9a(3.7g)，收率45％；LC-MS：[M+H]+＝501.5。
第二步：化合物9b
于25mL单口瓶，加入9a(2g,4.0mmol)，10mL DMF，0℃搅拌，加入DBU(760mg,5.0mmol)，反应1h，TLC监测Fmoc脱保护完成后，待用；
另取25mL单口瓶中加入M4(1.65g,4.0mmol)，PyBOP(2.59g,5.0mmol)，HOBt(675mg,5.0mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(823uL,5.04mmol)，继续搅拌30min，将上述反应液加至反应瓶中，升至室温反应。HPLC监测反应结束后，反应液经制备液相纯化，得到产品制备液，制备液经二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到固体1.5g，收率56％；LC-MS：[M+H]+＝674.7。
第三步：化合物9c
于25mL单口瓶中加入9b(900mg,1.3mmol)，10mL DMF溶清后，加入900mg 5％Pd/C，氢化反应1.5h，反应完毕，过滤，得滤液，未经纯化直接用于下一步反应。
第四步：化合物9d
将粗产品9c置于冰水浴中，加入DIPEA(223uL,1.3mmol)，再加入化合物M3(750mg,1.3mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到9d(529mg)；LC-MS：[M-H]-＝828.4。
第五步：化合物9e
于50mL单口瓶中加入9d(500mg,0.6mmol)，M5(300mg,0.6mmol)，PyBOP(416mg,0.8mmol)，HOBt(108mg,0.5mmol)及15mL DMF,冰水浴下加入DIPEA(351uL,2.13mmol)，升至室温反应3h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物9e的制备液，制备液冻干得到9e(257mg)；LC-MS：[M+H]+＝1247.5。
第六步：化合物9A
于25mL单口瓶中加入9e(100mg,0.08mmol)，溴化锌(360mg,1.6mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物9A(55mg)；LC-MS：[M+H]+＝1091.3。
实施例15
化合物9B的合成：
Figure BDA0003977943680000601
参照实施例14合成路线，得到化合物9B(44mg)；LC-MS：[M+H]+＝1091.3。
实施例16
化合物10A的合成：
Figure BDA0003977943680000602
第一步：化合物10a
于250mL单口瓶中，加入M1(6g,16.3mmol)，100mL THF，对甲苯磺酸一水合物(0.31g,1.63mmol)，搅拌冷却至0℃，滴加3-羟基-2-环丙基丙酸苄酯(参照专利WO2013187496A1公布的方法制备)(6.7g,32.6mmol)，滴毕自然升温至室温反应(反应约2-4h)，TLC监控。反应结束，加入饱和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余物经硅胶柱纯化(PE:EA＝10:1-5:1-2:1)得10a(4.9g)，收率58％；LC-MS：[M+H]+＝515.4。
第二步：化合物10b
于25mL单口瓶，加入10a(4g,7.8mmol)，10mL DMF，0℃搅拌，加入DBU(1.2g,8.0mmol)，反应1h，TLC监测Fmoc脱保护完成后，待用；
另取25mL单口瓶中加入M4(3.3g,8.0mmol)，PyBOP(5.2g,10.0mmol)，HOBt(1.35g,10.0mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(1.65mL,10.1mmol)，继续搅拌50min，将上述反应液加至反应瓶中，升至室温反应。HPLC监测反应结束后，反应液经制备液相纯化，得到产品制备液，制备液经二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到固体2.3g，收率42％；LC-MS：[M+H]+＝688.8。
第三步：化合物10c
于25mL单口瓶中加入10b(1.0g,1.45mmol)，15mL DMF溶清后，加入1.0g 5％Pd/C，氢化反应1.5h，反应完毕，过滤，得滤液，未经纯化直接用于下一步反应。
第四步：化合物10d
将粗产品10c置于冰水浴中，加入DIPEA(258uL,1.5mmol)，再加入化合物M3(837mg,1.45mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到10d(499mg)；LC-MS：[M-H]-＝842.4。
第五步：化合物10e
于50mL单口瓶中加入10d(400mg,0.48mmol)，M5(240mg,0.48mmol)，PyBOP(250mg,0.48mmol)，HOBt(104mg,0.48mmol)及15mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(330uL,2.0mmol)，升至室温反应3h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物10e的制备液，制备液冻干得到10e(188mg)；LC-MS：[M+H]+＝1261.5。
第六步：化合物10A
于25mL单口瓶中加入10e(100mg,0.08mmol)，溴化锌(360mg,1.6mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物10A(61mg)；LC-MS：[M+H]+＝1105.4。
实施例17
化合物10B的合成：
Figure BDA0003977943680000611
参照实施例16合成路线，得到化合物10B(75mg)；LC-MS：[M+H]+＝1105.4。
实施例18
化合物11A的合成：
Figure BDA0003977943680000621
第一步：化合物11a
于250mL单口瓶中，加入M1(6g,16.3mmol)，100mL THF，对甲苯磺酸一水合物(0.31g,1.63mmol)，搅拌冷却至0℃，滴加2-羟基-2-环丁基乙酸苄酯(参照文献Journal ofMedicinal Chemistry,2013,56(13),5541-5552.公布的方法合成)(6.7g,32.6mmol)，滴毕自然升温至室温反应(反应约2-4h)，TLC监控。反应结束，加入饱和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余物经硅胶柱纯化(PE:EA＝10:1-5:1-2:1)得11a(5.1g)，收率62％；LC-MS：[M+H]+＝515.7。
第二步：化合物11b
于25mL单口瓶，加入11a(4g,7.8mmol)，10mL DMF，0℃搅拌，加入DBU(1.2g,8.0mmol)，反应1h，TLC监测Fmoc脱保护完成后，待用；
另取25mL单口瓶中加入M4(3.3g,8.0mmol)，PyBOP(5.2g,10.0mmol)，HOBt(1.35g,10.0mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(1.63mL,10.0mmol)，继续搅拌40min，将上述反应液加至反应瓶中，升至室温反应。HPLC监测反应结束后，反应液经制备液相纯化，得到产品制备液，制备液经二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到固体2.3g，收率42％；LC-MS：[M+H]+＝688.3。
第三步：化合物11c
于25mL单口瓶中加入11b(2.0g,2.9mmol)，25mL DMF溶清后，加入2.0g 5％Pd/C，氢化反应3h，反应完毕，过滤，得滤液，未经纯化直接用于下一步反应。
第四步：化合物11d
将粗产品11c置于冰水浴中，加入DIPEA(516uL,3.0mmol)，再加入化合物M3(1.7g,2.9mmol)，加毕升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得到制备液，制备液冻干得到11d(934mg)；LC-MS：[M-H]-＝842.4。
第五步：化合物11e
于50mL单口瓶中加入11d(800mg,0.96mmol)，M5(480mg,0.96mmol)，PyBOP(500mg,0.96mmol)，HOBt(208mg,0.96mmol)及30mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(660uL,4.0mmol)，升至室温反应4h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物11e的制备液，制备液冻干得到11e(401mg)；LC-MS：[M+H]+＝1261.4。
第六步：化合物11A
于25mL单口瓶中加入11e(150mg,0.12mmol)，溴化锌(532mg,2.4mmol)及10mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物11A(86mg)；LC-MS：[M+H]+＝1105.4。
实施例19
化合物11B的合成
Figure BDA0003977943680000631
参照实施例18合成路线，得到化合物11B(50mg)。LC-MS：[M+H]+1105.4。
实施例20
化合物12A的合成：
Figure BDA0003977943680000632
第一步：化合物12a
于250mL单口瓶中，加入M1(6g,16.3mmol)，100mL THF，对甲苯磺酸一水合物(0.31g,1.63mmol)，搅拌冷却至0℃，滴加3-羟基-2-环丁基丙酸苄酯(参照专利WO2009011285A1公布的方法制备)(7.2g,32.6mmol)，滴毕自然升温至室温反应(反应约2-4h)，TLC监控。反应结束，加入饱和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余物经硅胶柱纯化(PE:EA＝10:1-5:1-2:1)得12a(4.5g)，收率52％；LC-MS：[M+H]+＝529.4。
第二步：化合物12b
于25mL单口瓶，加入12a(4g,7.6mmol)，10mL DMF，0℃搅拌，加入DBU(1.2g,8.0mmol)，反应1h，TLC监测Fmoc脱保护完成后，待用；
另取25mL单口瓶中加入M4(3.2g,7.6mmol)，PyBOP(4.7g,9.0mmol)，HOBt(1.22g,9.0mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(1.49mL,0.9mmol)，继续搅拌30min，将上述反应液加至反应瓶中，升至室温反应。HPLC监测反应结束后，反应液经制备液相纯化，得到产品制备液，制备液经二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到固体2.0g，收率37％；LC-MS：[M+H]+＝702.8。
第三步：化合物12c
于25mL单口瓶中加入12b(1.0g,1.43mmol)，15mL DMF溶清后，加入1.0g 5％Pd/C，氢化反应1.5h，反应完毕，过滤，得滤液，未经纯化直接用于下一步反应。
第四步：化合物12d
将粗产品12c置于冰水浴中，加入DIPEA(258uL,1.5mmol)，再加入化合物M3(825mg,1.43mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到12d(522mg)；LC-MS：[M-H]-＝856.4。
第五步：化合物12e
于50mL单口瓶中加入12d(400mg,0.47mmol)，M5(240mg,0.47mmol)，PyBOP(250mg,0.47mmol)，HOBt(101mg,0.47mmol)及15mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(330uL,2.0mmol)，升至室温反应3h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物12e的制备液，制备液冻干得到12e(198mg)；LC-MS：[M+H]+＝1275.4。
第六步：化合物12A
于25mL单口瓶中加入12e(100mg,0.08mmol)，溴化锌(360mg,1.6mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物12A(55mg)；LC-MS：[M+H]+＝1119.4。
实施例21
化合物12B的合成：
Figure BDA0003977943680000641
参照实施例20合成路线，得到化合物12B(50mg)；LC-MS：[M+H]+＝1119.4。
实施例22
化合物13A的合成：
Figure BDA0003977943680000651
第一步：化合物13a
于250mL单口瓶中，加入M1(6g,16.3mmol)，100mL THF，对甲苯磺酸一水合物(0.31g,1.63mmol)，搅拌冷却至0℃，滴加2-羟基-2-环戊基乙酸苄酯(参照文献Journal ofMedicinal Chemistry,2013,56(13),5541-5552.公布的方法合成)(7.2g,32.6mmol)，滴毕自然升温至室温反应(反应约2-4h)，TLC监控。反应结束，加入饱和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余物经硅胶柱纯化(PE:EA＝10:1-5:1-2:1)得13a(4.6g)，收率53％；LC-MS：[M+H]+＝529.5。
第二步：化合物13b
于25mL单口瓶，加入13a(4g,7.6mmol)，10mL DMF，0℃搅拌，加入DBU(1.17g,7.8mmol)，反应1h，TLC监测Fmoc脱保护完成后，待用；
另取25mL单口瓶中加入M4(3.14g,7.6mmol)，PyBOP(4.42g,8.5mmol)，HOBt(1.15g,8.5mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(1.39mL,0.85mmol)，继续搅拌30min，将上述反应液加至反应瓶中，升至室温反应。HPLC监测反应结束后，反应液经制备液相纯化，得到产品制备液，制备液经二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到固体2.1g，收率39％；LC-MS：[M+H]+＝702.8。
第三步：化合物13c
于25mL单口瓶中加入13b(1.5g,1.87mmol)，25mL DMF溶清后，加入1.5g 5％Pd/C，氢化反应3h，反应完毕，过滤，得滤液，未经纯化直接用于下一步反应。
第四步：化合物13d
将粗产品13c置于冰水浴中，加入DIPEA(333uL,1.93mmol)，再加入化合物M3(1.1g,1.87mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得到制备液，制备液冻干得到13d(519mg)；LC-MS：[M-H]-＝856.6。
第五步：化合物13e
于50mL单口瓶中加入13d(400mg,0.47mmol)，M5(240mg,0.48mmol)，PyBOP(250mg,0.48mmol)，HOBt(103mg,48mmol)及15mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(330uL,2.0mmol)，升至室温反应4h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物13e的制备液，制备液冻干得到13e(187mg)；LC-MS：[M+H]+＝1275.5。
第六步：化合物13A
于25mL单口瓶中加入13e(100mg,0.08mmol)，溴化锌(355mg,0.16mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物13A(60mg)；LC-MS：[M+H]+＝1119.6。
实施例23
化合物13B的合成：
Figure BDA0003977943680000661
参照实施例22合成路线，得到化合物13B(51mg)；LC-MS：[M+H]+＝1119.6。
实施例24
化合物14A的合成：
Figure BDA0003977943680000662
第一步：化合物14a
于250mL单口瓶中，加入M1(6g,16.3mmol)，100mL THF，对甲苯磺酸一水合物(0.31g,1.63mmol)，搅拌冷却至0℃，滴加3-羟基-2-环戊基丙酸苄酯(参照专利WO2009011285A1公布的方法合成)(7.6g,32.6mmol)，滴毕自然升温至室温反应(反应约2-4h)，TLC监控。反应结束，加入饱和NaHCO3溶液，用乙酸乙酯萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残余物经硅胶柱纯化(PE:EA＝10:1-5:1-2:1)得14a(4.4g)，收率49％；LC-MS：[M+H]+＝543.6。
第二步：化合物14b
于25mL单口瓶，加入14a(4g,7.4mmol)，10mL DMF，0℃搅拌，加入DBU(1.2g,8.0mmol)，反应1h，TLC监测Fmoc脱保护完成后，待用；
另取25mL单口瓶中加入M4(3.1g,7.4mmol)，PyBOP(4.6g,8.8mmol)，HOBt(1.19g,8.8mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(1.49mL,9.0mmol)，继续搅拌30min，将上述反应液加至反应瓶中，升至室温反应。HPLC监测反应结束后，反应液经制备液相纯化，得到产品制备液，制备液经二氯甲烷萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，得到固体2.6g，收率49％；LC-MS：[M+H]+＝716.4。
第三步：化合物14c
于25mL单口瓶中加入14b(1.0g,1.4mmol)，15mL DMF溶清后，加入1.0g 5％Pd/C，氢化反应1.5h，反应完毕，过滤，得滤液，未经纯化直接用于下一步反应。
第四步：化合物14d
将粗产品14c置于冰水浴中，加入DIPEA(248uL,1.5mmol)，再加入化合物M3(808mg,1.4mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到14d(500mg)；LC-MS：[M-H]-＝870.5。
第五步：化合物14e
于50mL单口瓶中加入14d(400mg,0.46mmol)，M5(235mg,0.46mmol)，PyBOP(245mg,0.46mmol)，HOBt(99mg,0.46mmol)及15mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(331uL,2.0mmol)，升至室温反应3h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物14e的制备液，制备液冻干得到14e(146mg)；LC-MS：[M+H]+＝1289.5。
第六步：化合物14A
于25mL单口瓶中加入14e(100mg,0.08mmol)，溴化锌(360mg,1.6mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物14A(52mg)；LC-MS：[M+H]+＝1133.4。
实施例25
化合物14B的合成：
Figure BDA0003977943680000671
参照实施例24合成路线，得到化合物14B(48mg)；LC-MS：[M+H]+＝1133.4。
实施例26
化合物15A和15B的合成：
Figure BDA0003977943680000681
第一步：化合物15a
于250mL单口瓶中加入M1(10g,27.1mmol),2-羟基-丁酸苄酯(参照文献ChemicalCommunications,2019,55(53),7699-7702.公布的方法制备)(10.5g,54.3mmol)，醋酸锌(9.96g,54.3mmol)及100mL甲苯，加热至100℃反应4h。反应完毕，降至室温，过滤除去不溶物，滤液浓缩得粗品。粗品经硅胶柱层析纯化(PE:EA＝10:1-5:1-2:1)得到目标物5.67g，收率42％；LC-MS：[M+H]+＝503.5。
第二步：化合物15b
于50mL单口瓶中加入15a(5g,9.95mmol)及15mL DMF，溶清后，冰水浴下，加入DBU(1.68g,11mmol),反应1h，记为反应液①；
另取50mL单口瓶，加入M4(4.1g,10.0mmol)，PyBOP(5.75g,11mmol)，HOBt(1.49g,11mmol)及10mL DMF，溶清后，冰水浴下，加入DIPEA(1.82mL,11mmol)，继续反应40min，加入反应液①，升至室温反应2h。HPLC监测反应进程，反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得制备液。制备液经二氯甲烷萃取、饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩得到固体4.6g，收率68％；LC-MS：[M+H]+＝676.7。
第三步：化合物15d
于25mL单口瓶中加入15b(2.0g,2.96mmol)，15mL DMF溶清后，加入2.0g 5％Pd/C，氢化反应2h，反应完毕，过滤，将滤液置于冰水浴中，加入DIPEA(496uL,3.0mmol)，再加入M3(1.7g,2.96mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到产品1120.0mg，收率45％；LC-MS：[M-H]-＝830.3。
第四步：化合物15e
于50mL单口瓶中加入15d(500mg,0.60mmol)，M5(321mg,0.60mmol)，PyBOP(469mg,0.90mmol)，HOBt(121mg,0.90mmol)及15mL DMF,冰水浴下加入DIPEA(446uL,2.7mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物15e-1和化合物15e-2的制备液，制备液分别冻干得到138mg化合物15e-1，LC-MS：[M+H]+＝1249.5；140mg化合物15e-2，LC-MS：[M+H]+＝1249.5。
第五步：化合物15A
Figure BDA0003977943680000691
于25mL单口瓶中加入15e-1(100mg,0.08mmol)，溴化锌(360mg,1.6mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体59mg；LC-MS：[M+H]+＝1093.4。
第六步：化合物15B
Figure BDA0003977943680000692
于25mL单口瓶中加入15e-2(100mg,0.08mmol)，溴化锌(360mg,1.6mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体60mg；LC-MS：[M+H]+＝1093.4。
实施例27
化合物16A和16B的合成：
Figure BDA0003977943680000693
参照实施例26合成路线，得到化合物16A(55mg)；LC-MS：[M+H]+＝1093.4。
Figure BDA0003977943680000694
参照实施例26合成路线，得到化合物16B(54mg)；LC-MS：[M+H]+＝1093.4。
实施例28
化合物17A和17B的合成：
Figure BDA0003977943680000701
第一步：化合物17a
于250mL单口瓶中加入M1(10g,27.1mmol),2-羟基-苯丙酸苄酯(参考文献NatureCommunications,2020.11(1),56.公布的方法合成)(14.7g,54.3mmol)，醋酸锌(9.96g,54.3mmol)及100mL甲苯，加热至100℃反应4h。反应完毕，降至室温，过滤除去不溶物，滤液浓缩得粗品。粗品经硅胶柱层析纯化(PE:EA＝10:1-5:1-2:1)得到目标物6.13g，收率40％；LC-MS：[M+H]+＝565.6。
第二步：化合物17b
于50mL单口瓶中加入17a(5g,8.86mmol)及15mL DMF，溶清后，冰水浴下，加入DBU(1.53g,10mmol)，反应1h，记为反应液①；
另取50mL单口瓶，加入M4(3.6g,8.86mmol)，PyBOP(5.23g,10mmol)，HOBt(1.36g,10mmol)及10mL DMF，溶清后，冰水浴下，加入DIPEA(1.65mL,10mmol)，继续反应30min，加入反应液①，升至室温反应2h。HPLC监测反应进程，反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得制备液。制备液经二氯甲烷萃取、饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩得到固体5.0g，收率77％；LC-MS：[M+H]+＝738.3。
第三步：化合物17d
于25mL单口瓶中加入17b(3.0g,4.07mmol)，15mL DMF溶清后，加入3.0g 5％Pd/C，氢化反应2h，反应完毕，过滤，将滤液置于冰水浴中，加入DIPEA(744uL,4.5mmol)，再加入M3(2.34g,4.07mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到产品1.2g，收率33％；LC-MS：[M-H]-＝892.4。
第四步：化合物17e
于50mL单口瓶中加入17d(500mg,0.56mmol)，M5(300mg,0.56mmol)，PyBOP(438mg,0.84mmol)，HOBt(113mg,0.84mmol)及15mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(330uL,2.0mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物17e-1和化合物17e-2的制备液，制备液分别冻干得到156mg化合物17e-1，LC-MS：[M+H]+＝1311.4；150mg化合物17e-2，LC-MS：[M+H]+＝1311.7。
第五步：化合物17A
Figure BDA0003977943680000711
于25mL单口瓶中加入17e-1(100mg,0.08mmol)，溴化锌(360mg,1.6mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体43mg；LC-MS：[M+H]+＝1155.4。
第六步：化合物17B
Figure BDA0003977943680000712
于25mL单口瓶中加入17e-2(100mg,0.08mmol)，溴化锌(360mg,1.6mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体40mg；LC-MS：[M+H]+＝1155.4。
实施例29
化合物18A和18B的合成：
Figure BDA0003977943680000713
参照实施例28合成路线，得到化合物18A(54mg)；LC-MS：[M+H]+＝1155.4。
Figure BDA0003977943680000714
参照实施例28合成路线，得到化合物18B(55mg)；LC-MS：[M+H]+＝1155.4。
实施例30
化合物19A和19B的合成：
Figure BDA0003977943680000721
第一步：化合物19a
于250mL单口瓶中加入M1(10g,27.1mmol),2-环丙基-2-羟基乙酸苄酯(参照专利WO2020244657A1公布的方法制备)(11.2g,54.3mmol)，醋酸锌(9.96g,54.3mmol)及100mL甲苯，加热至100℃反应4h。反应完毕，降至室温，过滤除去不溶物，滤液浓缩得粗品。粗品经硅胶柱层析纯化(PE:EA＝10:1-5:1-2:1)得到目标物4.97g，收率36％；LC-MS：[M+H]+＝515.2。
第二步：化合物19b
于50mL单口瓶中加入19a(4g,7.8mmol)及10mL DMF，溶清后，冰水浴下，加入DBU(1.42g,9.3mmol),反应1h，记为反应液①；
另取50mL单口瓶，加入M4(3.2g,7.8mmol)，PyBOP(4.5g,8.6mmol)，HOBt(1.16g,8.6mmol)及10mL DMF，溶清后，冰水浴下，加入DIPEA(1.65mL,10mmol)，继续反应30min，加入反应液①，升至室温反应2h。HPLC监测反应进程，反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得制备液。制备液经二氯甲烷萃取、饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩得到固体4.2g，收率78％；LC-MS：[M+H]+＝688.3。
第三步：化合物19d
于25mL单口瓶中加入19b(1000mg,1.45mmol)，15mL DMF溶清后，加入1000mg 5％Pd/C，氢化反应2h，反应完毕，过滤，将滤液置于冰水浴中，加入DIPEA(248uL,1.5mmol)，再加入M3(720mg,1.45mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到产品503mg，收率41％；LC-MS：[M-H]-＝842.3。
第四步：化合物19e-1和19e-2
于50mL单口瓶中加入19d(500mg,0.59mmol)，M5(317mg,0.59mmol)，PyBOP(339mg,0.65mmol)，HOBt(88mg,0.86mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(292uL,1.77mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物19e-1和化合物19e-2的制备液，制备液分别冻干得到112mg化合物19e-1，LC-MS：[M+H]+＝1261.5；131mg化合物19e-2，LC-MS：[M+H]+＝1261.5。
第五步：化合物19A
Figure BDA0003977943680000731
于25mL单口瓶中加入19e-1(100mg,0.079mmol)，溴化锌(357mg,1.59mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体55mg；LC-MS：[M+H]+＝1105.4。
第六步：化合物19B
Figure BDA0003977943680000732
于25mL单口瓶中加入19e-2(100mg,0.079mmol)，溴化锌(357mg,1.59mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体58mg；LC-MS：[M+H]+＝1105.4。
实施例31
化合物20A和20B的合成：
Figure BDA0003977943680000733
第一步：化合物20a
于250mL单口瓶中加入M1(10g,27.1mmol),2-羟基-环丙基丙酸苄酯(参照专利WO2020063676A公布的方法合成)(12.0g,54.3mmol)，醋酸锌(9.96g,54.3mmol)及100mL甲苯，加热至100℃反应4h。反应完毕，降至室温，过滤除去不溶物，滤液浓缩得粗品。粗品经硅胶柱层析纯化(PE:EA＝10:1-5:1-2:1)得到目标物5.09g；LC-MS：[M+H]+＝529.2。
第二步：化合物20b
于50mL单口瓶中加入20a(4g,7.6mmol)及10mL DMF，溶清后，冰水浴下，加入DBU(1.39g,9.1mmol)，反应1h，记为反应液①；
另取50mL单口瓶，加入M4(3.12g,7.6mmol)，PyBOP(4.5g,8.6mmol)，HOBt(1.16g,8.6mmol)及10mL DMF，溶清后，冰水浴下，加入DIPEA(1.65mL,10mmol)，继续反应30min，加入反应液①，升至室温反应2h。HPLC监测反应进程，反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得制备液。制备液经二氯甲烷萃取、饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩得到固体4.5g，收率84％；LC-MS：[M+H]+＝702.3。
第三步：化合物20d
于25mL单口瓶中加入20b(1000mg,1.42mmol)，15mL DMF溶清后，加入1000mg 5％Pd/C，氢化反应2h，反应完毕，过滤，将滤液置于冰水浴中，加入DIPEA(248uL,1.5mmol)，再加入M5(708mg,1.42mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到产品443mg，收率36％；LC-MS：[M-H]-＝856.4。
第四步：化合物20e-1和20e-2
于50mL单口瓶中加入20d(400mg,0.47mmol)，依喜替康甲磺酸盐(250mg,0.47mmol)，PyBOP(223mg,0.56mmol)，HOBt(83mg,0.56mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(248uL,1.5mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物20e-1和化合物20e-2的制备液，制备液分别冻干得到103mg化合物20e-1，LC-MS：[M+H]+＝1275.5；103mg化合物20e-2，LC-MS：[M+H]+＝1275.5。
第五步：化合物20A
Figure BDA0003977943680000741
于25mL单口瓶中加入8A(100mg,0.078mmol)，溴化锌(352mg,1.57mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体51mg；LC-MS：[M+H]+＝1119.4。
第六步：化合物20B
Figure BDA0003977943680000742
于25mL单口瓶中加入20e-2(100mg,0.079mmol)，溴化锌(357mg,1.59mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体47mg；LC-MS：[M+H]+＝1119.4。
实施例32
化合物21的合成：
Figure BDA0003977943680000751
第一步：化合物SM3-1
于2000mL单口瓶中加入77087-60-6(100g,458mmol),马来酸(53.4g,460mmol)，TEA(64mL,460mmol)及1000mL甲苯，加热至100℃反应5h。反应完毕，降至室温，过滤除去不溶物，滤液浓缩得粗品。粗品经硅胶柱层析纯化(PE:EA＝100:1-50:1-20:1)得到目标物75.6g；LC-MS：[M+H]+＝299.1。
第二步：化合物(R)-2-羟基-1,5-戊二酸叔丁酯
于2000mL单口瓶中加入172793-31-6(100g,338mmol)及1000mL水,依次加入亚硝酸钠(35g,507mmol)，浓硫酸(32mL,35mmol)，缓慢升温至室温反应24h。反应完毕，乙酸乙酯500mL萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经硅胶柱层析纯化(PE:EA＝50:1-30:1-2:1)得到目标物91.2g；LC-MS：[M+H]+＝261.4。
第三步：化合物SM3
于2000mL单口瓶中加入(R)-2-羟基-1,5-戊二酸叔丁酯(50g,192mmol)及1000mL无水四氢呋喃，冰水浴降温至0℃，依次加入PPh3(87.7g,288mmol)，DEAD(50.2g,288mmol)及SM3-1(57.3,192mmol)，缓慢升温至室温反应13h。反应完毕，过滤除去不溶物，滤液浓缩得粗品。粗品经硅胶柱层析纯化(PE:EA＝50:1-30:1-1:1)得到产品68.6g；
将上述产品溶于500mL甲醇中，冰水浴冷却至0℃，于该温度下滴加NaOH(64mL,190mmol,3M/L)，维持该温度下反应12h后，加入HCl(6M/L)调节pH为3，二氯甲烷500mL萃取五次，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，所得粗产品经柱层析(DCM/MeOH＝50/1-20/1-2/1)纯化，得到SM3 50.4g；LC-MS：[M-H]-＝525.5。
第四步：化合物M6
于2000mL单口瓶，加入化合物SM3(50g，95mmol,1.0eq)，五氟苯酚(19.2g,104.5mmol,1.1eq)、DCC(21.5g,104.5mmol,1.1eq)及THF(600mL)，室温反应1h(采用TLC监测)，过滤滤去不溶物。反应液直接经制备纯化，制备液水泵减压水浴35℃浓缩除去乙腈，冻干得到化合物M6(51.9g)，收率79％；LC-MS：[M+H]+＝693.3。
第五步：化合物21a
于25mL单口瓶中加入1c(1g,2.36mmol)，25mL DMF溶清后，加入DIPEA(430uL,2.6mmol)，再加入M6(1177mg,2.36mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到产品555mg；LC-MS：[M-H]-＝931.0。
第六步：化合物21b
于100mL单口瓶中加入21a(500mg,0.54mmol)，依喜替康甲磺酸盐M5(285mg,0.54mmol)，PyBOP(239mg,0.6mmol)，HOBt(239mg,0.6mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(248uL,1.5mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物21b的制备液，制备液冻干得到化合物231mg；LC-MS：[M+H]+＝1349.5。
第七步：化合物21
于25mL单口瓶中加入化合物21b(200mg,0.1488mmol)，溴化锌(665mg,2.96mmol)及10mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体103mg；LC-MS：[M+H]+＝1137.5。
实施例33
化合物22的合成：
Figure BDA0003977943680000761
以化合物M6及3c为起始原料，参照实施例32的合成路线，得到化合物22(91mg)；LC-MS：[M+H]+＝1165.5。
实施例34
化合物23及24的合成：
Figure BDA0003977943680000762
以化合物M6及5c为起始原料，参照实施例32的合成路线，得到102mg化合物23，LC-MS：[M+H]+＝1151.4；得到99mg化合物24，LC-MS：
[M+H]+＝1151.4。
实施例35
化合物25和26的合成：
Figure BDA0003977943680000771
以化合物M6及7c为起始原料，参照实施例32的合成路线，得到83mg化合物25，LC-MS：[M+H]+＝1205.7；得到80mg化合物26，LC-MS：
[M+H]+＝1205.7。
实施例36
化合物27和28的合成：
Figure BDA0003977943680000772
以化合物M6及19c为起始原料，参照实施例32的合成路线，得到100mg化合物27，LC-MS：[M+H]+＝1177.5；得到101mg化合物28，LC-MS：
[M+H]+＝1177.5。
实施例37
化合物29的合成：
Figure BDA0003977943680000773
第一步：化合物SM4-1
于5000mL单口瓶，加入马来酸(50g,431mmol,1.0eq)，114559-25-0(110g,431mmol,1eq)、TEA(263g,2.16mol,5eq)及甲苯(2000mL)，加热至回流反应5h(采用TLC监测)，过滤滤去不溶物。反应液直接减压旋转蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱层析(PE/EA＝50/1-20/1-1/1)得到SM4-1(64.7g)，收率50％；LC-MS：[M+H]+＝299.2。
第二步：化合物SM4-2
于2000mL单口瓶中加入SM4-1(64g,215mmol)，1000mL DMF溶清后，加入DIPEA(71mL,430mmol)，再加入壬乙二醇单甲醚甲磺酸酯(111.5g,220mmol)，加毕升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕，反应液经硅胶柱层析(PE/EA＝50/1-20/1-1/1)纯化，得到产品59.9g；LC-MS：[M+H]+＝709.4。
第三步：化合物SM4
于2000mL单口瓶中加入SM4-2(59g,83mmol)，1000mL MeOH溶清后，加入K2CO3(11.75g,85mmol)，加毕于室温反应4h。HPLC监测反应完毕，过滤除去不溶物，反应液直接经制备纯化，制备液水泵减压水浴35℃浓缩除去乙腈，冻干得到化合物SM4(27g)；LC-MS：[M-H]—＝693.5。
第四步：化合物M7
于500mL单口瓶，加入化合物SM4(25g,36mmol,1.0eq)、五氟苯酚(7.3g,40mmol,1.1eq)、DCC(8.2g,40mmol,1.1eq)及THF(200mL)，室温反应1h(采用TLC监测)，过滤滤去不溶物。反应液直接经制备纯化，制备液水泵减压水浴35℃浓缩除去乙腈，冻干得到化合物M7(23.3g)，收率93％；LC-MS：[M+H]+＝695.8。
第五步：化合物29a
于25mL单口瓶中加入1c(1g,2.36mmol)，25mL DMF溶清后，加入DIPEA(430uL,2.6mmol)，再加入M7(1640mg,2.36mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到产品609mg；LC-MS：[M-H]-＝1098.5。
第六步：化合物29b
于100mL单口瓶中加入29a(500mg,0.45mmol)，依喜替康甲磺酸盐M5(240mg,0.45mmol)，PyBOP(215mg,0.54mmol)，HOBt(215mg,0.54mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(248uL,1.5mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物29b的制备液，制备液冻干得到化合物187mg；LC-MS：[M+H]+＝1517.6。
第七步：化合物29
于25mL单口瓶中加入化合物29b(150mg,0.988mmol)，溴化锌(223mg,0.988mmol)及10mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体114mg；LC-MS：[M+H]+＝1517.9。
实施例38
化合物30的合成：
Figure BDA0003977943680000781
以化合物M7及3c为起始原料，参照实施例37的合成路线，得到化合物30(125mg)；LC-MS：[M+H]+＝1445.6。
实施例39
化合物31及32的合成：
Figure BDA0003977943680000791
以化合物M7及5c为起始原料，参照实施例37的合成路线，得到61mg化合物31，LC-MS：[M+H]+＝1431.7；得到63mg化合物32，LC-MS：
[M+H]+＝1431.7。
实施例40
化合物33和34的合成：
Figure BDA0003977943680000792
以化合物M7及7c为起始原料，参照实施例37的合成路线，得到60mg化合物33，LC-MS：[M+H]+＝1485.6；得到58mg化合物34，LC-MS：
[M+H]+＝1485.6。
实施例41
化合物35和36的合成：
Figure BDA0003977943680000793
以化合物M7及19c为起始原料，参照实施例37的合成路线，得到102mg化合物35，LC-MS：[M+H]+＝1457.8；得到102mg化合物36，LC-MS：[M+H]+＝1457.8。
实施例42
化合物37的合成：
Figure BDA0003977943680000801
第一步：化合物SM5-1
于2000mL单口瓶，加入化合物16947-84-5(100g,295mmol,1.0eq)、DIPEA(50mL,300mmol)，溴化苄(51.3g,300mmol)及THF(1000mL)，室温反应12h(采用TLC监测)，过滤滤去不溶物。反应液直接减压旋转蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱层析(PE/EA＝50/1-20/1-2/1)得到SM5-1(110.1g)，收率87％；LC-MS：[M+H]+＝429.2。
第二步：化合物SM5-2
于2000mL单口瓶，加入化合物SM5-1(100g,233.4mmol,1.0eq)及THF(1000mL)，冰水浴冷却至0℃，分批次加入NaH(37.4g,933.5mmol)，MeI(132.5g,933.5mmol)，维持0℃下反应24h(采用TLC监测)，加入饱和NH4Cl水溶液500mL淬灭反应，乙酸乙酯500mL萃取三次，无水硫酸钠干燥有机相，过滤。滤液直接减压旋转蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱层析(PE/EA＝100/1-50/1-10/1)得到SM5-2(37.1g)；LC-MS：[M+H]+＝443.3。
第三步：化合物SM5(参照文献Org.Lett.,2006,8,3387-3390.)
于1000mL单口瓶，加入化合物SM5-2(35g,79mmol,1.0eq)及DCE(500mL)，依次加入二乙酸钯(180mg,0.8mmol)，I2(20g,79mmol)，二乙酸碘苯(40.8g,126.4mmol)，升温至60℃下反应40h(采用TLC监测)，加入饱和硫代硫酸钠水溶液500mL淬灭反应，二氯甲烷500mL萃取三次，无水硫酸钠干燥有机相，过滤。滤液直接减压旋转蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱层析(PE/EA＝100/1-50/1-10/1)得到SM5(28g)；LC-MS：[M+H]+＝501.3。
第四步：化合物SM6
于500mL单口瓶，加入化合物SM5(25g,50mmol,1.0eq)、磷酸二叔丁酯钾盐(13.66g,55mmol,1.1eq)、一水合对甲苯磺酸(951mg,5mmol,0.1eq)及THF(200mL)，室温反应1h(采用TLC监测)，过滤滤去不溶物。反应液直接经制备纯化，制备液水泵减压水浴35℃浓缩除去乙腈，冻干得到化合物SM6(15.1g)，收率46％；LC-MS：[M+H]+＝651.4。
第五步：化合物SM7
于250mL单口瓶中加入SM6(15g,23mmol)及100mL DMF，溶清后，冰水浴下，加入15g5％Pd/C，氢气置换体系内的气氛三次，室温下反应12h，过滤除去Pd/C，油泵减压旋蒸除去溶剂，待用；
另取250mL单口瓶，加入上述粗品及100mL甲苯，三乙胺(6.4mL,46mmol)，马来酸酐(2.4g,24mmol)，溶清后，升至100℃反应2h。HPLC监测反应进程，反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得制备液。制备液经二氯甲烷萃取、饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩得到固体4.2g，收率36％；LC-MS：[M+H]+＝507.3。
第六步：化合物M8
于100mL单口瓶，加入化合物SM7(4g,7.9mmol,1.0eq)、五氟苯酚(1.6g,8.7mmol,1.1eq)、DCC(1.8g,8.7mmol,1.1eq)及THF(60mL)，室温反应1h(采用TLC监测)，过滤滤去不溶物。反应液直接经制备纯化，制备液水泵减压水浴35℃浓缩除去乙腈，冻干得到化合物M8(3.7g)，收率70％；LC-MS：[M+H]+＝673.2。
第七步：化合物37a
于25mL单口瓶中加入1c(1g,2.36mmol)，25mL DMF溶清后，加入DIPEA(430uL,2.6mmol)，再加入M8(1.2g,2.36mmol)，加毕升至室温反应1h。HPLC监测反应完毕，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到产品488mg；LC-MS：[M-H]-＝911.0。
第八步：化合物37b
于100mL单口瓶中加入37a(400mg,0.44mmol)，依喜替康甲磺酸盐M5(235mg,0.44mmol)，PyBOP(199mg,0.5mmol)，HOBt(69mg,0.5mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(218uL,1.32mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物37b的制备液，制备液冻干得到化合物201mg；LC-MS：[M+H]+＝1329.6。
第九步：化合物37
于25mL单口瓶中加入化合物37b(130mg,0.098mmol)，溴化锌(221mg,0.98mmol)及10mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体96mg；LC-MS：[M+H]+＝1117.4。
实施例43
化合物38的合成：
Figure BDA0003977943680000811
以化合物M8及3c为起始原料，参照实施例42的合成路线，得到化合物38(51mg)；LC-MS：[M+H]+＝1145.6。
实施例44
化合物39及40的合成：
Figure BDA0003977943680000821
以化合物M8及5c为起始原料，参照实施例42的合成路线，得到57mg化合物39，LC-MS：[M+H]+＝1131.4；得到60mg化合物40，LC-MS：
[M+H]+＝1131.4。
实施例45
化合物41和42的合成：
Figure BDA0003977943680000822
以化合物M7及7c为起始原料，参照实施例42的合成路线，得到44mg化合物41，LC-MS：[M+H]+＝1185.3；得到44mg化合物42，LC-MS：
[M+H]+＝1185.3。
实施例46
化合物43和44的合成：
Figure BDA0003977943680000823
以化合物M8及19c为起始原料，参照实施例42的合成路线，得到62mg化合物43，LC-MS：[M+H]+＝1157.4；得到59mg化合物44，LC-MS：
[M+H]+＝1157.4。
实施例47(对照例)
化合物45的合成：
Figure BDA0003977943680000824
化合物45参照专利“CN104755494A”的实施例58提供的方法合成。
实施例48
化合物46的合成：
Figure BDA0003977943680000831
第一步：化合物46a
于50mL单口瓶中加入1d(500mg,0.62mmol)，M9(310mg,0.62mmol)，PyBOP(448mg,0.86mmol)，HOBt(116mg,0.86mmol)及15mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(378uL,2.29mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到46a(210mg)；LC-MS：[M+H]+＝1221.6。
第二步：化合物46
于25mL单口瓶中加入46a(200mg,0.162mmol)，溴化锌(736mg,3.26mmol)及10mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物46(120mg)；LC-MS：[M+H]+＝1065.3。
实施例49
化合物47的合成：
Figure BDA0003977943680000832
参照实施例48合成路线，得到化合物47(81mg)；LC-MS：[M+H]+＝1065.3。
实施例50
化合物48A的合成：
Figure BDA0003977943680000833
第一步：化合物48a
于100mL单口瓶中加入5d(1.66g,2.02mmol,1.0eq)，M9(1.08g,2.02mmol,1.0eq)，PyBOP(1.58g,3.03mmol,1.5eq)，HOBt(0.41g,3.03mmol,1.5eq)及DMF(40mL)，冰水浴下加入DIPEA(0.84mL,1.5eq)，升至室温反应2h(采用HPLC监测)。反应液直接经制备纯化，制备液水泵减压水浴35℃浓缩除去乙腈，冻干得到化合物48a(1.54g)，收率61％；LC-MS：[M+H]+＝1235.4。
第六步：化合物48A
于100mL单口瓶中加入化合物48a(1.0g,0.8mmol,1.0eq)，35mL硝基甲烷，溶解后再加入溴化锌(3.64g,16mmol,20.0eq)，油浴40℃(提前预热稳定)反应30min，水泵减压水浴45℃浓缩除去硝基甲烷，得黄色残余物固体(采用HPLC监测)。经酸法制备，得到制备液，制备液经水泵减压水浴35℃浓缩旋除乙腈，冻干得到化合物48A(786mg)收率90％。
实施例51
化合物48B的合成：
Figure BDA0003977943680000841
第一步：化合物48b
于25mL单口瓶中加入化合物5d-1(200mg,0.24mmol,1.0eq)、M9(127mg,0.24mmol，1.0eq)、PyBOP(187mg,0.36mmol,1.2eq)、HOBt(48mg,0.36mmol,1.2eq)及DMF(6mL)，冰水浴降至0-5℃，加入DIPEA(62mg,0.48mmol,2.0eq)，加毕，升至20±5℃反应2h，HPLC监测反应结束。反应液直接HPLC制备纯化，收集产品制备液，冻干得到化合物48b(150.2mg)；LC-MS：[M+H]+＝1235.4。
第二步：化合物48B
于25mL单口瓶中依次加入化合物48b(100mg,0.081mmol，1.0eq)，ZnBr2(364mg,1.62mmol,20.0eq)和CH3NO2(10mL)，加毕，升至40℃反应0.5h，停止反应，反应液直接45℃减压旋干后得到黄色固体，取样HPLC监测反应。旋干的固体直接HPLC制备纯化，收集产品制备液，冻干得到化合物48B(70.0mg)；LC-MS：[M+H]+＝1079.4。
实施例52
化合物49A的合成：
Figure BDA0003977943680000842
参照实施例50的路线，得到化合物49A(71mg)；LC-MS:[M+H]+＝1079.4。
实施例53
化合物49B的制备：
Figure BDA0003977943680000851
参照实施例51合成路线，得到化合物49B(65mg)；LC-MS：[M+H]+＝1079.4。
实施例54
化合物50A和50B的合成：
Figure BDA0003977943680000852
第一步：化合物50a和50b
于50mL单口瓶中加入7d(500mg,0.57mmol)，M9(305mg,0.57mmol)，PyBOP(448mg,0.86mmol)，HOBt(116mg,0.86mmol)及15mL DMF,冰水浴下加入DIPEA(378uL,2.29mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物50a和化合物50b的制备液，制备液分别冻干得到170mg化合物50a，LC-MS：[M+H]+＝1289.46；202mg化合物50b，LC-MS：[M+H]+＝1289.46。
第二步：化合物50A
Figure BDA0003977943680000853
于25mL单口瓶中加入50a(100mg,0.077mmol)，溴化锌(349mg,1.55mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体44mg。
第三步：化合物50B
Figure BDA0003977943680000854
于25mL单口瓶中加入50b(100mg,0.077mmol)，溴化锌(349mg,1.55mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体45mg。
实施例55
化合物51A和51B的合成：
Figure BDA0003977943680000861
第一步：化合物51a和化合物51b
于50mL单口瓶中加入8d(500mg,0.57mmol)，M9(305mg,0.57mmol)，PyBOP(448mg,0.86mmol)，HOBt(116mg,0.86mmol)及15mL DMF,冰水浴下加入DIPEA(378uL,2.29mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物51a和化合物51b的制备液，制备液分别冻干得到190mg化合物51a，186mg化合物51b。化合物51a的LC-MS：[M+H]+＝1289.47；化合物51b的LC-MS：[M+H]+＝1289.47。
第二步：化合物51A
Figure BDA0003977943680000862
于25mL单口瓶中加入化合物51a(100mg,0.077mmol)，溴化锌(349mg,1.55mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体39mg。
第三步：化合物51B
Figure BDA0003977943680000863
于25mL单口瓶中加入化合物51b(100mg,0.077mmol)，溴化锌(349mg,1.55mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体60mg。
实施例56
化合物52A的合成：
Figure BDA0003977943680000871
第一步：化合物52a
于50mL单口瓶中加入11d(800mg,0.96mmol)，M9(480mg,0.96mmol)，PyBOP(500mg,0.96mmol)，HOBt(208mg,0.96mmol)及30mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(660uL,4.0mmol)，升至室温反应4h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物52a的制备液，制备液冻干得到52a(388mg)；LC-MS：[M+H]+＝1261.4。
第二步：化合物52A
于25mL单口瓶中加入52a(150mg,0.12mmol)，溴化锌(532mg,2.4mmol)及10mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物52A(79mg)；LC-MS：[M+H]+＝1105.4。
实施例57
化合物52B的合成
Figure BDA0003977943680000872
参照实施例56合成路线，得到化合物52B(50mg)。LC-MS：[M+H]+1105.4。
实施例58
化合物53A的合成：
Figure BDA0003977943680000873
第一步：化合物53a
于50mL单口瓶中加入12d(400mg,0.47mmol)，M9(240mg,0.47mmol)，PyBOP(250mg,0.47mmol)，HOBt(101mg,0.47mmol)及15mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(330uL,2.0mmol)，升至室温反应3h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物53a的制备液，制备液冻干得到53a(200mg)；LC-MS：[M+H]+＝1275.4。
第二步：化合物53A
于25mL单口瓶中加入53a(100mg,0.08mmol)，溴化锌(360mg,1.6mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物53A(51mg)；LC-MS：[M+H]+＝1119.4。
实施例59
化合物53B的合成：
Figure BDA0003977943680000881
参照实施例58合成路线，得到化合物53B(50mg)；LC-MS：[M+H]+＝1119.4。
实施例60
化合物54A和54B的合成：
Figure BDA0003977943680000882
第一步：化合物54a和54b
于50mL单口瓶中加入19d(500mg,0.59mmol)，M9(317mg,0.59mmol)，PyBOP(339mg,0.65mmol)，HOBt(88mg,0.86mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(292uL,1.77mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物54a和54b的制备液，制备液分别冻干得到103mg化合物54a，LC-MS：[M+H]+＝1261.5；111mg化合物54b，LC-MS：[M+H]+＝1261.5。
第二步：化合物54A
Figure BDA0003977943680000883
于25mL单口瓶中加入54a(100mg,0.079mmol)，溴化锌(357mg,1.59mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体61mg；LC-MS：[M+H]+＝1105.4。
第三步：化合物54B
Figure BDA0003977943680000891
于25mL单口瓶中加入54b(100mg,0.079mmol)，溴化锌(357mg,1.59mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体57mg；LC-MS：[M+H]+＝1105.4。
实施例61
化合物55A和55B的合成：
Figure BDA0003977943680000892
第一步：化合物55a和55b
于50mL单口瓶中加入20d(400mg,0.47mmol)，M9(250mg,0.47mmol)，PyBOP(223mg,0.56mmol)，HOBt(83mg,0.56mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(248uL,1.5mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物55a和55b的制备液，制备液分别冻干得到100mg化合物55a，LC-MS：[M+H]+＝1275.5；101mg化合物55b，LC-MS：[M+H]+＝1275.5。
第二步：化合物55A
Figure BDA0003977943680000893
于25mL单口瓶中加入55a(100mg,0.078mmol)，溴化锌(352mg,1.57mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体42mg；LC-MS：[M+H]+＝1119.4。
第三步：化合物55B
Figure BDA0003977943680000901
于25mL单口瓶中加入55b(100mg,0.079mmol)，溴化锌(357mg,1.59mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体45mg；LC-MS：[M+H]+＝1119.4。
实施例62
化合物56的合成：
Figure BDA0003977943680000902
参照实施例60合成路线，得到化合物56(50mg)；LC-MS：[M+H]+＝1119.3。
实施例63
化合物57的合成：
Figure BDA0003977943680000903
参照实施例61合成路线，得到化合物57(50mg)；LC-MS：[M+H]+＝1119.4。
实施例64
化合物58的合成：
Figure BDA0003977943680000904
第一步：化合物58a的合成
向伊喜替康甲磺酸盐M5(15g,28mol，采用专利申请“EP0737683A1”所公开的方法制备)中加入400mL DMF，冰水浴冷却至0℃，滴加三乙胺，调节pH至7-8，冰水浴下滴加溴化苄(9.6g,56mmol)，升温至室温(25℃)下反应1小时，TLC监测反应完全，反应液减压浓缩，所得粗产品经制备级高效液相色谱法纯化(乙腈/纯水体系)，收集目标峰，减压除去乙腈以后，冻干，得到化合物58a约11g，黄色固体，收率约74％，MS m/z:[M+H]+526.3。
第二步：化合物58b的合成
室温下，于250mL单口瓶中依次加入化合物58a(11g,21mol),120mL甲酸溶解，向所得亮黄色溶液中加入30mL甲醛(40％水溶液)，升温至50℃下反应1小时后，TLC监测反应完全，冷却至室温，反应液经制备级高效液相色谱法纯化(乙腈/纯水体系)，收集目标峰，减压除去乙腈以后，冻干，得到化合物58b约4.5g，黄色粉末状固体，收率约40％，MS m/z:[M+H]+540.6。
第三步：化合物58的合成：
室温下，于250mL 单口瓶中加入化合物58b(2.3g,4.3mol),加入100mL DMF溶解，向所得亮黄色溶液中加入2.3g 5％ Pd/C，氢气气球置换体系内气氛，维持室温下反应1.5小时后，HPLC监测反应完全，过滤除去Pd/C，所得反应液浓缩后，经制备级高效液相色谱法纯化(乙腈/纯水体系)，收集目标峰，减压除去乙腈以后，冻干，得到化合物58约1.0g，黄色粉末状固体，收率约52％，MS m/z:[M+H]+450.5。
实施例65
化合物59的合成：
Figure BDA0003977943680000911
第一步：化合物59a
于50mL单口瓶中加入1d(500mg,0.62mmol)，58(279mg,0.62mmol)，PyBOP(448mg,0.86mmol)，HOBt(116mg,0.86mmol)及15mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(378uL,2.29mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到59a(166mg)；LC-MS：[M+H]+＝1235.6。
第二步：化合物59
于25mL单口瓶中加入59a(100mg,0.081mmol)，溴化锌(368mg,1.63mmol)及10mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物59(43mg)；LC-MS：[M+H]+＝1079.3。
实施例66
化合物60的合成：
Figure BDA0003977943680000921
参照实施例65合成路线，得到化合物60(40mg)；LC-MS：[M+H]+＝1079.3。
实施例67
化合物61的合成：
Figure BDA0003977943680000922
第一步：化合物61a
于100mL单口瓶中加入5d(1.66g,2.02mmol,1.0eq)，58(0.91g,2.02mmol,1.0eq)，PyBOP(1.58g,3.03mmol,1.5eq)，HOBt(0.41g,3.03mmol,1.5eq)及DMF(40mL)，冰水浴下加入DIPEA(0.84mL,1.5eq)，升至室温反应2h(采用HPLC监测)。反应液直接经制备纯化，制备液水泵减压水浴35℃浓缩除去乙腈，冻干得到化合物61a(1.21g)；LC-MS：[M+H]+＝1249.4。
第二步：化合物61
于100mL单口瓶中加入化合物61a(1.0g,0.8mmol,1.0eq)，35mL硝基甲烷，溶解后再加入溴化锌(3.64g,16mmol,20.0eq)，油浴40℃(提前预热稳定)反应30min，水泵减压水浴45℃浓缩除去硝基甲烷，得黄色残余物固体(采用HPLC监测)。经酸法制备，得到制备液，制备液经水泵减压水浴35℃浓缩旋除乙腈，冻干得到化合物61(786mg)，LC-MS：[M+H]+＝1093.6。
实施例68
化合物62的合成：
Figure BDA0003977943680000923
第一步：化合物62a
于25mL单口瓶中加入化合物5d-1(200mg,0.24mmol,1.0eq)、58(110.3mg,0.24mmol，1.0eq)、PyBOP(187mg,0.36mmol,1.2eq)、HOBt(48mg,0.36mmol,1.2eq)及DMF(6mL)，冰水浴降至0-5℃，加入DIPEA(62mg,0.48mmol,2.0eq)，加毕，升至20±5℃反应2h，HPLC监测反应结束。反应液直接HPLC制备纯化，收集产品制备液，冻干得到化合物62a(120.9mg)；LC-MS：[M+H]+＝1249.4。
第二步：化合物62
于25mL单口瓶中依次加入化合物62a(100mg,0.081mmol，1.0eq)，ZnBr2(364mg,1.62mmol,20.0eq)和CH3NO2(10mL)，加毕，升至40℃反应0.5h，停止反应，反应液直接45℃减压旋干后得到黄色固体，取样HPLC监测反应。旋干的固体直接HPLC制备纯化，收集产品制备液，冻干得到化合物62(61mg)；LC-MS：[M+H]+＝1093.4。
实施例69
化合物63的制备：
Figure BDA0003977943680000931
参照实施例67的路线，得到化合物63(60mg)；LC-MS:[M+H]+＝1093.4。
实施例70
化合物64的制备：
Figure BDA0003977943680000932
参照实施例68合成路线，得到化合物64(65mg)；LC-MS：[M+H]+＝1093.4。
实施例71
化合物65A和65B的制备：
Figure BDA0003977943680000933
第一步：化合物65a和65b
于50mL单口瓶中加入7d(500mg,0.57mmol)，58(256.8mg,0.57mmol)，PyBOP(448mg,0.86mmol)，HOBt(116mg,0.86mmol)及15mL DMF,冰水浴下加入DIPEA(378uL,2.29mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物65a和65b的制备液，制备液分别冻干得到155mg化合物65a，LC-MS：[M+H]+＝1303.4；158mg化合物65b，LC-MS：[M+H]+＝1303.6。
第二步：化合物65A
Figure BDA0003977943680000941
于25mL单口瓶中加入50a(100mg,0.077mmol)，溴化锌(349mg,1.55mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到制备液，制备液冻干得到固体49mg。
第三步：化合物65B
Figure BDA0003977943680000942
于25mL单口瓶中加入65b(100mg,0.077mmol)，溴化锌(349mg,1.55mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到制备液，制备液冻干得到固体47mg。
实施例72
化合物66A和66B的合成：
Figure BDA0003977943680000943
第一步：化合物66a和化合物66b
于50mL单口瓶中加入8d(500mg,0.57mmol)，58(256.8mg,0.57mmol)，PyBOP(448mg,0.86mmol)，HOBt(116mg,0.86mmol)及15mL DMF,冰水浴下加入DIPEA(378uL,2.29mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物66a和化合物66b的制备液，制备液分别冻干得到160mg化合物66a，160mg化合物66b。化合物66a的LC-MS：[M+H]+＝1303.7；化合物66b的LC-MS：[M+H]+＝1303.6。
第二步：化合物66A
Figure BDA0003977943680000951
于25mL单口瓶中加入化合物66a(100mg,0.077mmol)，溴化锌(349mg,1.55mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体57mg，LC-MS：[M+H]+＝1147.5。
第三步：化合物66B
Figure BDA0003977943680000952
于25mL单口瓶中加入化合物66b(100mg,0.077mmol)，溴化锌(349mg,1.55mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体57mg，LC-MS：[M+H]+＝1147.5。。
实施例73
化合物67A的合成：
Figure BDA0003977943680000953
第一步：化合物67a
于50mL单口瓶中加入11d(800mg,0.96mmol)，58(432.5mg,0.96mmol)，PyBOP(500mg,0.96mmol)，HOBt(208mg,0.96mmol)及30mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(660uL,4.0mmol)，升至室温反应4h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物67a的制备液，制备液冻干得到67a(402mg)；LC-MS：[M+H]+＝1275.4。
第二步：化合物67A
于25mL单口瓶中加入67a(100mg,0.78mmol)，溴化锌(356mg,1.57mmol)及10mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物67A(47mg)；LC-MS：[M+H]+＝1119.5。
实施例74
化合物67B的合成：
Figure BDA0003977943680000961
参照实施例73合成路线，得到化合物67B(50mg)。LC-MS：[M+H]+1119.4。
实施例75
化合物68A的合成：
Figure BDA0003977943680000962
第一步：化合物68a
于50mL单口瓶中加入12d(400mg,0.47mmol)，58(211.7mg,0.47mmol)，PyBOP(250mg,0.47mmol)，HOBt(101mg,0.47mmol)及15mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(330uL,2.0mmol)，升至室温反应3h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物68a的制备液，制备液冻干得到68a(177mg)；LC-MS：[M+H]+＝1289.4。
第二步：化合物68A
于25mL单口瓶中加入68a(100mg,0.08mmol)，溴化锌(360mg,1.6mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物68A(45mg)；LC-MS：[M+H]+＝1133.4。
实施例76
化合物68B的合成：
Figure BDA0003977943680000963
参照实施例75合成路线，得到化合物68B(50mg)；LC-MS：[M+H]+＝1133.4。
实施例77
化合物69A和68B的合成：
Figure BDA0003977943680000971
第一步：化合物69a和69b
于50mL单口瓶中加入19d(500mg,0.59mmol)，58(266mg,0.59mmol)，PyBOP(339mg,0.65mmol)，HOBt(88mg,0.86mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(292uL,1.77mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物69a和69b的制备液，制备液分别冻干得到109mg化合物69a，LC-MS：[M+H]+＝1275.5；111mg化合物69b，LC-MS：[M+H]+＝1275.7。
第二步：化合物69A
Figure BDA0003977943680000972
于25mL单口瓶中加入69a(100mg,0.078mmol)，溴化锌(352mg,1.56mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体53mg；LC-MS：[M+H]+＝1119.4。
第三步：化合物69B
Figure BDA0003977943680000973
于25mL单口瓶中加入69b(100mg,0.078mmol)，溴化锌(352mg,1.56mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体54mg；LC-MS：[M+H]+＝1119.4。
实施例78
化合物70A和70B的合成：
Figure BDA0003977943680000981
第一步：化合物70a和70b
于50mL单口瓶中加入20d(400mg,0.47mmol)，58(211.7mg,0.47mmol)，PyBOP(223mg,0.56mmol)，HOBt(83mg,0.56mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(248uL,1.5mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物70a和70b的制备液，制备液分别冻干得到106mg化合物70a，LC-MS：[M+H]+＝1289.5；101mg化合物70b，LC-MS：[M+H]+＝1289.4。
第二步：化合物70A
Figure BDA0003977943680000982
于25mL单口瓶中加入70a(100mg,0.078mmol)，溴化锌(352mg,1.57mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体39mg；LC-MS：[M+H]+＝1133.4。
第三步：化合物70B
Figure BDA0003977943680000983
于25mL单口瓶中加入70b(100mg,0.078mmol)，溴化锌(352mg,1.56mmol)及5mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体35mg；LC-MS：[M+H]+＝1133.4。
实施例79
化合物71的合成：
Figure BDA0003977943680000991
参照实施例78合成路线，得到化合物71(30mg)；LC-MS：[M+H]+＝1133.3。
实施例80
化合物72的合成：
Figure BDA0003977943680000992
参照实施例78合成路线，得到化合物72(33mg)；LC-MS：[M+H]+＝1133.4。
实施例81
Figure BDA0003977943680000993
化合物M11的合成：
于100mL单口瓶，加入化合物M3(11.0g,19.5mmol,1.0eq)、DIPEA(2.8g,21.4mmol,1.1eq)、27-氨基-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂二十七烷酸(9.7g,20.5mmol,1.05eq)及DMF(60mL)，室温反应20min(采用TLC监测)。反应液直接经制备纯化，制备液水泵减压水浴35℃浓缩除去乙腈，冻干得到化合物M10(13.2g)，收率78％；LC-MS：[M+H]+＝866.5。
于100mL单口瓶，加入化合物M10(13.0g,15mmol,1.0eq)、五氟苯酚(3g,16.5mmol,1.1eq)、DCC(3.4g,16.5mmol,1.1eq)及THF(30mL)，室温反应30min(采用TLC监测)，过滤滤去不溶物。反应液直接经制备纯化，制备液水泵减压水浴35℃浓缩除去乙腈，冻干得到化合物M11(14.2g)，收率92％；LC-MS：[M+H]+＝1032.5。
实施例82
化合物73的合成：
Figure BDA0003977943680001001
第一步：化合物73a的合成
向M11(1g,0.79mol)中加入10mL DMF，冰水浴冷却至0℃，加入化合物1c(334mg,0.79mol)，DIPEA(154mg,1.19mol)，维持该条件下反应1h，TLC监测反应完全，反应液经制备级高效液相色谱法纯化(乙腈/纯水体系)，收集目标峰，减压除去乙腈以后，冻干，得到化合物73a约1.2g，MS m/z:[M+H]+＝1271.9。
第二步：化合物73b的合成
于25mL单口瓶中加入73a(1.2g,0.94mmol)，M5(500mg,0.94mmol)，PyBOP(625mg,1.2mmol)，HOBt(162mg,1.2mmol)及15mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(310mg,2.4mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到73b(709mg)；LC-MS：[M+H]+＝1720.8。
第三步：化合物73的合成：
于25mL单口瓶中加入73b(200mg,0.116mmol)，溴化锌(523mg,2.32mmol)及10mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物73(88mg)；LC-MS：[M+H]+＝1532.6。
实施例83
化合物74的合成：
Figure BDA0003977943680001002
参照实施例82合成路线，得到化合物74(90mg)；LC-MS：[M+H]+＝1532.6。
实施例84
化合物75的合成：
Figure BDA0003977943680001011
第一步：化合物75a的合成
向M11(1g,0.79mol)中加入10mL DMF，冰水浴冷却至0℃，加入化合物5c(345mg,0.79mol)，DIPEA(154mg,1.19mol)，维持该条件下反应1h，TLC监测反应完全，反应液经制备级高效液相色谱法纯化(乙腈/纯水体系)，收集目标峰，减压除去乙腈以后，冻干，得到化合物75a 0.9g，MS m/z:[M+H]+＝1285.6。
第二步：化合物75b的合成
于25mL单口瓶中加入75a(700mg,0.54mmol)，M5(289mg,0.54mmol)，PyBOP(313mg,0.6mmol)，HOBt(81mg,0.6mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(155mg,1.2mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得制备液，制备液冻干得到75b(304mg)；LC-MS：[M+H]+＝1734.8。
第三步：化合物75的合成：
于25mL单口瓶中加入75b(200mg,0.116mmol)，溴化锌(523mg,2.32mmol)及10mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物75(96mg)；LC-MS：[M+H]+＝1546.6。
实施例85
化合物76的合成：
Figure BDA0003977943680001012
参照实施例84合成路线，得到化合物76(92mg)；LC-MS：[M+H]+＝1546.5。
实施例86
化合物77的合成：
Figure BDA0003977943680001021
参照实施例84合成路线，得到化合物77(87mg)；LC-MS：[M+H]+＝1546.5。
实施例87
化合物78的合成：
Figure BDA0003977943680001022
参照实施例84合成路线，得到化合物78(94mg)；LC-MS：[M+H]+＝1546.7。
实施例88
化合物79和80的合成：
Figure BDA0003977943680001023
第一步：化合物79a的合成
向M11(1g,0.79mol)中加入10mL DMF，冰水浴冷却至0℃，加入化合物20c(377mg,0.79mol)，DIPEA(154mg,1.19mol)，维持该条件下反应1h，TLC监测反应完全，反应液经制备级高效液相色谱法纯化(乙腈/纯水体系)，收集目标峰，减压除去乙腈以后，冻干，得到783mg化合物79a，MS m/z:[M+H]+＝1325.8。
第二步：化合物79b-1和79b-2的合成
于25mL单口瓶中加入79a(600mg,0.45mmol)，M5(240mg,0.45mmol)，PyBOP(261mg,0.5mmol)，HOBt(68mg,0.5mmol)及10mL DMF，冰水浴下加入DIPEA(130mg,1mmol)，升至室温反应2h。HPLC监测反应完毕后，反应液经高效液相纯化，得化合物79b-1和79b-2的制备液，制备液冻干得到79b-1(124mg)；LC-MS：[M+H]+＝1743.0；得到79b-1(122mg)；LC-MS：[M+H]+＝1743.0。
第三步：化合物79的合成
Figure BDA0003977943680001031
于25mL单口瓶中加入79b-1(100mg,0.057mmol)，溴化锌(258mg,1.15mmol)及10mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物79(30mg)；LC-MS：[M+H]+＝1586.9。
第四步：化合物80的合成
Figure BDA0003977943680001032
于25mL单口瓶中加入79b-2(100mg,0.057mmol)，溴化锌(258mg,1.15mmol)及10mL硝基甲烷，40℃下反应1h。HPLC监测反应完毕后，减压浓缩除去溶剂，得粗品。粗品经高效液相纯化，得到产品制备液，制备液冻干得到固体化合物80(33mg)；LC-MS：[M+H]+＝1587.0。
实施例89
化合物81的合成：
Figure BDA0003977943680001033
参照实施例88合成路线，得到化合物81(24mg)；LC-MS：[M+H]+＝1586.9。
实施例90
化合物82的合成：
Figure BDA0003977943680001041
参照实施例88合成路线，得到化合物82(29mg)；LC-MS：[M+H]+＝1586.9。
实施例91
1)hu4D3抗体的表达与纯化：
使用Expi293(上海奥浦迈生物科技股份有限公司)悬浮细胞表达hu4D3抗体。转染前一天，以0.9×106个/mL密度将细胞接种于含300mL OPM-293CD05 Medium(81075-001，上海奥浦迈生物科技股份有限公司)的1L摇瓶中，37℃，5％ CO2，120rpm细胞培养摇床过夜培养。次日，用PEI-MAX进行抗体表达质粒的转染，其中质粒:PEI-MAX的质量比为1:3。转染后第一天按5％(v/v)加入OPM-293ProFeed补料，转染后第三天再次按5％(v/v)加入OPM-293ProFeed补料，转染后第六天离心收集上清。
收集得到的细胞表达上清，经Protein A亲和层析柱(UniMab 50，苏州纳微科技股份有限公司)，以0.05M乙酸钠(pH3.6)洗脱，捕获的抗体用1M Tris-HCl(pH8.8)按0.7/10(v/v)调节至pH7.0，再通过凝胶过滤层析柱SEC(Superdex 200，GE公司)去除多聚体等杂质，同时将抗体缓冲液置换成20mM PB(pH6.5)。
抗体hu4D3：
轻链核酸编码序列
SEQ ID NO：38
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTAGCCTGTCCGCTTCTGTGGGCGATAGAGTGAC
CATCACATGCAGAGCTTCTCAGGATATCAATAAGTATCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGC
CTGGAAAGGTGCCTAAGCTGCTGATCTACTCTACATCTACCCTGCAGTCTGGAGTGCCT
TCTAGATTTTCTGGATCTGGCTCTGGCACCGATTTTACACTGACAATCTCTTCTCTGCAG
CCTGAGGATGTGGCTACATATTATTGTCTGCAGTATGATGATCTGTTCACCTTTGGCCAG
GGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGC
CATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTC
TATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACT
CCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGC
ACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTC
ACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
轻链氨基酸序列
SEQ ID NO：18
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINKYLAWYQQKPGKVPKLLIYSTSTLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQYDDLFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL
KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA
DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
其中，可变区为：
SEQ ID NO：14
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINKYLAWYQQKPGKVPKLLIYSTSTLQSGVPSR
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCLQYDDLFTFGQGTKLEIK
其中下划线部分从左向右依次分别为CDR1(SEQ ID NO：7)、CDR2(SEQ ID NO：8)、CDR3(SEQ ID NO：9)。
上述轻链的可变区的核酸编码序列为SEQ ID NO：34GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTAGCCTGTCCGCTTCTGTGGGCGATAGAGTGACCATCACATGCAGAGCTTCTCAGGATATCAATAAGTATCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGTGCCTAAGCTGCTGATCTACTCTACATCTACCCTGCAGTCTGGAGTGCCTTCTAGATTTTCTGGATCTGGCTCTGGCACCGATTTTACACTGACAATCTCTTCTCTGCAGCCTGAGGATGTGGCTACATATTATTGTCTGCAGTATGATGATCTGTTCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGC
上述轻链的可变区中的CDR1(SEQ ID NO：7)、CDR2(SEQ ID NO：8)、CDR3(SEQ IDNO：9)的核苷酸编码序列分别为：
SEQ ID No.27
CAAGACATTAATAAGTAT
SEQ ID No.28
TCCACATCT
SEQ ID No.29
CTGCAGTATGATGATCTATTCACG
重链的核酸编码序列
SEQ ID NO：37
ATGGGCTGGTCCTGGGTGTTCCTGTTCCTGCTGAGCGTGACCGCCGGCGTGCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGCTGAGCTGTAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCTCCTTCGACATTAACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGAGCAGCGCCTGGAGTGGATGGGCTGGATCTTCCCCGGCGACGGCAACACCAAGTACTCCCAGAAGTTCCAGGGAAGAGCTACCATCACCAGAGATACATCCGCTTCTACAGCTTACATGGAGCTGTCTAGCCTGAGATCTGAGGATACAGCTGTGTATTACTGTGTGAGAGGAGAGGCTCTGTACTATTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAA
重链的氨基酸序列
SEQ ID NO：17
QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTSFDINWVRQAPEQRLEWMGWIFPGDGNTKYSQKFQGRATITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGEALYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
其中，重链的可变区为：
SEQ ID NO：13
QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTSFDINWVRQAPEQRLEWMGWIFPGDGNTKYSQKFQGRATITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGEALYYFDYWGQGTLVTVSS
其中下划线部分从左向右依次分别为CDR1(SEQ ID NO：1)、CDR2(SEQ ID NO：2)、CDR3(SEQ ID NO：3)，
上述重链的可变区的核酸编码序列为SEQ ID NO：33CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGCTGAGCTGTAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCTCCTTCGACATTAACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGAGCAGCGCCTGGAGTGGATGGGCTGGATCTTCCCCGGCGACGGCAACACCAAGTACTCCCAGAAGTTCCAGGGAAGAGCTACCATCACCAGAGATACATCCGCTTCTACAGCTTACATGGAGCTGTCTAGCCTGAGATCTGAGGATACAGCTGTGTATTACTGTGTGAGAGGAGAGGCTCTGTACTATTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCTG
上述重链的可变区中的CDR1(SEQ ID NO：1)、CDR2(SEQ ID NO：2)、CDR3(SEQ IDNO：3)的核苷酸编码序列分别为：
SEQ ID No.21
GGCTACACCTTCACAAGCTTTGAT
SEQ ID No.22
ATTTTTCCTGGAGATGGTAAT
SEQ ID No.23
GTAAGAGGGGAGGCCCTGTATTACTTTGACTAC
2)hu7F11抗体的表达与纯化：按照类似的方法，对于hu7F11抗体进行表达与纯化。
抗体hu7F11：
轻链的核酸编码序列
SEQ ID NO：40
GATATCGTGATGACACAGTCTCCTGATTCTCTGGCCGTGTCTCTGGGCGAAAGAGCTACAATCAACTGTAAGGCTTCTCAGTCTGTGTCTAATGATGTGGTGTGGTACCAGCAGAAGCCTGGGCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCTCCAACAGGTACACCGGCGTGCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTACGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGACTACTCCTCCCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
轻链的氨基酸序列
SEQ ID NO：20
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVSNDVVWYQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDYSSPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
其中，轻链的可变区为：
SEQ ID NO：16
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSVSNDVVWYQQKPGQPPKLLIYYASNRYTGVPDRFSGSGYGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQDYSSPWTFGGGTKVEIK
其中下划线部分从左向右依次分别为CDR1(SEQ ID NO：10)、CDR2(SEQ ID NO：11)、CDR3(SEQ ID NO：12)。
上述轻链的可变区的核酸编码序列为SEQ ID NO：36GATATCGTGATGACACAGTCTCCTGATTCTCTGGCCGTGTCTCTGGGCGAAAGAGCTACAATCAACTGTAAGGCTTCTCAGTCTGTGTCTAATGATGTGGTGTGGTACCAGCAGAAGCCTGGGCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTACGCCTCCAACAGGTACACCGGCGTGCCCGACAGGTTCTCCGGCTCCGGCTACGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGGACTACTCCTCCCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGC
上述轻链的可变区中的CDR1(SEQ ID NO：10)、CDR2(SEQ ID NO：11)、CDR3(SEQ IDNO：12)的核苷酸编码序列分别为：
SEQ ID No.30
CAGAGTGTGAGTAATGAT
SEQ ID No.31
TATGCATCC
SEQ ID No.32
CAGCAGGATTATTCCTCTCCGTGGACG
重链的核酸编码序列
SEQ ID NO：39
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACCACGTGATCTCCTGGGTGCGCCAGGCCACCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCAGATCTACCCCGGCTCCGACAACTCCTACTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACTCTGACCGCCGACAAGTCCATCAACACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGAGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGAGGGCTACGGCTACGGCAAGAACGGCGTGGGCTACGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTTAA
重链的氨基酸序列
SEQ ID NO：19
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDHVISWVRQATGQGLEWMGQIYPGSDNSYYAQKFQGRVTLTADKSINTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYGYGKNGVGYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
其中，重链的可变区为：
SEQ ID NO：15
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDHVISWVRQATGQGLEWMGQIYPGSDNSYYAQKFQGRVTLTADKSINTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYGYGKNGVGYAMDYWGQGTLVTVSS
其中下划线部分从左向右依次分别为CDR1(SEQ ID NO：4)、CDR2(SEQ ID NO：5)、CDR3(SEQ ID NO：6)，
上述重链的可变区的核酸编码序列为SEQ ID NO：35CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGCTTCTGTGAAGGTGTCTTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACCGACCACGTGATCTCCTGGGTGCGCCAGGCCACCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCAGATCTACCCCGGCTCCGACAACTCCTACTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACTCTGACCGCCGACAAGTCCATCAACACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGAGGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGAGGGCTACGGCTACGGCAAGAACGGCGTGGGCTACGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCTTCTG
上述重链的可变区中的CDR1(SEQ ID NO：4)、CDR2(SEQ ID NO：5)、CDR3(SEQ IDNO：6)的核苷酸编码序列分别为：
SEQ ID No.24
GGATACACATTCACTGACCATGTC
SEQ ID No.25
ATTTATCCTGGAAGTGATAATAGT
SEQ ID No.26
GCAAGAGAGGGCTATGGTTATGGAAAAAACGGAGTTGGCTATGCTATGGACTAC
3)hTINA1抗体的表达与纯化：按照类似的方法，对于hTINA1抗体进行表达与纯化。具体参见专利CN105849126A中说明书67/91页的表2中的“hTINA1-H1L1”。
抗体hTINA1：
轻链核酸编码序列SEQ ID No.43
ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGCAAGGCCAGCCAGGACGTGTCCACAGCCGTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTACCGGTACACCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCACTACATCACCCCCCTGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGGAACTCCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCTCCCCCGTCACCAAGAGCTTCAACAGGGGGGAGTGT
轻链氨基酸序列SEQ ID No.44
MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
其中，可变区为：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGQGTKLEIK
重链核酸编码序列SEQ ID No.41
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTGCTGAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCAGGCGCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTTACCACCGCCGGCATGCAGTGGGTGCGCCAGGCTCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGCTGGATCAACACCCACAGCGGCGTGCCCAAATACGCCGAGGACTTCAAGGGCAGAGTGACCATCAGCGCCGACACCAGCACCTCCACAGCCTACCTGCAGCTGAGCAGCCTGAAGTCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGAAGCGGCTTCGGCAGCAGCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTCAGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAAGCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCCGTGACCGTGAGCTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCCTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCCCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGCAAA
重链的氨基酸序列SEQ ID No.42
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQGLEWMGWINTHSGVPKYAEDFKGRVTISADTSTSTAYLQLSSLKSEDTAVYYCARSGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
其中，重链的可变区为：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQGLEWMGWINTHSGVPKYAEDFKGRVTISADTSTSTAYLQLSSLKSEDTAVYYCARSGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSS
实施例92
1)通过偶联hu4D3抗体与payload制备hu4D3抗体-药物偶联物样品：
在经过细胞表达并通过Protein A亲和层析与分子筛层析纯化之后，抗人Trop2抗体被置换于20mM NaAc-HAc，pH6.0的缓冲液中，浓缩或者稀释，抗人Trop2抗体至蛋白浓度为5mg/mL。连接子加药物为白色粉末，使用DMA将其溶解至10mg/mL备用。为了打开，抗人Trop2抗体的链间二硫键，先按照分子比加入15倍的TCEP，并在室温下反应2h。然后按照分子比加入16倍的连接子加药物溶液，在室温下反应2h。反应结束后使用30KDa超滤离心管超滤，将未偶联上抗人Trop2抗体的连接子加药物去除，即得到抗人Trop2抗体-药物偶联物样品。
所得到的人Trop2抗体-药物偶联物样品将通过SEC-HPLC确定单体率，通过RP-HPLC或者HIC-HPLC确定载药量。
2)按照类似的方法，通过偶联hu7F11抗体与payload制备hu7F11抗体-药物偶联物样品。
实施例93
通过偶联TINA1抗体与payload制备DS1062a抗体-药物偶联物样品在经过细胞表达并通过Protein A亲和层析与分子筛层析纯化之后，抗人Trop2抗体被置换于20mM NaAc-HAc，pH6.0的缓冲液中，浓缩或者稀释抗人Trop2抗体至蛋白浓度为5mg/mL。连接子加药物为白色粉末，使用DMA将其溶解至10mg/mL备用。为了打开抗人Trop2抗体的链间二硫键，先按照分子比加入8～12倍的TCEP，并在室温下反应1～2h。然后按照分子比加入5～8倍的连接子加药物溶液，在室温下反应1～2h。反应结束后使用30KDa超滤离心管超滤，将未偶联上抗人Trop2抗体的连接子加药物去除，即得到抗人Trop2抗体-药物偶联物样品。
所得到的人Trop2抗体-药物偶联物样品将通过SEC-HPLC确定单体率，通过RP-HPLC或者HIC-HPLC确定载药量。
实施例94
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-1，
Figure BDA0003977943680001111
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-2，
Figure BDA0003977943680001112
Figure BDA0003977943680001121
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-3，
Figure BDA0003977943680001122
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-4，
Figure BDA0003977943680001123
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-5，
Figure BDA0003977943680001124
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-6，
Figure BDA0003977943680001125
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-7，
Figure BDA0003977943680001126
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-8，
Figure BDA0003977943680001131
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-9，
Figure BDA0003977943680001132
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-10，
Figure BDA0003977943680001133
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-11，
Figure BDA0003977943680001134
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-12，
Figure BDA0003977943680001135
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-13，
Figure BDA0003977943680001141
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-14，
Figure BDA0003977943680001142
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-15，
Figure BDA0003977943680001143
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-16，
Figure BDA0003977943680001144
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-17，
Figure BDA0003977943680001145
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-18，
Figure BDA0003977943680001151
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-19，
Figure BDA0003977943680001152
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-20，
Figure BDA0003977943680001153
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-21，
Figure BDA0003977943680001154
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-22，
Figure BDA0003977943680001155
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-23，
Figure BDA0003977943680001161
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-24，
Figure BDA0003977943680001162
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-25，
Figure BDA0003977943680001163
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-26，
Figure BDA0003977943680001164
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-27，
Figure BDA0003977943680001165
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-28，
Figure BDA0003977943680001171
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-29，
Figure BDA0003977943680001172
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-30，
Figure BDA0003977943680001173
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-31，
Figure BDA0003977943680001174
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-32，
Figure BDA0003977943680001175
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-33，
Figure BDA0003977943680001181
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-34，
Figure BDA0003977943680001182
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-35，
Figure BDA0003977943680001183
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-36，
Figure BDA0003977943680001184
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-37，
Figure BDA0003977943680001185
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-38，
Figure BDA0003977943680001191
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-39，
Figure BDA0003977943680001192
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-40，
Figure BDA0003977943680001193
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-41，
Figure BDA0003977943680001194
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-42，
Figure BDA0003977943680001195
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-43，
Figure BDA0003977943680001201
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-44，
Figure BDA0003977943680001202
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-45，
Figure BDA0003977943680001203
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-46，
Figure BDA0003977943680001204
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-47，
Figure BDA0003977943680001205
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-48，
Figure BDA0003977943680001211
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-49，
Figure BDA0003977943680001212
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-50，
Figure BDA0003977943680001213
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-51，
Figure BDA0003977943680001214
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-52，
Figure BDA0003977943680001215
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-53，
Figure BDA0003977943680001221
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-54，
Figure BDA0003977943680001222
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-55，
Figure BDA0003977943680001223
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-56，
Figure BDA0003977943680001224
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-57，
Figure BDA0003977943680001225
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-58，
Figure BDA0003977943680001231
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-59，
Figure BDA0003977943680001232
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-60，
Figure BDA0003977943680001233
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-61，
Figure BDA0003977943680001234
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-62，
Figure BDA0003977943680001235
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-63，
Figure BDA0003977943680001241
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-64，
Figure BDA0003977943680001242
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-65，
Figure BDA0003977943680001243
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-66，
Figure BDA0003977943680001244
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-67，
Figure BDA0003977943680001245
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-68，
Figure BDA0003977943680001251
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-69，
Figure BDA0003977943680001252
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-70，
Figure BDA0003977943680001253
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-71，
Figure BDA0003977943680001254
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-72，
Figure BDA0003977943680001255
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-73，
Figure BDA0003977943680001261
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-74，
Figure BDA0003977943680001262
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-75，
Figure BDA0003977943680001263
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-76，
Figure BDA0003977943680001264
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-77，
Figure BDA0003977943680001265
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-78，
Figure BDA0003977943680001271
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-79，
Figure BDA0003977943680001272
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-80，
Figure BDA0003977943680001273
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-81，
Figure BDA0003977943680001274
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-82，
Figure BDA0003977943680001275
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-83，
Figure BDA0003977943680001281
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-84，
Figure BDA0003977943680001282
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-85，
Figure BDA0003977943680001283
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-86，
Figure BDA0003977943680001284
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-87，
Figure BDA0003977943680001285
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-88，
Figure BDA0003977943680001291
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-89，
Figure BDA0003977943680001292
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-90，
Figure BDA0003977943680001293
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-91，
Figure BDA0003977943680001294
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-92，
Figure BDA0003977943680001295
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-93，
Figure BDA0003977943680001301
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-94，
Figure BDA0003977943680001302
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-95，
Figure BDA0003977943680001303
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-96，
Figure BDA0003977943680001304
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-97，
Figure BDA0003977943680001305
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-98，
Figure BDA0003977943680001311
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-99，
Figure BDA0003977943680001312
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-100，
Figure BDA0003977943680001313
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-101，
Figure BDA0003977943680001314
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-102，
Figure BDA0003977943680001315
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-103，
Figure BDA0003977943680001321
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-104，
Figure BDA0003977943680001322
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-105，
Figure BDA0003977943680001323
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-106，
Figure BDA0003977943680001324
化合物45按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-DS，
Figure BDA0003977943680001325
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-107，
Figure BDA0003977943680001331
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-108，
Figure BDA0003977943680001332
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-109，
Figure BDA0003977943680001333
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-110，
Figure BDA0003977943680001334
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-111，
Figure BDA0003977943680001335
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-112，
Figure BDA0003977943680001341
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-113，
Figure BDA0003977943680001342
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-114，
Figure BDA0003977943680001343
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-115，
Figure BDA0003977943680001344
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-116，
Figure BDA0003977943680001345
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-117，
Figure BDA0003977943680001351
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-118，
Figure BDA0003977943680001352
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-119，
Figure BDA0003977943680001353
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-120，
Figure BDA0003977943680001354
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-121，
Figure BDA0003977943680001355
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-122，
Figure BDA0003977943680001361
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-123，
Figure BDA0003977943680001362
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-124，
Figure BDA0003977943680001363
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-125，
Figure BDA0003977943680001364
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-126，
Figure BDA0003977943680001365
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-127，
Figure BDA0003977943680001371
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-128，
Figure BDA0003977943680001372
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-129，
Figure BDA0003977943680001373
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-130，
Figure BDA0003977943680001374
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-131，
Figure BDA0003977943680001375
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-132，
Figure BDA0003977943680001381
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-133，
Figure BDA0003977943680001382
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-134，
Figure BDA0003977943680001383
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-135，
Figure BDA0003977943680001384
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-136，
Figure BDA0003977943680001385
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-137，
Figure BDA0003977943680001391
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-138，
Figure BDA0003977943680001392
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-139，
Figure BDA0003977943680001393
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-140，
Figure BDA0003977943680001394
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-141，
Figure BDA0003977943680001395
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-142，
Figure BDA0003977943680001401
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-143，
Figure BDA0003977943680001402
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-144，
Figure BDA0003977943680001403
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-145，
Figure BDA0003977943680001404
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-146，
Figure BDA0003977943680001405
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-147，
Figure BDA0003977943680001411
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-148，
Figure BDA0003977943680001412
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-149，
Figure BDA0003977943680001413
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-150，
Figure BDA0003977943680001414
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-151，
Figure BDA0003977943680001415
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-152，
Figure BDA0003977943680001421
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-153，
Figure BDA0003977943680001422
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-154，
Figure BDA0003977943680001423
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-155，
Figure BDA0003977943680001424
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-156，
Figure BDA0003977943680001425
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-157，
Figure BDA0003977943680001431
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-158，
Figure BDA0003977943680001432
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-159，
Figure BDA0003977943680001433
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-160，
Figure BDA0003977943680001434
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-161，
Figure BDA0003977943680001435
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-162，
Figure BDA0003977943680001441
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-163，
Figure BDA0003977943680001442
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-164，
Figure BDA0003977943680001443
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-165，
Figure BDA0003977943680001444
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-166，
Figure BDA0003977943680001445
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-167，
Figure BDA0003977943680001451
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-168，
Figure BDA0003977943680001452
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-169，
Figure BDA0003977943680001453
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-170，
Figure BDA0003977943680001454
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-171，
Figure BDA0003977943680001455
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-172，
Figure BDA0003977943680001461
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-173，
Figure BDA0003977943680001462
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-174，
Figure BDA0003977943680001463
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-175，
Figure BDA0003977943680001464
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-176，
Figure BDA0003977943680001465
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-177，
Figure BDA0003977943680001471
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-178，
Figure BDA0003977943680001472
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-179，
Figure BDA0003977943680001473
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-180，
Figure BDA0003977943680001474
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-181，
Figure BDA0003977943680001475
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-182，
Figure BDA0003977943680001481
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-183，
Figure BDA0003977943680001482
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-184，
Figure BDA0003977943680001483
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-185，
Figure BDA0003977943680001484
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-186，
Figure BDA0003977943680001485
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-187，
Figure BDA0003977943680001491
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-188，
Figure BDA0003977943680001492
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-189，
Figure BDA0003977943680001493
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-190，
Figure BDA0003977943680001494
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-191，
Figure BDA0003977943680001495
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-192，
Figure BDA0003977943680001501
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-193，
Figure BDA0003977943680001502
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-194，
Figure BDA0003977943680001503
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-195，
Figure BDA0003977943680001504
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-196，
Figure BDA0003977943680001505
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-197，
Figure BDA0003977943680001511
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-198，
Figure BDA0003977943680001512
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-199，
Figure BDA0003977943680001513
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-200，
Figure BDA0003977943680001514
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-201，
Figure BDA0003977943680001515
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-202，
Figure BDA0003977943680001521
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-203，
Figure BDA0003977943680001522
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-204，
Figure BDA0003977943680001523
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-205，
Figure BDA0003977943680001524
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-206，
Figure BDA0003977943680001525
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-207，
Figure BDA0003977943680001531
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-208，
Figure BDA0003977943680001532
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-209，
Figure BDA0003977943680001533
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-210，
Figure BDA0003977943680001534
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-211，
Figure BDA0003977943680001535
按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-212，
Figure BDA0003977943680001541
化合物45按照实施例92的通用偶联方法制备得到ADC-213，
Figure BDA0003977943680001542
化合物5A按照实施例92的通用偶联方法制备得到DS1062a，
Figure BDA0003977943680001543
其中TINA1抗体为靶向trop2的抗体，n选自4或8。
实施例309
使用SEC-HPLC方法测定单体率方法1：
色谱柱：Biocore SEC-300 5μm，4.6×300mm；
厂家：NanoChrom，货号：B213-050030-04630S；
流动相：50mM PB+300mM NaCl+200mM Arg+5％ IPA,pH＝6.5；
表1：方法参数
参数 设置
流速 0.3mL/min
波长 214nm和280nm
柱温 30℃
样品盘温度 室温
进样量 20ug
最大压力 150bar/15MPa/2175PSI
梯度 等度
运行时间 20分钟
使用SEC-HPLC方法测定单体率方法2：
色谱柱：ACQUITY UPLC Protein SEC 4.6x150mm 1.7μm
厂家：waters货号:186005225
流动相：50mM PB+300mM NaCl+200mM Arg+5％ IPA,pH＝6.5
表2：方法参数
流速 0.8mL/min
波长 214nm和280nm
柱温 30℃
梯度 等度
运行时间 12分钟
确认 方法参数确认
表3.本发明公开配体-药物偶联物(ADC)单体率数据
分子名称 降解％ 聚集体％ 单体率％
DS1062a(DAR＝4) 0.108 3.431 96.461
ADC-1 0 2.956 97.044
ADC-2 0 1.276 98.724
ADC-6 0 1.236 98.764
ADC-10 0 2.530 97.470
结论：本发明公开的ADC具有低降解率，低聚集率的特点，具有单体率高的优异性质。
实施例310
使用RP-HPLC方法测定药物抗体比例DAR：
色谱柱名称:Proteomix RP-1000 4.6×100mm 5μm 1000A；厂家：Sepax；
表4：方法参数
Figure BDA0003977943680001551
Figure BDA0003977943680001561
表5：ADC药物-抗体偶联比(DAR)详细数据
样品名 RP-DAR
DS1062a 4.13
ADC-1 7.62
ADC-2 7.51
ADC-12 7.54
ADC-6 7.38
ADC-10 7.62
ADC-70 7.52
ADC-72 7.39
ADC-73 6.95
ADC-176 7.54
ADC-178 7.37
ADC-179 6.75
结论：本发明公开的ADC具有DAR值高的优异性质，在相同剂量ADC药物的给药剂量下，可以显著提高靶点位置的药物浓度。
实施例311
ADC血浆稳定性数据：
配置ADC与去IgG的血浆混合液，使ADC的终浓度为0.6mg/mL，放置于37℃恒温箱中的水浴盒中孵育，孵育时间设置为0天，3天，7天，同时设置血浆未孵育对照。孵育后的样品经纯化提取后测定药物抗体比例DAR，用来反映ADC在血浆中的稳定性。
表6ADC药物的血浆稳定性
Figure BDA0003977943680001562
结论：本发明公开的ADC血浆稳定性较好，血浆孵育中未出现DAR值的大变化。而对照品DS-1062a在血浆孵育过程中DAR有显著的下降，血浆稳定性较差。
实施例312
ADC保持了对应的原始抗人Trop2抗体hu4D3和hu7F11对于TROP2的亲和力：
用双抗原夹心ELISA法对比hu4D3与ADC-6，ADC10，ADC12；TINA1与ADC-1和DS1062a对于TROP2的相对亲和力。
具体步骤如下：
重组TROP2-His*6抗原包板，1％牛血清蛋白封闭后；分别稀释hu4D3和对应的ADC及TINA1和对应的ADC，分别再以起始浓度2000 ng/mL，连续3倍梯度稀释，共11个浓度；样品在包被过的酶标板上孵育一段时间后，再加入羊抗人Fc-HRP标记的二抗孵育；最后进行TMB显色，硫酸溶液终止，在酶标仪上检测450 nm处的吸光值。检测结果以0D450 nm对浓度作图。
结论：如附图3A～3F显示，偶联后的ADC与对应的抗体保持了相似的亲和力，EC50值无显著差异；说明hu4D3偶联毒素后，不影响其与抗原的亲和力。
实施例313
体外药效检测：
本发明中利用人源肿瘤细胞株(BxPC-3)作为实验模型，以评价ADC偶联药物的体外药效。接种一定数目的肿瘤细胞系于96孔板中，向细胞中加入梯度稀释的受试抗体及对应的ADC药物，处理5天，利用MTS检测细胞活力，通过计算IC50评价受试抗体及ADC对肿瘤细胞系的体外抑制效果。抗体药物起始浓度为500 nM，稀释倍数为7倍，共8个浓度点，处理5天。最终算法按照存活率＝(实验组-空白)/(对照组-空白组)×100％，随后利用Graph PadPrism拟合曲线，计算半数抑制浓度(IC50)。
表7：受试物Hu4D3裸抗与ADC-2、ADC-12、ADC-6、ADC-10,TINA1裸抗与DS1062a在人源肿瘤细胞株BxPC-3中的体外药效结果：
Figure BDA0003977943680001571
结论：如表7及附图4所示，在BxPC-3细胞中，裸抗TINA1与hu4D3均未见明显的肿瘤细胞杀伤活性；本发明的ADC-2、ADC-6、ADC-10及ADC-12相较于DS1062a的体外杀伤活性明显更强。
实施例314
体内药效检测：
本发明中利用BALB/c裸鼠皮下接种多种人源肿瘤细胞株(BXPC3，A431+SW620)作为实验模型，以评价ADC偶联药物的体内药效。接种一定数目的肿瘤细胞系于BALB/c裸鼠皮下中，当肿瘤体积长至150-300mm3时，尾静脉注射抗体及对应的ADC药物，每周一次，给药四次，持续观察，每周两次测瘤，评价受试抗体及ADC对肿瘤细胞系的抑制效果。
结论：
在TROP2中高表达细胞株BXPC3的荷瘤小鼠药效实验中，ADC-6、ADC-10、ADC-12体内药效实验结果优于DS1062a。
在A431+SW620异质瘤中，ADC-6和ADC-12体内药效实验结果优于DS1062a，具有很好的“旁观者效应”(bystander effect).
实施例315
Linker-drug化合物5A的体外药效：
1)实验材料：
细胞：测试用细胞来源于中国科学院细胞库；
细胞培养基DMEM：Gibco；
FBS：BIOWEST。
2)培养基的配制：
生长培养基(with 10％FBS,Penicillin/streptomycin(100U/mL)；
检测培养基(with 1％FBS,Penicillin/streptomycin(100U/mL)。
3)操作：
提前30min开启生物安全柜紫外灯照射，然后后开通风3min。将生长培养基、检测培养基、D-PBS和胰酶放入37℃恒温水浴锅里预热，之后用酒精对表面进行消毒，放入生物安全柜中。将汇合率在80％左右的细胞放于生物安全柜中，吸掉旧培养基，用D-PBS润洗，吸弃，用胰酶消化2～3min，后加入生长培养基中和，1200rpm离心3min。吸去离心上清，用4mL检测培养基混匀，取100uL计数(其中取出50uL细胞液，加入50uL Trypan Blue Stain并混匀，混匀后计数)。按照预先优化好的细胞铺板密度铺板，80ul/孔铺于96孔板中，孔E11、F11只加80uL检测培养基，边缘孔加入150uL的DPBS。铺板24h后加入稀释抗体，每孔20uL和设置对照，第11列只加入20uL的检测培养基，每个浓度设置2个复孔，加入后于细胞涡旋震荡器上混匀，550rpm，3min。
溶液的稀释：用检测培养基在V型96孔板第一列中配制起始浓度为5uM，300uL的供试品溶液，后面第2到10列分别加入240uL的检测培养基，从混匀的第一列中取60uL加入到第二列，用排枪上下混匀10次，弃枪头，后面7个浓度依次操作。
4)检测：
4天后取出MTS试剂，常温避光解冻后，充分涡旋混匀后，在生物安全柜中，沿孔侧壁按每100μL细胞培养体积加入20μL CellTiter One Solution Reagen MTS试剂，轻轻拍动板面，使MTS溶液混合均匀后，放于细胞培养箱中避光静置孵育2h。反应结束后，取出96孔板，于酶标仪中检测OD490 nm吸光值，并进行数据记录、整理、分析和存储。
5)结果：
表8化合物5A对人非小细胞肺腺癌细胞H1975、人非小细胞肺癌细胞HCC827、人表皮癌细胞A431、人胃癌细胞NCI-N87、人原位胰腺腺癌细胞BXPC-3、人表皮癌细胞A431+人结肠癌细胞SW620、人乳腺癌细胞ZR-75-1、人浆细胞白血病细胞H929、人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226、人白血病细胞JJN-3、人乳腺癌细胞MDA-MB-361、人乳腺癌细胞SK-BR-3的体外抑制效果
Figure BDA0003977943680001581
Figure BDA0003977943680001591
表8说明化合物5A(Linker-drug)对以下实体瘤细胞和血液瘤细胞均具有良好的抑制作用。
实施例316
裸抗及化合物d3、d38、d39及d44的体外药效实验：
1)实验材料
细胞：N87,SW620,SW620+A431,Fadu,HCC827来源于中国科学院细胞库；
细胞培养基DMEM：Gibco；
FBS：BIOWEST。
2)培养基的配制
生长培养基(with 10％FBS,Penicillin/streptomycin(100U/mL)；
检测培养基(with 1％FBS,Penicillin/streptomycin(100U/mL)。
3)操作
在96孔板中，使用适当的细胞密度进行铺板，24小时后，进行药物加药。24小时后用检测培养基稀释药物(1uM起始，5倍稀释，9个浓度，第十列添加检测培养基用来作为空白对照)，将稀释好的药物加入对应的细胞孔中然后用微孔板震荡器(型号：MX100-4A)震荡3min，震速550rpm/min，震荡完放入二氧化碳培养箱孵育3天。
4)检测
4天后取出MTS试剂，常温避光解冻后，充分涡旋混匀后，在生物安全柜中，沿孔侧壁按每100μL细胞培养体积加入20μL CellTiter One Solution Reagen MTS试剂，轻轻拍动板面，使MTS溶液混合均匀后，放于细胞培养箱中避光静置孵育2h。反应结束后，取出96孔板，于酶标仪中检测OD490 nm吸光值，并进行数据记录、整理、分析和存储。
5)结果
表9裸抗及化合物d3、d38、d39及d44的体外药效实验
Figure BDA0003977943680001592
Figure BDA0003977943680001601
结论：如表9和附图6A-6E所示，本发明的小分子药物在多种人源肿瘤细胞株(N87、SW620、Fadu、HCC827)以及SW620+A431异质瘤的实验模型中均表现出优异的肿瘤抑制体外活性。
实施例317
抗体-药物偶联物(ADC)的体外药效检测：
利用多种人源肿瘤细胞株(N87、SW620、Fadu、HCC827)以及SW620+A431异质瘤的实验模型评价ADC偶联药物的体外药效。
接种一定数目的肿瘤细胞于96孔板中，向细胞中加入梯度稀释的受试抗体及对应的ADC药物，处理5天，利用Alamar Blue或MTS检测细胞活力，通过计算IC50评价受试ADC对肿瘤细胞系的抑制效果。抗体药物起始浓度为500nM，稀释倍数为7倍，共8个浓度点，处理5天。最终算法按照存活率＝(实验组-空白)/(对照组-空白组)×100％，随后利用Graph PadPrism拟合曲线，计算半数抑制浓度(IC50)。结果见表10和附图7A-7E。
表10抗体-药物偶联物(ADC)的体外药效检测：
Figure BDA0003977943680001602
结论：本发明制备的抗体-药物偶联物在多种人源肿瘤细胞株(N87、SW620、Fadu、HCC827)以及SW620+A431异质瘤的实验模型中均表现出优异的肿瘤抑制活性。SW620+A431异质瘤的实验数据表明本发明制备的抗体-药物偶联物能够较好的发挥旁观者效应。

Claims (38)

1.一种如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
Figure FDA0003977943670000011
其中：
Ab为靶向人Trop2的抗体或其抗原结合片段；
L1非限制性地选自：
Figure FDA0003977943670000012
优选L1为
Figure FDA0003977943670000013
优选L1为
Figure FDA0003977943670000014
L2具有如下式A所示的结构，
Figure FDA0003977943670000015
其中Y为支架，选自C1-C6烷基、取代C1-C6烷基或C3-C8环烷基；优选Y为C1-C6烷基；Ac为亲水结构单元；与Y相连的2号碳具有R构型或S构型的绝对手性；
L3存在或者不存在，当存在时，L3选自PEG亲水单元：
Figure FDA0003977943670000016
o选自1-10的整数，优选2-8的整数；
L4为酶切单元；
L5为连接单元；
式I中与N相连的1号手性碳原子具有R构型或者S构型的绝对手性；
R选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R选自氢原子或C1-C6烷基；
R1选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羧基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R1选自氢原子或C1-C6烷基；
更优选R1选自C1-C6烷基；
R2选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羧基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R2选自氢原子、卤素或C1-C6烷基；
更优选R2选自卤素；
X选自-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-O-、-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-NH-或-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-S-；
优选X选自-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-O-；
Ra和Rb各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C6-C10芳基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选Ra和Rb各自独立地选自氢原子、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基或C6-C10芳基C1-C6烷基；
或者，Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；优选Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基；
R3、R4相同或者不同，且分别独立地为氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、氨基、氰基、硝基、羟C1-C6烷基、C3-C8环烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；
优选R3、R4分别独立地为氢原子或C1-C6烷基；
或者，R3、R4及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；
m选自0-4的整数，优选为0、1；n选自1-10的整数。
2.根据权利要求1所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab为靶向人Trop2抗体或其抗原结合片段。
3.根据权利要求1或2所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体包含：IgG1重链，κ轻链，所述IgG1重链和κ轻链所组成的抗体特异性识别人TROP2蛋白。
4.根据权利要求1-3任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，其特征在于，Ab的抗体的κ轻链包含如SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示的CDR，IgG1重链包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的CDR。
5.根据权利要求1-4任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体由重链和轻链组成，所述的轻链包含核酸编码序列分别为SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29的CDRL1、CDRL2和CDRL3，所述的重链包含核酸编码序列分别为SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的CDRH1、CDRH2和CDRH3。
6.根据权利要求1-5任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体由重链和轻链组成，所述的重链包含序列为SEQ ID NO：13的重链可变区，所述的轻链包含序列为SEQ ID NO：14的轻链可变区。
7.根据权利要求1-6任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体由重链和轻链组成，所述的重链可变区包含核酸编码序列为SEQ ID NO：33的重链可变区，所述的轻链可变区包含核酸编码序列为SEQ ID NO：34的轻链可变区。
8.根据权利要求1-7任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体重链氨基酸序列为SEQ ID NO：17，抗体轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：18。
9.根据权利要求1-8任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体重链核酸编码序列为SEQ ID NO：37，抗体轻链的核酸编码序列为SEQ ID NO：38。
10.根据权利要求1-3任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体的κ轻链包含如SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12所示的CDR，IgG1重链包含如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的CDR。
11.根据权利要求1-3、10任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体的κ轻链包含核酸编码序列分别为SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的CDRL1、CDRL2和CDRL3，Ab的抗体的重链包含核酸编码序列分别为SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的CDRH1、CDRH2和CDRH3。
12.根据权利要求1-3、10-11任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体由重链和轻链组成，所述的重链包含序列为SEQ ID NO：15的重链可变区，所述的轻链包含序列为SEQ ID NO：16的轻链可变区。
13.根据权利要求1-3、10-12任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体由重链和轻链组成，所述的重链可变区包含核酸编码序列为SEQ ID NO：35的重链可变区，所述的轻链可变区包含核酸编码序列为SEQ ID NO：36的轻链可变区。
14.根据权利要求1-3、10-13任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体重链氨基酸序列为SEQ ID NO：19，抗体轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：20。
15.根据权利要求1-3、10-14任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，Ab的抗体重链核酸编码序列为SEQ IDNO：39，抗体轻链的核酸编码序列为SEQ ID NO：40。
16.根据权利要求1-15中任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，所述X非限制性地选自以下结构或其异构体：
Figure FDA0003977943670000041
其中左侧波浪线与喜树碱衍生物部分相连，右侧波浪线与L5相连。
17.根据权利要求1-16中任一项所述如通式Ⅰ所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：L4非限制性地选自由氨基酸构成的肽残基，
其中任选地，所述氨基酸进一步被选自氘原子、卤素、羟基、氰基、氨基、硝基、羧基、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基和C3-C8环烷基或者取代C3-C8环烷基中的一个或多个取代基所取代；
优选地，所述肽残基为由一个、两个或者多个选自苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、赖氨酸(K)、瓜氨酸(C)、丝氨酸(S)、谷氨酸(E)或者天冬氨酸(D)中的氨基酸形成的肽残基；
更优选地，所述肽残基为由甘氨酸(G)-甘氨酸(G)-苯丙氨酸(F)-甘氨酸(G)组成的四肽残基。
18.根据权利要求1-17中任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：
L5非限制性地选自-NR5(CR6R7)q-或者化学键，q选自0-6的整数；
R5、R6和R7相同或者不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选地，R5、R6和R7各自独立地选自氢原子或C1-C6烷基；
更优选地，R5、R6和R7各自独立地选自氢原子。
19.根据权利要求1-18中任一项所述如通式I所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述连接单元-L1-L2-L3-L4-L5-非限制性地选自以下结构；
Figure FDA0003977943670000042
Figure FDA0003977943670000051
优选为
Figure FDA0003977943670000052
其中：
Ac为亲水结构单元；
R5、R6和R7相同或者不同，且各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选地，R5、R6和R7各自独立地选自氢原子或C1-C6烷基；
更优选地，R5、R6和R7各自独立地选自氢原子；
与N相连的2号碳原子具有R构型或者S构型的绝对手性；
左侧波浪线与抗体或其抗原结合片段部分相连，右侧波浪线与X相连；
o选自1-10的整数。
20.一种如通式Ⅱ所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物；
Figure FDA0003977943670000061
其中：
Ab为靶向人Trop2的抗体或其抗原结合片段；
L1为连接单元与Ab连接，非限制性地选自：
Figure FDA0003977943670000062
L1优选为
Figure FDA0003977943670000063
优选L1为
Figure FDA0003977943670000064
L3存在或者不存在，当L3存在时，L3选自
Figure FDA0003977943670000065
o选自1-10的整数，优选2-8的整数；
Ac为亲水结构单元；
1位、2位及3位手性碳原子具有R绝对构型或S绝对构型两种手性构型；
R选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R选自氢原子或C1-C6烷基；
R1选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羧基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R1选自氢原子或C1-C6烷基；
更优选R1选自C1-C6烷基；
R2选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羧基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R2选自氢原子、卤素或C1-C6烷基；
更优选R2选自卤素；
X选自-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-O-、-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-NH-或-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-S-；
优选X选自-C(O)-CRaRb-(CR3R4)m-O-；
Ra和Rb各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基或5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选Ra和Rb各自独立地选自氢原子、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基或C6-C10芳基C1-C6烷基；
或者，Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；优选Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基；
R3、R4相同或者不同，且分别独立地为氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羟基、氨基、氰基、硝基、羟C1-C6烷基、C3-C8环烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；
优选R3、R4，分别独立地为氢原子或C1-C6烷基；
或者，R3、R4及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基或3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；
m选自0-4的整数，优选为0、1；
n选自1-10的整数。
21.如权利要求1-20任一项中所述的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述Ac具有如下式B所示结构，
Figure FDA0003977943670000071
其中：
Z非限制性地选自亲水结构羧基、磷酸、聚磷酸、亚磷酸、磺酸、亚磺酸或聚乙二醇(PEG)中的一种或多种所组成的组；
优选Z选自亲水结构羧基、磷酸或聚乙二醇(PEG)；
Y’为任选的连接氨基和Z的支架；优选Y’为C1-C6烷基；
Ac通过支架Y与结构式I中已标示的2位碳相连。
22.如权利要求1-21中任一项所述的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述Ac非限制性地选自甘氨酸、(D/L)丙氨酸、(D/L)亮氨酸、(D/L)异亮氨酸、(D/L)缬氨酸、(D/L)苯丙氨酸、(D/L)脯氨酸、(D/L)色氨酸、(D/L)丝氨酸、(D/L)酪氨酸、(D/L)半胱氨酸、(D/L)胱氨酸、(D/L)精氨酸、(D/L)组氨酸、(D/L)蛋氨酸、(D/L)天冬酰胺、(D/L)谷氨酰胺、(D/L)苏氨酸、(D/L)天冬氨酸、(D/L)谷氨酸、天然或非天然氨基酸衍生物或以下结构或其异构体，
Figure FDA0003977943670000081
优选
Figure FDA0003977943670000082
23.根据权利要求1-22中任一项所述配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述Ac非限制性地选自甘氨酸、磷酸、(D/L)谷氨酸或聚乙二醇亲水结构。
24.根据权利要求1-23中任一项所述配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述
Figure FDA0003977943670000083
具有如下式d所示的结构；
Figure FDA0003977943670000084
其中：
R选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R选自氢原子或C1-C6烷基；
R1选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羧基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R1选自氢原子或C1-C6烷基；
更优选R1选自C1-C6烷基；
R2选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、羧基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选R2选自氢原子、卤素或C1-C6烷基；
更优选R2选自卤素；
Ra和Rb各自独立地选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
优选Ra和Rb各自独立地选自氢原子、C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C6-C10芳基；
或者，Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；优选Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基；
1位手性碳原子具有R绝对构型或S绝对构型两种手性构型；
m选自0或1。
25.如权利要求1-24中任一项所述配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述结构式d非限制性的选自以下化合物；
Figure FDA0003977943670000091
Figure FDA0003977943670000101
26.一种连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：具有如下式Ⅲ所示的结构，
Figure FDA0003977943670000111
其中：
R选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
Ra选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
Rb选自氢原子、氘原子、卤素、C1-C6烷基、氘代C1-C6烷基、卤代C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基、C6-C10芳基、取代C6-C10芳基、5-10元杂芳基、取代5-10元杂芳基；
或者，Ra、Rb及其所连接碳原子构成C3-C8环烷基、C3-C8环烷基C1-C6烷基、3-7元杂环基、取代3-7元杂环基；
L3存在或者不存在，当L3存在时，选自
Figure FDA0003977943670000112
o选自1-10的整数；
1位或2位手性碳原子具有R绝对构型或S绝对构型两种手性；
Ac为亲水结构单元；
m选自0或1；
优选地，所述连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物用于与配体Ab偶联形成权利要求1-25中任一项所述式I或式Ⅱ的配体-喜树碱类衍生物偶联物。
27.根据权利要求26所述的连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述Ac具有如下式B所示结构，
Figure FDA0003977943670000113
其中：
Z非限制性地选自亲水结构羧基、磷酸、聚磷酸、亚磷酸、磺酸、亚磺酸或聚乙二醇(PEG)中的一种或多种所组成的组；
Y’为任选的连接氨基和Z的支架；
Ac通过支架Y与结构式I中已标示的2位碳相连。
28.如权利要求26或27中任一项所述的连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述Ac非限制性地选自甘氨酸、(D/L)丙氨酸、(D/L)亮氨酸、(D/L)异亮氨酸、(D/L)缬氨酸、(D/L)苯丙氨酸、(D/L)脯氨酸、(D/L)色氨酸、(D/L)丝氨酸、(D/L)酪氨酸、(D/L)半胱氨酸、(D/L)胱氨酸、(D/L)精氨酸、(D/L)组氨酸、(D/L)蛋氨酸、(D/L)天冬酰胺、(D/L)谷氨酰胺、(D/L)苏氨酸、(D/L)天冬氨酸、(D/L)谷氨酸、天然或非天然氨基酸衍生物或以下结构，
Figure FDA0003977943670000121
29.如权利要求26-28中任一项所述连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：Ac非限制性地选自甘氨酸、磷酸、(D/L)谷氨酸或聚乙二醇亲水结构。
30.如权利要求26-29中任一项所述连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在在于：所述连接子-药物化合物非限制性地选自以下结构或其异构体，
Figure FDA0003977943670000122
Figure FDA0003977943670000131
Figure FDA0003977943670000141
Figure FDA0003977943670000151
Figure FDA0003977943670000161
其中：o选自1-10的整数。
31.一种制备如通式Ⅰ或通式Ⅱ所示的配体-喜树碱类衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的方法，其特征在于：包含以下步骤，
Figure FDA0003977943670000162
通过还原的抗体或者其抗原结合片段与连接子-药物化合物偶联反应，得到如通式Ⅰ或通式Ⅱ所示配体-喜树碱类衍生物偶联物；
1位、2位或3位手性碳原子具有R构型或S构型的绝对手性；
Ab、L1、L2、L3、L4、L5、X、R、R1、R2及n如权利要求1-30任一项中所述。
32.根据权利要求1-25中任一项所述配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或权利要求31所述的方法，其特征在于：所述配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物非限制性地选自以下结构或其丁二酰亚胺开环结构或其异构体，
Figure FDA0003977943670000171
Figure FDA0003977943670000181
Figure FDA0003977943670000191
Figure FDA0003977943670000201
Figure FDA0003977943670000211
Figure FDA0003977943670000221
Figure FDA0003977943670000231
Figure FDA0003977943670000241
Figure FDA0003977943670000251
Figure FDA0003977943670000261
Figure FDA0003977943670000271
其中：
hu4D3为靶向人Trop2的抗体或其抗原结合片段；
n选自1-10的整数。
33.如权利要求1-25中任一项所述配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或权利要求31所述的方法，其特征在于：所述配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物非限制性地选自以下结构或其丁二酰亚胺开环结构或其异构体，
Figure FDA0003977943670000272
Figure FDA0003977943670000281
Figure FDA0003977943670000291
Figure FDA0003977943670000301
Figure FDA0003977943670000311
Figure FDA0003977943670000321
Figure FDA0003977943670000331
Figure FDA0003977943670000341
Figure FDA0003977943670000351
Figure FDA0003977943670000361
Figure FDA0003977943670000371
其中：
hu7F11为靶向人Trop2的抗体或其抗原结合片段；
n选自1-10的整数。
34.根据权利要求1-25或32-33中任一项所述配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或根据权利要求26-30中任一项所述连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于：所述药学上可接受的盐包括与结构式中酸性官能团形成的钠盐、钾盐、钙盐或镁盐以及与结构中碱性官能团形成的醋酸盐、三氟乙酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、硝酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、乳酸盐、油酸盐、抗坏血酸盐、水杨酸盐、甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐或对甲苯磺酸盐。
35.一种药物组合物，其包含权利要求1-25或32-33中任一项所述配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或权利要求26-30中任一项所述连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及任选的药学上可接受的载体。
36.一种药物制剂，其包含权利要求1-25或32-33中任一项所述配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或权利要求26-30中任一项所述连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
37.权利要求1-25或32-33中任一项所述配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或权利要求26-32中任一项所述连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，或权利要求35所述的药物组合物和/或权利要求36所述的药物制剂，在制备用于治疗或预防癌症或者肿瘤的药物中的用途；
或者，权利要求1-25或32-33中任一项所述配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或权利要求26-30中任一项所述连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，或权利要求34所述的药物组合物和/或权利要求36所述的药物制剂，用于治疗或预防癌症或者肿瘤；
优选地，癌症或者肿瘤表达有TROP2；
更优选地，癌症或者肿瘤选自腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、肺癌、结肠癌、三阴乳腺癌、直肠癌、结直肠癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、多形性胶质细胞瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病等实体瘤或血液瘤。
38.一种治疗或预防癌症或者肿瘤的方法，包括向有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的权利要求1-25或32-33中任一项所述配体-喜树碱衍生物偶联物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或权利要求26-30中任一项所述连接子-药物化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，或权利要求35所述的药物组合物和/或权利要求36所述的药物制剂；
优选地，癌症或者肿瘤表达有TROP2；
更优选地，癌症或者肿瘤选自腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肾癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、食道癌、肺癌、结肠癌、三阴乳腺癌、直肠癌、结直肠癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、多形性胶质细胞瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病等实体瘤或血液瘤。
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