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CN116212038A - 一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米dna疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米dna疫苗及其制备方法 Download PDF

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CN116212038A CN202310017590.8A CN202310017590A CN116212038A CN 116212038 A CN116212038 A CN 116212038A CN 202310017590 A CN202310017590 A CN 202310017590A CN 116212038 A CN116212038 A CN 116212038A
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Abstract

本发明提供了一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗及其制备方法，制备原料包括质粒、4‑(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺、细胞集落刺激因子、巯基改性的透明质酸和四臂‑马来酰亚胺接枝的聚乙二醇。该纳米DNA疫苗经皮下给药后能够大量招募免疫细胞形成透明质酸人造淋巴结，通过持续输出抗原呈递细胞和抗原特异性T细胞抑制肿瘤的产生。此外，透明质酸人造淋巴结还可以缓释纳米DNA疫苗，延长疫苗刺激时间，改善现有DNA疫苗普遍免疫原性不强的问题，也能够解决生物相容性的问题。该纳米DNA疫苗具有易于制备、易于储存、价格低廉等优点。

Description

一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA 疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料和肿瘤基因疫苗技术领域，尤其涉及一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗及其制备方法。
背景技术
DNA疫苗由于能够激发癌症的体液和细胞免疫，在肿瘤免疫治疗领域被人们广泛探索。(参见Nguyen,T.L.,Yin,Y.,Choi,Y.,Jeong,J.H.,Kim,J.,ACS Nano 2020,14(9),11623-11636.)并且，DNA疫苗具有较好的稳定性，易于储存和递送。但是，DNA疫苗普遍免疫原性较差，制备一种有持续免疫反应效力的DNA疫苗仍然是领域中具有挑战性的难题。
近年来，三维生物材料被证明能够提高疫苗和其他一些免疫疗法的有效性，实现对宿主细胞群的调节。介孔二氧化硅可注射生物支架在体内调节宿主免疫细胞以及作为激发适应性免疫反应的疫苗平台已经进入临床一期，可见其有较好的发展前景。(参见Kim,J.,Li,W.A.,Choi,Y.,Lewin,S.A.,Verbeke,C.S.；Dranoff,G.；Mooney,D.J.,NatBiotechnol 2015,33(1),64-72.)但是介孔二氧化硅是一种生物相容性有争议的，体内降解性差的无机材料，限制了其应用和未来市场，因此我们迫切需要用生物相容性好的材料对其进行替代。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗及其制备方法，该DNA疫苗经皮下给药后能够大量招募免疫细胞形成透明质酸人造淋巴结，通过持续输出抗原呈递细胞和抗原特异性T细胞抑制肿瘤的产生。
本发明提供了一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗，制备原料包括质粒、4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺、细胞集落刺激因子、巯基改性的透明质酸和四臂-马来酰亚胺接枝的聚乙二醇。
在本发明中，所述质粒与4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺的质量比为1：(1.25～5)，优选为1：(1.25～2.5)；所述质粒和4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺”所制备的纳米DNA疫苗的总质量与“巯基改性的透明质酸”的质量比为1：(40～100)，优选为1：(50～100)，更优选为1：(80～100)；所述细胞集落刺激因子与四臂-马来酰亚胺接枝的聚乙二醇的质量比为1：(50～100)，优选为1：(80～100)。
在本发明中，所述4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺的分子量为22000～27000Da；具体实施例中，所述4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺的分子量为25000Da。所述巯基改性的透明质酸的分子量为1200000～1300000Da；具体实施例中，所述巯基改性的透明质酸的分子量为1300000Da。所述四臂-马来酰亚胺接枝的聚乙二醇的分子量为20000～2500Da。
在本发明中，所述质粒选自鸡卵清蛋白编码质粒和/或黑色素瘤相关抗原编码质粒。
在本发明中，所述鸡卵清蛋白编码质粒的碱基数为6711bp；所述黑色素瘤相关抗原编码质粒的碱基数为6745bp。
本发明提供了一种上述技术方案所述增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：
将质粒、4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺与水混合，形成纳米DNA疫苗，然后与巯基改性的透明质酸溶液混合，得到溶液A；
将细胞集落刺激因子和四臂-马来酰亚胺接枝的聚乙二醇中混合，得到溶液B；
将所述溶液A和溶液B混合形成凝胶，得到增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗。
在本发明中，所述纳米DNA疫苗与巯基改性的透明质酸的质量比优选为1：(50～100)，更优选为1：(80～100)；
在本发明中，所述质粒、4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺与水混合的时间为8～15min，优选为8～10min；所述溶液A和溶液B混合的时间为10～40s，优选为30～40s。
本发明按照以下方法对纳米DNA疫苗进行性能测试：
1)细胞培养：在本发明中，选用B16-OVA细胞系，所述细胞培养方法按照通用方法，无特殊限制。培养基优选为含12％胎牛血清的DMEM培养基(无丙酮酸钠)，所述培养条件优选在二氧化碳体积分数为5％，温度为37℃的培养箱中；
2)细胞毒性：细胞毒性评价选用293T细胞系。将细胞按照每孔8×103的密度种于96孔板中，培养过夜。不同浓度的材料与细胞共培养24h后，每孔加入20μL的CCK-8溶液，继续培养1h。酶标仪震荡5min，通过酶标仪检测每孔在450nm和610nm下吸光度值。并通过以下公式计算细胞存活率。
细胞存活率(％)＝(A样品/A空白)×100；
3)细胞水平转染性能：选用Hela细胞系、荧光素酶质粒来评价材料对DNA的转染能力：将上述培养的细胞按照每孔1×104的密度种植于96孔板中，200μL培养液培养过夜；将实施例6制备纳米DNA疫苗的4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺材料与各质粒以不同的比例混合后(荧光素酶质粒与DNA的比例分别是1/1.25、1/1.25和1/5)，与细胞培养48h。对于用荧光素酶质粒来验证转染效果的方案，吸出培养基，加入细胞裂解液(用于裂解细胞，释放荧光素酶)和荧光素酶底物(用于检测荧光素酶的表达量，荧光素酶能够催化荧光素产生荧光)，荧光仪测量荧光强度；
4)肿瘤预防动物模型：选用B16-OVA肿瘤模型，并选用20g左右的C57BL/6小白鼠。将增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗接种在小鼠背后，一周后，在小鼠右后肢外侧皮下接种密度为1×106的B16-OVA细胞，跟踪瘤体积大小，实验结束后通过流式细胞术对肿瘤内、淋巴结内、脾脏内、透明酸人造淋巴结内免疫细胞进行检测。
本发明提供了一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗，制备原料包括质粒、4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺、细胞集落刺激因子、巯基改性的透明质酸和四臂-马来酰亚胺接枝的聚乙二醇。该纳米DNA疫苗经皮下给药后能够大量招募免疫细胞形成透明质酸人造淋巴结，通过持续输出抗原呈递细胞和抗原特异性T细胞抑制肿瘤的产生。此外，透明质酸人造淋巴结还可以缓释纳米DNA疫苗，延长疫苗刺激时间，改善现有DNA疫苗普遍免疫原性不强的问题，也能够解决生物相容性的问题。该纳米DNA疫苗具有易于制备、易于储存、价格低廉等优点。
附图说明
图1为本发明实施例6中得到的质粒与4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺纳米DNA疫苗的扫描电镜图；
图2为本发明实施例24中得到的增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗细胞毒性；
图3为本发明实施例30中得到的纳米DNA疫苗的基因递送能力测试结果；
图4为增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗与其它对照组在脾脏内的效果测试；
图5为增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗与其它对照组在淋巴结内的效果测试；
图6为增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗与其它对照组在肿瘤内的效果测试；
图7为透明酸人造淋巴结内招募树突状细胞和巨噬细胞效果测试；
图8为透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗与其它对照组肿瘤治疗效果测试。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗及其制备方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
首先将质粒与4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺先进行作用，形成纳米DNA疫苗，然后将纳米DNA疫苗与巯基改性的透明质酸混合形成溶液A。
其中，质粒、4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺与巯基改性的透明质酸的用量见表1。
表1实施例1～16中质粒与材料质量比和复合时间
Figure BDA0004041116270000051
Figure BDA0004041116270000061
按照实施例6，制备出溶液A，利用扫描电镜对实施例6中得到的纳米DNA疫苗进行分析，得到扫描电镜图片，如图1所示，结果表明，实施例6制备出的质粒/苯基硼酸改性聚乙烯亚胺纳米DNA疫苗平均大小在80～100nm之间。
实施例17～28
按照实施例6，制备出的质粒/苯基硼酸改性聚乙烯亚胺纳米DNA疫苗，与巯基改性的透明质酸混合形成溶液A；然后将细胞集落刺激因子加入到四臂-马来酰亚胺接枝的聚乙二醇中混合均匀形成溶液B；最后将溶液A与溶液B混合，在极短时间内得到透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗。其中，细胞集落刺激因子和四臂-马来酰亚胺接枝的聚乙二醇的用量、溶液A和溶液B的用量及复合时间见表2。
表2实施例17～28不同原料的比例及溶液复合时间
Figure BDA0004041116270000071
按照实施例24，制备出一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗。
实施例29
将293T细胞按照每孔8×103的密度种于96孔板中，培养过夜。不同浓度的实施例24到的纳米DNA疫苗与细胞共培养24h后，每孔加入20μL的CCK-8溶液，继续孵育1h。通过酶标仪检测每孔在450nm和610nm下吸光度值。计算细胞存活率。实验结果表明，如图2所示，实施例24得到的纳米DNA疫苗在1μg/mL的浓度下几乎没有影响到细胞存活率，这也是一般细胞和动物实验使用浓度。并且在20μg/mL的极高浓度下细胞存活率也能达到50％，证明了实施例24得到的纳米DNA疫苗有较好的生物相容性。
实施例30
选用Hela细胞系、荧光素酶质粒来评价材料对DNA的转染能力：将上述培养的细胞按照每孔1×104的密度种植于96孔板中，200μL培养液培养过夜；将实施例6制备纳米DNA疫苗的4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺材料与各质粒以不同的比例混合后(荧光素酶质粒与DNA的比例分别是1/1.25、1/1.25和1/5)，与细胞培养48h。对于用荧光素酶质粒来验证转染效果的方案，吸出培养基，加入细胞裂解液(用于裂解细胞，释放荧光素酶)和荧光素酶底物(用于检测荧光素酶的表达量，荧光素酶能够催化荧光素产生荧光)，荧光仪测量荧光强度。之后在Hela细胞中检测得到的DNA转染数据如图3所示，结果显示，相较于阳性对照PEI25K，本发明实施例制备的纳米DNA疫苗转染Hela细胞系后能够表达等量甚至更多的荧光素酶，证明本发明实施例制备的纳米DNA疫苗能够具有良好的DNA转染能力。
实施例31
选用B16-OVA肿瘤模型，并选用20g左右的C57BL/6小白鼠。将实施例18的增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗接种在小鼠背后，一周后，在小鼠右后肢外侧皮下接种密度为1×106的B16-OVA细胞，跟踪瘤体积大小，实验结束后通过流式细胞术对肿瘤内、透明酸人造淋巴结内免疫细胞进行检测。
实验结果表明，按照实施例18制备出一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗在体内动物实验中与其它对照组相比，其CD8+T细胞在实验动物脾脏内占比上调近5％、淋巴结内占比上调近10％和肿瘤内占比上调近20％，CD8+T细胞数量占比的上调标志着实验动物机体产生了强劲的抗肿瘤免疫效应；另外，其脾脏内、淋巴结内和肿瘤内CD4+T细胞、效应记忆T细胞和M1型巨噬细胞也有明显上调，上调幅度均在10％左右。透明酸人造淋巴结内同样招募大量树突状细胞和巨噬细胞，其中树突状细胞占比约20％，巨噬细胞占比约30％。因此，实施例18得到的增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗具有较好的肿瘤预防效果，细胞集落刺激因子与四臂-马来酰亚胺接枝的聚乙二醇的质量比仅稍微影响了透明酸人造淋巴结细胞招募的能力。
实施例32
选用B16-OVA肿瘤模型，并选用20g左右的C57BL/6小白鼠。将实施例24的增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗接种在小鼠背后，一周后，在小鼠右后肢外侧皮下接种密度为1×106的B16-OVA细胞，跟踪瘤体积大小，实验结束后通过流式细胞术对肿瘤内、透明酸人造淋巴结内免疫细胞进行检测。
实验结果表明，按照实施例24，如图4、图5和图6所示制备出一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗在体内动物实验中与其它对照组相比，其CD8+T细胞在实验动物脾脏内占比上调近5％(图4)、淋巴结内占比上调近10％(图5)和肿瘤内占比上调近20％(图6)CD8+T细胞是抗肿瘤免疫中最重要的效应细胞，CD8+T细胞数量占比的上调标志着实验动物机体产生了强劲的抗肿瘤免疫效应；另外，其脾脏内、淋巴结内和肿瘤内CD4+T细胞、效应记忆T细胞和M1型巨噬细胞也有明显上调，CD4+T细胞占比上调10～20％，效应记忆T细胞占比上调10～15％，M1型巨噬细胞占比上调10～20％。如图7所示透明酸人造淋巴结内招募大量树突状细胞和巨噬细胞，其中树突状细胞占比约25％，巨噬细胞占比约35％，在所有实施例中免疫细胞招募量最大。实施例24后，如图8与其它对照组相比，肿瘤体积明显减小。因此，实施例24得到的增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗具有较好的肿瘤预防效果。
实施例33
选用B16-OVA肿瘤模型，并选用20g左右的C57BL/6小白鼠。将实施例27的增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗接种在小鼠背后，一周后，在小鼠右后肢外侧皮下接种密度为1×106的B16-OVA细胞，跟踪瘤体积大小，实验结束后通过流式细胞术对肿瘤内、透明酸人造淋巴结内免疫细胞进行检测。
实验结果表明，按照实施例27制备出一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗在体内动物实验中与其它对照组相比，其CD8+T细胞在实验动物脾脏内占比上调近5％、淋巴结内占比上调近10％和肿瘤内占比上调近20％，CD8+T细胞数量占比的上调标志着实验动物机体产生了强劲的抗肿瘤免疫效应；另外，其脾脏内、淋巴结内和肿瘤内CD4+T细胞、效应记忆T细胞和M1型巨噬细胞也有明显上调，上调幅度均在10％左右。透明酸人造淋巴结内同样招募大量树突状细胞和巨噬细胞，其中树突状细胞占比约20％，巨噬细胞占比约30％。因此，实施例27得到的增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗同样具有较好的肿瘤预防效果，复合时间仅稍微影响了透明酸人造淋巴结细胞招募的能力。
由以上实施例可知，本发明提供了一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗，制备原料包括质粒、4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺、细胞集落刺激因子、巯基改性的透明质酸和四臂-马来酰亚胺接枝的聚乙二醇。该纳米DNA疫苗经皮下给药后能够大量招募免疫细胞形成透明质酸人造淋巴结，通过持续输出抗原呈递细胞和抗原特异性T细胞抑制肿瘤的产生。此外，透明质酸人造淋巴结还可以缓释纳米DNA疫苗，延长疫苗刺激时间，改善现有DNA疫苗普遍免疫原性不强的问题，也能够解决生物相容性的问题。该纳米DNA疫苗具有易于制备、易于储存、价格低廉等优点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗，其特征在于，制备原料包括质粒、4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺、细胞集落刺激因子、巯基改性的透明质酸和四臂-马来酰亚胺接枝的聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗，其特征在于，所述质粒与4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺的质量比为1：(1.25～5)；质粒与4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺所制备的纳米DNA疫苗的质量和巯基改性透明质酸的质量比为1:(40～100)；所述细胞集落刺激因子与四臂-马来酰亚胺接枝的聚乙二醇的质量比为1：(50～100)。
3.根据权利要求1所述的增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗，其特征在于，所述4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺的分子量为22000～27000Da；所述巯基改性的透明质酸的分子量为1200000～1300000Da；所述四臂-马来酰亚胺接枝的聚乙二醇的分子量为20000～2500Da。
4.根据权利要求1所述的增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗，其特征在于，所述质粒选自鸡卵清蛋白编码质粒和/或黑色素瘤相关抗原编码质粒。
5.根据权利要求4所述的增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗，其特征在于，所述鸡卵清蛋白编码质粒的碱基数为6711bp；所述黑色素瘤相关抗原编码质粒的碱基数为6745bp。
6.一种权利要求1～5任一项所述增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：
将质粒、4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺与水混合，形成纳米DNA疫苗，然后与巯基改性的透明质酸溶液混合，得到溶液A；
将细胞集落刺激因子和四臂-马来酰亚胺接枝的聚乙二醇中混合，得到溶液B；
将所述溶液A和溶液B混合形成凝胶，得到增强癌症预防效果的透明质酸人造淋巴结缓释纳米DNA疫苗。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述质粒、4-(溴甲基)苯基硼酸改性的线性聚乙烯亚胺与水混合的时间为8～15min；
所述溶液A和溶液B混合的时间为10～40s。
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