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CN116218838A - 从阴离子交换树脂洗脱长链核酸rna的方法 - Google Patents

从阴离子交换树脂洗脱长链核酸rna的方法 Download PDF

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CN116218838A
CN116218838A CN202310079678.2A CN202310079678A CN116218838A CN 116218838 A CN116218838 A CN 116218838A CN 202310079678 A CN202310079678 A CN 202310079678A CN 116218838 A CN116218838 A CN 116218838A
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CN
China
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exchange resin
anion exchange
long
concentration
chain rna
Prior art date
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Pending
Application number
CN202310079678.2A
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English (en)
Inventor
杜君瑶
滕以刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
Original Assignee
Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
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Filing date
Publication date
Application filed by Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd filed Critical Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
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Publication of CN116218838A publication Critical patent/CN116218838A/zh
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase

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Abstract

本发明提供一种从阴离子交换树脂洗脱长链RNA的方法，其步骤包括：(1)在已经结合有长链RNA的阴离子交换树脂上，用含有高浓度盐的缓冲液除去结合的蛋白及其他杂质小分子；(2)用含有低浓度强碱和高浓度盐的溶液对长链RNA进行洗脱。本发明采用低浓度的强碱与高浓度的盐同时进行洗脱，高盐竞争解离核酸分子的同时，低浓度的强碱的OH‑与和层析介质上的H+相互中和，降低了层析介质的电荷，同时不会对核酸分子产生破坏。达到理想的洗脱效果。

Description

从阴离子交换树脂洗脱长链核酸RNA的方法
技术领域
本发明专利涉及一种从阴离子交换树脂洗脱长链核酸RNA的方法。
背景技术
长链核酸，尤其是长链RNA纯化的重要性，因近年mRNA疫苗的快速发展而逐渐被重视。经体外转录(IVT)得到的带有帽子结构(cap)和多聚腺苷酸尾巴结构(Poly A)的mRNA需要经纯化与转录体系中的酶及小分子化合物分离。目前通用的mRNA纯化方法有Oligo dT亲和柱层析，除此之外，反向层析的应用也比较广泛。然而反向层析需要用到一些有机试剂，在后续的纯化中需要去除，增加了纯化难度。
阴离子交换(AEX)是一种常用的层析纯化方式，普遍应用于生物大分子的纯化技术中。然而核酸的阴离子交换纯化遇到一些困难，由于带有较多的负电荷，阴离子交换层析通常只能应用于500nt以下核酸的纯化，尽管一些改进能够应用于更长的核酸纯化，但是其需要一些特殊条件，从而阻碍了普遍的应用。
发明内容
本发明建立了一种从阴离子交换树脂洗脱长链RNA的方法。
本发明采用的技术方案为：
一种从阴离子交换树脂洗脱长链RNA的方法，其特征在于其步骤包括：
(1)在已经结合有长链RNA的阴离子交换树脂上，用含有高浓度盐的缓冲液除去结合的蛋白及其他杂质小分子；
(2)用含有低浓度强碱和高浓度盐的溶液对长链RNA进行洗脱。
优选的，所述低浓度强碱的浓度为0.05mM至50mM，强碱为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂。
优选的，所述长链RNA为大于500nt的RNA。
优选的，所述高浓度盐的浓度为100mM至4M，盐指氯化钠、氯化钾或氯化锂。
优选的，所述阴离子交换树脂指弱碱性阴离子交换树脂，功能基团为伯胺、仲胺或叔胺。
优选的，所述阴离子交换树脂为DEAE树脂。
优选的，所述缓冲液为Tris缓冲液。
含有弱碱性配基的阴离子交换树脂，本身配基不带电，在水溶液中结合水电离出的氢离子从而带有正电荷，继而吸附带有负电荷的分子。通常情况下，洗脱是在高盐(如1MNaCl)的条件下，通过高浓度的负电离子竞争吸附将目的分子解离，比如小于500nt的核酸分子可以用该法洗脱。但是长度大于500nt的长链核酸分子中带有大量负电荷，使得单纯依靠高盐竞争进行洗脱不可行。
本发明采用低浓度的强碱与高浓度的盐同时进行洗脱，高盐竞争解离长链RNA分子的同时，低浓度的强碱的OH-与和层析介质上的H+相互中和，降低了层析介质的电荷，同时不会对核酸分子产生破坏。达到理想的洗脱效果。
附图说明
图1为实施例1中各步骤取样得到的琼脂糖凝胶电泳图，其中IVT：体外转录的RNA；FT1，FT2：流穿组分；NaCl梯度：室温下0-1M氯化钠梯度洗脱的组分；65℃NaCl梯度：65℃柱温下0-1M氯化钠梯度洗脱的组分；洗脱：Buffer C1洗脱的组分。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
各实施例中用到的溶液配方如下：
Buffer A
10mM Tris
pH 7.0；
Buffer B
10mM Tris
1M NaCl
pH 7.0；
Buffer C1
20mM NaOH
1M NaCl；
Buffer C2
5mM NaOH
1M NaCl。
实施例1从阴离子交换树脂洗脱RNA的方法
DEAE层析柱(4.7ml)，接入SCG-100层析系统，水洗除去乙醇，A泵接入Buffer A，B泵接入Buffer B，Buffer B洗柱5个柱体积，Buffer A平衡。
体外转录合成(IVT)mRNA(长度在2000nt左右)1ml，加入0.5M EDTA 200μl，加入去离子水8.8ml，65℃水浴处理10min，0.22μm滤膜过滤；
样品通过A泵上样，再用BufferA洗柱至基线(A260)平，梯度拉至100％ Buffer B，洗至基线平，收集流出液；
换成100％ Buffer A，将柱温升至65℃，梯度拉至100％ Buffer B，洗至基线平，收集流出液；
柱温降至室温，B泵换成Buffer C1进行洗脱，收集洗脱液。
配制1％琼脂糖凝胶，在1X TAE缓冲液中对实施例1中收集到的各组分进行电泳检测，结果如图1所示，可以看出，仅采用高温高盐(65℃+Buffer B)，无法洗脱结合在离子交换柱料上的RNA，换成高盐低碱洗脱液(Buffer C1)后，则可以很容易的将结合在离子交换柱料上的RNA洗脱下来。
实施例2
本实施例的步骤基本同实施例1，区别在于同洗脱液从Buffer C1换成Buffer C2，结果与实施例1基本相同。

Claims (7)

1.一种从阴离子交换树脂洗脱长链RNA的方法，其特征在于其步骤包括：
(1)在已经结合有长链RNA的阴离子交换树脂上，用含有高浓度盐的缓冲液除去结合的蛋白及其他杂质小分子；
(2)用含有低浓度强碱和高浓度盐的溶液对长链RNA进行洗脱。
2.根据权利要求1所述的从阴离子交换树脂洗脱长链RNA的方法，其特征在于：所述高浓度盐的浓度为100mM至4M，盐指氯化钠、氯化钾或氯化锂。
3.根据权利要求1所述的从阴离子交换树脂洗脱长链RNA的方法，其特征在于：所述低浓度强碱的浓度为0.05mM至50mM，强碱为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的从阴离子交换树脂洗脱长链RNA的方法，其特征在于：所述长链RNA为大于500nt的RNA。
5.根据权利要求3所述的从阴离子交换树脂洗脱长链RNA的方法，其特征在于：所述阴离子交换树脂指弱碱性阴离子交换树脂，功能基团为伯胺、仲胺或叔胺。
6.根据权利要求5所述的从阴离子交换树脂洗脱长链RNA的方法，其特征在于：所述阴离子交换树脂为DEAE树脂。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的从阴离子交换树脂洗脱长链RNA的方法，其特征在于：所述缓冲液为Tris缓冲液。
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