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CN116200421A - 一种提高番茄果实番茄红素含量的基因及其应用 - Google Patents

一种提高番茄果实番茄红素含量的基因及其应用 Download PDF

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CN116200421A CN202211555694.6A CN202211555694A CN116200421A CN 116200421 A CN116200421 A CN 116200421A CN 202211555694 A CN202211555694 A CN 202211555694A CN 116200421 A CN116200421 A CN 116200421A
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及番茄SlWRKY40基因在调控番茄果实番茄红素合成中的应用，SlWRRY40基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。SlWRKY40基因过表达促进番茄果实番茄红素的积累。

Description

一种提高番茄果实番茄红素含量的基因及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及番茄SlWRKY40基因在调控番茄果实番茄红素合成中的应用。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicum)是三大世界性贸易蔬菜之一，在全球蔬菜贸易中占有重要地位。随着番茄需求的不断上升，世界番茄的种植面积和生产总量均在不断扩大。番茄富含一类天然的异戊二烯类化合物——类胡萝卜素，包括番茄红素、β-胡萝卜素和叶黄素等。其中，番茄红素是成熟番茄果实中最主要的类胡萝卜素组分，其不仅是番茄最主要的呈色物质影响果实的外观品质，而且具有良好的营养保健功效。大量医学研究表明，番茄红素在抗氧化、增强免疫力、保护皮肤、降低心血管疾病风险和抑制前列腺癌等多种肿瘤发生发展等方面具有重要的功效。由于人体不能自行合成番茄红素，摄入番茄红素主要来源于番茄及其制品。因此，利用基因工程策略提高番茄的番茄红素含量，对于改善类胡萝卜素的缺乏症和维持身体健康具有重要意义。
WRKY是植物特有的一类转录因子家族，因其含有由WRKYGQK 7个氨基酸组成的保守序列而得名。WRKY转录因子广泛参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应，并在植物种子发育、根系生长、叶片衰老和开花等生长发育过程中发挥重要的作用，但是关于其在调控番茄红素合成方面的功能鲜有报道。番茄SlWRKY40(Solyc06g068460.2.1)与拟南芥AtWRKY40高度同源。拟南芥AtWRKY40主要参与植物对生物胁迫(如灰霉菌和白粉菌等)和逆境(如镉胁迫和干旱等)的抗性，同时参与茉莉酸(JA)和脱落酸(ABA)等植物激素，以及挥发性物质E-2-己烯醛的信号途径。SlWRKY40基因的序列在番茄数据库(https://solgenomics.net/)中已经被公开。目前，关于其用途尚未清楚，仅发现其表达可受到干旱、盐、病原菌、激发子和病毒的诱导(Huang等，2017)。
Huang S,Gao Y,Liu J,Peng X,Niu X,Fei Z,Cao S,Liu Y.Genome-wideanalysis of WRKY transcription factors in Solanum lycopersicum.Mol GenetGenomics.2012.287(6):495-513.
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供SlWRKY40基因的用途---用于调控番茄果实番茄红素合成。
为了解决上述问题，本发明提供SlWRKY40基因在调控番茄果实番茄红素合成中的应用，SlWRRY40基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
本发明中：SlWRKY40基因编码的蛋白质具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
本发明提供了一种含有上述基因的质粒以及含有上述基因的植物表达载体proSlE8:SlWRKY40。
本发明还提供一种含有上述基因的宿主细胞，宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞。
本发明还同时提供了一种调控番茄果实番茄红素合成的方法：构建SlWRKY40过表达转基因番茄，所述转基因番茄的番茄红素含量显著提高。
作为本发明的上述方法的改进：过表达载体为proSlE8:SlWRKY40。
关于SlWRKY40在调控番茄果实番茄红素合成中的功能，目前现有技术中尚未报道。本发明首次构建了番茄SlWRKY40基因过表达番茄，并进行功能研究。通过表型观察、番茄红素含量分析发现SlWRKY40在番茄果实番茄红素合成中起到正向调控作用。
附图说明：
下面结合图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是SlWRKY40过表达载体proSlE8:SlWRKY40的载体图谱。
图2是SlWRKY40过表达番茄果实中SlWRKY40的表达量。
图3是SlWRKY40过表达番茄果实和对照在各个成熟时期的表型图。
图4是SlWRKY40过表达番茄果实和对照在各个成熟时期番茄红素的含量。
图3和图4中，WT代表未转基因的野生型番茄Alisa Craig，OE-5和OE-22是SlWRKY40过表达的两个株系。MG(Mature green)代表绿熟期，B(Breaker)代表破色期，T(Turning)代表转色期，RR(Red ripe)代表红熟期。
星号代表转基因株系与对照存在显著差异(*p<0.05，**p<0.01)。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，本发明的保护范围并不仅限于此。一、SlWRKY40基因克隆及过表达载体构建
采用TRIZOL法提取番茄叶片的总RNA用TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒将RNA反转录成cDNA(具体参照试剂盒说明书)。在番茄数据库(https://solgenomics.net/)中获取SlWRKY40基因的蛋白编码序列(Coding sequence，CDS)，用primer premiere 5.0软件设计扩增引物SlWRKY40-F(5’ATGGAATTTACCAGTTTGGT 3’)和SlWRKY40-R(5’TTACCATCTCCCTGTCTGAT 3’)。以cDNA为模板，SlWRKY40-F和SlWRKY40-R为前后引物，利用TOYOBO公司高保真酶KOD FX进行PCR扩增，反应体系如下：2×PCR buffer forKOD FX 25μL，dNTPs(2mM)10μL，primer F(10μM)1.5μL，primer R(10μM)1.5μL，templateDNA 1μL，KOD FX 1μL，ddH2O 10μL，共50μL。PCR反应程序如下：94℃预变性2min；98℃变性10s，50℃退火30s，68℃延伸1min 30s，35个循环；最后68℃终延伸5min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收纯化。扩增出来的基因全长连接至入门载体pQBV3上，确认测序正确后，通过同源重组的方法将目的基因(SEQ ID NO:1所述)转移到带番茄果实特异性表达启动子SlE8的双元载体上(双元载体骨架为pK7WGF2，载体上的35S启动子通过HindIII和SpeI酶切连接被2187bp的SlE8启动子替换，参考Sun等(2020))，构建好的过表达载体命名为proSlE8:SlWRKY40(图1)。
Sun C,Deng L,Du M,Zhao J,Chen Q,Huang T,Jiang H,Li CB,LiC.Atranscriptional network promotes anthocyanin biosynthesis in tomatoflesh.Mol Plant.2020.6；13(1):42-58.
SEQ ID NO:1为SlWRKY40的核苷酸序列(带终止密码子)，SEQ ID No:2为SlWRKY40的氨基酸序列。
二、SlWRKY40过表达转基因材料构建
将过表达载体proSlE8:SlWRKY40转化农杆菌LBA4404菌株，以野生型番茄AlisaCraig的子叶作为外植体，与菌液进行共培养，获得愈伤组织，愈伤组织经过分化培养基和生根培养基获得转基因阳性苗，具体步骤参照Shao等(2020)的方法。利用PCR和实时荧光定量PCR检测T0待植株中SlWRKY40的存在和表达情况。
Shao Z,Zhao Y,Liu L,Chen S,Li C,Meng F,Liu H,Hu S,Wang J,WangQ.Overexpression of FBR41 enhances resistance to sphinganine analogmycotoxin-induced cell death and Alternaria stem canker in tomato.PlantBiotechnol J.2020.18(1):141-154.
对鉴定阳性的T0植株进行单株留种，种子播在含有50mg/L硫酸卡那霉素的1/2MS培养基上，选择抗性：非抗性接近于3：1(说明外源基因是单拷贝插入)的株系的抗性苗，继续单株留种，获得T1代种子。将T1代种子继续播在相同的抗性培养基上，选择均为抗性的种子，即可作为实验材料。通过上述方法，获得SlWRKY40单拷贝插入、过量表达且稳定遗传的转基因番茄株系，记为SlWRKY40-OE-5和SlWRKY40-OE-22。上述两个株系绿熟期果实中SlWRKY40的表达量分别是对照的3.6倍和91.8倍(图2)。
备注说明：
1、抗性苗能够在抗性培养基上长侧根，非抗性苗在抗性培养基上无法长出侧根。
2、基因表达检测为常规的实时荧光定量PCR。
三、转基因果实番茄红素含量研究
转基因番茄和野生型番茄于2022年春季种植在杭州市农业科学院之江基地的连栋大棚中，在番茄开花期进行统一花期标记。以花期标记后40天为番茄绿熟期(果实充分膨大，但果皮仍为绿色)，花期标记后43天为破色期(果实顶端开始变红)，花期标记后46天为转色期(果实橙红色，显色60％-90％)，花期标记后53天为红熟期(果实红色，显色100％)。摘取同一果穗，同一花期无损伤的番茄果实，进行表型观察，并取其果皮，液氮速冻后研磨成粉末，用于番茄红素含量分析。
番茄红素提取方法如下：取0.3-0.5g果实粉末于10mL离心管中，迅速加入6mL提取液(正己烷：丙酮：无水乙醇＝1：1：1，v/v/v)，放在摇床中200rpm摇30min。加入2mL蒸馏水，涡旋混匀，于4℃，1500rpm离心10min。用无菌注射器吸取1mL上清液进行真空干燥，之后加入1mL溶解液(四氢呋喃：乙腈：甲醇＝3：6：11，v/v/v)充分溶解，用0.22μm有机相过滤头过滤后，转移到棕色液相瓶中用于含量测定。
番茄红素含量的定量分析采用岛津的高效液相色谱系统(Shimadzu,Japan)，搭配自动进样器、C18色谱柱(5μm粒径，4.6mm×250mm，Elite，中国)和SPD-M20A二极阵列检测器。流动相为(甲醇：乙腈＝9:1，v/v，同时加入0.05％三乙胺)，流速为1.2mL/min，柱温为30℃，进样量为20μL，检测波长为475nm。样品的番茄红素含量根据番茄红素标样绘制的标准曲线计算得到，计算结果的单位为μg/g FW(fresh weight，鲜重)。
研究结果：如图3所示，SlWRKY40过表达番茄果实在破色期(B)、转色期(T)和红熟期(RR)三个成熟时期比对照果实更红。与表型相一致，SlWRKY40过表达番茄果实中番茄红素的含量在这个三个时期均显著高于对照果实(图4)。在红熟期，SlWRKY40-OE-5和SlWRKY40-OE-22这两个株系番茄果实的番茄红素含量分别比对照提高40％和28％(图4)。以上结果说明，SlWRKY40可促进番茄果实番茄红素的积累。
最后，还需注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实例。显然，本发明不仅局限于以上实施案例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.SlWRKY40基因在调控番茄果实番茄红素合成中的应用，其特征在于：SlWRRY40基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：SlWRKY40基因过表达促进番茄果实番茄红素的积累。
3.一种调控番茄果实番茄红素合成的方法，其特征在于：构建SlWRKY40过表达转基因番茄，所述转基因番茄的番茄红素含量显著提高。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：过表达载体为proSlE8:SlWRKY40。
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