CN116200404B - 一种大豆天冬酰胺合成酶类似基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆天冬酰胺合成酶类似基因及其应用。本发明研究显示SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因是一个受低磷抑制表达的基因，GmASL6影响大豆根瘤氨基酸代谢过程，超量表达GmASL6基因会促进大豆根系发育，增加植株的氮磷含量以及转基因复合植株的根瘤数，减少天冬氨酸含量；显示GmASL6介导天冬酰胺的累积或合成，最终影响根瘤生长。同时，GmASL6基因和蛋白质能够调控包含它的转基因根瘤氨基酸代谢过程、促进植株生长及在低磷胁迫下促进大豆生长。本发明为培育耐低磷植株转基因植物提供了更多有效途径，明确了GmASL6基因参与根瘤中天冬酰胺合成的生物学功能及其对根瘤固氮的调控作用。

Description

一种大豆天冬酰胺合成酶类似基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因育种技术领域。更具体地，涉及一种大豆天冬酰胺合成酶类似基因及其应用。

背景技术

大豆(Glycine max)是重要粮油作物，也是植物蛋白的主要来源，具有重要的经济价值。除丰富的脂肪、蛋白质、碳水化合物外，大豆还含有多种独特的活性物质，如大豆异黄酮、大豆皂苷、大豆多肽等，在医疗保健方面具有较高的应用价值。区别于其他传统作物如水稻和小麦等，大豆能与根瘤菌互利共生，形成根瘤结构。根瘤可以利用土壤中的氮元素，还能将空气中的氮气固定为氨，为豆科作物提供氮源。大豆的共生固氮作用，不仅供于大豆植株自身的氮营养，同时可以减少农业生产中氮肥的施用。据统计，大豆每年通过共生固氮向农业生态系统输送氮元素达1.6千万吨，对发展环境友好型农业，减少氮肥施用以及环境污染具有重要意义。

在豆科植物中，天冬酰胺是根瘤氮代谢的产物，参与氮同化物的运输过程，同时也参与了根瘤共生固氮的代谢过程。许多研究发现，豆科植物的根，根瘤，木质部汁液等存在较高浓度的天冬酰胺。在逆境胁迫条件下，豆科作物的根系和根瘤部位会出现自由态氨基酸特别是天冬酰胺的累积，表明天冬酰胺的累积可能参与调控根瘤氮代谢的过程，但具体的机理还不清楚。

磷元素是作物生长发育过程中必需的大量营养元素之一，耕地土壤有效磷浓度低已成为全球范围内，作物产量和品质的主要限制因子。我国南方地区多为酸性土地，土壤普遍存在磷有效性低的问题，影响了华南地区作物产量与品质。在长期的进化过程中，植物进化出一系列适应低磷胁迫的生理和分子机制(Vance et al.,2003；Liang et al.,2010；Wang et al.,2010；Oldroyd and Leyser,2020；Zhu et al.,2020)。在豆科作物，如大豆、苜蓿、三叶草中，低磷胁迫会造成根系和根瘤部位天冬酰胺的累积，有研究指出这一部分累积的天冬酰胺参与调控大豆氮代谢，可能与大豆和根瘤适应低磷胁迫机制相关(Almeidaet al.,2000；Hernández et al.,2009；Sulieman et al.,2010,2013；Xue et al.,2018)。而目前，天冬酰胺合成酶家族在拟南芥，小麦和油菜中虽已被克隆及报道，但天冬酰胺合成酶类似基因参与根瘤中天冬酰胺合成的生物学功能及其对根瘤固氮的调控作用尚未明确。因此，为了揭示天冬酰胺合成酶类似基因在根瘤中的功能，有必要针对对豆科作物根瘤氮代谢与转运的机制进入深入的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种大豆天冬酰胺合成酶类似基因GmASL6及其应用。

本发明的第一个目的是提供大豆天冬酰胺合成酶类似基因GmASL6的应用。

本发明的第二个目的是提供一种促进大豆生长和/或在磷胁迫下促进大豆生长的产品。

本发明的第三个目的是提供一种提高大豆植株氮磷含量或促进大豆植株根根瘤生长的方法。

本发明的第四个目的是提供一种培育耐低磷植株转基因植物的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明研究显示SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因是一个受低磷抑制表达的基因，GmASL6基因影响大豆根瘤氨基酸代谢过程，超量表达该基因能增加大豆根瘤天冬酰胺含量，增加转基因复合植株的根瘤数，表明GmASL6介导天冬酰胺的累积或合成，最终影响根瘤生长。同时，GmASL6基因和蛋白质能调控包含它的转基因根瘤氨基酸代谢过程、促进植株生长及增加植株氮磷含量够。

因此，以下应用均在本发明的保护范围内：

超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂在促进大豆生长和/或在低磷胁迫下促进大豆生长中的应用。

超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂在制备促进大豆生长和/或在低磷胁迫下促进大豆生长的产品中的应用

超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂在提高大豆植株氮磷含量和/或在制备提高大豆植株氮磷含量的产品中的应用。

超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂在减少大豆植株根瘤天冬酰胺含量中的应用。

超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂在培育耐低磷植株转基因植物中的应用。

超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂在促进大豆植株根瘤生长或提高大豆植株根瘤数量中的应用。

优选地，上述基因GmASL6的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供一种促进大豆生长和/或在磷胁迫下促进大豆生长的产品，含超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂。

本发明提供一种提高大豆植株氮磷含量或促进大豆植株根根瘤生长的方法，采用上述超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂对大豆进行处理。

本发明还提供一种培育耐低磷植株转基因植物的方法，将超量表达GmASL6基因的重组载体导入大豆中即得。

优选地，所述表达载体，可用现有的植物表达载体构建含有GmASL6基因的重组表达载体。

更优选地，所述植物表达载体包括双元农杆菌载体等，如pTF101s或其它衍生植物表达载体。

本发明具有以下有益效果：

本发明研究显示SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因是一个受低磷抑制表达的基因，GmASL6影响大豆根瘤氨基酸代谢过程，超量表达GmASL6基因能减少大豆根瘤天冬酰胺含量，增加植株的氮磷含量，增加转基因复合植株的根瘤数；显示GmASL6介导天冬酰胺的累积或合成，最终影响根瘤生长。同时，GmASL6基因和蛋白质能够调控包含它的转基因根瘤氨基酸代谢过程、促进植株生长及在低磷胁迫下促进大豆生长。本发明为培育耐低磷植株转基因植物提供了更多有效途径，明确了GmASL6基因参与根瘤中天冬酰胺合成的生物学功能及其对根瘤固氮的调控作用。

附图说明

图1：GmASL6在正常磷及低磷条件下，根系及根瘤表达模式分析结果图(大豆萌发后接种根瘤菌，在正常磷(HP：250μM KH₂PO₄)和缺磷(LP：5μM KH₂PO₄)条件下水培育苗；图中数据为4次重复的平均值和标准误。“*”表示正常磷与缺磷处理间差异显著(Student’s t-test,0.01≤P<0.05)，“**”表示正常磷及缺磷处理间差异极显著(Student’s t-test，P<0.01))。

图2：GmASL6启动子驱动GUS在离体毛根的组织化学定位结果图(A：正常磷处理条件下(HP：250μM KH₂PO₄)离体毛根GUS染色结果；B：正常磷处理条件下根根伸长区；C：正常磷条件下根尖；D：正常磷处理条件下侧根原基；E：低磷处理条件下(LP：5μM KH₂PO₄)离体毛根GUS染色结果；F：低磷处理条件下根根伸长区；G：低磷处理条件下根尖；H：低磷处理条件下侧根原基。A和E标尺都为5mm；其他标尺为1mm)。

图3：GmASL6的亚细胞定位结果图(GFP表示GFP通道，BF表示明场，Merge表示GFP与BF重叠。GFP荧光通过激光共聚焦显微镜进行观察。图中标尺为20微米)。

图4：超量表达GmASL6对大离体毛根生长的影响结果图(A：超量表达GmASL6转基因离体毛根以及CK毛根表型；B：毛根干重；C:毛根全磷含量；D：毛根天冬酰胺浓度。CK指转入OX空载的离体毛根，OX指超量表达GmASL6毛根。离体毛根分别在正常磷(HP：250μM KH₂PO₄)和缺磷(LP：5μM KH₂PO₄)培养基上生长25天后，收取样品)。

图5：超量表达GmASL6对大豆复合植株生长的影响结果图(A：超量表达GmASL6复合植株表型；B：复合植株干重；C：复合植株全氮含量；D：复合植株全磷含量；E：总根长；F：根部氮含量；G：根部磷含量。CK指转化空载对照的复合植株，超量指超量GmASL6转基因复合植株。结种根瘤菌后，复合植株分别在正常磷(HP：250μM KH₂PO₄)和缺磷(LP：5μM KH₂PO₄)条件下生长31天后，收取样品。图中数据为8个生物学重复的平均值和标准误差。“*”表示OX复合植株与CK复合植株间差异显著(Student’s t-test，0.01<P≤0.05),“**”表示OX复合植株与CK复合植株间差异极显著(Student’s t-test，0.001<P≤0.01)。图中复合植株及根系的标尺都为10cm)。

图6：超量表达GmASL6对大豆复合植株根瘤的影响结果图(A：超量GmASL6复合植株根瘤表型；B：根瘤鲜重；C：根瘤数；D：根瘤天冬酰胺浓度；E：天冬氨酸的浓度；F：谷氨酰胺的浓度。CK指转化空载对照的复合植株，OX指超量GmASL6转基因复合植株。结种根瘤菌后，复合植株分别在正常磷(HP：250μM KH₂PO₄)和缺磷(LP：5μM KH₂PO₄)条件下生长31天后，收取根瘤样品。图中数据为8个生物学重复的平均值和标准误差。“*”表示OX复合植株与CK复合植株间差异显著(Student’s t-test，0.01<P≤0.05),“**”表示OX复合植株与CK复合植株间差异极显著(Student’s t-test，0.001<P≤0.01)。图中根系局部放大图标尺为1cm，根瘤标尺为1cm)。

图7：GmASL6-GST重组蛋白异源表达及酶活分析结果图(A：GmASL6-GST蛋白的western blot分析结果，泳道I为含有GST空载的大肠杆菌菌液破碎后的全蛋白，泳道II经由GST磁珠纯化后的GST空载蛋白，泳道III为含有GmASL6-GST的大肠杆菌菌液破碎后的全蛋白，泳道IV为经由GST磁珠纯化后的GmASL6-GST蛋白泳道；B：GmASL6-GST天冬酰胺合成酶酶活分析，“***”表示GmAS6-GST与GST空载间天冬酰胺合成酶酶活差异极显著(Student’st-test，0.001<P≤0.01))。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

SEQ ID NO.1所示核苷酸序列：ATGTTGGGAATTTTCAAGCAGAAGTTGGTTAATGCACCCAAGGAGCTGAACAGTCCAGCTTCTTTGAATTCATGCATTAAGCCTAAGCTAAGTCATGAAATCCTGAAGGATTTCATGTCCTGCAATTCCTCCAATGCTTTCTCAATGTGCTTTGGGAATGATGCTTTGCTAGCCTATTCCACTTCATACAAGCCCTCCATTAATCATAGGTTATTCTCTGGATTGGATAACATATACTGTGTTTTCCTGGGTGGCCTGCACAACCTTAGCATGCTCAACAAGCAGTATGGACTATCAAAGGGAACAAATGAGGCCATGTTTATCATTGAAGCATATCGTACACTTCGCGACAGGGGTCCATACCCTGCTGATCAAGTCCTCAAAGAACTTGAAGGCAGTTTTGCATTTGTGATCTATGACAACAAGGATGGAACAGTTTTTGTTGCATCTGGTTCTAATGGCCATATTGAGCTCTACTGGGGTATTGCAGGTGATGGTTCTGTTATAATTTCTGAAAATCTGGAGCTTATAAAAGCAAGTTGTGCTAAATCATTTGCACCATTTCCAGCTGGGTGTATGTTTCATAGTGAACACGGTCTCATGAACTTTGAGCATCCAACACAGAAGATGAAAGCAATGCCTCGGATTGACAGCGAGGGGGTTATGTGCGGGGCCAACTTCAATGTTGACTCTCAGTCAAAGATCCAGGTGATGCCACGTGTTGGAAGTGAAGCTAATTGGGCAACTTGGGGCTAA。

SEQ ID NO.2所示氨基酸序列：MLGIFKQKLVNAPKELNSPASLNSCIKPKLSHEILKDFMSCNSSNAFSMCFGNDALLAYSTSYKPSINHRLFSGLDNIYCVFLGGLHNLSMLNKQYGLSKGTNEAMF IIEAYRTLRDRGPYPADQVLKELEGSFAFVIYDNKDGTVFVASGSNGHIELYWGIAGDGSVIISENLELIKASCAKSFAPFPAGCMFHSEHGLMNFEHPTQKMKAMPRIDSEGVMCGANFNVDSQSKIQVMPRVGSEANWATWG*。

实施例1载体的构建

经过本发明前期实验克隆的到一个基因，其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明经过对该基因的功能研究，鉴定该基因为大豆的天冬酰胺合成酶类似基因，命名为GmASL6，进一步通过大豆转基因复合植株的研究，对根瘤表达的GmASL6进行了系统的功能分析。

1、超量表达载体：GmASL6-pTF101s载体

以大豆cDNA为模版，采用GmASL6-pTF101s基因正、反向特异性引物F：5’-TTCGCGAGCTCGGTACCCGGGATGTTGGGAATTTTCAAGCAGA-3’和R：5’-CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTTAGCCCCAAGTTGCCC-3’，进行PCR反应，扩增GmASL6基因CDS序列全长。

PCR反应体系为：Vazyme phata Buffer 25μL，10mM dNTP 1μL，正向及反向引物2μL，大豆cDNA 3μL，Vazyme phata高保真酶(美吉生物，中国)1μL，ddH₂O 16μL。

PCR程序设置为：94℃3min，30个重复循环(具体包括：94℃30秒，60℃30秒，72℃1min)，72℃10min，扩增产物于16℃保存。

扩增后回收并纯化目的条带。使用SmaI限制性内切酶单酶切pTF101s质粒，回收并纯化单酶切产物，通过一步克隆连接法连接酶切产物和目的基因片段。得到GmASL6-pTF101s载体用于后续实验。

2、亚细胞定位载体构建：GmASL6-pEGAD载体

以大豆cDNA为模版，用GmASL6-pEGAD基因正、反向特异性引物F：5’-CTAGCGCTACCGGTATGTTGGGAATTTTCAAGCAGAAG-3’和R：5’-TGGTGGCGACCGGTAGGCCCCAAGTTGCCCAATT-3’，进行PCR反应，扩增GmASL6基因CDS序列全长。

PCR扩增方法和条件同上，将扩增产物经凝胶电泳后，使用琼脂糖凝胶试剂盒回收并纯化目的条带。使用AgeI限制性内切酶单酶切pEGAD质粒，回收并纯化单酶切产物，通过一步克隆连接法连接酶切产物和目的基因片段。一步克隆连接产物直接转入大肠杆菌感受态，测序并比对无误后，抽取质粒并转入农杆菌GV3101中，-80℃储存备用。得到35S:GmASL6-GFP载体用于后续实验。

3、GmASL6-GST重组蛋白异源表达载体构建：GmASL6-pGEX

以大豆cDNA为模版，用GmASL6-pGEX基因正、反向特异性引物F：5’-GGGGCCCCTGGGATCCATGTTGGCTATATTCCACAAAGC-3’和R：5’-GGGAATTCGGGGATCCCTAATGTTGGTCCCATTCCATC-3’，进行PCR反应，扩增GmASL6基因CDS序列全长。

PCR扩增方法和条件同上，将扩增产物经凝胶电泳后，使用琼脂糖凝胶试剂盒回收并纯化目的条带。使用BamHI限制性内切酶单酶切pGEX质粒，回收并纯化单酶切产物，通过一步克隆连接法连接酶切产物和目的基因片段。一步克隆连接产物直接转入大肠杆菌感受态，测序并比对无误后，抽取质粒并转入大肠杆菌BL21中，-80℃储存备用。得到GmASL6-pGEX载体用于后续实验。

4、组织定位分析载体的构建：GmASL6-pTF102载体

以大豆基因组DNA为模版，用GmASL6-pTF102基因正、反向特异性引物F：5’-CTATGACATGATTACGAATTC CTCGGAAGTCCGAGTGTC-3’和R：5’-GACTGACCTACCCGGGGATCCCAATAATCAGCAATCCAAATAGCTG-3’，进行PCR反应，扩增GmASL6的2000bp启动子片段。

PCR反应体系包含：Vazyme phata Buffer 25μL，10mM dNTP 1μL，正向及反向引物2μL，大豆基因组DNA 3μL，Vazyme phata高保真酶(美吉生物，中国)1μL，ddH₂O 16μL。

PCR程序设置为：94℃3min，30个重复循环(具体包括：94℃30秒，60℃30秒，72℃1min)，72℃10min，扩增产物于16℃保存。

将扩增得到的目的片段的回收以及纯化：扩增产物经凝胶电泳后，使用琼脂糖凝胶试剂盒(美吉生物，中国)回收并纯化目的条带。连接启动子片段与载体：使用EcoR I和BamH I双酶切pTF102质粒，回收并纯化双酶切产物，通过一步克隆连接法连接酶切产物和启动子片段。反应体系包含：Assembly mix Buffer 5μL(全氏金，中国)，载体双酶切产物1μL，启动子片段4μL。一步克隆连接法温度体系包括：50℃15min，4℃冷却5秒。一步克隆连接产物直接转入大肠杆菌感受态，测序且比对无误后，抽取质粒并转入农杆菌K599中，备用。得到GmASL6-pTF102载体用于后续实验。

实施例2GmASL6表达模式分析、组织定位及亚细胞定位

1、GmASL6表达的组织特异性分析

采用大豆幼苗在接种根瘤菌处理后，分两组进行水培处理，一组为正常磷浓度处理(HP：250μM KH₂PO₄)，另一组为低磷处理(LP：5μM KH₂PO₄)，收取不同天数的根系以及根瘤样品，将上述RNA利用Promega公司逆转录试剂盒反转录成cDNA，进一步用定量PCR检测GmASL6的表达模式。定量PCR的反应体系为20微升，包括2×SYBR Green PCR master mix10微升，Nuclease-free water 7微升，浓度为10微摩尔/升的正反向引物各0.5微升，稀释的cDNA模板2微升。反应程序为，95℃变性1分钟；然后进行40次循环的94℃15秒，60℃15秒，72℃30秒。

采用大豆GmEF1-α作为内参，具体用于定量PCR检测基因表达量的引物分别为：

结果如图1所示，可以看出GmASL6在31天时，受低磷下调表达。在接种根瘤菌后31天，GmASL6在根瘤中均大幅下调，下调幅度达89％。

2、GmASL6的组织化学定位分析

选取大小一致且种皮完整的种子，在经过13h的氯气消毒(4.2mL盐酸添加100mL次氯酸钠反应生成氯气)之后，将大豆种子胚芽朝下萌发于MS培养基中，25℃光照培养5d。将含有GmASL6-pTF102质粒的农杆菌K599接种于液体YEP培养基中培养24h。用手术刀沾取已转入GmASL6-pTF102质粒的活化后的K599菌液，在萌发大豆的子叶和子叶节部位水平切出多道伤口，然后放置于预先用水润湿的灭菌滤纸上，用保鲜膜密封，避光培养4天后，将豆瓣移入含有200μg L^-1草铵膦(Sigma，美国)和50mg L^-1特美汀(鼎国生物，广州)的MS培养基上，避光培养15天。

转基因大豆离体毛根处理：分别配制正常磷处理(HP：250μM KH₂PO₄)、低磷处理(LP：5μM KH₂PO₄)的MS液体固体培养基(都含50mg L^-1特美汀抑菌)，挑选白嫩、长势较好的离体毛根移入MS培基上进行正常磷和低磷处理，避光培养14d后，收取离体毛根样品。

取出正常磷和低磷处理后的离体毛根，用二级水冲洗2遍，分别置于GUS染色液中染色(GUS染色液含：0.1M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，1mM X-Gluc，pH为7.2)，同步抽真空30min，转入37℃条件下避光染色过一夜。着色后的毛根转移至75％乙醇中保存，使用体视显微镜(Leica，德国)观察GUS染色情况，并拍照。

结果如图2所示，在正常磷处理条件下，Pro _GmASL6:GUS转基因的大豆离体毛根的GUS染色主要分布在根伸长区的维管组织、侧根原基和根尖等部位(图2A，2B，2C，2D)。但是，在低磷处理条件下，GUS染色在根伸长区维管组织、侧根原基和根尖等部位的染色均显著减弱，尤其是在根尖部位几乎观测不到染色(图2E，2F，2G，2H)。

3、GmASL6的亚细胞定位分析

通过实施例1构建GmASL6-pEGAD载体转入农杆菌GV3101中，进一步对3～4周龄的烟草叶片进行下表皮侵染转化实验。将已转入GmASL6-pEGAD质粒的GV3101菌株由超低温冰箱中取出，接种至YEP培养基，28℃振荡培养24h。5000rpm离心10min，弃去上清液，然后用侵润液(侵染液含：10mM MgCl2，100μM乙酰丁香酮，10mM MES)重悬GV3101，将侵染液OD值调至0.5后22℃避光培养4h。将GmASL6-pEGAD侵染液用注射器由叶片背面注射入烟草叶片。2天后，在激光共聚焦显微镜下对烟草叶片进行GFP荧光观察，并拍照。

结果如图3所示，可以看出，相较于35S:GFP蛋白在细胞膜、细胞质和细胞膜均有绿色荧光的信号，GmASL6:GFP蛋白的绿色荧光信号主要存在于细胞膜和细胞核，揭示了GmASL6为细胞膜和细胞核定位蛋白。

实施例3转基因材料的获得与分析

1、转基因大豆毛根的获得

选取大小一致且种皮完整的大豆种子，在经过13h的氯气消毒(4.2mL盐酸添加100mL次氯酸钠反应生成氯气)之后，将大豆种子胚芽朝下萌发于MS培养基中，25℃光照培养5d。用手术刀沾取已转入目的载体的活化后的农杆菌K599菌液，在萌发大豆的子叶和子叶节部位水平切出多道伤口，然后放置于预先用水润湿的灭菌滤纸上，用保鲜膜密封，避光培养4天后，将豆瓣移入含有200μg L^-1草铵膦(Sigma,美国)和50mg L-1特美汀(鼎国生物，广州)的MS培养基上，避光培养15天。

2、大豆复合植株的获得

挑选大小一致且饱满的大豆种子，使用10％ H₂O₂灭菌10min后，无菌水清洗5次。将大豆种子播种于石英砂表面，加入二级水，覆盖2cm厚的石英砂砂在种子上，光照条件下培养5天。将已转入GmASL6-pTF101s的农杆菌K599分别涂布在固体YEP培养基表面，30℃培养24h，同时以空载作为相应的空载对照。注射器针头沾取活化后的K599，于大豆幼苗下胚轴位置穿孔，之后在伤口部位覆盖K599菌体，覆盖湿润砂子继续培养幼苗，幼苗需再覆一层保鲜膜，每天喷水数次，保持伤口部位湿润。15天左右伤口位置开始长出毛根，取一部分样品，经检测后，只留下阳性的毛根。待阳性毛根长至10cm左右，剪去大豆植株的主根，进行接种根瘤菌处理。结种根瘤菌后，复合植株移入沙培，每周一次浇施正常磷(HP：250μM KH₂PO₄)和低磷(LP：5μM KH₂PO₄)营养液200mL。

3、转基因材料的检测

(1)转基因大豆离体毛根与下胚轴复合植株转基因毛根的检测

提取获得的转基因系毛根的总RNA，反转录成cDNA后，用定量PCR检测GmASL6的表达量。大豆EF1-a作为参照基因，引物与方法同实施例2，相对表达量为目的基因GmASL6的表达量与看家基因表达量的比值。

实施例4GmASL6功能分析

1、超量表达GmASL6对大豆转基因离体毛根生长的影响

待上述转基因及其空载对照毛根生长至15d，选取长势良好、毛根形态相似、鲜重约为0.1g的离体毛根，转至正常磷处理(HP：250μM KH₂PO₄)、低磷处理(LP：5μM KH₂PO₄)的MS液体固体培养基上(都含50mg L^-1特美汀抑菌)，继续避光培养14d后，收取毛根样品。分别测定其天冬酰胺浓度、毛根干重以及全磷含量。本次实验的每个处理均设置6个独立生物学重复以及空载对照。

结果如图4所示，超量表达GmASL6促进大豆离体毛根的生长，并显著提高其磷含量(图4A)。在正常磷处理条件下，与CK相比，转基因离体毛根的干重增加了58.7％，磷含量增加了45.8％。而在低磷处理条件下，与CK相比，转基因离体毛根的干重增加了110％(图4B)，而其磷含量提高了31％(图4C)。而且，在正常磷和低磷条件下，转基因毛根的天冬酰胺浓度分别增加了30.8％和25.8％(图4D)，揭示了超量GmASL6增强离体毛根中天冬酰胺的合成。

2、超量表达GmASL6对大豆转基因复合植株生长的影响

依据上述下胚轴注射法获得大豆转基因复合植株后，进行接种根瘤菌处理。结种根瘤菌后，复合植株移入沙培，每周一次浇施正常磷(HP：250μM KH₂PO₄)和低磷(LP：5μMKH₂PO₄)营养液200mL。

结果如图5所示，超量表达GmASL6后增加了转基因离体毛根量(图5A)，超量表达GmASL6提高植株干重、植株氮磷含量(图5B-D)。且促进根系发育具体表现在根长增加(图5E)，根系氮含量增加(图5F)。通过测定根系天冬酰胺含量结果显示(图5G)，超量表达GmASL6，减少了根系天冬酰胺含量。

超量表达GmASL6对大豆复合植株根瘤的影响，如图6所示，超量表达GmASL6，增加了根瘤数量以及根瘤重量(图6A)，提高了根瘤鲜重，且在低磷条件下，根瘤数目较CK相比，显著增加(图6B，6C)。同时，超量表达GmASL6后调控了转基因根瘤氨基酸代谢过程，显著改变了根瘤中不同氨基酸：天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺的浓度(图6D，6E，6F)，通过测定根瘤天冬酰胺含量，结果显示，超量表达GmASL6减少了植株根瘤天冬酰胺含量。

实施例5GmASL6酶活分析

1、GmASL6蛋白纯化

将实施例1中已转入GmASL6-pGEX质粒的BL21大肠杆菌接种于液体LB培养基中，28℃振荡培养，到菌体培养至波长600的分光光度计测定OD为0.5-0.6时，加入IPTG至最终浓度为1mM，于28℃摇床诱导培养4h后，各加入3mL的100mM浓度PMSF和DTT，摇匀后分装至50mL离心管中，在4℃的离心机5000rpm离心10min，去掉上清并加入50mM的PBS缓冲液重悬，于35pis高压破碎，得到澄清透亮菌液后5000rpm离心10分钟，取上清于新的50mL离心管中，加入3mL GSH磁珠，封口后置于冰上，放到冷库摇床中结合5h。

蛋白上清与磁珠结合完成后，用预冷的PBS缓冲液洗去杂蛋白，当测定洗涤的缓冲液蛋白含量为0时，加入3mL预冷的蛋白洗脱液洗脱磁珠上的重组蛋白，并用考马斯亮蓝的方法测定蛋白浓度，取适量进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western Blot，验证GmASL6酶液中无杂蛋白(图7A)，即可进行后续试验。

2、GmASL6重组蛋白的酶活力测定

将上述纯化后的GmASL6-GST以及GST蛋白加入考马斯亮蓝G-250中，测定其蛋白浓度，GST蛋白为酶活分析的空白对照，以GmAS5为阳性对照。根据以下反应体系：100mM Tris-HCl(pH为8.0)，100mM NaCl，5mM ATP，10mM MgCl2，10mM Asp，10mM Gln，37℃水浴锅中反应15min，加入500μL乙醇终止反应后，测定其中的天冬酰胺浓度。

结果如图7B显示，以天冬氨酸和谷氨酰胺为底物，在温度为37℃，pH为8.0的条件下，GmASL6-GST蛋白的天冬酰胺合成酶酶活比GST无明显变化，这说明GmASL6-GST蛋白不具有天冬酰胺合成酶活。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂在促进大豆生长和/或在低磷胁迫下促进大豆生长中的应用，其特征在于，所述制剂为超量表达载体。

2.超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂在制备促进大豆生长和/或在低磷胁迫下促进大豆生长的产品中的应用，其特征在于，所述制剂为超量表达载体。

3.超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂在提高大豆植株氮磷含量和/或在制备提高大豆植株氮磷含量的产品中的应用，其特征在于，所述制剂为超量表达载体。

4.超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂在减少大豆植株根瘤天冬酰胺含量中的应用，其特征在于，所述制剂为超量表达载体。

5.超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂在培育耐低磷植株转基因植物中的应用，其特征在于，所述制剂为超量表达载体。

6.超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂在促进大豆植株根瘤生长或提高大豆植株根瘤数量中的应用，其特征在于，所述制剂为超量表达载体。

7.一种促进大豆生长和/或在磷胁迫下促进大豆生长的产品，其特征在于，含超量表达SEQ ID NO:1所示的GmASL6基因的制剂；所述制剂为超量表达载体。

8.一种提高大豆植株氮磷含量或促进大豆植株根根瘤生长的方法，其特征在于，采用权利要求7所述产品对大豆进行处理。

9.一种培育耐低磷植株转基因植物的方法，其特征在于，将超量表达GmASL6基因的重组载体导入大豆中即得，所述GmASL6基因的序列如SEQ ID NO:1所示。