CN116200399A - 一种MYB转录因子基因ZmMYB76及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种MYB转录因子基因ZmMYB76及其编码蛋白和应用，基因ZmMYB76的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述基因ZmMYB76可在在玉米抗虫调控中的应用，通过过表达所述基因ZmMYB76提高玉米植株对玉米螟虫的抗性。本发明首次提出的基因ZmMYB76，是一个对玉米螟具有抗性作用的新型MYB转录因子基因，该基因在玉米螟咬食后在玉米叶片中表达上调，抗虫功能未见报道，可为绿色、持久地防治玉米螟和创制玉米抗虫新种质提供技术支持。

Description

一种MYB转录因子基因ZmMYB76及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种MYB转录因子基因ZmMYB76及其编码蛋白和应用。

背景技术

玉米螟是玉米主要的害虫，可危害玉米植株叶片、花丝、茎秆、籽粒等各个部分，其通过直接咬食使植株丧失功能，严重影响植株与后期籽粒的发育，导致玉米的减产与病菌的侵入。目前，玉米螟的防治手段以化学防治为主，容易对生态环境造成污染。

萜类是植物次生代谢产物中最为丰富的一类化合物，许多成分都具有重要生理功能，在植物与病虫害的互作中扮演着重要的角色，参与对病虫害的直接与间接防御反应。而转录因子对萜类合成酶基因具有调控作用，其通过与靶基因上游特定的DNA元件结合，加强或抑制靶基因的表达，从而在植物抗虫反应中发挥重要作用。

玉米遗传基础相对狭窄和基因资源有限，需要进一步发掘具有调控玉米抗虫性的功能基因，采取有效手段拓展功能基因在提高玉米抗玉米螟方面的应用，为丰富玉米抗虫基因资源及分子辅助选育和创制抗玉米螟材料提供新的技术思路。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种具有较好的抗虫功能的MYB转录因子ZmMYB76基因及其编码蛋白和应用。

为实现上述目的，本发明提供了一种MYB转录因子基因ZmMYB76，其全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，其编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供所述的基因ZmMYB76的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种含有所述的基因ZmMYB76的表达载体。

本发明还提供一种含有所述的表达载体的宿主菌。

本发明还提供所述的基因ZmMYB76在玉米抗虫调控中的应用。

进一步地，所述的应用，通过过表达所述基因ZmMYB76提高玉米植株对玉米螟虫的抗性。

进一步地，所述的应用，所述基因ZmMYB76通过上调ZmDLS基因的表达而促进萜类物质的合成实现玉米抗虫调控，所述ZmDLS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明发掘出一种玉米抗虫相关的关键MYB转录因子基因ZmMYB76，既丰富了玉米抗虫基因资源，又为选育和创制玉米抗虫种质材料奠定了基础，本发明首次提出的基因ZmMYB76，是一个对玉米螟具有抗性作用的新型MYB转录因子基因，该基因在玉米螟咬食后在玉米叶片中表达上调，抗虫功能未见报道，可为绿色、持久地防治玉米螟和创制玉米抗虫新种质提供技术支持。瞬时过表达试验表明，基因ZmMYB76具有较好的抗虫功能，可作为一种潜在的分子标记进行开发。

本领域普通技术人员，基于所述基因ZmMYB76的功能，在结合现有技术的基础上，可以获得抗虫的玉米植株或种质材料。因此，本发明请求保护所述基因ZmMYB76在选育和创制抗虫玉米种质资源材料中的应用。所述的基因ZmMYB76可以用于分子辅助育种来选育抗虫材料和创制新的抗虫种质，达到绿色生态持久防控玉米螟的目的。另外，本发明还请求保护一种玉米抗玉米螟种质材料的选育与创制方法，过表达所述基因ZmMYB76，实现玉米品种的遗传改良。

本发明的有益效果体现在：

(1)本发明首次揭示了一种对玉米螟具有抗性作用的新型MYB转录因子基因ZmMYB76，通过调控所述基因ZmMYB76过表达，提高玉米植株对玉米螟的抗性。本发明为从分子水平防止玉米螟提供了新的解决方案，可为玉米抗虫新种质的创制提供技术支持。

(2)本发明利用大数据分析及RT-qPCR技术发现基因ZmMYB76在玉米螟咬食后显著上调表达，其结合ZmDLS基因的启动子区域，调控ZmDLS基因的表达，促进萜类物质的合成，以趋避玉米螟的侵害。本发明通过瞬时表达技术及异源过表达等技术，明确了ZmMYB76基因在玉米抗玉米螟过程中的功能。

(3)本发明提供了一种抗玉米螟玉米种质的选育与创制方法。该方法的核心在过表达所述基因ZmMYB76，为玉米的抗虫育种及分子标记开发提供技术支持。

附图说明

图1是ZmDLS基因启动子的顺式作用元件分析图。

图2是ZmDLS基因与筛选出的ZmMYBs基因受玉米螟侵食后的基因表达量图。

图3是ZmDLS基因与ZmMYB76基因的酵母单杂交试验图。

图4是ZmDLS基因与ZmMYB76基因的双荧光素酶试验图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

以下实施例所使用的各种原料和设备，如未作特别说明，均为本领域公知的市售产品。

实施例1：MYB转录因子筛选

根据玉米遗传学和基因组学数据库(https://maizegdb.org/)，下载玉米B73自交系转录组数据。运用BLAST软件进行本地建库对于拟南芥MYB的CDS(编码区)序列，鉴定到候选ZmMYB基因157个。将157个ZmMYBs与ZmDLS基因进行相关性分析，筛选出与ZmDLS基因相关性较高的6个ZmMYBs。因ZmDLS基因受玉米螟侵食后基因表达量显著增加，故分析筛选出来的6个ZmMYBs在玉米螟侵食后的基因表达量，根据相关性网络分析和基因共表达分析，最终筛选出转录因子基因ZmMYB76。

ZmDLS基因：是一种编码D-柠檬烯合酶的基因，D-柠檬烯合酶是萜类化合物D-柠檬烯形成的关键酶，ZmDLS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，ZmDLS基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，ZmDLS基因启动子的顺式作用元件分析图如图1所示。

实施例2：玉米螟咬食玉米叶片后ZmMYBs基因表达量分析

荧光定量PCR测定植物体内基因在特定状态下的表达水平；使用Primer Primier5.0软件设计引物，并由上海生工公司合成；植物RNA提取试剂盒(成都百菲特科技有限公司，货号RN33050)提取玉米B73叶片的RNA使用全式金

One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒反转录合成cDNA。按表1体系添加试剂，设置三个生物学重复，同时按照表1的反应条件进行反应，使用2-ΔΔCt法计算相对表达量。表达量测定结果见图2，可以看出转录因子基因ZmMYB76表达量显著上升。

表1荧光定量PCR反应体系和反应条件

实施例3：ZmMYB76基因的核苷酸序列

植物RNA提取试剂盒提取玉米B73叶片的RNA；使用反转录试剂盒(全式金

One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)按照说明将RNA反转录合成cDNA，根据玉米基因组(V4.0)获取玉米ZmMYB76基因CDS(编码区)完整序列，用Primer Premier 5.0软件设计全长引物为：

ZmMYB76-F1:ATGGTGACTGTGAGAGAGGAGATGC

ZmMYB76-R2:TCACATCATGATTTCTTGATCTCCC

以cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系如下：

表2 PCR扩增反应体系与反应条件

ZmMYB76基因的核苷酸如SEQ ID NO.1所示，ZmMYB76基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例4：基因ZmMYB76与ZmDLS基因互作酵母单杂交试验

首先制备酵母感受态(现做现用，不可冷冻保存后使用)：从-80℃冰箱中取出酵母菌株Y1HGold，吸取10-20μL涂布YPDA固体培养基中，YPDA固体培养基配方如表3所示，28℃培养箱中培养2d-4d至菌斑直径长到2mm左右；从YPDA固体培养平板上分别挑取2-3个克隆至20mL YPDA液体培养基中，YPDA液体培养基配方如表4所示，28℃恒温，180rpm过夜培养，至OD₆₀₀大于1.5；取约10mL菌液接种于100mL新鲜的YPDA液体培养基，28℃恒温，180rpm培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6，室温1,000×g离心5分钟收菌；去上清，10mL无菌水重悬细胞，6,000rpm离心5min，去除上清；沉淀用1.5mL 1×LiAc重悬后即为感受态细胞。再将待转化的pAbAi空载体质粒及其重组载体按照表转化至酵母感受态细胞，转化后涂布于SD/-Ura固体培养基上培养，SD/-Ura固体培养基配方如表5所示，筛选阳性克隆用于后续试验，转化前需要使用限制性内切酶BstBⅠ进行线性化。Y1H[pBait-AbAi]菌株本底水平表达：将Y1H[pBait-AbAi]菌株用0.9％NaCl重悬，调至OD₆₀₀＝0.002，取100μL涂布在含不同浓度(0ng/mL,100ng/mL,200ng/mL,400ng/mL,600ng/mL,800ng/mL)金担子素(Aureobasidin A,AbA)的表6所示配方的SD/-Ura缺陷型培养基上，28℃倒置避光培养2-3d。若平板上有白色单菌落，pBait-AbAi菌株存在自激活，反之，证明AbA浓度可抑制自激活，确定抑制pBait-AbAi菌株生长的最低AbA浓度。已携带pBait-AbAi酵母感受态的制备同上，转化产物涂布于SD/-Leu固体培养基，28℃倒置培养3-5d。筛选阳性克隆梯度稀释后涂布于含100ng/mLAbA的SD/-Leu固体培养基，酵母转化体系如表7所示。

表3 YPDA固体培养基配方

表4 YPDA液体培养基配方

表5 SD/-Ura固体培养基配方

表6 SD/-Ura缺陷型培养基配方

表7酵母感受态转化体系

试验结果详见图3，ZmMYB76可有效结合ZmDLS的启动子区域，调控ZmDLS的表达。

实施例5：瞬时转化基因ZmMYB76

通过SnapGene软件对pGreenII 62-SK和pGreenII 0800-LUC载体进行分析，选择合适的酶切位点，酶切体系如表8、表9所示，利用同源重组酶按照表10体系构建重组质粒。将启动子ZmDLSpro、转录因子基因ZmMYB76分别连接到pGreenII 0800-LUC载体、pGreenII62-SK载体中，后将两种重组质粒分别转化根癌农杆菌GV3101中。将重组质粒pGreenII0800-LUC、和空载pGreenII 62-SK共转入作为对照，将重组质粒pGreenII 0800-LUC和重组质粒pGreenII 62-SK共转入本氏烟叶片中，利用双荧光素酶报告分析系统(E710，Promega)和Modulus发光仪(GloMax96，Promega)分析渗入72h后萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。试验结果见图4，ZmMYB76与ZmDLS启动子驱动的LUC在N.tabacum的叶片中共同表达，ZmMYB76显著上调ZmDLS的表达。

表8 pGreenII 0800-LUC载体酶切反应体系与反应条件

表9 pGreenII 62-SK载体酶切反应体系与反应条件

表10连接反应体系与反应条件

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种MYB转录因子基因ZmMYB76，其特征在于，其全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的基因ZmMYB76，其特征在于：其编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1或2所述的基因ZmMYB76的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

4.一种含有如权利要求1或2所述的基因ZmMYB76的表达载体。

5.一种含有如权利要求4所述的表达载体的宿主菌。

6.如权利要求1或2所述的基因ZmMYB76在玉米抗虫调控中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，通过过表达所述基因ZmMYB76提高玉米植株对玉米螟虫的抗性。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因ZmMYB76通过上调ZmDLS基因的表达而促进萜类物质的合成实现玉米抗虫调控，所述ZmDLS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

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