CN116200352B - 7α-羟基类固醇脱氢酶突变体及其在7-氧代-石胆酸合成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体及其在7‑氧代‑石胆酸合成中的应用，属于基因工程和生物催化技术领域。本发明通过将Brucella melitensis 7α‑羟基类固醇脱氢酶(Bm7α‑HSDH)口袋特定的氨基酸实施定点突变，并组合了部分优势突变，获得了热稳定性和催化效率均得到显著提升的突变体。在催化底物鹅去氧胆酸合成7‑氧代‑石胆酸的反应中，突变体酶活力最多提高约45倍，催化效率提高约122倍，T_m值最大可提升约12℃，为生物法催化合成熊去氧胆酸提供了优质的生物酶和前体化合物，为实现其工业化生产奠定了坚实的研究基础。

Description

7α-羟基类固醇脱氢酶突变体及其在7-氧代-石胆酸合成中的 应用

技术领域

本发明涉及7α-羟基类固醇脱氢酶突变体及其在7-氧代-石胆酸合成中的应用，属于基因工程和生物催化技术领域。

背景技术

鹅去氧胆酸(3α,7α-二羟基-5-β-胆烷酸)是一种含有2个羟基的类固醇，主要作用是降低胆汁内胆固醇的饱和度。7-氧代-石胆酸(3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸)是鹅去氧胆酸的还原产物，充当熊去氧胆酸(3α,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸)合成的中间体。熊去氧胆酸与鹅去氧胆酸互为立体异构体，主要作用是治疗治疗胆结石、脂肪肝、胆汁性消化不良和预防新冠病毒等。

7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH，EC 1.1.1.159)是用于生产7-氧代-石胆酸的主要酶之一。7α-羟基类固醇脱氢酶属于短链脱氢酶/还原酶，包含Rossmann折叠的NAD(P)H/NAD(P)⁺结合域和一个由Ser-Tyr-Lys组成的活性催化三联体。目前已经克隆了10种不同来源的7α-HSDH基因并进行了功能验证。这些7α-HSDH的氨基酸序列同源性为17.57％–73.93％，在7-氧代-石胆酸生产中显示出不同的催化效率和热稳定性。但天然的7α-HSDH酶在7-氧代-石胆酸生产中热稳定性较差和效率低。据报道，来自Xanthomonas maltophilia的7α-HSDH在反应24h后，7-氧代-石胆酸的产率仅有80％。来自Clostridium absonum的7α-HSDH在37℃孵育2h后，其残余活性低于50％。

发明人筛选到一种来自Brucella melitensis的7α-HSDH，能够以鹅去氧胆酸为底物，催化合成7-氧代-石胆酸，但是野生型酶稳定性和催化效率较低，导致生物制备过程中消耗较高的时间成本和经济成本。因此提高7α-HSDH的热稳定性和催化效率，可以为该酶催化合成熊去氧胆酸的中间体7-氧代-石胆酸的工业化生产奠定坚实的研究基础。

发明内容

本发明人团队发现来自B.melitensis的7α-HSDH，能够以鹅去氧胆酸为底物，催化合成7-氧代-石胆酸，但是野生型酶稳定性和催化效率较低，导致生物制备过程中需要较高的时间成本和经济成本。

本发明将来源于B.melitensis的7α-HSDH基因根据大肠杆菌密码子的偏好性进行密码子优化并人工合成其基因，命名为Bm7α-HSDH；然后通过对特定的氨基酸进行突变，获得了催化效率与热稳定性提高的7α-HSDH突变体，可用于实现7-氧代-石胆酸的高效合成。

本发明的来源于B.melitensis的7α-HSDH基因含有915bp碱基，本发明提供了针对大肠杆菌密码子偏好性进行优化得到的基因7α-HSDH，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1所示基因编码的7α-HSDH包含有305个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的第262位、第301位、第258位中的一个或多个氨基酸突变后得到的。

本发明提供了一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的第262位赖氨酸突变为苏氨酸得到的，命名为：K262T；

或，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的第301位谷氨酰胺突变为异亮氨酸得到的，命名为：Q301I；

或，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的第258位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，同时将氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的第262位赖氨酸突变为苏氨酸得到的，命名为：I258M/K262T。

本发明还提供了一种编码上述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因，所述基因可以通过克隆、人工全序列合成的方法得到。

本发明还提供了一种携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述的重组表达载体可通过本领域常规方法将编码基因连接于各种市售空载载体上构建而成。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pET-21a、pET-21a或pRSFDuet-1为表达载体。

本发明还提供了一种表达上述突变体、或携带上述基因、或携带上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌为表达宿主。

本发明还提供了一种包含所述7α-HSDH突变体的编码基因或其重组表达载体的重组表达转化体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组表达转化体可通过本领域常规技术，将上述重组表达载体转化至相应宿主细胞中制得。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所编码的7α-HSDH基因能被有效表达即可。

本发明还提供了一种用于催化鹅去氧胆酸合成7-氧代-石胆酸的催化剂，所述催化剂为上述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，或采用上述重组细胞制备得到的含有7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的酶液或其冻干粉。

在本发明的一种实施方式中，所述的催化剂是以下形式中的任意一种：培养本发明所述的重组表达转化体，分离得到的含有所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的转化体细胞；或，培养本发明所述的重组表达转化体，分离得到的含有所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的粗酶液；或，培养本发明所述的重组表达转化体，分离得到含有所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的粗酶液，将所述粗酶液干燥得到的粗酶粉。其中，所述重组表达转化体的培养方法和条件为常规的方法和条件，针对不同的宿主体系，采用不同的优化条件，从而实现蛋白的高效表达。

本发明还提供了一种合成7-氧代-石胆酸的方法，所述方法为，将上述突变体，或采用上述重组细胞制备得到的突变体添加至含有底物鹅去氧胆酸、辅酶NAD⁺的反应体系中，催化制备得到7-氧代-石胆酸；

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中还含有pH 8.0～9.5的缓冲盐溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲盐溶液可以是本领域常规的任何缓冲液，只要其pH范围在8.0～9.5即可，比如磷酸钠、磷酸钾、Tris-HCl缓冲液、碳酸钠缓冲液，优选pH为9.5的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液的浓度为0.05～0.2M。

在本发明的一种实施方式中，所述底物鹅去氧胆酸的浓度为2～50mM。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中反应温度为20～40℃。

在本发明的一种实施方式中，反应温度为30℃。

上述反应条件为：在pH 8.0～9.5的缓冲盐溶液中进行，底物鹅去氧胆酸的浓度为2～50mM，温度为20～40℃。

本发明还提供了上述突变体、或上述基因、或上述重组载体、或上述重组细胞在制备7-氧代-石胆酸或含有7-氧代-石胆酸的产品中的应用。

有益效果

(1)本发明以序列表SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的7α-HSDH为母本，通过同源序列、结构比对，找到底物结合位点附近的关键氨基酸，采用丙氨酸扫描策略，确定拟突变的候选位点，采用定点突变的方法，成功的实现了7α-HSDH催化效率、热稳定性的显著改变。在此基础上，通过酶活测定、CD检测、液相检测，获得催化效率提高的7α-HSDH突变体。与野生型相比，优选的突变体不仅可以高效催化鹅去氧胆酸，并且热稳定性得到了提高。

(2)本发明将7α-HSDH基因构建在质粒pET-21a中，并在Escherichia coli BL21(DE3)表达，粗酶液经His-Trap亲和层析柱纯化后得到纯酶。通过优化酶活测定条件，在pH9.5的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液中于30℃中测定比酶活。通过酶活测定，组合突变体I258M/K262T，酶活力提高约45倍，T_m值升高约12℃。

(3)本发明的7α-HSDH为羟基类固醇脱氢酶用于不对称转化反应结合辅酶循环合成熊去氧胆酸提供了新的途径，解决了熊去氧胆酸合成原材料不足的问题，并且为工业中熊去氧胆酸中间体合成提供了优良菌种和酶，有助于大大降低其生产成本。

附图说明

图1：野生型、单点优势突变体及其组合突变的SDS-PAGE分析。M：蛋白分子量标准，CK：大肠杆菌细胞破碎液上清；1泳道为WT在细胞中的表达情况；2-5泳道：分别为WT、K262T、Q301I、I258M/K262T蛋白纯化产物。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的鹅去氧胆酸购自：百灵威有限公司。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB培养基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要时使用前加入氨苄青霉素(100μg·mL^-1)，固体培养基添加1.5％琼脂粉。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

7α-HSDH酶活力的测定：

通过测定NADH在340nm的吸光度变化率，在30℃下测量7α-HSDH氧化CDCA的酶活力。酶活力测定标准：反应体积200μL，分别加入终浓度为100mM的Na₂CO₃-NaHCO₃(pH 9.5)、5mM的NAD⁺和5mM的CDCA，置于30℃金属浴孵育3min，加入适量的纯酶(10–200μM)，在Bio-Tek Cytation 5细胞成像多功能检测系统扫描340nm处吸光度的变化。

酶活力定义为：在上述条件下，每分钟催化生成1μmol的NADH的酶量定义为一个单位U。

酶活的计算公式为：酶活(U)＝EW×V×10³/(6220×0.5)

比活的计算公式：比活(U·mg^-1)＝酶活(U)/蛋白量(mg)

其中，EW：1min内340nm处吸光度的变化；V：反应液的体积(mL)；6220：摩尔消光系数L·mol^-1·cm^-1)；0.5：光程距离(cm)。

动力学参数的测定：

根据米氏方程v＝V_max×[S]/K_m+[S]，计算出酶对不同底物的K_m值。

其中，v：反应速率(U·mg^-1)；V_max：最大反应速率(U·mg^-1)；[S]：底物浓度(mM)；K_m：反应速度v达到一半1/2V_max时的底物浓度。

当底物浓度饱和时，k_cat＝V_max/Et，计算出K_cat值。

其中，V_max：最大反应速率；Et：酶位点的浓度。

动力学参数测定：

总反应体积200μL，加入0.1M Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH 9.5)，5.0mM NAD⁺，温度30℃保温2min，加入适量纯酶液测定不同底物浓度(0.1mM～5.0mM)下的比酶活。酶动力学曲线的拟合通过GraphPad软件实现，分别以底物浓度和比酶活为横、纵坐标，选择米氏方程模型进行非线性拟合，获得V_max值与K_m值，通过数据换算获得k_cat值与k_cat/K_m值(表3)。

CD测定

使用Jasco J720分光旋光计进行圆二色谱测量。使用以下仪器设置(平均30次扫描)在磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中从190到250nm收集波长扫描数据：响应，1s；灵敏度为100毫米；速度为50nm min^-1。在20℃至80℃之间每3℃重复扫描一次。在50mM Na/K磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，蛋白质浓度约为0.01M，在220nm处记录了圆二色谱信号随温度升高的降低，计算不同蛋白的T_m值。

实施例1：7α-HSDH基因密码子优化及其合成

具体步骤如下：

(1)B.melitensis来源的7α-HSDH基因含有915bp碱基(NCBI的登录号为：MW202238)。参照大肠杆菌密码子偏爱性对7α-HSDH基因进行密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

(2)在该基因的C端引入6个组氨酸标签基因，然后在两端分别加入BamH I和Xho I限制性酶切位点序列，最后与pET-21a连接，获得重组质粒pET-21a-7α-HSDH。

实施例2：7α-HSDH突变体基因和重组大肠杆菌表达体系的构建

(1)构建7α-HSDH突变体

采用全质粒PCR技术对7α-HSDH设计

定点突变，以重组质粒pET-21a-7α-HSDH为模板，设计引物序列(表1)，分别进行以下突变：K262C、K262F、K262G、K262T、K262V、K262Y、Q301F、Q301I、Q301L、Q301M、Q301N、I258M/K262T。

表1：构建突变体引物设计表

pmol·μl^-1)1.0μl，模板1.0μl，ddH₂O 22.0μl；

PCR扩增条件：预变形：98℃30s；变性：98℃10s；退火：55℃15s；延伸：72℃

60s；后延伸：72℃10min；保存：4℃。

PCR扩增结束后，将扩增产物用Dpn I在37℃条件下消化2h去除模板质粒，消化产物转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂平板、挑取单菌落试管培养，测序验证突变体序列。

(2)重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)：

在每管100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10μL步骤(1)得到的PCR产物，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42℃水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却3min。每管中加入700μL LB液体培养基，37℃100rpm摇床温育培养1h。培养后菌液3,000×g离心2min，弃上清700μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50μg·mL^-1氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。

(3)阳性克隆的选择：

挑取4个克隆，转接入装有5mL的含有100μg·mL^-1氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养8h，利用质粒提取试剂盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)提取质粒。

用以下反应体系进行酶切验证：10×Buffer 2μL，质粒DNA 5μL，BamH I 0.5μL，Xho I 0.5μL，ddH₂O将体系补足20μL。

分别获得阳性克隆：E.coli/pET-21a-K262C、E.coli/pET-21a-K262F、E.coli/pET-21a-K262G、E.coli/pET-21a-K262T、E.coli/pET-21a-K262V、E.coli/pET-21a-K262Y、E.coli/pET-21a-Q301F、E.coli/pET-21a-Q301I、E.coli/pET-21a-Q301L、E.coli/pET-21a-Q301M、E.coli/pET-21a-Q301N、E.coli/pET-21a-I258M/K262T。

同时，按照上述方法制备得到含有野生型酶的重组菌：E.coli/pET-21a-7α-HSDH。

实施例3：重组菌的诱导表达培养

具体步骤如下：

(1)分别挑取实施例2制备得到的含有突变体的阳性克隆及含有野生型酶的单菌落接种于10mL含100μg·mL^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。

(2)取10mL步骤(1)得到的培养液转接于1L含100μg·mL^-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀约为0.6～0.8，制备得到培养物；向培养物中加入终浓度为0.1mM的异丙基-Β-D-硫代半乳糖苷，在25℃下进行诱导培养12h。

(3)诱导培养结束后，分别将培养液于6,000×g离心10min收集重组大肠杆菌细胞并用生理盐水洗涤三次后收集。

实施例4：重组蛋白的纯化

利用His-Trap HP affinity column纯化重组蛋白：

(1)分别称取2g实施例3收集得到的湿菌体，加入适量20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液悬浮细胞，于冰浴中进行超声破碎(工作2s，间隔3s，工作时间10min)。4℃条件下12,000×g离心30min收集上清液作为粗酶液。

(2)利用Cytiva公司生产的His-Trap亲和层析分别对上述粗酶液进行纯化，通过SDS-PAGE分析了野生型及其优势突变蛋白的纯化产物(图1)，野生型在细胞内表达条带及其纯化后条带均显示为非单一条带，可能是全长蛋白柔性末端影响了蛋白的表达。纯酶液超滤脱盐后用于酶活测定。

分别制备得到含有野生型酶WT的纯酶液、含有K262C的纯酶液、含有K262F的纯酶液、含有K262G的纯酶液、含有K262T的纯酶液、含有K262V的纯酶液、含有K262Y的纯酶液、含有Q301F的纯酶液、含有Q301I的纯酶液、含有Q301L的纯酶液、含有Q301M的纯酶液、含有Q301N的纯酶液、含有I258M/K262T的纯酶液。

实施例5：比酶活测定

分别检测实施例4得到的野生型酶与突变体酶对鹅去氧胆酸比酶活，结果如下表所示。

表2：野生型与突变型的比酶活比较

注释：n.d.^a表示未检测到活性；本发明的突变体命名方式：采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如K262C，表示位置262的氨基酸由亲本7α-HSDH的赖氨酸Lys替换成半胱氨酸Cys，位置的编号对应于亲本7α-HSDH的氨基酸序列的相应位点。

如表2所示，分别测定野生型与突变体催化鹅去氧胆酸的比酶活，结果表明单突变体K262C、K262G、K262T、Q301I的比酶活相对于野生型呈现显提高，其他单突变体比活显示不同程度的降低。

将优势单突变体进行组合突变，最终筛选得到了比酶活大幅度提高的I258M/K262T。结果表明，258、262、301位点不同氨基酸侧链位阻与极性的改变对催化鹅去氧胆酸的催化活力起着重要的作用。

实施例6：动力学参数测定

动力学参数测定：总反应体积200μL，加入0.1M Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH 9.5)，5.0mM NAD⁺，温度30℃保温2min，加入适量纯酶液测定不同底物(0.1mM～5.0mM)下的比酶活。计算出7α-HSDH野生型与突变体的k_cat、K_m、k_cat/K_m。(表3)。

表3：野生型与突变型的动力学参数

如表3所示，K262G、K262T、Q301I以及I258M/K262T突变体催化底物鹅去氧胆酸的k_cat/K_m值呈现显著提高，有利于提高酶催化底物鹅去氧胆酸，合成7-氧代-石胆酸的催化效率。

实施例7：CD测定

通过对实施例4得到的突变体的热稳定性进行表征，获得了热稳定性和催化效率同时提高的突变体，作为工业转化合成7-氧代-石胆酸的优良酶。使用Jasco J720分光旋光计进行圆二色谱测量，计算不同蛋白的T_m值(表4)。

表4：7α-HSDH野生型与优势突变体的热稳定性分析

结果如表4所示，相对于野生型，K262T、Q301I和I258M/K262T的T_m值均表现为显著的改善，结合实施例6，K262T和I258M/K262T同时表现为热稳定性和催化效率的提高。

实施例8：7α-HSDH催化合成7-氧代-石胆酸

具体步骤如下：

纯酶催化反应体系在50mL离心管进行，10mL反应混合物由0.1M Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH 9.5)、2mM NAD⁺、2mM鹅去氧胆酸和20μg纯酶组成，30℃，200r·min^-1振荡反应12小时，取样检测产物产率。用2M的NaOH调节pH至10.0～11.0终止反应，用等体积的乙腈萃取三次，萃取液混合，然后旋转蒸发浓缩至有结晶析出，抽滤后除去溶剂，烘干至恒重，通过HPLC进行检测。反应转化率采用液相色谱法进行分析，使用C-18柱(250mm×4.6mm)，流动相为乙腈：水(0.1％磷酸)＝60:40，柱温30℃，流速1.0mL min^-1，检测波长195nm。结果如表5所示。

表5：7α-HSDH野生型与突变体的产率

如表5所示，K262T、I258M/K262T突变体表现为产率的显著改善，其余突变体因为酶活性或热稳定性的变化，其产率相对于野生型无明显改善。表明突变体在催化效率和热稳定性方面的提高可能对鹅去氧胆酸高效制备7-氧代-石胆酸起着决定性作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列的第301位谷氨酰胺突变为异亮氨酸得到的。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是以pET-21a或pRSFDuet-1为表达载体。

5.表达权利要求1所述的突变体、或携带权利要求2所述的基因、或携带权利要求3或4所述的重组载体的重组细胞。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌或真菌为表达宿主。

7.一种用于催化鹅去氧胆酸合成7-氧代-石胆酸的催化剂，其特征在于，所述催化剂为权利要求1所述的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，或采用权利要求5或6所述重组细胞制备得到的含有7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的酶液或其冻干粉。

8.一种合成7-氧代-石胆酸的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1所述的突变体，或采用权利要求5或6所述重组细胞制备得到的突变体添加至含有底物鹅去氧胆酸、辅酶NAD⁺的反应体系中，催化制备得到7-氧代-石胆酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述反应体系中还含有pH 8.0～9.5的缓冲盐溶液；所述底物鹅去氧胆酸的浓度为2～50mM，反应温度为20～40℃。

10.权利要求1所述的突变体、或权利要求2所述的基因、或权利要求3或4所述的重组载体、或权利要求5或6所述的重组细胞在制备7-氧代-石胆酸或含有7-氧代-石胆酸的产品中的应用。