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CN116196408B - 一种新型免疫佐剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种新型免疫佐剂及其制备方法和应用

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CN116196408B
CN116196408B CN202211680771.0A CN202211680771A CN116196408B CN 116196408 B CN116196408 B CN 116196408B CN 202211680771 A CN202211680771 A CN 202211680771A CN 116196408 B CN116196408 B CN 116196408B
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trt
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ctc resin
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任宝永
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Sige Suzhou Biotechnology Co ltd
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Sige Suzhou Biotechnology Co ltd
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Abstract

一种新型免疫佐剂及其制备方法和应用，新型免疫佐剂的分子式如下：本发明的佐剂可以产生更强的免疫效果，本发明的佐剂可以显著降低抗原用量，本发明的佐剂制备方便，容易保存。

Description

一种新型免疫佐剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种新型免疫佐剂及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
佐剂是一种添加到疫苗中的物质，用于刺激和增强免疫应答的强度和持久性。新疫苗佐剂的传统开发被描述为医学史上最慢的过程之一。铝盐(明矾)自20世纪20年代首次获得许可以来的70多年里，仍然是许多疫苗产品中唯一的佐剂，如抗乙型肝炎、白喉、破伤风和百日咳或人乳头状瘤病毒的疫苗。然而，在20世纪90年代末，水包油乳剂佐剂MF59在欧洲首次被用于一种针对季节性流感的三价灭活疫苗佐剂，被许可用于65岁以上的成年人。在过去的20年里，其他4种佐剂已被纳入其他产品中：AS01(用于带状疱疹疫苗Shingrix和疟疾疫苗Mosquirix)、AS04(用于乙型肝炎疫苗Fendrix和人乳头状瘤疫苗Cervarix)、AS03(用于大流行性流感疫苗Pandemrix和Arepanrix)和胞嘧啶磷酸鸟苷(CpG)1018(用于乙肝疫苗Heplisav-B)。尽管在此期间许多其他佐剂在临床前模型中显示出高效能，通常是由于安全性或耐受性问题，大多数尚未在人体中获得许可。另外，尽管现有佐剂(包括明矾、MF59和佐剂系统AS0佐剂)其应用广泛，但实际上在人体中发挥作用的分子机制尚不十分清楚。
由于近些年包括新冠病毒在内多种感染性疾病的存在，人们对疫苗佐剂的关注也迅速增长。疫苗生产企业和WHO等公共卫生部门，已经制定了多个增强当前疫苗和开发新疫苗的目标，并且在过去几年中出现了针对感染性、过敏性和自身免疫性疾病以及癌症和生育治疗的新候选疫苗。在许多情况下，由于疫苗抗原本身免疫原性较低，这些疫苗需要安全而高效的免疫佐剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型免疫佐剂及其制备方法和应用。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种新型免疫佐剂，分子式如下：
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种制备新型免疫佐剂的方法，包括下列步骤：
步骤1：将2-CTC树脂用二氯甲烷溶胀，然后加入Fmoc-Cys(Trt)-OH和DIPEA，反应0.8-1.2小时，然后加入甲醇封端，接着抽滤去掉二氯甲烷，用二甲基甲酰胺洗涤，制得Fmoc-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤2：向Fmoc-Cys(Trt)-CTC树脂加入其体积15-25％的哌啶/二甲基甲酰胺溶液，然后鼓氮气20-40分钟，抽干后得到H2N-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤3：用二甲基甲酰胺洗涤步骤2得到的H2N-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤4：将Fmoc-Acp-OH氨基酸、DIPEA和HBTU加入到二甲基甲酰胺中进行反应，得到Fmoc-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤6：用二甲基甲酰胺洗涤步骤4得到的Fmoc-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤7：向Fmoc-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂加入其体积15-25％的哌啶/二甲基甲酰胺溶液，然后鼓氮气20-40分钟，抽干后得到H2N-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤8：用二甲基甲酰胺洗涤步骤7得到的H2N-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤9：将Fmoc-Ser(PO3HBzl)-OH氨基酸、DIPEA和HBTU加入到二甲基甲酰胺中进行反应，得到Fmoc-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤10：用二甲基甲酰胺洗涤步骤9得到的Fmoc-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤11：向Fmoc-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂加入其体积15-25％的哌啶/二甲基甲酰胺溶液，然后鼓氮气20-40分钟，抽干后得到H2N-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤12：用二甲基甲酰胺洗涤步骤11得到的H2N-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤13：按照步骤9-12的方法制备得到：
H2N-Ser(PO3HBzl)-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤14：将乙酸酐和DIPEA加入到二甲基甲酰胺中进行反应，得到Ac-Ser(PO3HBzl)-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤15：用甲醇洗涤Ac-Ser(PO3HBzl)-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤16：将切割液与步骤15的产物混合，搅拌条件下切割1.5-2.5h，然后过滤去掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥后得到粗品Ac-Ser(PO3H2)-Ser(PO3H2)-Acp-Cys。
优选的技术方案为：2-CTC树脂的取代度为0.8-1.2mmol/g。
优选的技术方案为：步骤4中，Fmoc-Acp-OH氨基酸、DIPEA、HBTU和树脂之间的摩尔比为：2.8-3.2：5-7：2.8-2.9：1。
优选的技术方案为：步骤9中，Fmoc-Ser(PO3H2Bzl)-OH氨基酸、DIPEA、HBTU和树脂之间的摩尔比为：2.8-3.2：5-7：2.8-2.9：1。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种新型免疫佐剂的应用，所述新型免疫佐剂在疫苗制备中的应用。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
1、本发明的佐剂可以产生更强的免疫效果。
2、本发明的佐剂可以显著降低抗原用量。
3、本发明的佐剂制备方便，容易保存。
附图说明
图1RBD抗原表达质粒图谱。
图2RBD抗原鉴定结果。
图3RBD抗原与佐剂偶联示意图。
图4各组小鼠血清效价检测。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-4。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1：一种新型免疫佐剂及其制备方法和应用
一种新型免疫佐剂，分子式如下：
制备方法：采用Fmoc固相多肽合成方法。
R1O1(Ac-Ser(PO3H2)-Ser(PO3H2)-Acp-Cys)的合成。
步骤1：取CTC树脂(取代度约1.0mmol/g)1g，用5mlDCM溶胀5分钟,充分溶胀后，加入0.4mmol Fmoc-Cys(Trt)-OH，0.8mmol DIPEA，反应1小时，加1ml甲醇封端半小时，抽滤掉DCM，用DMF洗涤3遍树脂，此时树脂为Fmoc-Cys(Trt)-CTC树脂(取代度约0.4mmol/g)。
步骤2：加3倍树脂体积的20％Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，抽干。得到H2N-Cys(Trt)-CTC树脂(脱除Fmoc基团)。
步骤3：2倍树脂体积的DMF洗涤5次上一步骤的树脂(洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备)。
步骤4：取1.2mmol Fmoc-Acp-OH氨基酸,2.4mmol DIPEA,1.14mmol HBTU。适量溶剂DMF反应30分钟。得到Fmoc-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂。氨基酸：DIPEA:HBTU：树脂＝3：6：2.85：1(摩尔比)
步骤5：2倍树脂体积的DMF洗涤3次上一步骤的树脂(洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备)。
步骤6：加3倍树脂体积的20％Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，抽干。得到H2N-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂(脱除Fmoc基团)。
步骤7：2倍树脂体积的DMF洗涤5次上一步骤的树脂(洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备)。
步骤8：取1.2mmol Fmoc-Ser(PO3HBzl)-OH氨基酸,2.4mmol DIPEA,1.14mmolHBTU。适量溶剂DMF反应30分钟。得到Fmoc-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂。氨基酸：DIPEA:HBTU：树脂＝3：6：2.85：1(摩尔比)。
步骤9：2倍树脂体积的DMF洗涤3次上一步骤的树脂(洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备)。
步骤10：加3倍树脂体积的20％Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，抽干。得到H2N-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂(脱除Fmoc基团)。
步骤11：2倍树脂体积的DMF洗涤5次上一步骤的树脂(洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备)。
步骤12：重复8、9、10、11步骤，得到H2N-Ser(PO3HBzl)-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂
步骤13：取2.4mmol乙酸酐,4.8mmol DIPEA。适量溶剂DMF反应30分钟。得到Ac-Ser(PO3HBzl)-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂。乙酸酐：DIPEA：树脂＝6：12：1(摩尔比)。
步骤14：甲醇洗涤树脂3次，并抽干树脂(为切割做好准备)。
步骤15：切割：6倍树脂体积的切割液(体积比；三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水＝87.5％：5％：2.5％：2.5％：2.5％)，摇床摇晃2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品Ac-Ser(PO3H2)-Ser(PO3H2)-Acp-Cys；
通过HPLC仪器纯化得到95％以上纯度的Ac-Ser(PO3H2)-Ser(PO3H2)-Acp-Cys。
纯化步骤：先用分析柱(C18分析柱)，快梯度分析多肽粗品。流动相为：水相A：0.1％TFA/水；有机相B：0.1％TFA/乙腈；梯度：5％-70％20分钟。粗品主峰在7min分钟左右。
使用C18制备柱进行多肽分离，收集目标峰。测质谱，发现收集的目标峰的分子量和Ac-Ser(PO3H2)-Ser(PO3H2)-Acp-Cys的分子量吻合，测HPLC纯度在95％以上。
将收集到的目标峰先用液氮冻实，再放冻干机上真空干燥成粉末状。
取冻干后的粉末状多肽1mg，用水溶解，进行HPLC和MS复测，结果显示，HPLC纯度在95％以上，MS分子量没有变化。
Pip为哌啶；TFA为三氟乙酸；DIPEA为一种碱，调节缩合反应时的PH；HBTU为一种缩合剂；Wang树脂：王树脂。
第8步骤中，括号里面的时相应氨基酸的侧链保护基团，在第10步骤中，一次性全部脱除，此步骤通常称之为切割。
一、新冠病毒疫苗RBD抗原的制备
冠病毒Spike基因采购于南京金斯瑞生物科技有限公司(货号：C0425FA280-6)。设计合成引物如下：
RBD-F:GCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGTAGGGTGCAGCCAACCGAGTCTATC
RBD-R:CACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCATTAGTGATGATGGTGGTGGTGATGATGGAAGTTCACGCACTTGTTCTTCACC
以Spike基因为模板，以RBD-F/RBD-R为引物，扩增RBD-HIS基因片段，扩增条件：94℃，5min；(94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min)x30；72℃，5min。扩增体系：10Xbuffer(含Mg2+)，5ul；2.5mM dNTP，2ul；10uM primer1，1ul；10uM primer2，1ul；模板，2ul；Taq，0.5ul；ddH2O，38.5ul。以HSA基因为模板，以HSA-F1/HSA-R2为引物，扩增HSA片段，扩增条件：94℃，5min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min)x30；72℃，5min。扩增体系：10X buffer(含Mg2+)，5ul；2.5mM dNTP，2ul；10uM primer1，1ul；10uM primer2，1ul；模板，1ul；Taq，0.5ul；ddH2O，38.5ul。用HindIII/EcoRI酶切PCDNA3.1质粒载体并利用胶回收试剂盒回收大片段，胶回收试剂盒购自天根生化，货号：DP209，操作步骤参见说明书。用HindIII/EcoRI酶切RBD-HIS PCR产物，酶切体系：Buffer 2X：2ul，EcoRI：0.5ul，HindIII：0.5ul，模板PCR产物2ul，水：15ul，37℃反应30分钟，之后利用胶回收试剂盒做回收，胶回收试剂盒购自天根生化，货号：DP209，操作步骤参见说明书。将酶切回收的载体和片段利用T4 DNA酶连接30分钟(ThermoFisher，货号:46300018)，连接后的产物转化FAST1大肠杆菌感受态，37℃培养过夜，第二天挑取克隆测序鉴定。对于测序正确的克隆，用无内毒素质粒提取试剂盒提取大肠杆菌TOP10中的重组质粒，命名为：pCDNA3.1-RBD HIS。
>RBD HIS AA
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFHHHHHHHH*。
>RBD HIS NT
AGGGTGCAGCCAACCGAGTCTATCGTGCGCTTTCCTAATATCACAAACCTGTGCCCATTTGGCGAGGTGTTCAACGCAACCCGCTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAATAGGAAGCGGATCAGCAACTGCGTGGCCGACTATAGCGTGCTGTACAACTCCGCCTCTTTCAGCACCTTTAAGTGCTATGGCGTGTCCCCCACAAAGCTGAATGACCTGTGCTTTACCAACGTCTACGCCGATTCTTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCCCCCGGCCAGACAGGCAAGATCGCAGACTACAATTATAAGCTGCCAGACGATTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAATCTGGATTCCAAAGTGGGCGGCAACTACAATTATCTGTACCGGCTGTTTAGAAAGAGCAATCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCTCTACAGAAATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCTTGCAATGGCGTGGAGGGCTTTAACTGTTATTTCCCACTCCAGTCCTACGGCTTCCAGCCCACAAACGGCGTGGGCTATCAGCCTTACCGCGTGGTGGTGCTGAGCTTTGAGCTGCTGCACGCCCCAGCAACAGTGTGCGGCCCCAAGAAGTCCACCAATCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCCATCATCACCACCACCATCATCAC。
二、抗原与佐剂偶联
利用Sulfo-SMCC交联试剂盒(ThermoFisher货号：22122)，将抗原与佐剂进行偶联,偶联原理示意图如图3所示。
1、向RBD HIS抗原蛋白溶液中加入适量交联剂(Sulfo-SMCC)，RBD his抗原与交联剂的摩尔数比例控制在1:5-1:100范围；
2、将反应混合物在室温下孵育30min。
3、使用用偶联缓冲液平衡的脱盐色谱柱除去过量的交联剂。
4、将R101和脱盐后的RBD His抗原按摩尔比合并混合，摩尔比为1:1～10:1。
5、反应混合液室温孵育30min或4℃孵育2小时。
三、小鼠免疫
选择6～8周龄左右的雄性Balb/C健康小鼠，采取背部多点免疫。免疫分组如下；免疫程序：初次免疫剂量为10ug抗原/小鼠，铝盐佐剂(B/C组)用量为100ul/小鼠。经15天后进行第二次相同剂量的免疫；7天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度。
实施例2：一种新型免疫佐剂及其制备方法和应用
一种新型免疫佐剂，分子式如下：
一种制备新型免疫佐剂的方法，包括下列步骤：
步骤1：将2-CTC树脂用二氯甲烷溶胀，然后加入Fmoc-Cys(Trt)-OH和DIPEA，反应0.8小时，然后加入甲醇封端，接着抽滤去掉二氯甲烷，用二甲基甲酰胺洗涤，制得Fmoc-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤2：向Fmoc-Cys(Trt)-CTC树脂加入其体积15％的哌啶/二甲基甲酰胺溶液，然后鼓氮气20分钟，抽干后得到H2N-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤3：用二甲基甲酰胺洗涤步骤2得到的H2N-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤4：将Fmoc-Acp-OH氨基酸、DIPEA和HBTU加入到二甲基甲酰胺中进行反应，得到Fmoc-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤6：用二甲基甲酰胺洗涤步骤4得到的Fmoc-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤7：向Fmoc-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂加入其体积15％的哌啶/二甲基甲酰胺溶液，然后鼓氮气20分钟，抽干后得到H2N-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤8：用二甲基甲酰胺洗涤步骤7得到的H2N-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤9：将Fmoc-Ser(PO3HBzl)-OH氨基酸、DIPEA和HBTU加入到二甲基甲酰胺中进行反应，得到Fmoc-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤10：用二甲基甲酰胺洗涤步骤9得到的Fmoc-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤11：向Fmoc-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂加入其体积15％的哌啶/二甲基甲酰胺溶液，然后鼓氮气20分钟，抽干后得到H2N-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤12：用二甲基甲酰胺洗涤步骤11得到的H2N-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤13：按照步骤9-12的方法制备得到：
H2N-Ser(PO3H2Bzl)-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤14：将乙酸酐和DIPEA加入到二甲基甲酰胺中进行反应，得到Ac-Ser(PO3HBzl)-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤15：用甲醇洗涤Ac-Ser(PO3HBzl)-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤16：将切割液与步骤15的产物混合，搅拌条件下切割1.5h，然后过滤去掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥后得到粗品Ac-Ser(PO3H2)-Ser(PO3H2)-Acp-Cys。
优选的技术方案为：2-CTC树脂的取代度为0.8mmol/g。
优选的技术方案为：步骤4中，Fmoc-Acp-OH氨基酸、DIPEA、HBTU和树脂之间的摩尔比为：2.8：5：2.8：1。
优选的技术方案为：步骤9中，Fmoc-Ser(PO3HBzl)-OH氨基酸、DIPEA、HBTU和树脂之间的摩尔比为：2.8：5：2.8：1。
所述新型免疫佐剂在疫苗制备中的应用。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

Claims (5)

1.一种新型免疫佐剂，其特征在于：分子式如下：
2.一种制备权利要求1所述的新型免疫佐剂的方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：将2-CTC树脂用二氯甲烷溶胀，然后加入Fmoc-Cys(Trt)-OH和DIPEA，反应0.8-1.2小时，然后加入甲醇封端，接着抽滤去掉二氯甲烷，用二甲基甲酰胺洗涤，制得Fmoc-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤2：向Fmoc-Cys(Trt)-CTC树脂加入其体积15-25％的哌啶/二甲基甲酰胺溶液，然后鼓氮气20-40分钟，抽干后得到H2N-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤3：用二甲基甲酰胺洗涤步骤2得到的H2N-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤4：将Fmoc-Acp-OH氨基酸、DIPEA和HBTU加入到二甲基甲酰胺中进行反应，得到Fmoc-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤6：用二甲基甲酰胺洗涤步骤4得到的Fmoc-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤7：向Fmoc-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂加入其体积15-25％的哌啶/二甲基甲酰胺溶液，然后鼓氮气20-40分钟，抽干后得到H2N-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤8：用二甲基甲酰胺洗涤步骤7得到的H2N-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤9：将Fmoc-Ser(PO3HBzl)-OH氨基酸、DIPEA和HBTU加入到二甲基甲酰胺中进行反应，得到Fmoc-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤10：用二甲基甲酰胺洗涤步骤9得到的Fmoc-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤11：向Fmoc-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂加入其体积15-25％的哌啶/二甲基甲酰胺溶液，然后鼓氮气20-40分钟，抽干后得到H2N-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤12：用二甲基甲酰胺洗涤步骤11得到的H2N-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤13：按照步骤9-12的方法制备得到：
H2N-Ser(PO3HBzl)-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤14：将乙酸酐和DIPEA加入到二甲基甲酰胺中进行反应，得到Ac-Ser(PO3HBzl)-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤15：用甲醇洗涤Ac-Ser(PO3HBzl)-Ser(PO3HBzl)-Acp-Cys(Trt)-CTC树脂；
步骤16：将切割液与步骤15的产物混合，搅拌条件下切割1.5-2.5h，然后过滤去掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥后得到粗品Ac-Ser(PO3H2)-Ser(PO3H2)-Acp-Cys。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：2-CTC树脂的取代度为0.8-1.2mmol/g。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤4中，Fmoc-Acp-OH氨基酸、DIPEA、HBTU和树脂之间的摩尔比为：2.8-3.2：5-7：2.8-2.9：1。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤9中，Fmoc-Ser(PO3HBzl)-OH氨基酸、DIPEA、HBTU和树脂之间的摩尔比为：2.8-3.2：5-7：2.8-2.9：1。
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