CN116196230A

CN116196230A - 一种艾香醇组合物及其应用

Info

Publication number: CN116196230A
Application number: CN202310239231.7A
Authority: CN
Inventors: 张军; 吴建飞; 冼宝仪
Original assignee: Guangzhou Aizhuo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Aizhuo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-03-10
Filing date: 2023-03-10
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2043-03-10
Also published as: CN116196230B

Abstract

本发明公开了一种艾香醇组合物及其应用，所述艾香醇组合物由以下原料及其质量百分比组成：1，2‑己二醇90‑94％和乙基己基甘油6‑10％；该艾香醇组合物具有良好的防腐性能，且细胞毒性小和刺激性小的优点。

Description

一种艾香醇组合物及其应用

技术领域

本发明属于化妆品领域，尤其涉及一种艾香醇组合物及其应用。

背景技术

随着社会的发展和生活水平的提高，人们对化妆品功能性的多样化和产品品质提出了更高的要求。化妆品中丰富的营养物质极易导致微生物在产品中生长繁殖，在反复使用过程中，极易因接触微生物而导致化妆品被污染进而变质。

添加防腐剂可抑制化妆品中微生物滋生，防止产品变质。但现有的防腐剂要么防腐功效欠佳，要么刺激性大，难以做到在兼具良好防腐功效的同时，保持较低的刺激性。因此，开发一种兼具防腐性能和刺激性小的防腐剂具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术中的不足，本发明提供一种艾香醇组合物及其应用，该艾香醇组合物具有良好的防腐性能，且细胞毒性小和刺激性小的优点。

本发明的目的在于提供一种艾香醇组合物，所述艾香醇组合物由以下原料及其质量百分比组成：1，2-己二醇90-94％和乙基己基甘油6-10％。

优选地，所述艾香醇组合物由以下原料及其质量百分比组成：1，2-己二醇91-93％和乙基己基甘油7-9％。

优选地，所述艾香醇组合物由以下原料及其质量百分比组成：1，2-己二醇92％和乙基己基甘油8％。

本发明另一目的在于提供一种所述的艾香醇组合物在制备化妆品中的应用。

优选地，所述化妆品选自面膜液、爽肤水、精华液、原液、洁面乳、香水、卸妆水、粉底液、粉底霜、遮瑕霜、胭脂、口红、眼影或腮红中的任意一种。

优选地，以质量百分比计，所述艾香醇组合物的用量为所述化妆品的1％-5％。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1：1，2-己二醇92％和乙基己基甘油8％的艾香醇组合物。

对比例1：1，2-己二醇100％单一组分。

对比例2：乙基己基甘油100％单一组分。

1.抗菌性能测试：

参考消毒技术规范2002版2.1.8.3最小抑菌浓度测试试验(琼脂稀释法)。

1.1测试材料：

1.1.1测试菌种：本实验所使用的细菌为铜绿假单胞菌ATCC9027、大肠埃希氏菌ATCC8739和金黄色葡萄球菌ATCC6538混合菌；真菌为白色假丝酵母菌ATCC10231、黑曲霉ATCC16404，均来源于广东省微生物菌种保藏中心。

1.1.2测试培养基：细菌培养采用营养琼脂，真菌采用马铃薯葡萄糖琼脂。

1.2测试步骤：

1.2.1双倍浓度培养基的配制：称取营养琼脂培养基干粉3.3g，定容至50mL，配置成双倍营养琼脂培养基；称取马铃薯葡萄糖培养基干粉4.01g，定容至50mL；摇晃至粉末完全溶解，封口，将培养基至于高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌15分钟，将灭菌好的琼脂培养基放置在45-50℃的水浴锅中恒温备用。此培养基将用于稀释实施例1和对比例1-2的组合物。

1.2.2含实施例1和对比例1-2溶液的配制：以无菌操作取10g施例1和对比例1-2样品，然后加入无菌水，充分震荡溶解，将实施例1和对比例1-2配制成测试浓度的2倍，备用。

1.2.3含实施例1和对比例1-2的组合物培养基的配制：分别取10ml系列稀释的实施例1和对比例1-2的组合物加入平皿内。将在45℃-50℃水浴中的双倍琼脂培养基10ml，加入平皿内，边加边摇晃平板，使实施例1、对比例1-2的组合物分别和培养基充分混匀，待凝固后备用。

1.2.4菌悬液的配制

1.2.4.1细菌菌悬液的配制：无菌操作向菌种斜面加入无菌0.9％氯化钠水溶液，洗出一定的菌量，然后将洗出的菌加到与2号比浊标准管相同大小的无菌容器中，加入无菌0.9％氯化钠水溶液稀释，直到浊度与2号比浊标准管(对应的细菌近似浓度：6×10⁸cfu/ml)的浊度相同。使用前再使用无菌0.9％氯化钠水溶液进行十倍稀释使菌悬液含菌量约为10⁷cfu/ml。

1.2.4.2酵母菌悬液的配制：无菌操作向白色假丝酵母斜面加入无菌0.9％生理盐水，洗出一定的菌量，然后将洗出的菌加到与3、4号比浊标准管相同直径(大小)的无菌试管中，最后加入无菌0.9％生理盐水稀释，直到菌悬液含菌量约为10⁷cfu/ml，备用。

1.2.4.3黑曲霉菌悬液的配制：用含0.05％吐温-80无菌0.9％氯化钠水溶液对黑曲霉孢子进行洗脱，制备成黑曲霉孢子悬浮液，对黑曲霉孢子悬浮液进行过滤除去菌丝体，直到使黑曲霉孢子悬液含菌量约为10⁷cfu/ml，备用。

1.2.5用加样器取1μl～2μl(含菌量约为10⁷cfu/ml)菌悬液分别点种于含实施例1或对比例1-2的组合物的培养基的平皿，接种后所形成的菌液圈直径约5mm-8mm(每个点菌量约为10⁴cfu)。

1.2.6以同样方法接种不含实施例1和对比例1-2的组合物的琼脂平板，作为对照。

1.2.7将接种后的细菌平板放置36℃培养箱中，倒置培养24h，观察结果；真菌平板放置28℃培养箱中，倒置培养48h，观察结果。

1.3评判规定：菌落生长被完全抑制的最低抗(抑)菌液浓度为该样品对受试菌的MIC。单一菌落生长可忽略不计。

表1.实施例1和对比例1-2的组合物MIC测定结果。

由表1可知，1，2-己二醇92％和乙基己基甘油8％的艾香醇组合物对抑制大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、恶臭假单胞菌、巴西曲霉和白色假丝酵母的生长具有协同增效作用，对抑制洋葱伯克霍尔德氏菌的生长并没有协同增效作用。

2.防腐功效测试：

参照ISO11930-2019防腐功效测试方法，进行微生物防腐挑战实验，接初始种菌量为5.5×10⁶CFU/g或6.9×10⁵CFU/g，在第7、14和28天测定含菌量，计算出对应时间节点的各种微生物数量减少对数值。

表2-4中的防腐剂分别为实施例1、对比例1-2的组合物；测试体系为面膜液、保湿乳液、修复霜，护体配方和生产工艺见表2-4：

表2.面膜液成分表

表3.保湿乳液成分表

表4.修复霜成分表

试验结果判定：在第7天时细菌数量降低3个数量级，第14、28天时细菌降低3个数量级且不增加；酵母菌第7天降低1个数量级，第14、28天降低一个数量级且不增加；曲霉在14天时不增加，在28天时下降一个数量级，即为通过，结果参见表5-7。

表5.面膜液防腐功效测试数据

表6.保湿乳液防腐功效测试数据

表7.修复霜防腐功效测试数据

由表5-7可知，添加实施例1组合物的化妆品可以通过防腐功效测试，而添加对比例1和2组合物的化妆品不能通过防腐功效测试，从数据可以明显看出实施例对细菌、酵母、曲霉三种微生物的抑制效果更加均衡，所以防腐性能更优良，更适合用在日化产品中应对环境中各种微生物的污染问题。

3、刺激性测试：

3.1试验原理：鸡胚绒毛尿囊膜试验是一种较早被采用的眼刺激性体外评估方法，绒毛尿囊膜(CAM)是一个呼吸性膜，包围在鸡胚周围。本实验利用孵化的鸡胚中期绒毛尿囊膜血管系统完整、清晰和透明的特点，将一定量受试物直接与鸡胚尿囊膜接触，作用一段时间之后观察绒毛尿囊膜毒性效应指标(如：出血、凝血和血管融解)的变化，这些指标反映血管及血管网的形态结构、颜色和通透性的变化，以及反映绒毛尿囊膜蛋白质变性等现象及其受损程度，然后组合得到一个评分，用于评估受试物的眼刺激性。本试验的目的测试受试物引起鸡胚绒毛尿囊膜毒性变化的能力，标准描述了评价被评估物质潜在的眼刺激性的要素过程。

3.2试验方法：

3.2.1CAM制备：选择白莱杭鸡作为SPF种蛋，应在不影响胚胎活性或发育的情况下转移或运输鸡胚，尽量避免对鸡胚摇动、不必要的倾斜、敲打以及其它机械性刺激。将购买0d胚龄的鸡胚，用配制好的新洁尔灭(1：30)或其它不影响鸡胚生长发育的消毒剂进行消毒并清洁表面，置于温度37.5℃±0.5℃，相对湿度50％-60％的孵化箱中培育。孵化时，鸡胚应气室朝上放置于蛋架上培养。试验前，将待检测鸡胚取出，置于黑暗处，用照蛋器检查胚胎情况，选择有丰富、规律的血管的鸡胚作为实验材料。9日龄鸡胚进行照蛋检查，在蛋壳表面标记气室位置；用牙科锯齿弯镊剥去带标记的蛋壳部分，暴露白色蛋膜，应小心操作不破坏蛋膜完整性。用吸管滴加几ml 0.9％氯化钠(Nacl)溶液使蛋膜湿润，此时可立即进行下一步操作，否则应将鸡胚置于孵化器或灯光下(防止鸡胚温度降低)，放置时间不应超过20min。将0.9％氯化钠溶液倾出。小心用镊子去除内膜，保证血管膜不受损。此时应再次观察血管系统的结构，并对其完整性和是否适宜用于试验做出判断。

3.2.2加样测试：取0.3mL样品(实施例1、对比例1、对比例2分别配置成4％的水溶液)直接作用于CAM。作用3min后，用生理盐水轻轻冲洗CAM膜上的受试物，冲洗操作可能很快将CAM膜上轻度的出血变化掩盖，因此应在30s冲洗完成后观察结果，观察每种毒性效应变化的程度。每个样品测试6个鸡胚，采用终点评价法。

3.3结果观察

3.3.1出血

指血液从CAM的血管和(或)毛细血管流出，出血可以表现为多种形式，如以菜花状、平滑状、弥散的纱状或点状出血(由于血液从血管膜的不同区域有选择性的流出所致)；根据严重程度不同，对出血进行分级和记分。

a)无出血(0分)；

b)轻度出血(1分)；仅见细小血管出血和少量出血(如0.5％TexaponASV，作用5min)；

c)中度出血(2分)：小血管和大血管出血，并有明显量的血液流出(如1.0％TexaponASV，作用5min)；

d)重度出血(3分)：几乎所有血管都出血，大量血液流出(如5％TexaponASV，作用5min)。

应当注意，出血可能是短暂的，前30秒观察到的大量出血可能会覆盖随后发生的出血反应。

3.3.2凝血

指血管内和血管外蛋白质的变性，通常见于大和中等大的血管，不包括毛细血管发生的变化。血栓：即血管内凝血，因不同原因引起的血管内血流的中断，如血管压力的改变、管壁肿胀等，表现为血管内深色的凝血点。血管外凝血：可表现为血管外深色的凝血点；还可以表现为浑浊(不透明)，出现于膜的全部或一部分，可能是近似于乳白色薄纱样，或者呈乳浊状。需要仔细检查不要将凝血与受试物在水溶液中理化性质的变化相混淆(如形成胶体、沉淀等)。按严重程度不同对凝血分级和记分：

a)无凝血(0分)；

b)轻度凝血(1分)：血管内和(或)血管外轻度凝血，和(或)CAM膜轻度浑浊(轻度凝血如0.2％氢氧化钠作用5min，轻度浑浊如0.3％乙酸作用5min)；

c)中度凝血(2分)：血管内和(或)血管外中度凝血，和(或)CAM膜中度浑浊(中度凝血如0.3％氢氧化钠作用5min，轻度浑浊如3％乙酸作用5min)

d)重度凝血(3分)：血管内和(或)血管外重度凝血，和(或)CAM膜中度浑浊(中度凝血如0.5％氢氧化钠作用5min，轻度浑浊如30％乙酸作用5min)

3.3.3血管融解

指CAM膜上血管消失，可能是由于出血、血管壁张力变化等多因素变化所致。按严重程度不同对血管融解分级和记分：

a)无血管融解(0分)；

b)轻度血管融解(1分)：仅小血管融解(如0.5％TexaponASV，作用5min)；

c)中度血管溶解(2分)：小血管和大血管融解(如1％TexaponASV，作用5min)；

d)重度血管溶解(3分)：大血管和全部血管树都融解(如5％TexaponASV，作用5min)；

3.3.4要求

观察并记录出血、凝血和血管溶解毒性效应变化的程度。必要时应拍照并保存试验图片，并将观察结果与实验室历史资料或有相关参考图片作对比。

3.4结果分析

终点评分法(endpoint score,ES)

采用终点评价法进行的试验，应计算终点评分(ES)，结果保留小数点后两位：每只鸡胚记分＝每只鸡胚观察到的出血、凝血和血管融解程度的和；ES＝6只鸡胚得分的数学总和。

ES＝6只鸡胚观察到出血、凝血、血管融解的程度总和。

根据ES数值按表8对受试物眼刺激性进行分类。

表8.终点评分法结果评价

终点评分	刺激性分类
		ES≤12	无/轻刺激
12＜ES＜16	中度刺激性
		ES≥16	强刺激性/腐蚀性

3.5测试结果

表9.测试结果

从数据可以看出，对比例1和实施例1的组合物都是中度刺激，刺激性明显低于对比例2的强刺激性。综合最小抑菌浓度测试和防腐功效测试来看，在提高了综合防腐性能的基础上，实施例1的艾香醇组合物的刺激性并没有加大。

4、细胞毒性测试：

本测试参考GBT16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验。

4.1实验原理：Cell counting kit-8cytotoxicity test(CCK-8)是细胞活力标记物，活细胞线粒体中的脱氢酸可将CCK-8试剂还原成可溶于培养基的橙黄色甲臜染料，活细胞越多，被还原成的染料越多，颜色深浅与细胞数目呈线性关系。通过测定波长450nm时的吸光度值，计算细胞的生存率。

4.2试验细胞：人类永生化表皮细胞(HaCaT)、兔角膜上皮细胞(SIRC)

4.3测试步骤

4.3.1细胞准备及96孔板接种

将细胞进行复苏、传代，在正式试验开始前，至少需要传2～3代，至细胞达到稳定生长状态后才开始下一步试验。取稳定生长状态的细胞，调整细胞浓度至1×10⁵个/ml，以每孔100μl接种到96孔细胞培养板中(除最外周孔)。在细胞培养板的最外周孔中加入200μlPBS，以减少培养基的蒸发。置二氧化碳培养箱中，在37℃±1℃，湿度90％±5％，CO₂浓度5％±1％条件下进行培养。24h后，观察细胞，如果细胞融合达到孔底面积的70-80％，状态良好，即可进行下一步实验。

4.3.2样品的配制：采用培养基(如高糖DMEM培养基)将实施例1和对比例1-2的组合物样品分别配制到相应的测试浓度。

4.4.3加样测试：将接种了细胞的96孔细胞培养板从二氧化碳培养箱中取出，用75％酒精消毒表面后，置于生物安全柜中，用排枪将孔中的培养基去除，每个受试物做3个复孔，用排枪由96孔板的第2列开始加样，分别加入PBS(空白对照)、溶剂对照、制备好的样品、阳性对照，每孔100μl，每个3个复孔。置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养24h。

4.4.4细胞生存率测试：每孔加入100μl PBS清洗受试细胞，清洗2次。用排枪吸去孔中液体时，小心操作，可以孔边缘吸液，以免吸去存活细胞而影响实验结果。清洗完成后，吸去PBS。在每孔中分别加入100μl DMEM完全培养基和10μl CCK-8溶液，置于二氧化碳培养箱中，培养2h左右，培养时间应根据CCK-8的灵敏度进行确定，一般建议选择2h。在450nm波长，测定吸光度(OD)值。

4.4.5细胞生存率的计算：按照式(1)计算细胞生存率。

式中：

CSR：细胞生存率，％；

ODS：受试物平均OD值；

ODC：溶剂对照OD值；

ODb：空白对照OD值。

4.4.6结果分析：细胞存活率≥70％时，则认为样品无细胞毒性；细胞存活率<70％时，则认为样品具有潜在的细胞毒性。

表10.人类永生化表皮细胞(HaCaT)毒性测试结果

表11.兔角膜上皮细胞(SIRC)毒性测试结果

从两种细胞毒性结果来看，实施例3和对比例5在1.25g/L的浓度时无细胞毒性，而对比例6存在潜在的细胞毒性。说明实施例1的艾香醇组合物在提升了防腐性能的基础上保留了较高的细胞安全性。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管对照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims

1.一种艾香醇组合物，其特征在于，所述艾香醇组合物由以下原料及其质量百分比组成：1，2-己二醇90-94％和乙基己基甘油6-10％。

2.如权利要求1所述的艾香醇组合物，其特征在于，所述艾香醇组合物由以下原料及其质量百分比组成：1，2-己二醇91-93％和乙基己基甘油7-9％。

3.如权利要求2所述的艾香醇组合物，其特征在于，所述艾香醇组合物由以下原料及其质量百分比组成：1，2-己二醇92％和乙基己基甘油8％。

4.如权利要求1～3任一项所述的艾香醇组合物在制备化妆品中的应用。

5.如权利要求4所述的艾香醇组合物在制备化妆品中的应用，其特征在于，所述化妆品选自面膜液、爽肤水、精华液、原液、洁面乳、香水、卸妆水、粉底液、粉底霜、遮瑕霜、胭脂、口红、眼影或腮红中的任意一种。

6.如权利要求5所述的艾香醇组合物在制备化妆品中的应用，其特征在于，以质量百分比计，所述艾香醇组合物的用量为所述化妆品的1％-5％。