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CN116173202A - 一种抗lilrb4单克隆抗体注射制剂 - Google Patents

一种抗lilrb4单克隆抗体注射制剂 Download PDF

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CN116173202A
CN116173202A CN202211687825.6A CN202211687825A CN116173202A CN 116173202 A CN116173202 A CN 116173202A CN 202211687825 A CN202211687825 A CN 202211687825A CN 116173202 A CN116173202 A CN 116173202A
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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体提供了一种抗LILRB4单克隆抗体注射制剂，包括抗LILRB4单克隆抗体、缓冲盐、蛋白保护剂、表面活性剂，其中，所述注射制剂的pH为5.5‑6.5。本发明供的注射制剂通过不同含量的缓冲盐、蛋白保护剂、和表面活性剂的协同配比相互作用，协同配合，为抗LILRB4单克隆抗体提供了良好的存储环境，保证了抗LILRB4单克隆抗体的生物学活性，其中，抗LILRB4单克隆抗体能够有效抑制LILRB4抗原与其配体复合物的结合，从而阻断其与配体ApoE复合物的相互作用，进而阻止下游NF‑κB信号通路的激活和ARG1的释放，防止T细胞增殖的抑制，及组织浸润的促进，能够用于治疗癌症。

Description

一种抗LILRB4单克隆抗体注射制剂
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗LILRB4单克隆抗体注射制剂。
背景技术
急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia，AML)包括所有非淋巴细胞来源的急性白血病。急性髓系白血病是造血系统的髓系原始细胞克隆性恶性增殖性疾病。是一个具有高度异质性的疾病群，它可以由正常髓系细胞分化发育过程中不同阶段的造血祖细胞恶性转化。
白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B(LILRB)是一组I型跨膜糖蛋白，主要在髓系细胞中表达，其特征是用于配体结合的细胞外免疫球蛋白样结构域和细胞内免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)。在LILRB受体结合对应的配体激活的情况下，ITIM结构域可募集酪氨酸磷酸酶SHP-1、SHP-2或肌醇磷酸酶SHIP，从而调控相关信号通路抑制细胞因子，趋化因子及共刺激因子的表达，特异性抑制T细胞的激活。由于其免疫抑制功能，LILRB被认为是髓系细胞的免疫检查点蛋白。白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4(LILRB4)，又称ILT3，是髓系单核细胞(包括树突状细胞)表面的一种免疫抑制性跨膜蛋白。LILRB4可抑制抗原呈递细胞激活，导致免疫耐受。LILRB4在特定血液瘤细胞和实体瘤微环境中的髓系单核细胞表面也有表达。
目前，以明生物、恩格姆生物制药公司和华夏英泰(北京)生物技术有限公司均在研发靶向LILRB4的单克隆抗体药物，抗LILRB4单克隆抗体作为首款有望用于AML的T细胞激活剂，为此，抗LILRB4单克隆抗体的研究具有非常大的市场潜力。
生物大分子具有复杂的结构如一级、二级、三级等高级结构，而蛋白质的结构特别是高级结构非常脆弱，容易发生构象变化，如变性、聚集和沉淀等，抗LILRB4单克隆抗体与所有单克隆抗体一样均具有不稳定性，会经历多种化学和物理降解。保持蛋白的高级结构是发挥它们生物学活性的最基本要求，这些降解及聚集的产物会对生物制药的安全性产生很大的影响，特别是一些蛋白聚集物会激发人体的免疫反应，轻者会降低生物药物的疗效，重者甚至会造成病人的死亡，此外，单抗类药物不仅仅需要在生产的时候能得到高纯度的产品，还要在运输、储存和使用过程中保持结构稳定，所以在研发抗LILRB4单克隆抗体的同时需要对其制剂进行条件摸索，从而研发一种更加适应抗LILRB4单克隆抗体的注射制剂。
发明内容
为了解决现有技术中抗LILRB4单克隆抗体不稳定性的问题，为了保证其在运输、存储和使用过程中的稳定性，需要摸索专门针对抗LILRB4单克隆抗体所需要的制剂条件，为此，本发明公开了一种抗LILRB4单克隆抗体注射制剂。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗LILRB4单克隆抗体注射制剂，该注射制剂包括以下成分：
Figure BDA0004021465620000021
其中，所述注射制剂的pH为5.5-6.5。
本发明的有益效果如下：本发明提供的注射制剂通过不同含量的缓冲盐、蛋白保护剂、和表面活性剂的协同配比相互作用，协同配合，为抗LILRB4单克隆抗体提供了良好的存储环境，保证了抗LILRB4单克隆抗体的生物学活性，本发明提供的抗LILRB4单克隆抗体能够有效抑制LILRB4抗原与其配体复合物的结合，从而阻断其与配体ApoE复合物的相互作用，进而阻止下游NF-κB信号通路的激活和ARG1的释放，防止T细胞增殖的抑制，及组织浸润的促进；此外，本发明筛选得到的抗LILRB4单克隆抗体能够用于治疗癌症，癌症包括但不限于急性髓系白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、母细胞性浆细胞样树状突细胞肿瘤(BPDCN)、乳腺癌、肺癌或前列腺癌；该注射制剂能够保证抗LILRB4单克隆抗体在贮存和运输过程中，有效降低制剂中抗体的聚集物和降解物的生成速率，提高抗体的物理稳定性，确保活性的同时降低潜在的安全性风险，该制剂的制备工艺简单，成本低廉，浓度更高，稳定性更好，便于批量生产。
附图说明
图1为本发明实施例2中pScFv-Disb-HS载体的质粒图谱；
图2为本发明实施例3中梯度稀释ELISA抗LILRB4噬菌体单克隆抗体相对亲和力的比较图；
图3为本发明实施例5中载体pTSE的图谱；
图4为本发明实施例5中鼠源抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图5为本发明实施例6中鼠源抗体与LILRB4的结合能力比较图；
图6为本发明实施例8中鼠源抗体与人单核细胞白血病细胞(THP-1)表面LILRB4的结合能力比较图；
图7本发明实施例9中鼠源抗体与ApoE竞争结合LILRB4实验比较图；
图8为本发明实施例10中鼠源抗体抑制THP-1分泌ARG1实验比较图；
图9为本发明实施例12中嵌合抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图10为本发明实施例15中人源化抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图11为本发明实施例16中人源化抗体与LILRB4结合实验图；
图12为本发明实施例17中人源化抗体与THP-1细胞表面LILRB4的结合实验比较图；
图13为本发明实施例18中人源化抗体与ApoE竞争结合LILRB4实验比较图；
图14为本发明实施例19中人源化抗体抑制THP-1分泌ARG1实验比较图；
图15为本发明实施例20中人源化抗体分子的生物学活性检测(报告基因)实验比较图。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供了一种抗LILRB4单克隆抗体注射制剂，该注射制剂包括以下成分：
Figure BDA0004021465620000031
其中，所述注射制剂的pH为5.5-6.5。
抗LILRB4单克隆抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的重链互补决定区HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID No：2所示的重链互补决定区HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID No：3所示的重链互补决定区HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID No：4所示的轻链互补决定区LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID No：5所示的轻链互补决定区LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID No：6所示的轻链互补决定区LCDR3。
重链互补决定区HCDR1 重链互补决定区HCDR2 重链互补决定区HCDR3 轻链互补决定区LCDR1 轻链互补决定区LCDR2 轻链互补决定区LCDR3
SYTMS TISSGGTYTYYPDSVKG DGYDGFDY RSSQSLAHHSNGNTYLH KVSNRFS SQSTLVFr
SEQ ID NO：1 SEQ ID NO：2 SEQ ID NO：3 SEQ ID No：4 SEQ ID NO：5 SEQ ID NO：6
实施例2鼠源抗体分子筛选
本发明通过用LILRB4抗原(LILRB4蛋白胞外段，后续实验所使用的用LILRB4抗原、蛋白均为用LILRB4胞外段)免疫小鼠，优化免疫方法，创建噬菌体展示库，具体噬菌体展示库的构建与筛选鉴定如下：
步骤一：LILRB4抗原免疫小鼠
1、实验动物：种属品系：BALB/c，雌性，小鼠；体重：18-20g；
实验动物提供商：亦康(北京)医药科技有限公司。
2、免疫：对小鼠进行免疫，免疫抗原为人LILRB4(南京金斯瑞生物科技有限公司合成基因，本公司构建载体并表达纯化)。
步骤二：噬菌体抗体库的构建：取效价较高的小鼠脾细胞，利用Trizol试剂(购买自Ambion，货号：15596026)，提取小鼠脾细胞中的总RNA，RT-PCR获得cDNA，以cDNA为模板，采用简并引物(所用简并引物参考文献：JournalofImmunologicalMethods233（2000)167-177)进行PCR扩增，从而获得免疫小鼠抗体重链可变区(VH)基因库及轻链可变区(VL)基因库，轻重链分别双酶切，连接至同样分步骤酶切处理过的载体上，构建pScFv-Disb-HS-VH-VL基因库，pScFv-Disb-HS载体是采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名pScFv-Disb-HS载体，获得其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建小鼠免疫噬菌体抗体库。
步骤三：以LILRB4为抗原包被免疫管，抗原包被量为5μg/500μL/管，4℃包被过夜，再用4％脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和免疫噬菌体抗体库，室温封闭1小时。封闭后的免疫噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为109～1012个，室温反应1小时后，使用PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，通过0.1M pH 2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5M pH8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH7.0左右。
步骤四：将上述中和后的噬菌体感染10mL生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30分钟，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
步骤五：将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体超感染，在28℃条件下，220rpm培养过夜制备噬菌体，PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选，共进行一轮噬菌体库富集筛选。
步骤六：LILRB4噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选：经过一轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，在37℃条件下，220rpm的条件下培养至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30分钟。4000rpm，离心15分钟，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，在28℃及220rpm的条件下培养过夜。4000rpm，4℃的条件下离心15分钟后，吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定，最终筛选得到2个亲和力较高的抗LILRB4鼠源抗体候选分子，分别命名为MA-Ⅰ和MB-Ⅰ，将上述得到的单克隆抗体进行基因测序确定为正确的抗体序列，经过测序，上述筛选到的2个单克隆抗体序列如下：
鼠源抗体分子 重链可变区序列 轻链可变区序列
MA-Ⅰ SEQ ID No:7 SEQ ID No:8
MB-Ⅰ SEQ ID No:9 SEQ ID No:10
具体的，SEQ ID No:7(MA-Ⅰ的重链可变区的氨基酸序列)：
EVQLQQSGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRDGYDGFDYWGQGTTLTVSS；
SEQ ID No:8(MA-Ⅰ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQTTLSLPVSPGDQASISCRSSQSLAHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTLVPTFGGGTKLEIK；
SEQ ID No:9(MB-Ⅰ的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTNYNEKFKTKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWGQLGLREGYYAVDYWGQGTSVTVSS；
SEQ ID No:10(MB-Ⅰ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPPTFGGGTKLEIK。
实施例3梯度稀释ELISA比较抗LILRB4噬菌体单克隆抗体的亲和力
将实施例2中获得的2个鼠源抗体分子(MA-Ⅰ和MB-Ⅰ)进行单克隆噬菌体的展示和纯化，然后进行噬菌体梯度稀释ELISA实验鉴定亲和力，具体方法如下：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被LILRB4抗原，100ng/孔/100μL，在4℃温度条件下包被过夜，使用PBST洗涤三次，将实施例2中筛选得到的2个噬菌体单克隆抗体分别用PBST四倍梯度稀释，每孔加入100μL稀释后的样品，在室温下静置1小时。用PBST洗涤ELISA板，将PBST稀释后的HRP-anti-M13(购买自Bio-viewshine，货号：GE27-9421-01)单克隆抗体加入ELISA板中，在室温放置1小时。TMB显色试剂盒显色，室温显色10分钟，用2M H2SO4终止后，酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的半最大效应浓度(EC50)值，具体数据如下：
克隆 MA-Ⅰ MB-Ⅰ
EC50 1.635 1.936
通过上述数据及如图2所示，实施例2筛选出的2个不同的鼠源抗体候选分子均能够与LILRB4结合。
实施例4
本发明实施例4在实施例2的基础上进一步限定了鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的恒定区的一种，轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:15所示的鼠源Ck型的恒定区；IgG1型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示，IgG2a型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:12所示，IgG2b型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:13所示，IgG3型的恒定区的氨基酸序列如SEQID No:14所示，具体序列如下：。
SEQ ID No:11(鼠IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG；
SEQ ID No:12(鼠IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK；
SEQ ID No:13(鼠IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK；
SEQ ID No:14(鼠IgG3型的重链恒定区氨基酸序列)：
ATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRTVSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPELELNETCAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSASVTLFKVKWIFSSVVQVKQTAIPDYRNMIGQGA；
SEQ ID No:15(鼠Ck型的轻链恒定区氨基酸序列)：
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。
实施例5抗LILRB4鼠源抗体分子制备
本发明实施例5在实施例4的基础上优选的限定了鼠源抗体分子包括鼠的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:11所示)和鼠Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:15所示)。抗体制备方法具体如下：
1、在将实施例2筛选出来的2个单克隆抗体的VH和VL的编码基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，优选的重链恒定区为鼠的IgG1型重链恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:11所示)，轻链恒定区为鼠Ck型的轻链恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:15所示)，pTSE载体结构如图3所示(pTSE载体制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段)。
2、瞬时转染HEK293细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得4个单克隆抗体，同时使用BCA试剂盒(购买自：北京汇天东方科技有限公司，货号：BCA0020)进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图4所示，从左侧到右侧依次为非还原MA-Ⅰ、还原MA-Ⅰ、非还原MB-Ⅰ、还原MB-Ⅰ鼠源抗LILRB4单克隆抗体及蛋白质分子量Marker，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例6鼠源抗体与LILRB4的结合实验
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被LILRB4，100ng/孔/100μL，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1小时，加入不同稀释浓度的MA-Ⅰ、MB-Ⅰ鼠源抗体，2种抗体的起始最高浓度均是50μg/mL，分别经过5倍梯度稀释，每个抗体共稀释12个梯度，在37℃温度条件下孵育1小时。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:2000稀释的Goat Anti-Mouse IgG-HRP(购买自solarbio，货号：SE131)，在37℃温度条件下孵育1小时。TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，室温显色8分钟，然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 MA-Ⅰ MB-Ⅰ
EC50(ng/mL) 8.347 12.80
通过上述数据及如图5所示，筛选出的2个不同鼠源抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ均能与LILRB4结合。
实施例7鼠源抗体与LILR家族蛋白的结合实验
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被LILRA1，LILRA2，LILRA3，LILRA4，LILRA5，LILRA6，LILRB1，LILRB2，LILRB3，LILRB4，LILRB5，100ng/孔/100μL，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1小时，随后加入100μL MA-Ⅰ和MB-Ⅰ鼠源抗体分子，2种抗体的浓度均是50μg/mL。在37℃温度条件下孵育1小时。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入用1％ BSA-PBST 1:2000稀释的Goat Anti-Mouse IgG-HRP(购买自solarbio，货号：SE131)，在37℃温度条件下孵育1小时。TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，室温显色8分钟，然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，具体数据如下：
Figure BDA0004021465620000071
通过上述数据得出，筛选出的2个不同鼠源抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ均能与LILRB4特异性结合，且不与LILR家族其它蛋白结合。
实施例8鼠源抗体与人单核细胞白血病细胞(THP-1)表面LILRB4的结合实验
取50μL不同稀释浓度的MA-Ⅰ、MB-Ⅰ鼠源抗体，起始工作浓度为30μg/mL，3倍梯度稀释，共稀释10个梯度，加入96孔板V底板中。随后向孔中添加50μLTHP-1细胞悬浮液，浓度为2×106cells/mL，混匀。4℃条件下孵育1小时。随后每孔加入100μL PBS缓冲液，3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL/孔异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗鼠IgG(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZF-0312)(1:100稀释)。混匀后，4℃避光孵育30分钟。每孔加入100μL PBS缓冲液，3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL PBS缓冲液重悬细胞，流式细胞仪上机检测。收集数据并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 MA-Ⅰ MB-Ⅰ
EC50(ng/mL) 305.9 351.0
通过上述数据及如图6所示，筛选出的2个不同鼠源抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ均能与THP-1细胞表面的LILRB4结合。
实施例9鼠源抗体与ApoE竞争结合LILRB4实验
取THP-1细胞，浓度为2×106cells/mL，铺于V底96孔板中，每孔添加50μL细胞悬浮液。随后向孔中添加50μL不同稀释浓度的MA-Ⅰ、MB-Ⅰ鼠源抗体，起始工作浓度为400μg/mL，5倍梯度稀释，共10个梯度。另外向孔中添加100μL0.4μg/mL FITC标记的ApoE蛋白。4℃条件下避光孵育1.5小时。随后每孔加入200μL PBS缓冲液，3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL PBS缓冲液重悬细胞，流式细胞仪上机检测。收集数据并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 MA-Ⅰ MB-Ⅰ
IC50(μg/mL) 0.2037 0.4399
通过上述数据及如图7所示，筛选出的2个不同的鼠源抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ均能与ApoE竞争结合THP-1细胞表面的LILRB4。
实施例10鼠源抗体抑制THP-1分泌ARG1
取THP-1细胞，浓度为1×107cells/mL，铺于V底96孔板中，每孔添加50μL细胞悬浮液。先将不同浓度的MA-Ⅰ，MB-Ⅰ鼠源抗体和ApoE按照1:1比例，各50μL混合均匀。鼠源抗体起始工作浓度为400μg/mL，2倍梯度稀释，共8个梯度，ApoE工作终浓度为0.5μg/mL。随后向实验孔中添加50μL鼠源抗体与ApoE混合物。37℃条件下孵育20小时后，3000rpm离心5分钟。每孔取出40μL上清加入96孔平底板中，随后按照精氨酸酶活性检测试剂盒(购买自Sigma-Aldrich，货号：MAK112-1KT)配置并预热反应底物，每孔添加10μL反应底物混匀，37℃条件下反应1小时。每孔再次添加200μL反应终止液，并使用多功能酶标仪于450nm处读吸光度值。收集数据并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 MA-Ⅰ MB-Ⅰ
IC50(μg/mL) 23.86 45.97
通过上述数据及如图8所示，筛选出的2个不同的鼠源抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ均能抑制THP-1细胞分泌ARG1。
实施例11
本发明实施例11进一步的限定了单克隆抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体分子，嵌合抗体分子包括鼠源抗体分子的重链可变区、鼠源抗体分子的轻链可变区和人源抗体恒定区。人源化抗体恒定区包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，人源化抗体重链恒定区选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的恒定区的一种，人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:19所示的人Ck型的恒定区；IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:16所示，IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:17所示，IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:18所示。
SEQ ID No:16(人IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No:17(人IgG2型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No:18(人的IgG4型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；
SEQ ID No:19(人的Ck链的轻链恒定区氨基酸序列)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C。
实施例12嵌合抗体分子的制备
本发明实施例12在实施例11的基础上进一步限定了人源抗体恒定区包括人的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:16所示)和人Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:19所示)。
具体的制备方法：将实施例2中免疫噬菌体抗体库筛选得到的抗体分子MA-Ⅰ的重链可变区VH(SEQ ID No:7)和轻链可变区VL基因(SEQ ID No:8)以及MB-Ⅰ的重链可变区VH(SEQ ID No:9)和轻链可变区VL基因(SEQ ID No:10)保持鼠源序列不变，分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)上，重链恒定区为人IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)，轻链恒定区为人Ck型(氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示)。瞬时转染HEK293细胞(购买自：中国医学科学院基础医学研究所，货号为：GNHu43)，进行抗体表达，分别得到嵌合抗体CA-Ⅰ和CB-Ⅰ。嵌合抗体CA-Ⅰ和CB-Ⅰ蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果如图9所示，从左侧到右侧依次为蛋白质分子量Marker，还原CA-Ⅰ，非还原CA-Ⅰ，还原CB-Ⅰ和非还原CB-Ⅰ抗LILRB4单克隆抗体，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例13鼠源抗体分子MA-Ⅰ和MB-Ⅰ进行人源化
首先将实施例2中鼠源抗体分子MA-Ⅰ和MB-Ⅰ的序列和人抗体种系数据库(v-base)进行比较，寻找同源性较高的人抗体轻、重链种系作为候选序列，然后将鼠源抗体分子MA-Ⅰ和MB-Ⅰ的CDR序列移植到人源候选序列上进行同源建模。然后通过三维结构模拟计算可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。将设计好的包含回复突变的人源化抗体的轻、重链可变区分别由南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成，然后再连接到瞬时表达载体上，对人源化得到的轻重链组合分析，得到如下人源化抗体分子：HA-Ⅰ，HA-Ⅱ，HA-Ⅲ，HB-Ⅰ，HB-Ⅱ，HB-Ⅲ，上述筛选到的6个单克隆抗体序列如下：
单克隆抗体 重链可变区 轻链可变区
HA-Ⅰ SEQ ID No:20 SEQ ID No:21
HA-Ⅱ SEQ ID No:22 SEQ ID No:23
HA-Ⅲ SEQ ID No:24 SEQ ID No:25
HB-Ⅰ SEQ ID No:26 SEQ ID No:27
HB-Ⅱ SEQ ID No:26 SEQ ID No:28
HB-Ⅲ SEQ ID No:26 SEQ ID No:29
具体的，SEQ ID No:20(HA-Ⅰ重链可变区的氨基酸序列)：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGYDGFDYWGQGTTVTVSS；
SEQ ID No:21(HA-Ⅰ轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLAHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPTFGGGTKVEIK；
SEQ ID No:22(HA-Ⅱ重链可变区的氨基酸序列)：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGYDGFDYWGQGTTVTVSS；
SEQ ID No:23(HA-Ⅱ轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLAHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPTFGGGTKVEIK；
SEQ ID No:24(HA-Ⅲ重链可变区的氨基酸序列)：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDGYDGFD YWGQGTTVTVSS；
SEQ ID No:25(HA-Ⅲ轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLAHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPTFGGGTK VEIK；
SEQ ID No:26(HB-Ⅰ，HB-Ⅱ，HB-Ⅲ重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIG EINPSNGRTNYNEKFKTRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWGQLGL REGYYAVDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID No:27(HB-Ⅰ轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPPTFGGGTKVEIK；
SEQ ID No:28(HB-Ⅱ轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGGAVKLLIYYTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPPTFGGGTKVEIK；
SEQ ID No:29(HB-Ⅲ轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGGAVKLLIYYTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPPTFGGGTKVEIK。
实施例14
本发明实施例14在实施例13的基础上进一步的限定了人源化抗体恒定区包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，人源化抗体重链恒定区选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的恒定区的一种，人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:19所示的人Ck型的恒定区；IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:16所示，IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:17所示，IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:18所示。
上述人源抗体恒定区具体序列与实施例11相同。
实施例15人源化抗体分子的制备
本发明实施例15在实施例14的基础上进一步的限定了人源抗体恒定区包括人IgG1型重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:16所示)和人Ck型轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:19所示)。
将上述实施例13人源化得到的6个人源化抗体分子的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，重链恒定区为人IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)，轻链恒定区为Ck链(氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示)。
将人源化抗体分子HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅰ、HB-Ⅱ、HB-Ⅲ分别瞬时转染HEK293细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得单克隆抗体，同时使用BCA试剂盒(购买自：北京汇天东方科技有限公司，货号：BCA0020)进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图10所示，从左侧到右侧依次为非还原HA-Ⅰ，还原HA-Ⅰ，非还原HA-Ⅱ，还原HA-Ⅱ，非还原HA-Ⅲ，还原HA-Ⅲ，蛋白质分子量Marker，非还原HB-Ⅰ，非还原HB-Ⅰ，非还原HB-Ⅱ，非还原HB-Ⅱ，非还原HB-Ⅲ和非还原HB-Ⅲ抗LILRB4单克隆抗体，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例16人源化抗体与LILRB4结合实验
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被LILRB4，100ng/孔/100μL，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1小时，加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅰ、HB-Ⅱ、HB-Ⅲ和实施例12中制备的嵌合抗体CA-Ⅰ和CB-Ⅰ，8个抗体的起始最高浓度均是50μg/mL，分别经过5倍稀释后每个抗体均稀释12个梯度，在37℃温度条件下孵育1小时。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:5000稀释的Goat Anti Human IgG-HRP(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZB-2304)，在37℃温度条件下孵育1小时。TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，室温显色5分钟，然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HB-Ⅰ HB-Ⅱ HB-Ⅲ CA-Ⅰ CB-Ⅰ
EC50(ng/mL) 17.37 15.36 14.01 342.8 917.8 74.32 17.83 65.46
通过上述数据及实验结果如图11所示，6个不同的人源化抗体分子均能与LILRB4进行结合。其中HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ三个人源化单克隆抗体的亲和力比较接近。HB-Ⅰ、HB-Ⅱ、HB-Ⅲ三个人源化单克隆抗体中HB-Ⅲ的EC50值最低，说明其与LILRB4结合能力最好，亲和力最高。同时HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ的EC50值与嵌合抗体CA-Ⅰ相似，HB-Ⅲ的EC50值与嵌合抗体CB-Ⅰ相似，说明人源化后的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ以及HB-Ⅲ保留了鼠源亲本抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ与LILRB4的高亲和力。
实施例17人源化抗体与THP-1细胞表面LILRB4的结合实验
取50μL不同稀释浓度的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅲ、CA-Ⅰ及CB-Ⅰ抗体，起始工作浓度为32μg/mL，2倍梯度稀释，共稀释12个梯度，加入96孔板V底板中。随后向孔中添加50μLTHP-1细胞悬浮液，浓度为2×106cells/mL，混匀。4℃条件下孵育1小时。随后每孔加入100μL PBS缓冲液，3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL/孔FITC标记山羊抗鼠IgG(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZF-0312)(1:100稀释)。混匀后，4℃避光孵育30分钟。每孔加入100μL PBS缓冲液，3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL PBS缓冲液重悬细胞，流式细胞仪上机检测。收集数据并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HB-Ⅲ CA-Ⅰ CB-Ⅰ
EC50(ng/mL) 181.5 178.7 185.7 385.9 200.3 445.3
通过上述数据及如图12所示，筛选出的4个人源化抗体均能与THP-1细胞表面的LILRB4结合。此外，这4个人源化抗体分子的EC50值与对应的嵌合抗体类似，说明人源化后的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ以及HB-Ⅲ保留了鼠源亲本抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ与LILRB4的高亲和力。
实施例18人源化抗体与ApoE竞争结合LILRB4实验
取THP-1细胞，浓度为2×106cells/mL，铺于V底96孔板中，每孔添加50μL细胞悬浮液。随后向孔中添加50μL不同稀释浓度的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅲ人源化抗体，起始工作浓度为400μg/mL，5倍梯度稀释，共12个梯度。另外向孔中添加100μL 0.4μg/mL FITC标记的ApoE蛋白，4℃条件下避光孵育1.5小时。随后每孔加入200μL PBS缓冲液，3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL PBS缓冲液重悬细胞，流式细胞仪上机检测，收集数据并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HB-Ⅲ
IC50(μg/mL) 0.4797 2.752 2.559 0.4265
通过上述数据及如图13所示，筛选出的4个人源化抗体均能与ApoE竞争结合THP-1细胞表面的LILRB4。此外，HA-Ⅰ和HB-Ⅲ的IC50值最低，说明其能够有效的抑制ApoE与LILRB4的结合。
实施例19人源化抗体抑制THP-1分泌ARG1
取THP-1细胞，浓度为1×107cells/mL，铺于V底96孔板中，每孔添加50μL细胞悬浮液，先将不同浓度的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅲ人源化抗体和ApoE按照1:1比例，各50μL混合均匀。人源化抗体的起始工作浓度为400μg/mL，2倍梯度稀释，共稀释8个梯度。ApoE的工作浓度为0.5μg/mL。随后向孔中添加50μL人源化抗体与ApoE混合物。37℃条件下孵育20小时后，3000rpm离心5分钟。每孔取出40μL上清加入96孔平底板中，随后按照精氨酸酶活性检测试剂盒(购买自Sigma-Aldrich，货号：MAK112-1KT)配置并预热反应底物，每孔添加10μL反应底物混匀，37℃条件下反应1小时。每孔再次添加200μL反应终止液，并使用多功能酶标仪于450nm处读吸光度值。收集数据并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HB-Ⅲ
IC50(μg/mL) 31.20 249.5 98.54 30.57
通过上述数据及如图14所示，筛选出的4个不同的人源化均能抑制THP-1细胞分泌ARG1。此外，本发明提供的4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ和HB-Ⅲ的IC50值最低，说明其能够有效的抑制ARG1分泌。
实施例20人源化抗体分子的生物学活性检测(报告基因)
取THP-1-NF-κB-Luc工程细胞，浓度为2×106cells/mL，铺于V底96孔板中，每孔添加50μL细胞悬浮液。随后向孔中添加100μL不同稀释浓度的4种人源化抗体分子HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅲ，抗体起始工作浓度为200μg/mL，5倍梯度稀释，共计8个梯度。37℃条件下孵育2小时后，添加20μg/mL ApoE蛋白，50μL每孔。轻轻混匀细胞培养板，置于37℃条件箱孵育5小时。1000rpm离心5分钟，弃上清后，按照说明书每孔加入50μL Lysis Buffer(购买自Promega，货号：E2661)，室温作用10分钟充分裂解。每孔吸取10μL转移至384孔板中，每孔再加入等体积荧光底物(购买自Promega，货号：E2610)，室温反应5分钟，在酶标仪下读荧光数值，并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HB-Ⅲ
IC50(μg/mL) 0.7557 2.678 3.437 0.8302
通过上述数据及图15所示，筛选出的4个人源化抗体分子均能阻断ApoE与LILRB4的结合，进而抑制下游NF-κB信号通路的传导。此外，本发明提供的4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ和HB-Ⅲ的IC50值最低，说明其能够有效的抑制下游信号通路传导。
实施例22
本发明实施例22提供了一种抗LILRB4单克隆抗体注射制剂，该注射制剂包括以下成分：
Figure BDA0004021465620000141
其中，所述注射制剂的pH为5.5-6.5。
其中，抗LILRB4单克隆抗体为实施例2-20筛选的人源化抗体分子HA-Ⅰ，且氨基酸序列与实施例1相同。
缓冲盐为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲盐或乙酸-乙酸钠缓冲盐；蛋白保护剂选自山梨醇、甘露醇、海藻糖或蔗糖中的一种或多种组合；表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆中的一种或多种组合。
实施例23制剂缓冲盐的筛选
抗LILRB4单克隆抗体注射制剂制备方法：通过超滤管将分离纯化好的抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ换液至目的缓冲盐中，并将浓缩后的抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ样品稀释至所需浓度，样品用0.22μm过滤器无菌过滤，分装至2ml西林瓶中，1ml/瓶。分装完毕后检测蛋白的热稳定性，同时放置40±2℃的培养箱中，分别进行纯度和电荷异构体的稳定性检测。
分析检测方法：热稳定性：采用多功能蛋白质稳定性分析系统(Uncle)检测热变性温度(Tm)、聚集温度(Tagg)；
纯度检测：采用分装排阻层析高效液相色谱法(SEC-HPLC)分析；
电荷异构体：采用阳离子交换色谱法测定电荷异构体主峰含量(CEX-HPLC)。
(1)缓冲盐pH范围筛选
在商业化蛋白制剂常用的pH范围展开筛选。通过多功能蛋白质稳定性分析系统(Uncle)考察蛋白构象稳定性(Tm)和胶体稳定性(Tagg)，通过40±2℃加速考察蛋白纯度(SEC-HPLC)和电荷异构体(CEX-HPLC)主峰含量变化，筛选相对稳定的pH范围。
缓冲盐设计组成如下：
Figure BDA0004021465620000151
热稳定性检测结果如下：
Figure BDA0004021465620000152
40±2℃加速稳定性考察结果
Figure BDA0004021465620000153
热稳定性结果显示，缓冲液pH5.0-6.5范围内，抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ蛋白分子的Tm和Tagg相对于其他缓冲液均较高。
40±2℃加速1周，随着pH的升高，各处方样品的纯度(SEC-HPLC)呈下降趋势；实验例2和实验例3的电荷异构体主峰含量最高，且纯度(SEC-HPLC)明显高于其他实验例，实验例4和5的pH高于6.5后电荷异构体含量出现明显下降，为此综合热稳定性和40±2℃加速稳定性的考察结果，抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ蛋白在pH5.0到pH6.5之间，抗LILRB4单克隆抗体稳定性较好，后续计划选择在pH5.0到pH6.5之间为制剂缓冲盐种类进行筛选。
(2)制剂缓冲盐种类的筛选
选择缓冲能力在5.0-6.5左右的缓冲盐内展开缓冲盐体系及pH的筛选，通过40±2℃加速考察蛋白纯度(SEC-HPLC)和电荷异构体(CEX-HPLC)主峰含量变化，筛选合适的缓冲盐体系及相对更稳定的pH。
缓冲液设计组成如下：
Figure BDA0004021465620000154
Figure BDA0004021465620000161
40±2℃加速稳定性考察结果：
Figure BDA0004021465620000162
加速稳定性的结果显示，40℃条件下放置4周，各实验例纯度均不同程度下降，实验例10单体纯度下降比例最少(下降2.9％)，实验例17单体纯度下降比例最多(下降4.4％)；随着pH增高，单体纯度下降比例逐渐增多，且实验例9-11单体纯度下降比例略小于其他实验例。40±2℃放置4周后，各实验例样品的酸区含量均有所增加，实验例10增长比例最少为6.9％，实验例12增长比例最多为13.2％；各实验例样品的主峰含量均有所下降，实验例10下降比例最少为9.2％，实验例12下降比例最多为18.1％；各实验例样品的碱区含量均有所增加，处方实验例16增长比例最少为0％，实验例12增长比例最多为5.0％。综合各考察结果显示，在如上几个实验例中蛋白在组氨酸-盐酸组氨酸缓冲盐和乙酸-乙酸钠缓冲盐在pH5.5-6.5条件下均可以有效的维持抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ蛋白的稳定特性，优选的，pH值范围为6.0-6.5，组氨酸-盐酸组氨酸缓冲盐优于乙酸-乙酸钠缓冲盐。
(3)蛋白保护剂及表面活性剂的筛选。
通过40±2℃加速稳定性实验，在上一轮缓冲盐和pH值筛选的基础上开展蛋白保护剂及表面活性剂的筛选。拟定缓冲盐为20mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲盐，pH值为6.0，抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ浓度为80mg/ml，制剂处方组成设计如下表所示：
Figure BDA0004021465620000171
40±2℃加速稳定性考察结果
Figure BDA0004021465620000172
Figure BDA0004021465620000181
加速稳定性的结果显示，40℃条件下放置4周，从纯度来看，各实验例样品单体纯度均不同程度下降，实验例20和实验例30-32与实验例18-19和实验例21-29相比，实验例20和实验例30-32单体纯度下降比例最少；从电荷异构体来看，各实验例样品的电荷异构体主峰含量均有所下降，实验例31下降比例最少；从亚可见颗粒来看，不同实验例之间总颗粒数目和≥25μm的颗粒数目均不同程度增长，实验例30～32颗粒数目明显少于其他实验例，为此可以说明加入表面活性剂明显改善蛋白颗粒状况。热稳定性结果显示，除实验例26-29外，其他实验例的Tm值与Tagg值均比较高，构象稳定性与胶体稳定性均比较好。
综合各考察结果显示，添加不同蛋白保护剂的实验例单体纯度和电荷异构体稳定性均无明显差异；添加甘露醇、山梨醇、海藻糖、蔗糖的实验例19-22在亚可见颗粒表现优于添加甘氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、盐酸赖氨酸、盐酸精氨酸、氯化钠的实验例23-29，添加表面活性剂的实验例30-32在亚可见微粒方面明显优于不添加表面活性剂的实验例；为此，蛋白保护剂优选甘露醇、山梨醇、海藻糖、蔗糖。
(4)蛋白保护剂确认
根据上一轮优选的蛋白保护剂，通过B22(第二维里系数)及kD(扩散相互作用参数)对蛋白保护剂进行确认。拟定缓冲盐为20mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲盐，pH6.0，蛋白浓度为80mg/ml，制剂实验例组成设计如下表所示：
Figure BDA0004021465620000182
B22&kD结果
Figure BDA0004021465620000183
各实验组蛋白样品的B22和kD均为正值，实验例34样品的B22和kD数值更大，弱排斥作用更大，山梨醇对蛋白保护作用更好，初步选定蛋白保护剂为山梨醇。
(5)表面活性剂含量筛选
通过早期的制剂评估与筛选，发现加入表面活性剂对亚可见微粒有明显改善作用，选择组氨酸-盐酸组氨酸缓冲盐为制剂缓冲体系，以山梨醇为蛋白保护剂，以聚山梨酯20为表面活性剂，通过40±2℃的加速稳定性实验，对表面活性剂含量进行筛选。制剂实施例组成设计如下表所示：
40±2℃加速稳定性考察结果
Figure BDA0004021465620000191
Figure BDA0004021465620000192
备注：外观中A表示“无色澄明液体、无可见异物”；B表示“无色澄明液体、轻微颗粒”
加速稳定性性的结果显示，40±2℃条件下放置4周，不添加非离子型表面活性剂聚山梨酯20时，有轻微颗粒，在添加不同浓度的非离子型表面活性剂聚山梨酯20后，抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ注射制剂均具有很好的稳定性，均为无色澄明液体，无可见异物。不添加非离子表面活性剂和添加非离子表面活性剂含量太低时总颗粒数目和≥25μm的颗粒数目略多，蛋白有聚集的倾向，而表面活性剂含量太高可能产生副作用，影响制剂输注的安全性。最终选择抗体制剂中表面活性剂含量为0.01％的聚山梨酯20。
为此，通过上述成分筛选，本发明提供的抗LILRB4单克隆抗体注射制剂优选的成分如下：60-100mg/mL的抗LILRB4单克隆抗体、20mM的组氨酸-盐酸组氨酸缓冲盐、250mM的山梨醇和0.01％(w/v)的聚山梨酯20，所述注射制剂的pH为6.0。
其中，抗LILRB4单克隆抗体为实施例2-20筛选的人源化抗体分子HA-Ⅰ，且氨基酸序列与实施例1相同。
实施例24抗LILRB4单克隆抗体注射制剂成分确认(蛋白浓度的考察)
蛋白液体制剂制备方法：通过超滤管将分离纯化好的抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ换液至实验例列表缓冲盐中，按照实验例列表的要求补加各种辅料并将蛋白稀释至所需浓度，样品用0.22μm过滤器无菌过滤，分装至2ml西林瓶中，1ml/瓶。分装完毕后进行加速试验及影响因素试验，以纯度、电荷异构体和亚可见微粒为关键指标，对蛋白浓度和实验例进行确认。制剂实验例组成设计如下表所示：
Figure BDA0004021465620000201
分析检测方法：
纯度检测：采用分装排阻层析高效液相色谱法(SEC-HPLC)分析；电荷异构体：采用阳离子交换色谱法测定电荷异构体主峰含量(CEX-HPLC)。亚可见颗粒：采用微流成像法检测。实验例确认试验包括加速试验(40±2℃)、冻融稳定性实验(-20℃)、振摇稳定性试验(2-8℃，120转/min)及光照稳定性试验(25±2℃，RH60％，4500±500lx)。
1)40±2℃加速稳定性考察结果
Figure BDA0004021465620000202
加速稳定性结果显示，40±2℃条件下放置4周，抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ蛋白浓度为60mg/ml、80mg/ml、100mg/ml时在纯度、电荷异构体、总颗粒数目和≥25μm的亚可见颗粒数目等方面无明显差异，浓度为120mg/ml时纯度和电荷异构体略差。
2)冻融稳定性考察结果
Figure BDA0004021465620000203
Figure BDA0004021465620000211
由上表可以看出，抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ蛋白在-20℃冻融5次后，各处方条件下纯度、电荷异构体主峰含量及亚可见颗粒数目均无明显变化。
3)振摇稳定性考察结果
Figure BDA0004021465620000212
由上表可以看出，抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ蛋白在2-8℃条件下，120转/min，水平振摇7天后，各实验例条件下各纯度、电荷异构体主峰含量及亚可见颗粒数目均无明显变化。
4)光照稳定性考察结果
Figure BDA0004021465620000213
由上表可以看出，抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ蛋白在25±2℃、光照强度4500±500lx条件下放置10天，抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ蛋白浓度在60mg/ml、80mg/ml、100mg/ml时在纯度、电荷异构体、总颗粒数目和≥25μm的亚可见颗粒数目等方面无明显差；浓度为120mg/ml时纯度和电荷异构体略差。
由以上实验证明，抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ蛋白浓度在60-100mg/ml范围内均很稳定，蛋白浓度优选60mg/ml-80mg/ml。
经过40℃加速试验、冻融试验、振摇试验及光照试验，进一步验证了蛋白浓度为60mg/ml-80mg/ml的抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ在20mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲盐、250mM山梨醇、0.01％聚山梨酯20及pH6.0的条件下具有更好的稳定性。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗LILRB4单克隆抗体注射制剂，其特征在于，该注射制剂包括以下成分：
Figure FDA0004021465610000011
其中，所述注射制剂的pH为5.5-6.5。
2.如权利要求1所述的抗LILRB4单克隆抗体注射制剂，其特征在于，所述抗LILRB4单克隆抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的重链互补决定区HCDR1、氨基酸序列如SEQID No:2所示的重链互补决定区HCDR2、氨基酸序列如SEQ ID No:3所示的重链互补决定区HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID No:4所示的轻链互补决定区LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID No:5所示的轻链互补决定区LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID No:6所示的轻链互补决定区LCDR3。
3.如权利要求2所述的抗LILRB4单克隆抗体注射制剂，其特征在于，所述抗LILRB4单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子包括氨基酸序列如SEQ ID No:7所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID No:8所示的轻链可变区。
4.如权利要求3所述的抗LILRB4单克隆抗体注射制剂，其特征在于，所述鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的恒定区的一种，所述轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:15所示的鼠源Ck型的恒定区；所述IgG1型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示，所述IgG2a型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:12所示，所述IgG2b型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:13所示，所述IgG3型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:14所示。
5.如权利要求2所述的抗LILRB4单克隆抗体注射制剂，其特征在于，所述抗LILRB4单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：
HA-Ⅰ：氨基酸序列如SEQ ID No:20所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID No:21所示的轻链可变区；
HA-Ⅱ：氨基酸序列如SEQ ID No:22所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID No:23所示的轻链可变区；
HA-Ⅲ：氨基酸序列如SEQ ID No:24所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQ ID No:25所示的轻链可变区。
6.如权利要求5所述的抗LILRB4单克隆抗体注射制剂，其特征在于，所述人源化抗体分子还包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，所述人源化抗体重链恒定区选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的恒定区的一种，所述人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:19所示的人Ck型的恒定区；所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNo:16所示，所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:17所示，所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:18所示。
7.如权利要求1所述的抗LILRB4单克隆抗体注射制剂，其特征在于，所述缓冲盐为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲盐或乙酸-乙酸钠缓冲盐；
优选的，所述缓冲盐为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲盐。
8.如权利要求1所述的抗LILRB4单克隆抗体注射制剂，其特征在于，所述蛋白保护剂选自山梨醇、甘露醇、海藻糖或蔗糖中的一种或多种组合；
优选的，所述蛋白保护剂为山梨醇。
9.如权利要求1所述的抗LILRB4单克隆抗体注射制剂，其特征在于，所述表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆中的一种或多种组合。
10.如权利要求9所述的抗LILRB4单克隆抗体注射制剂，其特征在于，所述表面活性剂为0.01-0.02％w/v的聚山梨酯20。
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