CN116171106A

CN116171106A - 用于生产具有改变的生物碱水平的烟草植物和制品的组合物和方法

Info

Publication number: CN116171106A
Application number: CN202180057699.3A
Authority: CN
Inventors: S·普拉莫德; M·F·德戈多伊·鲁索; J·弗雷德里克; A·亚当斯; 许冬梅
Original assignee: Altria Client Services LLC
Current assignee: Altria Client Services LLC
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2023-05-26
Also published as: BR112022024801A2; JP2023528445A; WO2021247740A1; CN119138333A; US20220010324A1; US12234469B2; US20250230458A1; EP4161255A1

Abstract

本公开提供了在一组ERF基因中具有基因修饰的烟草。还提供了具有改变的总生物碱和烟碱水平和商业上可接受的叶等级的烟草植物，通过育种或转基因方法的所述烟草的开发，以及从这些烟草植物生产烟草制品。还提供了用于产生具有新型突变或等位基因的烟草植物以降低烟碱水平的组合物和方法。还提供了用于育种具有降低的烟碱或生物碱含量，同时保持烟叶等级和烟草制品质量的烟草的序列多态性和分子标记。

Description

用于生产具有改变的生物碱水平的烟草植物和制品的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年6月3日提交的美国临时申请号63/034,061的权益，其全部内容通过引用并入本文。

序列表的引入

包含名为“P34813WO00_SL.TXT”的文件中的序列表，为2,780,435字节(

中所测)，且在2021年6月2日创建，该序列表与本文一起以电子方式提交，且其全部通过引用以并入于此。

技术领域

本公开提供了低生物碱相关的染色体缺失区域(LA相关区，LA_associated_region)，烟草Nic1b基因座和该区域或基因座内或周围的基因。还提供了具有改变的总生物碱和烟碱水平和商业上可接受的叶等级的烟草植物，其通过育种或转基因方法的开发，以及从这些烟草植物生产烟草制品。

背景技术

烟草中存在四种主要生物碱：烟碱、去甲烟碱、假木贼碱和新烟草碱。烟碱是主要的生物碱，通常占商业烟草栽培品种中总生物碱的90％以上。烟碱生物合成主要发生在烟草根部。然后，烟草植物通过维管束将烟碱转运到叶，在那里烟碱被储存在液泡中。

多种因素影响烟草生物碱水平，包括基因型、环境、受精和农艺实践(例如，由打顶、创伤和食草动物损害刺激烟碱产生)。通过一系列回交将最初在古巴雪茄烟品种中发现的低生物碱性状引入到香烟品种中。低生物碱烟草种质随后登记在栽培品种白肋烟21(Burley 21)的遗传背景中(Legg et al.,Crop Science,10:212(1970))。使用低生物碱白肋烟21(LA BU21)品系的基因研究表明，两个未连接的基因座有助于烟叶中的烟碱水平。这两个基因座被称为Nic1和Nic2。LA BU21中的nic1和nic2(分别与nicotine 1和nicotine 2相同)突变是半显性的。它们在烟碱水平上显示出剂量依赖性作用，其中nic1的作用比nic2的作用强约2.4倍。Nic2基因座的分子表征已有报道。nic2突变显示含有来自乙烯应答因子(ERF)家族的转录因子基因簇的缺失，例如ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168(Shoji et al.,Plant Cell,(10):3390-409(2010))。

降低烟草中的总生物碱含量可具有许多益处。其可增加烟草作为生物质资源的价值。烟草植物中烟碱类生物碱的增加可在保护植物对抗昆虫和食草动物中起重要作用。

与生物碱在昆虫防御中的角色一致，据报道LA BU21对昆虫损害极其敏感(Legget al.,Crop Science,10:212(1970))。将具有低总生物碱百分比(约0.20％)的烤制熟化烟草等基因系与其“正常”重复亲本(总生物碱1.85-2.70％)进行比较的进一步研究报道了低生物碱品系的产量、等级指数、总N和还原糖含量低于正常烤制熟化栽培品种(Chaplinand Weeks,Crop Science,16(3):416-18(1976))。

需要鉴定调节烟草烟碱水平的基因，并开发含有改变的烟碱水平(例如，减少的烟碱)同时保持(如果不产生更优的)烟叶质量的烟草植物和制品。

发明简述

在一个方面，本公开提供了经修饰的烟草植物或其部分，其在基因中包含基因修饰并下调所述基因的表达或活性，其中所述基因编码与选自下组的多核苷酸序列具有至少80％同一性的核酸序列：SEQ ID NO:38、48、49、52-54、158、159、204和205。

在一个方面，本公开提供了经修饰的烟草植物或其部分，其包含靶向基因并下调所述基因的表达或活性的基因修饰，其中所述基因编码与选自下组的多核苷酸序列具有至少80％同一性的核酸序列：SEQ ID NO:38、48、49、52-54、158、159、204和205。

在另一方面，本公开提供了经修饰的烟草植物或其部分，其在与选自下组的多核苷酸序列具有至少80％同一性的多核苷酸中包含非天然突变：SEQ ID NO:3、13、14、17-19、38、48、49、52-54、153、154、158、159、202、203、204和205。

在一个方面，本公开提供了包含重组核酸构建体的经修饰的烟草植物或其部分，所述重组核酸构建体包含与编码非编码RNA分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中所述非编码RNA分子能够结合与选自下组的多核苷酸序列具有至少80％同一性的mRNA：SEQ ID NO:38、48、49、52-54、158、159、204和205。

在另一方面，本公开提供了经修饰的烟草植物或其部分，其在基因中包含基因修饰并下调所述基因的表达或活性，其中所述基因编码与选自下组的氨基酸序列具有至少80％同一性或相似性的多肽：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207。

在一个方面，本公开提供了经修饰的烟草植物或其部分，其包含靶向基因并下调所述基因的表达或活性的基因修饰，其中所述基因编码与选自下组的氨基酸序列具有至少80％同一性或相似性的多肽：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207。

在一个方面，本公开提供了经修饰的烟草植物或其部分，其在具有核酸序列的多核苷酸中包含非天然突变，所述核酸序列编码与选自下组的氨基酸序列具有至少80％同一性或相似性的多肽：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207。

在另一方面，本公开提供了包含重组核酸构建体的经修饰的烟草植物或其部分，所述重组核酸构建体包含与编码非编码RNA分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中所述非编码RNA分子能够结合编码与选自下组的氨基酸序列具有至少80％同一性或相似性的多肽的RNA：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207，其中所述非编码RNA分子抑制所述多肽的表达。

在一个方面，本公开提供了本文所述的烟草植物的群体，来自本文所述的烟草植物的熟化烟草材料，以及由熟化烟草材料制成的再造烟草、烟草掺合物和烟草制品。

在另一方面，本公开提供了用于产生生物碱减少的烟草植物的方法，所述方法包括：(a)下调基因的表达或活性，所述基因编码(i)与选自下组的多核苷酸序列具有至少90％同一性的核酸序列：SEQ ID NO:3、13、14、17-19、38、48、49、52-54、153、154、158、159、202、203、204和205，或(ii)与选自下组的多肽序列具有至少90％同一性或相似性的氨基酸序列：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207；以及(b)从所述烟草植物收获叶或种子。

附图说明

图1：开发具有nic1和nic2缺失标记等位基因的F5系的育种方案(*(x)表示自交)。

图2：基因座g31431和基因座g31432周围的潜在可变剪接变体。较暗的框表示检测到的转录物，而较亮的框表示计算机生成的CDS模型。

图3：ERF16而非ERF130的过表达，在LA BU21(即，SEQ ID No.1，称为“Nic1bΔ”，其不含注释的基因，参见实施例2)或g32081(β-葡萄糖苷酶18样基因)中缺失LA_associated_region，导致LA BU21中烟碱和总生物碱的增加。

图4：经由人工microRNA抑制单独的Nic1b_ERF(ERFnew、ERF210、ERF199、ERF29和ERF91L2)使烟碱水平降低至对照植物的约50％-90％。平均烟碱水平和标准误差基于来自表7的数据。

图5A：定量RT-PCR数据显示ERF199-EAR显性抑制子在PMT和QPT基因表达的影响。SPDS基因用作对照。载体对照样品显示为vc。图5B：生物碱含量由于ERF199-EAR显性抑制子的表达而改变。

图6A：定量RT-PCR数据显示ERF29-EAR显性抑制子在PMT和QPT基因表达的影响。SPDS基因用作对照。载体对照样品显示为vc。图6B：生物碱含量由于ERF29-EAR显性抑制子的表达而改变。

图7A：定量RT-PCR数据显示ERF210-EAR显性抑制子在PMT和QPT基因表达的影响。SPDS基因用作对照。载体对照样品显示为vc。图7B：生物碱含量由于ERF210-EAR显性抑制子的表达而改变。

图8A：定量RT-PCR数据显示ERF16-EAR显性抑制子在PMT和QPT基因表达的影响。SPDS基因用作对照。载体对照样品显示为vc。图8B：生物碱含量由于ERF16-EAR显性抑制子的表达而改变。

图9A：定量RT-PCR数据显示ERF130-EAR显性抑制子在PMT和QPT基因表达的影响。SPDS基因用作对照。载体对照样品显示为vc。图9B：生物碱含量由于ERF130-EAR显性抑制子的表达而改变。

图10A：定量RT-PCR数据显示ERF91过表达(“ERF91 I”)或ERF91-EAR显性抑制子(“ERF91 II”)在PMT和QPT基因表达的影响。SPDS基因用作对照。载体对照样品显示为vc。图10B：生物碱含量由于ERF91过表达(“ERF91 I”)或ERF91-EAR显性抑制子(“ERF91 II”)而改变。

图11A：定量RT-PCR数据显示ERF101过表达在PMT和QPT基因表达的影响。SPDS基因用作对照。载体对照样品显示为vc。图11B：生物碱含量由于ERF101过表达而改变。

图12A：定量RT-PCR数据显示ERFnew过表达(标记为ERF17delN)在PMT和QPT基因表达的影响。SPDS基因用作对照。载体对照样品显示为vc。图12B：生物碱含量由于ERFnew过表达(标记为ERF17delN)而改变。

图13：与对照野生型TN90相比，从温室收集的NIC1b-ERF突变植物样品的烟碱水平。植物在2018年的田间季节种植，并于2019年取样。MS13646、MS13647和MS13648是g31420(NCG1)的示例性突变。MS13649、MS13651和MS13650是ERF16的示例性突变。MS13652和MS13654是g31435(NCG15)的示例性突变。虚线表示野生型TN90范围的最高点和最低点。烟碱水平以干重百分比表示。

图14：与对照TN90相比，从温室收集的NIC1b-ERF突变植物样品的去甲烟碱水平。植物在2018年的田间季节种植，并于2019年取样。MS13646、MS13647和MS13648是g31420(NCG1)的示例性突变。MS13649、MS13651和MS13650是ERF16的示例性突变。MS13652和MS13654是g31435(NCG15)的示例性突变。虚线表示野生型TN90范围的最高点和最低点。去甲烟碱水平以干重百分比表示。

图15：与对照TN90相比，温室收集的NIC1b-ERF突变植物样品的假木贼碱水平。植物在2018年的田间季节种植，并于2019年取样。MS13646、MS13647和MS13648是g31420(NCG1)的示例性突变。MS13649、MS13651和MS13650是ERF16的示例性突变。MS13652和MS13654是g31435(NCG15)的示例性突变。虚线表示野生型TN90范围的最高点和最低点。假木贼碱水平以干重百分比表示。

图16：与对照TN90相比，温室收集的NIC1b-ERF突变植物样品的新烟草碱水平。植物在2018年的田间季节种植，并于2019年取样。MS13646、MS13647和MS13648是g31420(NCG1)的示例性突变。MS13649、MS13651和MS13650是ERF16的示例性突变。MS13652和MS13654是g31435(NCG15)的示例性突变。虚线表示野生型TN90范围的最高点和最低点。新烟草碱水平以干重百分比表示。

图17：与对照TN90相比，从温室收集的NIC1b-ERF突变植物样品的烟碱水平。植物在2019田间季节种植并于2020年取样。MS13655、MS13656和MS13657是g31437(NCG17)的示例性突变。MS13658和MS13659是ERF130的示例性突变。虚线表示野生型TN 90范围的最高点和最低点。烟碱水平以干重百分比表示。虚线表示野生型TN90范围的最高点和最低点。烟碱水平以干重百分比表示。

图18：与对照TN90相比，从温室收集的NIC1b-ERF突变植物样品的去甲烟碱水平。植物在2019田间季节种植并于2020年取样。MS13655、MS13656和MS13657是g31437(NCG17)的示例性突变。MS13658和MS13659是ERF130的示例性突变。虚线表示野生型TN90范围的最高点和最低点。烟碱水平以干重百分比表示。虚线表示野生型TN90范围的最高点和最低点。去甲烟碱水平以干重百分比表示。

图19：与对照TN90相比，温室收集的NIC1b-ERF突变植物样品的假木贼碱水平。植物在2019田间季节种植并于2020年取样。MS13655、MS13656和MS13657是g31437(NCG17)的示例性突变。MS13658和MS13659是ERF130的示例性突变。虚线表示野生型TN90范围的最高点和最低点。烟碱水平以干重百分比表示。虚线表示野生型TN90范围的最高点和最低点。假木贼碱水平以干重百分比表示。

图20：与对照TN90相比，温室收集的NIC1b-ERF突变植物样品的新烟草碱水平。植物在2019田间季节种植并于2020年取样。MS13655、MS13656和MS13657是g31437(NCG17)的示例性突变。MS13658和MS13659是ERF130的示例性突变。虚线表示野生型TN 90范围的最高点和最低点。烟碱水平以干重百分比表示。虚线表示野生型TN90范围的最高点和最低点。新烟草碱水平以干重百分比表示。

序列简述

SEQ ID No:1给出了从TN 90×LA BU21杂交鉴定的LA_associated_region的序列。

SEQ ID No:2给出了Nic1b区(包括LA_associated_region)的序列。

SEQ ID No:3-37给出了Nic1b区中35个注释基因(NCG)的基因组编码序列(gDNA，其典型地以ATG开始并以终止密码子结束，但在一些情况下还含有非翻译区(UTR)序列)。

SEQ ID No：38-72给出了Nic1b区中35个注释基因(NCG)的cDNA序列。

SEQ ID No:73-107给出了由Nic1b区中35个注释基因(NCG)编码的氨基酸序列。

SEQ ID No:108-119给出了用于抑制所选NCG基因的示例性成熟人工miRNA序列(正义或反义)。

SEQ ID No:120-124给出了用于编辑所选NCG基因的示例性向导RNA序列。

SEQ ID No:125-145给出了跨越Nic1b区或在其两侧的21个SNP标记序列。

SEQ ID No:146-148分别给出了基因座g31432的基因组编码、cDNA和氨基酸序列。

SEQ ID No:149-151分别给出了基因座g31446的基因组编码、cDNA和氨基酸序列。

SEQ ID No:152-156给出了来自Nic1b区的多种蛋白编码基因和非编码RNA的基因组编码序列。SEQ ID No:157-161给出了相应的cDNA序列。SEQ ID No:162-183给出了相应的蛋白质或非编码RNA分子序列。

SEQ ID No:184-186给出了多种转录因子基因的基因组编码序列，所述转录因子基因在正常生物碱和还原型生物碱烟草品系间表现出差异表达。SEQ ID No:187-189给出了相应的cDNA序列。SEQ ID No:190-192给出了相应的蛋白质或非编码RNA分子序列。

SEQ ID No:193-201给出了紧邻多个ERF基因或在编码来自Nic1b区的非编码RNA的基因内的SNP标记序列。

SEQ ID No:202和203给出了与Nic1b区相关的两个ERF基因的基因组编码序列。SEQ ID No:204和205给出了相应的cDNA序列。SEQ ID No:206和207给出了相应的蛋白质序列。

SEQ ID No:208-214给出了7个Nic2_ERF基因的基因组编码序列。SEQ ID No:215-221给出了相应的cDNA序列。SEQ ID No:222-228给出了相应的蛋白质序列。

各种序列包括核苷酸序列中的“N”或氨基酸序列中的“X”。“N”可以是任何核苷酸，例如A、T、G、C或一个或多个核苷酸的缺失或插入。在某些情况下，给出了一串“N”。“N”的数目不一定与该位置上未确定的核苷酸的实际数目相关。实际的核苷酸序列可比所示的“N”片段更长或更短。类似地，“X”可以是任何氨基酸残基或一个或多个氨基酸的缺失或插入。同样地，“X”的数目不一定与该位置上未确定的氨基酸的实际数目相关。实际的氨基酸序列可比所示的“X”片段更长或更短。

发明详述

除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。本领域技术人员将认识到在本公开的实践中可使用许多方法。实际上，本公开决不限于所描述的方法和材料。为本公开的目的，以下术语如下定义。

本文引用的任何参考文献，包括例如所有专利和出版物通过引用整体并入。

如本文所用，除非上下文另有明确说明，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。

如本文所用，术语“约”表示大约，粗略地，大概地，或在其范围内。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过将边界延伸至所述数值以上和以下来修饰所述范围。

如本文所用，“Nic1b基因座”是指Nic1b区内或与Nic1b区紧密相连的任何染色体位置或部位。“Nic1b区”指约150万bps长的染色体片段，对应于TN90基因组的SEQ ID No.2，并具有与低生物碱性状相关的等位基因。“nic1b突变”是指Nic1b基因座中的突变。

如本文所用，Nic1b_ERF(或复数形式，Nic1b_ERFs)是指Nic1b基因座处或周围的任一个ERF基因或基因座，且包括例如ERF101、ERF110、ERFnew、ERF199、ERF19、ERF130、ERF16、ERF29、ERF210和ERF91L2。参见表11和Kajikawa et al.,,Plant physiol.2017,174:999-1011。“Nic1b_ERF突变”是指Nic1b_ERF基因中的突变。如本文所用，突变或突变型等位基因以全部小写字母和斜体显示。基因、基因座或蛋白质名称以全部大写字母或以首字母大写显示，且可以是斜体或非斜体。

如本文所用，Nic2_ERF(或复数形式，Nic2_ERFs)是指Nic2基因座处或周围的任一个ERF基因或基因座，且包括例如ERF221、ERF115、ERF168、ERF17、ERF179、ERF189。参见表12；Shoji et al.,Plant Cell,(10):3390-409(2010)；以及Kajikawa et al.,,Plantphysiol.2017,174:999-1011。

如本文所用，突变是指可遗传的基因修饰，其被引入基因中以改变由该基因编码的产物的表达或活性。此类修饰可在基因的任何序列区域中，例如在启动子、5’UTR、外显子、内含子、3’UTR或终止子区域中。在一个方面，突变减少、抑制或消除基因产物的表达或活性。在另一方面，突变增加、提高、强化或增加基因产物的表达或活性。在一个方面，突变不是存在于特定烟草品种或栽培品种中的天然多态性。如本文所用，“突变等位基因”是指来自基因座的等位基因，其中所述等位基因包含突变。如本文所用，“诱变”是指产生不涉及转基因或在最终突变体中不存在突变相关转基因的突变。在一个方面，诱变剂是顺式的。在另一方面，诱变通过基因或基因组编辑。在另一方面，诱变通过随机诱变，例如化学(例如EMS)或物理(r-照射)诱变。

在一个方面，突变是“非天然的”或“非天然发生的”突变。如本文所用，“非天然的”或“非天然存在的”突变是指通过人类干预产生的非自发突变，且不对应于未经人类干预产生的自发突变。人类干预的非限制性实例包括诱变(例如，化学诱变、电离辐射诱变)和靶向基因修饰(例如，基于CRISPR的方法、基于TALEN的方法、基于锌指的方法)。非天然突变和非天然发生的突变不包括天然产生的自发突变(例如，通过植物种系中的异常DNA复制)。

应当理解，当鉴定突变时，参考DNA序列应当来自相同的烟草品种。例如，如果包含突变的经修饰的烟草植物来自TN90品种，则内源参考序列必须是内源TN90序列，而非来自不同烟草品种(例如K326)的同源序列。类似地，如果包含突变的经修饰的烟草细胞是TN90细胞，则内源参考序列必须是内源TN90序列，而非来自不同烟草品种(例如K326)的烟草细胞的同源序列。

在一个方面，本文提供的突变产生突变基因座的显性等位基因。显性等位基因是掩蔽相同基因座处的第二等位基因贡献的等位基因。显性等位基因可以是“显性负等位基因(dominant negative allele)”或“显性正等位基因(dominant positive allele)”。显性负等位基因或抗形态是与正常等位基因功能相反的等位基因。显性负等位基因典型地未正常地起作用且直接抑制野生型蛋白质的活性(例如，通过二聚化)或抑制野生型蛋白质的正常功能所需的第二蛋白质的活性(例如，通路的活化剂或下游组件)。例如，显性负等位基因消除或降低等位基因在杂合或纯合状态下的正常功能。显性正等位基因可增加正常的基因功能(例如，超效等位基因)或为基因提供新功能(例如，新等位基因)。当等位基因杂合个体中连锁表型的穿透性低于等位基因纯合个体中观察到的穿透性时，出现半显性等位基因。

在一个方面，本文提供的突变产生突变基因座的显性负等位基因。在另一方面，本文提供的突变产生突变基因座的显性正等位基因。

如本文所用，“诱导”突变是指通过人为干预在多核苷酸序列中产生突变。在烟草中诱导突变的许多合适方法是本领域已知的。这些方法的非限制性实例包括使用化学诱变剂，使用辐射和使用核酸酶。在一个方面，诱导突变包括使用选自下组的试剂：化学诱变剂、辐射、转座子、农杆菌(Agrobacterium)和核酸酶。

在一个方面，诱导突变包括使用化学诱变剂。在一个方面，化学诱变剂包括甲磺酸乙酯(EMS)。

在另一方面，诱导突变包括使用辐射。在一个方面，辐射包括γ射线、X射线或电离辐射。在另一方面，辐射包括使用快中子。

在一个方面，诱导突变包括使用转座子。在另一方面，诱导突变包括使用农杆菌(Agrobacterium)。

在另一方面，诱导突变包括使用核酸酶。在一个方面，核酸酶选自下组：大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录活化子样效应物核酸酶、CRISPR/Cas9核酸酶、CRISPR/Cpf1核酸酶、CRISPR/CasX核酸酶、CRISPR/CasY核酸酶，以及Csm1核酸酶。在一个方面，诱导突变包括使用CRISPR/Cas9核酸酶。在一个方面，诱导突变包括使用CRISPR/Cpf1核酸酶。在一个方面，诱导突变包括使用CRISPR/CasX核酸酶。在一个方面，诱导突变包括使用CRISPR/CasY核酸酶。在一个方面，诱导突变包括使用Csm1核酸酶。

当突变的信使RNA(mRNA)被翻译成蛋白质或多肽时，基因编码区中的突变(例如外显子突变)可产生截短的蛋白质或多肽。在一个方面，本公开提供了导致蛋白质或多肽截短的突变。如本文所用，与内源对照蛋白质或多肽相比，“截短的”蛋白质或多肽包含至少少一个氨基酸。例如，如果内源蛋白A包含100个氨基酸，蛋白质A的截短形式可包含1-99个氨基酸。

在一个方面，本文提供的突变包括无效突变。如本文所用，“无效突变”是指使得由包含突变的基因编码的蛋白质完全丧失功能的突变，或者使得由基因组基因座编码的小RNA完全丧失功能的突变。无效突变可导致mRNA转录产物的缺乏，小RNA转录产物的缺乏，蛋白质功能的缺乏或其组合。

在一个方面，与缺乏突变的内源基因相比，内源基因中的突变导致表达水平降低。在另一方面，与缺乏突变的内源基因相比，内源基因中的突变导致表达水平增加。

在一个方面，与对照烟草植物中基因的表达相比，非天然突变导致表达水平降低。在一个方面，与对照烟草植物中基因的表达相比，非天然突变导致表达水平增加。

在另一方面，与由缺乏突变的内源基因编码的蛋白质或多肽相比，内源基因中的突变导致由具有突变的内源基因编码的蛋白质或多肽活性水平降低。在另一方面，与由缺乏突变的内源基因编码的蛋白质或多肽相比，内源基因中的突变导致由具有突变的内源基因编码的蛋白质或多肽的活性水平增加。

在一个方面，与由缺乏非天然突变的多核苷酸编码的蛋白质或多肽相比，非天然突变导致由包含非天然突变的多核苷酸编码的蛋白质或多肽的活性水平降低。在另一方面，与由缺乏非天然突变的多核苷酸编码的蛋白质或多肽相比，非天然突变导致由包含非天然突变的多核苷酸编码的蛋白质或多肽的活性水平增加。

在一个方面，与缺乏突变的基因组基因座相比，基因组基因座中的突变导致表达水平降低。在另一方面，与缺乏突变的基因组基因座相比，基因组基因座中的突变导致表达水平增加。在另一方面，与由缺乏突变的基因组基因座编码的蛋白质或多肽相比，基因组基因座中的突变导致由具有突变的基因组基因座编码的蛋白质或多肽的活性水平降低。在另一方面，与由缺乏突变的基因组基因座编码的蛋白质或多肽相比，基因组基因座中的突变导致由具有突变的基因组基因座编码的蛋白质或多肽的活性水平增加。

基因表达水平由本领域常规研究。作为非限制性实例，可使用定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)、RNA测序或Northern blot测量基因表达。在一个方面，使用qRT-PCR测量基因表达。另一方面，使用Northern blot测量基因表达。在另一方面，使用RNA测序测量基因表达。

如本文所用，烟草植物可以是来自烟草(Nicotiana)属的任何植物，包括但不限于普通烟草(Nicotiana tabacum)，抱茎烟草(Nicotiana amplexicaulis)PI 271989；本氏烟草(Nicotiana benthamiana)PI 555478；毕氏烟草(Nicotiana bigelovii)PI 555485；迪勃纳氏烟草(Nicotiana debneyi)；木丝烟草(Nicotiana excelsior)PI 224063；粘毛烟草(Nicotiana glutinosa)PI 555507；古特斯比氏烟草(Nicotiana goodspeedii)PI241012；野生烟草(Nicotiana gossei)PI 230953；西烟草(Nicotiana hesperis)PI271991；奈特氏烟草(Nicotiana knightiana)PI 555527；海滨烟草(Nicotianamaritima)PI 555535；麦格鲁希凤烟草(Nicotiana megalosiphon)PI555536；裸茎烟草(Nicotiana nudicaulis)PI 555540；烟草(Nicotiana paniculate)PI 555545；皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)PI 555548；残波烟草(Nicotiana repanda)PI 555552；黄花烟草(Nicotiana rustica)；芳香烟草(Nicotiana suaveolens)PI 230960；林烟草(Nicotiana sylvestris)PI555569；绒毛烟草(Nicotiana tomentosa)PI 266379；茸毛烟草(Nicotiana tomentosiformis)；和三角叶烟草(Nicotiana trigonophylla)PI 555572。在一个方面，本文所述的烟草植物是普通烟草(Nicotiana tabacum)植物。

在一个方面，本公开提供了Nic1b_ERF基因座中包含突变的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有50或更高的USDA等级指数值的叶。在一个方面，烟草植物在Nic2基因座的ERF基因中还包含突变。在一个方面，烟草植物还在选自下组的两个或更多、三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多或所有七个基因中包含一个或多个突变：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。在一个方面，烟草植物还在ERF189、ERF115或两者中包含一个或多个突变。在一个方面，烟草植物在熟化时能够产生具有选自下组的USDA等级指数值的叶：55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高，以及95或更高。在另一方面，烟草植物在熟化时能够产生具有与对照植物在相似条件下生长和熟化时相当的USDA等级指数值的叶，其中所述对照植物与烟草植物除突变外具有基本相同的遗传背景。在另一方面，烟草植物在熟化时能够产生具有在相似条件下生长时对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的USDA等级指数值的叶，其中所述对照植物与所述烟草植物除突变外具有基本相同的遗传背景。在另一方面，烟草植物在熟化时能够产生具有对照植物的USDA等级指数值的65％-130％、70％-130％、75％-130％、80％-130％、85％-130％、90％-130％、95％-130％、100％-130％、105％-130％、110％-130％、115％-130％或120％-130％的USDA等级指数值的叶。在另一方面，烟草植物在熟化时能够产生USDA等级指数值为对照植物的USDA等级指数值的70％-125％、75％-120％、80％-115％、85％-110％或90％-100％的叶。在一个方面，烟草植物包含当在相似生长条件下生长时的对照植物的烟碱水平的1％以下、2％以下、5％以下、8％以下、10％以下、12％以下、15％以下、20％以下、25％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下或80％以下的烟碱水平，其中所述对照植物与所述烟草植物除突变外具有基本相同的遗传背景。在另一方面，烟草植物包含选自下组的总生物碱水平：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％，以及小于0.05％。在另一方面，烟草植物包含选自下组的烟碱或总生物碱水平：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％，以及小于0.05％。在另一方面，烟草植物还包含直接抑制一个或多个基因的表达或活性的转基因或突变，所述基因编码选自下组的产物：PMT、MPO、QPT、BBL、A622、天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚胺酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、烟碱吸收通透酶(NUP)和MATE转运蛋白。

在一个方面，本公开提供了在Nic1b_ERF基因座中包含突变的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有与在相似条件下生长的对照植物相当的USDA等级指数值的叶，其中所述对照植物与所述烟草植物除所述突变外具有基本相同的遗传背景。在一个方面，烟草植物在Nic2基因座的ERF基因中还包含突变。在一个方面，烟草植物还在选自下组的两个或更多、三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多或所有七个基因中包含一个或多个突变：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。在一个方面，烟草植物还在ERF189、ERF115或两者中包含一个或多个突变。在另一方面，烟草植物在熟化时能够产生具有选自下组的USDA等级指数值的叶：55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高和95或更高。在另一方面，烟草植物在熟化时能够产生具有选自下组的USDA等级指数值的叶：50-95、55-95、60-95、65-95、70-95、75-95、80-95、80-95、85-95、90-95、55-90、60-85、65-80、70-75、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90，以及90-95。在另一方面，烟草植物在熟化时能够产生具有对照植物的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的USDA等级指数值的叶。在另一方面，烟草植物在熟化时能够产生具有对照植物的USDA等级指数值的65％-130％、70％-130％、75％-130％、80％-130％、85％-130％、90％-130％、95％-130％、100％-130％、105％-130％、110％-130％、115％-130％，或120％-130％的USDA等级指数值的叶。在另一方面，烟草植物在熟化时能够产生对照植物的USDA等级指数值的70％-125％、75％-120％、80％-115％、85％-110％或90％-100％的USDA等级指数值的叶。在另一方面，烟草植物包含低于在相似生长条件下生长的对照植物的烟碱或总生物碱水平的1％、2％、5％、8％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或80％的烟碱或总生物碱的水平。在另一方面，烟草植物还包含直接抑制一个或多个基因表达或活性的转基因或突变，所述基因编码选自下组的产物：PMT、MPO、QPT、BBL、A622、天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚胺酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、烟碱吸收通透酶(NUP)和MATE转运蛋白。

在一个方面，Nic1b_ERF基因座包含选自下组的一个或多个序列：SEQ ID No.3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205。在一个方面，Nic1b_ERF基因座包含少于50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000或9000个核苷酸的序列或染色体区段。在另一方面，Nic1b_ERF基因座包含至少50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000或9000个核苷酸的序列或染色体区段。在另一方面，Nic1b_ERF基因座包含100-300、100-400、100-500、100-600、100-700、100-800、100-900、100-1000、100-1500、100-2000、100-3000、100-4000、100-5000、100-6000、100-7000、100-8000或100-9000个核苷酸的序列或染色体区段。在一个方面，Nic1b_ERF基因座包含50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-6000、6000-7000、7000-8000或8000-9000个核苷酸的序列或染色体区段。

在一个方面，Nic1b_ERF基因座包含选自下组的SNP标记的50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000、40000、50000、60000或70000个核苷酸内的序列或染色体区段：SEQ IDNo.125-145和193-201。在另一方面，Nic1b_ERF基因座包含选自下组的SNP标记的100-300、100-400、100-500、100-600、100-700、100-800、100-900、100-1000、100-1500、100-2000、100-3000、100-4000、100-5000、100-6000、100-7000、100-8000或100-9000个核苷酸内的序列或染色体区段：SEQ ID No.125-145和193-201。在另一方面，Nic1b_ERF基因座包含选自下组的SNP标记的50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-6000、6000-7000、7000-8000或8000-9000个核苷酸内的序列或染色体区段：SEQ IDNo.125-145和193-201。

在一个方面，Nic1b_ERF基因座包含选自下组的序列：SEQ ID No.3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205、及其片段。在另一方面，Nic1b_ERF基因座包含选自下组序列的50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、30000、40000、50000、60000或70000个核苷酸内的序列或染色体区段：SEQ ID No.3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205。在另一方面，Nic1b_ERF基因座包含选自下组序列的100-300、100-400、100-500、100-600、100-700、100-800、100-900、100-1000、100-1500、100-2000、100-3000、100-4000、100-5000、100-6000、100-7000、100-8000、100-9000个核苷酸的序列或染色体区段：SEQ ID No.3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205。在一个方面，Nic1b_ERF基因座包含选自下组序列的50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-1500、1500-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-6000、6000-7000、7000-8000、8000-9000个核苷酸内的序列或染色体区段：SEQ ID No.3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205。

在一个方面，Nic1b_ERF基因座包含侧接且不包含选自下组的任意两个序列的序列或染色体区段：SEQ ID No.3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205、及其片段。在一个方面，Nic1b_ERF基因座包含侧接且不包含选自下组的SNP标记的任意两个的序列或染色体区段：SEQ ID No.125-145和193-201。在一个方面，Nic1b_ERF基因座包含侧接且不包含选自下组的任意两个序列的序列或染色体区段：SEQ ID No.3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205。

在一个方面，本公开还提供了包含选自下组的突变的烟草品种、栽培品种或品系：nic1b_erf突变、nic2突变及其组合，其中所述烟草品种、栽培品种或品系具有与在相似生长条件下生长的对照烟草品种、栽培品种或品系的叶等级相当的叶等级，其中所述对照烟草品种与所述烟草品种、栽培品种或品系除所述突变外具有基本相同的遗传背景。

在一个方面，本公开还提供了非转基因烟草植物或其部分，其包含选自下组的烟碱或总生物碱水平：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％和小于0.05％，其中所述烟草植物在熟化时能够产生USDA等级指数值为50或更高、55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高和95或更高的叶。在另一方面，此类非转基因烟草植物包含小于2.0％的烟碱水平，且在熟化时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。在另一方面，此类非转基因烟草植物包含小于1.0％的烟碱水平，且在熟化时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。

在一个方面，本公开还提供了包含非转基因突变的烟草植物或其部分，其中所述非转基因突变将所述烟草植物的烟碱或总生物碱水平降低至在相似生长条件下生长的对照植物的烟碱水平的1％以下、2％以下、5％以下、8％以下、10％以下、12％以下、15％以下、20％以下、25％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下或80％以下，其中所述烟草植物能够在熟化时产生具有与对照植物的USDA等级指数值相当的USDA等级指数值的叶，且其中对照植物与烟草植物除所述非转基因突变外具有基本相同的遗传背景。

在一个方面，本公开提供了在Nic1b_ERF基因座中包含突变的烟草植物或其部分，其中所述突变在LA白肋烟21(LA Burley 21)中不存在。在一个方面，与LA Burley 21相比，本文提供的烟草植物在Nic1b_ERF基因座包含较短的染色体渗入。在另一方面，本文提供的烟草植物在Nic1b_ERF基因座中不包含完整基因或完整基因编码序列的缺失。在一个方面，本文提供的烟草植物在Nic1b_ERF基因座是纯合的。在另一方面，本文提供的烟草植物在Nic1b_ERF基因座是杂合的。在一个方面，本文提供的烟草植物包含选自下组的Nic1b_ERF突变：点突变、缺失、插入、复制和倒位。在一个方面，本文提供的烟草植物中的Nic1b_ERF突变通过选自下组的途径引入：随机诱变和靶向诱变。在另一方面，本文提供的烟草植物的Nic1b_ERF突变通过选自下组的靶向诱变方法引入：大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALEN和CRISPR。

在一个方面，本文提供的烟草植物在一个或多个基因内包含一个或多个突变，所述基因包含与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列：SEQ ID NO:3、13、14、17-19、153、154、202、203和208-214、及其片段。在一个方面，一个或多个突变降低包含与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的一个或多个基因的表达或活性：SEQ ID NO:3、13、14、17-19、153、154、202、203和208-214、及其片段。

在一个方面，本文提供的烟草植物在一个或多个基因内包含一个或多个突变，所述基因包含与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的编码序列：SEQ ID NO:38、48、49、52至54、158、159、204、205和215-221、及其片段。在一个方面，一个或多个突变降低包含与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的编码序列的一个或多个基因的表达或活性：SEQ ID NO:38、48、49、52-54、158、159、204、205和215-221、及其片段。

在一个方面，本文提供的烟草植物在编码与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽的一个或多个基因内包含一个或多个突变：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207，以及222-228、及其片段。在一个方面，一个或多个突变降低编码与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽的一个或多个基因的表达或活性：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207以及222-228、及其片段。

在一个方面，本文提供的烟草植物在一个或多个基因内包含一个或多个突变，所述基因包含与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列：SEQ ID NO:4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202-205和72、及其片段。在一个方面，一个或多个突变降低包含与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列的一个或多个基因的表达或活性：SEQ ID NO:4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202-205和72、及其片段。

在一个方面，本文提供的烟草植物在一个或多个基因内包含一个或多个突变，所述基因包含与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的编码序列：SEQ ID NO:49、52、53、204、205和54、及其片段。在一个方面，一个或多个突变降低包含与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的编码序列的一个或多个基因的表达或活性：SEQ ID NO:49、52、53、204、205和54、及其片段。

在一个方面，本文提供的烟草植物在一个或多个基因内包含一个或多个突变，所述基因编码与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽：SEQ ID NO:84、87、88和89、及其片段。在一个方面，一个或多个突变降低编码与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多肽的一个或多个基因的表达或活性：SEQ ID NO:84、87、88和89、及其片段。

LA Burley21(也称为LA BU21)是通过将来自古巴雪茄品种的低生物碱基因通过若干回交引入Burley 21中而产生的低总生物碱烟草品系(Legg等，1970)。与其亲本Burley21约3.5％(干重)相比，其具有约0.2％总生物碱(干重)。LA BU21的叶级远低于商业上可接受的标准。LA BU21还表现出其他不利的叶表型，其特征在于产量低，成熟延迟和衰老，对昆虫食草敏感性较高，熟化后最终产品质量较差(Chaplin和Weeks,Crop Sci.16:416-418(1976)；Legg et al.Crop.Sci.10:212(1970)；Chaplin和Burk,Crop Sci.75:133-136(1983))。LA BU21叶还表现出诸如更高的多胺含量，更高的叶绿素含量和更多的叶肉细胞/单位叶面积的性状。

除非另有说明，本文提及的烟草植物、品种、栽培品种或品系的生物碱、多胺或烟碱水平(或其他叶化学或特性表征)或叶等级指数值的测量值是指平均测量值，包括，例如单个代表性植物的多个叶的平均值，或来自单个品种、栽培品种或品系的烟草植物的代表性群体的平均测量值。除非另有说明，在打顶两周后，在打顶后第3、4和5号叶收集的叶片样品中测量本文所述烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或其他化学或特性表征)。在另一方面，在打顶后在具有最高烟碱、生物碱或多胺水平(或其他叶化学或特性表征)的叶中测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或其他叶化学或特性表征)。在一个方面，在打顶后在以下的叶编号中测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在另一方面，在打顶后在具有连续叶编号的两个或更多的叶片中测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或其他叶化学或特性表征)，所述叶编号选自下组：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30。在另一方面，在打顶后在叶片中测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或其他叶化学或特性表征)，所述叶编号选自下组：1-5、6-10、11-15、16-20、21-25和26-30。在另一方面，在打顶后在两个或更多的叶片中测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或其他叶化学或特性表征)，所述叶编号选自下组：1-5、6-10、11-15、16-20、21-25和26-30。在另一方面，打顶后在三片或更多的叶片中测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或其他叶化学或特性表征)，所述叶编号选自下组：1-5、6-10、11-15、16-20、21-25和26-30。

如本文所用，叶编号基于烟草茎上的叶位置，其中叶编号1是打顶后最新的叶(顶部)且最高的叶编号分配给最老的叶(底部)。

用于确定平均测量值(例如，生物碱或烟碱水平或叶分级)的烟草植物的群体或烟叶集合可以是任何大小，例如，5、10、15、20、25、30、35、40或50。遵循工业上可接受的标准来确定平均测量值或等级指数值。

如本文所用，“打顶”是指当烟草植物接近营养成熟并在生殖生长开始时，除去茎尖，包括SAM、花和至多几个相邻的叶。典型地，烟草植物在花苞期(花开始出现后不久)进行打顶。例如，当50％的植物具有至少一朵开放的花时，可以打顶温室或田间生长的烟草植物。打顶烟草植物使得顶端优势的丧失且还诱导生物碱产量增加。

典型地，在打顶后约2周测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或其他叶化学或特性表征)。也可用其他时间点。在一个方面，在打顶后约1、2、3、4或5周测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或其他叶化学或特性表征)。在另一方面，在打顶后约3、5、7、10、12、14、17、19或21天测量烟草植物的烟碱、生物碱或多胺水平(或另一叶化学或特性表征)。

如本文所用，“相似的生长条件”或“相当的生长条件”是指用于种植两种或更多种植物基因型和在两种或更多种植物基因型之间进行有意义的比较的相似的环境条件和/或农艺实践，使得环境条件或农艺实践均不会有助于或解释在两种或更多种植物基因型间观察到的任何差异。环境条件包括，例如光、温度、水(湿度)和营养(例如氮和磷)。农艺实践包括，例如播种、修剪、底切、移植、打顶和抽吸。参见Tobacco,Production,Chemistry andTechnology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford(1999),pp 70-103的第4B和4C章。

“生物碱”是在植物中天然存在的复杂的含氮化合物，且在人和动物中具有药理学作用。“烟碱”是商品化香烟烟草中的主要天然生物碱，占烟草中生物碱含量的约90％。烟草中的其他主要生物碱包括可替宁、去甲烟碱、麦斯明、烟碱、假木贼碱和新烟草碱。次要的烟草生物碱包括烟碱-n-氧化物、N-甲基新烟草碱、N-甲基假木贼碱、假脱氧烟碱、2,3-联吡啶和其他。

在一个方面，与在相似生长条件下生长时没有nic1b_erf突变或Nic1b_ERF引导的转基因的对照烟草植物相比，本文提供的烟草植物包含较低水平的总生物碱或单独的生物碱。在另一方面，与在相似生长条件下生长的对照烟草植物相比，本文提供的烟草植物包含较低水平的一种或多种选自下组的生物碱：可替宁、去甲烟碱、麦斯明、烟碱、假木贼碱和新烟草碱。在一个方面，较低的生物碱或烟碱水平是指对照烟草植物的生物碱或烟碱水平的1％以下、2％以下、5％以下、8％以下、10％以下、12％以下、15％以下、20％以下、25％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下或80％以下的生物碱或烟碱水平。在另一方面，较低的生物碱或烟碱水平是指对照烟草植物的生物碱或烟碱水平的约0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-6％、6％-7％、7％-8％、8％-9％、9％-10％、11％-12％、12％-13％、13％-14％、14％-15％、15％-16％、16％-17％、17％-18％、18％-19％、19％-20％、21％-22％、22％-23％、23％-24％、24％-25％、25％-26％、26％-27％、27％-28％、28％-29％，或29％-30％的生物碱或烟碱水平。在另一方面，较低的生物碱或烟碱水平是指对照烟草植物的生物碱或烟碱水平的约0.5％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％的生物碱或烟碱水平。

生物碱水平可通过本领域已知的方法测定，例如通过基于气液色谱法、高效液相色谱法、放射免疫测定法和酶联免疫吸附测定法的定量。例如，烟碱生物碱水平可通过基于CORESTA Recommended Method No.7,1987和ISO标准(ISO TC 126N 394E。对于使用配备有毛细管柱和FID检测器的气-液色谱的方法，还参见Hibi et al.,Plant Physiology 100:826-35(1992))。除非另有说明，本文所述的所有生物碱水平使用根据CORESTA Method No62,Determination of Nicotine in Tobacco and Tobacco Products by GasChromatographic Analysis,February 2005，以及1999年3月23日出版在FederalRegister Vol.64,No.55(和2009年1月7日修订的Vol.74,No.4)的Centers for DiseaseControl and Prevention’s Protocol for Analysis of Nicotine,Total Moisture andpH in Smokeless Tobacco Products中定义的那些方法测量。

或者，烟草总生物碱可使用分段流动比色法测量，该方法由Skalar InstrumentCo(West Chester,PA)改进并由Collins et al.,Tobacco Science13:79-81(1969)中描述，用于分析烟草样品。简言之，在分析总生物碱和还原糖前，对烟草样品干燥、研磨并提取。然后，该方法采用乙酸/甲醇/水萃取以及木炭进行脱色。总生物碱的测定基于氯化氰与烟碱生物碱在芳族胺存在下反应形成有色络合物，其在460nm下测量。除非另有说明，本文所述的总生物碱水平或烟碱水平是基于干重(例如，总生物碱百分比或烟碱百分比)。

在一个方面，与在相似生长条件下生长时没有Nic1b_ERF突变或Nic1b_ERF引导的转基因的对照烟草植物相比，本文提供的烟草植物包含较低水平的烟碱。在一个方面，较低烟碱水平是指对照烟草植物的平均烟碱水平的1％以下、2％以下、5％以下、8％以下、10％以下、12％以下、15％以下、20％以下、25％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下或80％以下的平均烟碱水平。在另一方面中，较低烟碱水平是指对照烟草植物的平均烟碱水平的约0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-6％、6％-7％、7％-8％、8％-9％、9％-10％、11％-12％、12％-13％、13％-14％、14％-15％、15％-16％、16％-17％、17％-18％、18％-19％、19％-20％、21％-22％、22％-23％、23％-24％、24％-25％、25％-26％、26％-27％、27％-28％、28％-29％或29％-30％的平均烟碱水平。在另一方面，较低的烟碱水平是指对照烟草植物的平均烟碱水平的约0.5％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％的平均烟碱水平。

在一个方面，本文提供的烟草植物包含选自下组的平均烟碱或总生物碱水平：以干重计约0.01％、0.02％、0.05％、0.75％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、5％、6％、7％、8％和9％。在另一方面，本文提供的烟草植物包含选自下组的平均烟碱或总生物碱水平：以干重计约0.01％-0.02％、0.02％-0.05％、0.05％-0.75％、0.75％-0.1％、0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％-0.3％、0.3％-0.35％、0.35％-0.4％、0.4％-0.5％、0.5％-0.6％、0.6％-0.7％、0.7％-0.8％、0.8％-0.9％、0.9％-1％、1％-1.1％、1.1％-1.2％、1.2％-1.3％、1.3％-1.4％、1.4％-1.5％、1.5％-1.6％、1.6％-1.7％、1.7％-1.8％、1.8％-1.9％、1.9％-2％、2％-2.1％、2.1％-2.2％、2.2％-2.3％、2.3％-2.4％、2.4％-2.5％、2.5％-2.6％、2.6％-2.7％、2.7％-2.8％、2.8％-2.9％、2.9％-3％、3％-3.1％、3.1％-3.2％、3.2％-3.3％、3.3％-3.4％、3.4％-3.5％，以及3.5％-3.6％。在另一方面，本文提供的烟草植物包含选自下组的平均烟碱或总生物碱水平：以干重计约0.01％-0.1％、0.02％-0.2％、0.03％-0.3％、0.04％-0.4％、0.05％-0.5％、0.75％-1％、0.1％-1.5％、0.15％-2％、0.2％-3％和0.3％-3.5％。

本公开还提供了具有改变的烟碱水平而其他烟草性状(例如叶等级指数值)不存在负面影响的烟草植物。在一个方面，低烟碱或无烟碱烟草品种提供商业上可接受等级的熟化烟草。基于以下因素评估烟草等级，包括但不限于叶柄位置、叶尺寸、叶颜色、叶均匀性和完整性、成熟度、质地、弹性、光泽(与叶的着色强度和深度以及光泽有关)、吸湿性(烟叶吸收和保留环境水分的能力)和绿色细微差别或脱落。叶等级可以，例如使用由USDepartment of Agriculture的Agricultural Marketing Service(7U.S.C.§511)公布的官方标准等级来确定。参见例如，白肋烟官方标准等级(美国31型和外国93型)，1990年11月5日生效(55F.R.40645)；烤制熟化烟草官方标准等级(美国11、12、13、14型和外国92型)，1989年3月27日生效(54F.R.7925)；Pennsylvania Seedleaf烟草官方标准等级(美国41型)，1965年1月8日生效(29F.R.16854)；Ohio雪茄烟官方标准等级(美国42、43和44型)，1963年12月8日生效(28F.R.1171928和28F.R.11926)；Wisconsin Cigar-Binder烟草官方标准等级(美国54和55型)，1969年11月20日生效(34F.R.17061)；Wisconsin Cigar-Binder烟草官方标准等级(美国54和55型)，1969年11月20日生效(34F.R.17061)；Georgia和Florida Shade-Grown Cigar-Wrapper烟草官方标准等级(美国62型)，1971年4月生效。USDA等级指数值可根据工业上可接受的等级指数来确定。参见，例如，Bowman et al,Tobacco Science,32:39-40(1988)；Legacy Tobacco Document Library(BatesDocument#523267826-523267833,July 1,1988,Memorandum on the Proposed BurleyTobacco Grade Index)；以及Miller et al.,1990,Tobacco Intern.,192:55-57(所有上述参考文献以其全文引入作为参考)。除非另有说明，本文所述的任何植物的USDA等级指数是所接收的联邦等级的0-100数值表示，且是所有茎位置的加权平均值。等级指数越高表示质量越高。或者，可通过高光谱成像来确定叶等级。参见例如WO2011/027315(2011年3月10日公开，且其全部内容通过引用以并入)。

在一个方面，与在相似生长条件下生长时的对照烟草植物相比，本文提供的烟草植物包含相似水平的选自下组的一种或多种烟草芳香化合物：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、labdenoid、cembrenoid、糖酯和还原糖。在另一方面，本文提供的烟草植物包含nic1b_erf突变、nic2突变或其组合，其对选自下组的一种或多种烟草芳香化合物水平没有影响：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、labdenoid、cembrenoid、糖酯和还原糖。

如本文所用，烟草芳香化合物是与烟草烟雾的风味和香味相关的化合物。这些化合物包括但不限于3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、cembrenoid和labdenoid二萜和糖酯。烟草芳香化合物的浓度可通过本领域任何已知的代谢物图谱方法测定，包括但不限于气相色谱质谱(GC-MS)、核磁共振光谱、液相色谱-质谱联用。参见Weckwerth和Kahl编辑的TheHandbook of Plant Metabolomics,(Wiley-Blackwell)(2013年5月28日)。

如本文所用，“还原糖”是具有游离或潜在游离的醛或酮基团的任何糖(单糖或多糖)。葡萄糖和果糖通过降低烟雾pH和有效降低“游离”未质子化烟碱的量而在香烟烟雾中充当烟碱缓冲剂。例如，还原糖通过改变烟碱和其他烟草生物碱的感觉影响来平衡烟味。已报道了由种植条件引起的不同烟草品种、相同品种和相同植物品系中糖含量和生物碱含量之间的反比关系。还原糖水平可使用分段流动比色法测量，该方法由Davis,TobaccoScience 20:139-144(1976)中描述并由Skalar Instrument Co(West Chester,PA)改进，用于分析烟草样品。例如，用碳酸钠溶液透析样品。将新铜试剂加入样品并加热溶液。新铜试剂螯合物在糖的存在下还原，得到在460nm下测量的有色络合物。

在一个方面，本文提供的烟草植物在Nic1b_ERF或Nic2基因座包含一种或多种非天然存在的突变型等位基因，其降低或消除来自Nic1b_ERF或Nic2基因座的一个或多个基因活性。在一个方面，这些突变等位基因导致较低的烟碱水平。突变体Nic1b_ERF或Nic2等位基因可通过本领域已知的任何方法引入，包括随机或靶向诱变途径。

此类诱变方法包括但不限于用甲基硫酸乙酯(EMS)处理种子(Hildering和Verkerk,In,The use of induced mutations in plant breeding.Pergamon press,pp317-320,1965)或UV-辐射、X-射线，以及快中子辐射(参见，例如，Verkerk,Neth.J.Agric.Sci.19:197-203,1971；和Poehlman,Breeding Field Crops,Van NostrandReinhold,New York(3.sup.rd ed),1987)，转座子标记(Fedoroff et al.,1984；美国专利号4,732,856和美国专利号5,013,658)，以及T-DNA插入方法(Hoekema et al.,1983；美国专利号5,149,645)。EMS诱导的诱变由在基因组长度上的化学诱导随机点突变组成。快中子诱变包括将种子暴露于中子轰击，其通过双链DNA断裂导致大的缺失。转座子标记包括在内源基因内插入转座子以减少或消除基因的表达。烟草基因中可能存在的突变类型包括例如点突变、缺失、插入、复制和倒位。此类突变理想地存在于烟草基因的编码区中；然而，烟草基因的启动子区和内含子或非翻译区中的突变也可能是所需的。

此外，使用变性HPLC或选择性内切核酸酶消化所选择的PCR产物来筛选化学诱导的突变TILLING(靶向基因组中诱导的局部病变)的快速且可自动化的方法也适用于本公开。参见，McCallum et al.(2000)Nat.Biotechnol.18:455-457。影响基因表达或干扰基因功能的突变可使用本领域熟知的方法确定。基因外显子中的插入突变通常导致无效突变体。保守残基的突变可特别有效地抑制蛋白质的功能。在一个方面，包含无义突变(例如，终止密码子)的烟草植物是本文所述的一种或多种NCG基因。

在一个方面，本公开还提供了具有改变的烟碱水平同时保持商业上可接受的叶质量的烟草品系。这些品系可通过经由精确基因组工程技术将突变引入Nic1b_ERF或Nic2基因座处的一个或多个基因中来产生，所述精确基因组工程技术例如转录活化物样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、锌指核酸酶和成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/Csm1系统及其组合(参见，例如美国专利申请公开2017/0233756)。参见例如Gaj et al.,Trends in Biotechnology,31(7):397-405(2013)。

诱变烟草植物的筛选和选择可通过本领域普通技术人员已知的任何方法。筛选和选择方法的实例包括但不限于Southern分析，用于检测多核苷酸的PCR扩增，Northernblot，RNA酶保护，引物延伸，用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增，Sanger测序，下一代测序技术(例如Illumina、PacBio、Ion Torrent、454)，用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶测定，以及用于检测多肽的蛋白质凝胶电泳、Western blot、免疫沉淀和酶联免疫测定。其他技术(诸如原位杂交、酶染色和免疫染色)也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于执行所有参考技术的方法是已知的。

在一个方面，本文提供的烟草植物或植物基因组被选自下组的核酸酶突变或编辑：大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录活化物样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas9核酸酶、CRISPR/Cpf1核酸酶或CRISPR/Csm1核酸酶。

如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指内源植物基因组核酸序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个核苷酸的靶向诱变，或内源植物基因组核酸序列的去除或替换。在一个方面，提供的编辑的核酸序列与内源核酸序列具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性。在一个方面，提供的编辑的核酸序列与选自下组的多核苷酸具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性：SEQ ID NO:3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159、202-205和208-221、及其片段。在另一方面，提供的编辑的核酸序列与编码选自下组的多肽的多核苷酸具有至少99.9％、至少99.5％、至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％、至少94％、至少93％、至少92％、至少91％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的序列同一性：SEQ ID NO:3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159、202-205和208-221。

大范围核酸酶、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9、CRISPR/Csm1和CRISPR/Cpf1在基因组序列的靶位点处诱导双链DNA断裂，然后通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)的天然过程进行修复。然后，在切割位点发生序列修饰，其可包括在NHEJ的情况下导致基因破坏的缺失或插入，或通过HR整合供体核酸序列。在一个方面，所提供的方法包括用核酸酶编辑植物基因组，所提供的核酸酶通过与供体多核苷酸的HR使植物基因组中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或10个以上的核苷酸发生突变。在一个方面，提供的突变由使用核酸酶的基因组编辑引起。在另一方面，提供的突变由非同源末端连接或同源重组引起。

在一个方面，本文提供的突变提供活化目标基因的表达或活性的显性突变体，所述目标基因例如选自下组的基因：生物合成酶、调节转录因子、转运蛋白、分解代谢酶或其组合，用作一种或多种抗氧化剂。

大范围核酸酶，通常在微生物中鉴定，是具有高活性和长识别序列(>14bp)的独特酶，使得靶DNA的位点特异性消化。天然存在的大范围核酸酶的工程化形式典型地具有延伸的DNA识别序列(例如，14-40bp)。大范围核酸酶的工程化可能比ZFN和TALEN的工程化更具挑战性，因为大范围核酸酶的DNA识别和切割功能在单个结构域中交织。诱变和高通量筛选的专用方法已经用于产生新的大范围核酸酶变体，其识别独特序列并具有改善的核酸酶活性。

ZFN是由与FokI限制性内切核酸酶的切割结构域融合的工程化锌指DNA结合结构域组成的合成蛋白质。ZFN可以被设计成切割几乎任何长链双链DNA以修饰锌指DNA结合域。ZFN由单体形成二聚体，所述单体由融合到锌指阵列的FokI内切核酸酶的非特异性DNA切割结构域组成，所述锌指阵列被工程化以结合靶DNA序列。

ZFN的DNA结合结构域典型地由3-4个锌指阵列组成。相对于锌指∞-螺旋起点的位置-1、+2、+3和+6处的氨基酸(其有助于与靶DNA的位点特异性结合)可被改变和定制以适合特异性靶序列。其他氨基酸形成共有主链以产生具有不同序列特异性的ZFN。选择ZFN的靶序列的规则是本领域已知的。

FokI核酸酶结构域需要二聚化以切割DNA，并且因此需要两个具有其C-端区域的ZFN以结合切割位点的相反的DNA链(间隔5-7bp)。如果两个ZF结合位点是回文的，则ZFN单体可切割靶位点。如本文所用，术语ZFN是广义的，且包括单体ZFN，其可在没有另一ZFN的帮助下切割双链DNA。术语ZFN也用于指一对ZFN的一个或两个元件，其被工程化以一起作用以在相同位点切割DNA。

不受任何科学理论的限制，因为锌指结构域的DNA结合特异性原则上可使用各种方法之一重新工程化，所以定制的ZFN理论上可构建成靶向几乎任何基因序列。用于工程化锌指结构域的公开可用的方法包括相邻组装(CoDA)、寡聚体工程化(OPEN)和模块化组装(Modular Assembly)。

TALEN是通过将转录活化物样效应子(TALE)DNA结合结构域与FokI核酸酶结构域融合而产生的人工限制酶。当TALEN对的每个成员与靶位点两侧的DNA位点结合时，FokI单体二聚化并在靶位点引起双链DNA断裂。如本文所用，术语TALEN是广义的，且包括单体TALEN，其可切割双链DNA而无需另一TALEN的帮助。术语TALEN也用于指共同作用以在相同位点切割DNA的一对TALEN的一个或两个元件。

转录活化物样效应物(TALE)可被工程化以实际上结合任何DNA序列。TALE蛋白是衍生自黄单胞菌属(Xanthomonas)的各种植物细菌病原体的DNA结合结构域。黄单胞菌属病原体在感染期间分泌TALE到宿主植物细胞中。TALE移动到细胞核，在细胞核中识别并结合宿主基因组中特定基因的启动子区中的特定DNA序列的启动子区中的特定DNA序列。TALE具有由33-34个氨基酸的13-28个重复单体组成的中央DNA结合结构域。除在12位和13位的高变氨基酸残基，每个单体的氨基酸是高度保守的。这两个可变氨基酸被称为重复可变双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，且RVD的调节可识别连续的DNA碱基。氨基酸序列和DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复片段的组合来工程化特定的DNA结合结构域。

除野生型FokI切割结构域外，已设计了具有突变的FokI切割结构域的变体，以改善切割特异性和切割活性。FokI结构域作为二聚体起作用，需要两个具有独特DNA结合结构域的构建体用于具有适当的定向和间距的靶向基因组中的位点。TALEN DNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基数目和两个单独的TALEN结合位点之间的碱基数目都是实现高水平活性的参数。

TALE结合结构域的氨基酸序列和DNA识别间的关系允许可设计的蛋白。软件程序(诸如DNA Works)可用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法是本领域技术人员已知的。参见Doyle et al,.Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak etal.,Nucleic Acids Research(2011).39:e82；和tale-nt.cac.cornell.edu/about。

CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Csm1或CRISPR/Cpf1系统是基于FokI的方法ZFN和TALEN的替代物。CRISPR系统基于RNA引导的工程化核酸酶，其使用互补碱基配对来识别靶位点处的DNA序列。

CRISPR/Cas9、CRISPR/Csm1和CRISPR/Cpf1系统是细菌和古细菌的适应性免疫系统的一部分，通过以序列依赖性方式切割外源DNA来保护它们免于侵入核酸(诸如病毒)的侵害。通过在CRISPR基因座近端的两个相邻重复之间整合称为间隔区的侵入DNA的短片段获得免疫。CRISPR阵列(包括间隔子)在随后遇到侵入性DNA时被转录，并被加工成长度约40nt的小干扰CRISPR RNA(crRNA)，其与反式活化CRISPR RNA(tracrRNA)结合以活化并引导Cas9核酸酶。这在侵入DNA中切割被称为原型间隔区的同源双链DNA序列。切割的先决条件是在靶DNA下游存在保守的原型间隔区邻近基序(PAM)，其通常具有序列5-NGG-3，但NAG频率较低。特异性由PAM上游大约12个碱基的所谓“种子序列”提供，其必须在RNA和靶DNA之间匹配。Cpf1和Csm1以类似于Cas9的方式作用，但Cpf1和Csm1不需要tracrRNA。

在另一方面，提供的烟草植物在编码烟碱脱甲基酶(例如，CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10)的一个或多个基因座中还包含一个或多个突变，与在编码烟碱脱甲基酶的一个或多个基因座中缺乏一个或多个突变的对照植物相比，所述突变赋予降低量的去甲烟碱(参见美国专利号8,319,011；8,124,851；9,187,759；9,228,194；9,228,195；9,247,706)。在一个方面，与在相当的条件下生长和熟化的对照植物相比，描述的经修饰的烟草植物还包含降低的烟碱脱甲基酶活性。

本公开还提供了用于抑制植物(特别是烟草属植物，包括各种商业品种的烟草植物)中来自Nic1b_ERF基因座的一种或多种多肽的表达或功能的组合物和方法。

在一个方面，本公开提供包含异源表达盒的烟草植物或其部分，所述异源表达盒包含基因的Nic1b_ERF抑制序列，所述基因包含与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列：SEQ IDNO:3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205、及其片段，其中所述抑制序列与在植物细胞中有功能的启动子可操作地连接，且其中所述抑制序列与序列的至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸的片段具有至少90％的序列同一性，所述序列与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性：SEQ ID NO:3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205、及其片段。在另一方面，本公开提供包含异源表达盒的烟草植物或其部分，所述异源表达盒包含基因的Nic1b_ERF抑制序列，所述基因包含与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列：SEQ ID NO:3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205、及其片段，其中所述抑制序列与在植物细胞中有功能的启动子可操作地连接，且其中所述抑制序列与序列中至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸的片段具有至少90％的同一性，所述序列与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性：SEQ ID NO:3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205、及其片段。在一个方面，Nic1b_ERF抑制序列能够作为选自下组的抑制多核苷酸被转录：单链RNA多核苷酸、双链RNA多核苷酸及其组合。在一个方面，Nic1b_ERF抑制序列包含选自下组的序列：SEQ ID No.108-119。

如本文所用，术语“抑制(inhibit/inhibition/inhibiting)”被定义为本领域已知或本文所述的降低目标基因产物(例如，靶基因产物)的表达或功能的任何方法。“抑制”可在两种植物间进行比较的背景下进行，例如基因改造的植物VS野生型植物。或者，靶基因产物的表达或功能的抑制可以在同一植物内或不同植物间的植物细胞、细胞器、器官、组织或植物部分间的比较的背景下进行，且包括在同一植物或植物部分内的发育阶段或时间阶段间，或植物或植物部分间的比较。“抑制”包括目标基因产物的功能或产生的任何相对降低，直至并包括完全消除该基因产物的功能或产生。术语“抑制”涵盖下调靶基因产物的翻译和/或转录或靶基因产物的功能活性的任何方法或组合物。在一个方面，经修饰的植物中Nic1b基因座的一个或多个基因的mRNA或蛋白质水平，比非突变体或未被基因修饰以抑制该基因表达的植物中相同基因的mRNA或蛋白质水平小95％、小90％、小80％、小70％、小60％、小50％、小40％、小30％、小20％、小10％、小5％、小4％、小3％、小2％，或小1％。

术语“抑制序列”涵盖能够抑制基因的表达或功能的任何多核苷酸或多肽序列，所述基因参与植物中Nic1b_ERF基因座的烟碱生物合成调节，诸如全长多核苷酸或多肽序列、截短的多核苷酸或多肽序列、多核苷酸或多肽序列的片段、多核苷酸或多肽序列的变体、正义定向的核苷酸序列、反义定向的核苷酸序列、正义或反义定向的核苷酸序列的互补物、核苷酸序列的反向区、核苷酸序列的发夹、双链核苷酸序列、单链核苷酸序列，其组合等。术语“多核苷酸序列”包括RNA、DNA、化学修饰的核酸、核酸类似物，其组合等的序列。

抑制序列由靶基因产物的名称指定。因此，“Nic1b_ERF抑制序列”是指能够抑制参与植物中Nic1b_ERF基因座的烟碱生物合成调节(例如，在转录和/或翻译水平)的基因的表达，或能够抑制基因产物的功能的抑制序列。当在多核苷酸抑制序列的背景下使用短语“能够抑制”时，意指抑制序列本身发挥抑制作用；或者，当抑制性序列编码抑制性核苷酸分子(例如，发夹RNA、miRNA或双链RNA多核苷酸)，或编码抑制性多肽(例如，抑制靶基因产物的表达或功能的多肽)时，在其转录(例如，在编码发夹RNA、miRNA或双链RNA多核苷酸的抑制性序列的情况下)或其转录和翻译(在编码抑制性多肽的抑制性序列的情况下)后，分别转录或翻译产物，对靶基因产物发挥抑制作用(例如，抑制靶基因产物的表达或功能)。

公开的Nic1b_ERF抑制序列可以是经由本领域已知的任何沉默途径或机制的触发基因沉默的序列，包括但不限于正义抑制/共抑制、反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA干扰和含内含子的发夹RNA干扰、扩增子介导的干扰、核酶、小干扰RNA、人工或合成microRNA和人工反式作用siRNA。根据所需的结果，Nic1b_ERF抑制序列的范围可为编码本公开的蛋白质的至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约70个核苷酸、约100个核苷酸、约150个核苷酸、约200个核苷酸、约250个核苷酸、约300个核苷酸、约350个核苷酸、约400个核苷酸，和至多全长多核苷酸。在一个方面，Nic1b_ERF抑制序列可以是长度在约50至约400个核苷酸、约70至约350个核苷酸、约90至约325个核苷酸、约90至约300个核苷酸，约90至约275个核苷酸、约100至约400个核苷酸、约100至约350个核苷酸、约100至约325个核苷酸、约100至约300个核苷酸、约125至约300个核苷酸，或约125至约275个核苷酸之间的片段。在一些实施方案中，细胞色素P450多核苷酸的片段长度为约50、约60、约70、约80、约90、约100、约125、约150、约175、约200、约225、约250、约275、约300、约325、约350、约400个核苷酸，以及介于约70至约400个核苷酸间的其他此类值。在一个方面，Nic1b_ERF抑制序列可包含约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。

术语“多核苷酸”的使用不旨在将本公开限制为包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸可包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。本公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。

在一个方面，本公开提供了包含启动子的重组DNA构建体，所述启动子在烟草细胞中有功能且可操作地连接至编码RNA分子的多核苷酸，所述RNA分子能够结合编码与选自下组的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列的多肽的RNA：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207，以及222-228、及其片段，且其中所述RNA分子抑制所述多肽的表达。在一个方面，所述RNA分子选自下组：microRNA、siRNA和反式作用siRNA。在另一方面，重组DNA构建体编码双链RNA。还提供了包含这些重组DNA构建体的转基因烟草植物或其部分，熟化烟草材料或烟草制品。在一个方面，与不含重组DNA构建体的对照烟草植物相比，这些转基因植物，熟化烟草材料或烟草制品包含较低水平的烟碱。进一步提供了降低烟草植物烟碱水平的方法，该方法包括用这些重组DNA构建体中的任一种转化烟草植物。

如本文所用，“可操作地连接”是指两个或更多元件之间的功能连接。例如，目标多核苷酸与调节序列(例如启动子)之间的可操作连接是允许目标多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。

如本文所用，且当用于提及序列时，“异源”是指源自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则通过有意的人为干预从其在组成和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰的序列。该术语也适用于核酸构建体，在本文中也称为“多核苷酸构建体”或“核苷酸构建体”。以这种方式，“异源”核酸构建体意指源自外源物种的构建体，或者，如果源自相同物种，通过有意的人工干预从其组成和/或基因组基因座中的天然形式实质性修饰的构建体。异源核酸构建体包括但不限于，引入植物或其植物部分的重组核苷酸构建体，例如，通过转化方法或随后将转基因植物与另一目标植物育种。在一个方面，所用的启动子与启动子驱动的序列是异源的。另一方面，所用的启动子与烟草是异源的。在另一方面，所用的启动子对于烟草是天然的。

在一个方面，所述的经修饰的烟草植物是顺基因(cisgenic)植物。如本文所用，“顺式发生”或“顺基因”是指植物、植物细胞或植物基因组的基因修饰，其中所有组分(例如，启动子、供体核酸、选择基因)仅具有植物来源(即，不使用非植物来源的组件)。在一个方面，提供的经修饰的植物、植物细胞或植物基因组是顺基因的。所提供的顺基因植物、植物细胞和植物基因组可产生即用型烟草品系。在另一方面，提供的经修饰的烟草植物不包含非烟草遗传物质或序列。

如本文所用，“基因表达”是指基因产物的生物合成或产生，包括基因产物的转录和/或翻译。

本文还提供了用于过表达在植物(特别是烟草属植物，包括各种商业品种的烟草植物)中Nic1b_ERF基因座的一种或多种多肽的组合物和方法。

在一个方面，本公开提供了包含启动子的重组DNA构建体，所述启动子在烟草细胞中有功能且可操作地连接至编码多肽的多核苷酸，所述多肽具有与选自下组的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207以及222-228，及其片段。还提供了包含这些重组DNA构建体的转基因烟草植物或其部分，熟化烟草材料或烟草制品。在一个方面，与不含重组DNA构建体的对照烟草植物相比，这些转基因植物，熟化烟草材料或烟草制品包含增加水平的烟碱。还提供了增加烟草植物的烟碱水平的方法，该方法包括用这些重组DNA构建体中的任一种转化烟草植物。

在一个方面，对于携带Nic1b-ERF相关转基因或突变的每个转基因或突变品系，还提供了此类转基因或突变品系与针对Nic2基因座的一个或多个ERF基因的突变或转基因事件的组合。此类一个或多个Nic2 ERF基因包括但不限于ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168(Shoji et al.,Plant Cell,(10):3390-409(2010))。本文特别感兴趣并提供的是具有一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多，或七个或更多Nic1b ERF样基因(例如NCG1、NCG11、NCG12、NCG15、NCG16、NCG17、ERF101、ERF110、ERF16、ERF130)和一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多、或五个或更多Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)的转基因或诱变抑制的组合的植物。本文进一步特别感兴趣并提供的是具有一个或更多、两个或更多、三个或更多或所有四个Nic1b ERF样基因(例如NCG12、NCG15、NCG16、NCG17、ERF101、ERF110、ERF16、ERF130)的转基因或诱变抑制和ERF189、ERF115或两者的转基因或诱变抑制的组合的植物。本文还提供了具有一个或更多、两个或更多、三个或更多或所有四个Nic1bERF样基因(例如NCG12、NCG15、NCG16、NCG17、ERF101、ERF110、ERF16、ERF130)的转基因或诱变抑制与ERF189的转基因或诱变抑制的组合的植物。在另一方面，本文提供了具有一个或更多、两个或更多、三个或更多或所有四个Nic1b ERF样基因(例如NCG12、NCG15、NCG16、NCG17、ERF101、ERF110、ERF16、ERF130)的转基因或诱变抑制与ERF115的转基因或诱变抑制的组合的植物。本文特别感兴趣并提供的是具有一个或更多、两个或更多、三个或更多，或四个或更多Nic1b ERF样基因(NCG1、NCG12、NCG15、NCG16、NCG17)和一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)的转基因或诱变抑制的组合的植物。本文进一步特别感兴趣并提供的是具有一个或多、两个或更多、三个或更多或所有四个Nic1b ERF样基因(NCG12、NCG15、NCG16、NCG17)的转基因或诱变抑制和ERF189、ERF115或两者的转基因或诱变抑制的组合的植物。本文还提供了具有一个或更多、两个或更多、三个或更多或所有四个Nic1b ERF样基因(NCG12、NCG15、NCG16、NCG17)的转基因或诱变抑制与ERF189的转基因或诱变抑制的组合的植物。在另一方面，本文提供了具有一个或更多、两个或更多、三个或更多或所有四个Nic1b ERF样基因(NCG12、NCG15、NCG16、NCG17)的转基因或诱变抑制与ERF115的转基因或诱变抑制的组合的植物。

在另一方面，提供了具有NCG12的转基因或诱变抑制，以及一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)的转基因或诱变抑制的烟草植物。在另一方面，提供了具有NCG15的转基因或诱变抑制以及一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)的转基因或诱变抑制的烟草植物。在另一方面，提供了具有NCG16的转基因或诱变抑制以及一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)的转基因或诱变抑制的烟草植物。在另一方面，提供了具有NCG17的转基因或诱变抑制和一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)的转基因或诱变抑制的烟草植物。在另一方面，提供了具有ERF101的转基因或诱变抑制和一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)的转基因或诱变抑制的烟草植物。在另一方面，提供了具有ERF110的转基因或诱变抑制和一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic2ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)的转基因或诱变抑制的烟草植物。在另一方面，提供了具有ERF16的转基因或诱变抑制和一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)的转基因或诱变抑制的烟草植物。在另一方面，提供了具有ERF130的转基因或诱变抑制和一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic2 ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)的转基因或诱变抑制的烟草植物。

在一个方面，提供了具有一个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变抑制的对照植物相比，此类植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有一个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。

在一个方面，提供了具有两个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变抑制的对照植物相比，此类植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有两个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，以及一个或多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。

在一个方面，提供了具有三个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变抑制的对照植物相比，此类植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有三个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，以及一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。

在一个方面，提供了具有四个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变抑制的对照植物相比，此类植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有四个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，以及一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。

在一个方面，提供了具有五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变抑制的对照植物相比，此类植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。

在一个方面，提供了具有六个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变抑制的对照植物相比，此列植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有六个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。

在一个方面，提供了具有少于两个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变抑制的对照植物相比，此类植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有少于两个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，以及少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。

在一个方面，提供了具有少于三个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变抑制的对照植物相比，此类植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有少于三个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，以及少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。

在一个方面，提供了具有少于四个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变抑制的对照植物相比，此类植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有少于四个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，以及少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。

在一个方面，提供了具有少于五个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变抑制的对照植物相比，此类植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有少于五个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，以及少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。

在一个方面，提供了具有少于六个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变抑制的对照植物相比，此类植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有少于六个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，以及少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。

在一个方面，提供了具有一个或多个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变过表达的对照植物相比，此类植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有一个或多个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。

在一个方面，提供了具有两个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变过表达的对照植物相比，此类植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有两个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。

在一个方面，提供了具有三个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变过表达的对照植物相比，此类植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有三个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。

在一个方面，提供了具有四个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变过表达的对照植物相比，此类植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有四个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。

在一个方面，提供了具有五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变过表达的对照植物相比，此类植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。

在一个方面，提供了具有六个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变过表达的对照植物相比，此类植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有六个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。

在一个方面，提供了具有少于两个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变过表达的对照植物相比，此类植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有少于两个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。

在一个方面，提供了具有少于三个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变过表达的对照植物相比，此类植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有少于三个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。

在一个方面，提供了具有少于四个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变过表达的对照植物相比，此类植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有少于四个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。

在一个方面，提供了具有少于五个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变过表达的对照植物相比，此类植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有少于五个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。

在一个方面，提供了具有少于六个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与缺乏转基因或诱变过表达的对照植物相比，此类植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。在一个方面，提供了具有少于六个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及少于两个、少于三个、少于四个、少于五个、少于六个或少于七个Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。

在一个方面，提供了具有一个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，提供了具有两个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，提供了具有三个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制以及一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，提供了具有四个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制以及一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，提供了具有五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，在可比条件下，与不具有此类Nic2_ERF或Nic1b_ERF转基因或诱变抑制的对照植物相比，任何前述植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了具有少于两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，以及少于两个、少于三个、少于四个、少于五个或少于六个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，提供了具有两个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，提供了具有三个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，提供了具有四个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，提供了具有五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制以及和一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与不具有Nic2_ERF或Nic1b_ERF转基因或诱变抑制的对照植物相比，任何前述植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了具有一个或多个Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，提供了具有两个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，提供了具有三个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，提供了具有四个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，提供了具有五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与不具有此类Nic2_ERF或Nic1b_ERF转基因或诱变过表达的对照植物相比，此类植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了具有少于两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达以及少于两个、少于三个、少于四个、少于五个或少于六个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，提供了具有两个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，提供了具有三个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，提供了具有四个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多，或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，提供了具有五个或更多Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达，以及一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达的烟草植物。在一个方面，在可比条件下与不具有Nic2_ERF或Nic1b_ERF转基因或诱变过表达的对照植物相比，此类植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列的多肽：SEQ ID No 73、83、84、87-89、180、181、206和207。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列的多肽：SEQ ID No 73、83、84和87-89。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有一个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有一个或多个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：SEQID No 73、83、84、87-89、180、181、206和207。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有一个或多个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有一个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：SEQ ID No 73、83、84和87-89。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有两个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有两个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：SEQID No 73、83、84、87-89、180、181、206和207。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有两个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有两个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述烟草植物编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：SEQ ID No 73、83、84和87-89。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有三个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有三个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：SEQID No 73、83、84、87-89、180、181、206和207。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有三个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有三个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：SEQ ID No 73、83、84和87-89。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有少于两个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因抑制或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有少于两个Nic1b_ERF基因的转基因抑制或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有少于两个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因抑制或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有少于两个Nic1b_ERF基因的转基因抑制或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：SEQ ID No 73、83、84和87-89。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有少于三个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有少于三个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：SEQ ID No73、83、84、87-89、180、181、206和207。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有少于三个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有少于三个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：SEQ ID No 73、83、84和87-89。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有少于四个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有少于四个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：SEQ ID No73、83、84、87-89、180、181、206和207。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有少于四个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因抑制或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有少于四个Nic1b_ERF基因的转基因抑制或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：SEQ ID No 73、83、84和87-89。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有少于五个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有少于五个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：SEQ ID No73、83、84、87-89、180、181、206和207。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有少于五个Nic1b_ERF基因的转基因或诱变抑制，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少95％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53和54。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因抑制或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有少于五个Nic1b_ERF基因的转基因抑制或诱变抑制，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少95％相同的序列的多肽：SEQ ID No 73、83、84和87-89。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变抑制的对照植物相比，本段中描述的植物包含较低的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，Nic2_ERF基因的诱变抑制不含有整个Nic2_ERF基因或整个Nic2_ERF编码区的缺失。在一个方面，Nic2_ERF基因的诱变抑制含有整个Nic2_ERF基因或整个Nic2_ERF编码区的缺失。在一个方面，Nic1b_ERF基因的诱变抑制不含有整个Nic1b_ERF基因或整个Nic1b_ERF编码区的缺失。在一个方面，Nic1b_ERF基因的诱变抑制含有整个Nic1b_ERF基因或整个Nic1b_ERF编码区的缺失。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159、202-205。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达，所述基因编码包含与选自下组的的氨基酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列的多肽：SEQ ID No 73、83、84、87-89、180、181、206和207。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变过表达的对照植物相比，本段中描述的植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列：208、212、215和219，且所述烟草植物还具有一个或更多、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，所述基因包含与选自下组的核苷酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列：SEQ ID No 3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54。在一个方面，提供了烟草植物，其具有一个或两个Nic2_ERF基因的转基因或诱变过表达，所述基因编码包含与选自下组的氨基酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列的多肽：222和226，且所述烟草植物还具有一个或多个、两个或更多、三个或更多、四个或更多或五个或更多Nic1b_ERF基因的转基因或诱变过表达，所述基因编码包含与选自下组的的氨基酸序列至少90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的序列的多肽：SEQ ID No 73、83、84和87-89。在一个方面，在可比条件下与缺乏这种转基因或诱变过表达的对照植物相比，本段中描述的植物包含更高的烟碱或总生物碱水平。

在一个方面，较低烟碱或总生物碱水平是指在可比条件下与对照植物相比降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％。

在一个方面，较高烟碱或总生物碱水平是指在可比条件下与对照植物相比增加至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、400％、500％、600％、700％或800％。

在一个方面，重组DNA构建体或表达盒还可包含用于选择转基因细胞的可选择标记基因。可选择标记基因包括但不限于编码抗生素抗性的基因，诸如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草化合物抗性的基因，诸如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。其他的可选择标记包括表型标记(诸如β-半乳糖苷酶)和荧光蛋白(诸如绿色荧光蛋白(GFP))。

在一个方面，重组DNA构建体或表达盒包含选自下组的启动子：组成型启动子、诱导型启动子和组织优选的启动子(例如，叶特异性或根特异性启动子)。示例性组成型启动子包括美国专利号6,072,050中公开的Rsyn7启动子的核心启动子和其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313:810-812))；泛素(Christensen etal.(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensen et al.(1992)PlantMol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J 3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。示例性的化学诱导型启动子包括被水杨酸活化的烟草PR-1a启动子。其他目标化学诱导型启动子包括类固醇响应性启动子(参见，例如Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10421-10425and McNellis et al.(1998)Plant J.14(2):247-257的糖皮质激素诱导型启动子)以及四环素诱导型启动子(参见，例如，Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237，以及美国专利号5,814,618和5,789,156)。可使用的其他的示例性启动子是负责热调节基因表达、光调节基因表达的启动子(例如，豌豆rbcS-3A；玉蜀黍rbcS启动子；豌豆中发现的叶绿素alb结合蛋白基因；或Arabssu启动子)，激素调节基因表达(例如，小麦的Em基因的脱落酸(ABA)响应序列；大麦和拟南芥属的ABA诱导型HVA1和HVA22以及rd29A启动子；以及创伤诱导的基因表达(例如，wunl的基因表达)，器官特异性基因表达(例如，块茎特异性贮藏蛋白基因的基因表达)；所述来自玉米的23-kDa玉米醇溶蛋白基因；或扁豆(β-菜豆蛋白基因)，或病原体诱导型启动子(例如，分别是PR-1、prp-1、或β-1,3葡聚糖酶启动子、小麦的真菌诱导型wirla启动子，以及烟草和欧芹的线虫诱导型启动子TobRB7-5A和Hmg-1)。

在一个方面，提供的烟草植物还包含参与烟碱生物合成或转运的基因的活性的增加或降低的表达。涉及烟碱生物合成的基因包括但不限于精氨酸脱羧酶(ADC)、甲基腐胺氧化酶(MPO)、NADH脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(ODC)、磷酸核糖基邻氨基苯甲酸酯异构酶(PRAI)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)、喹啉酸磷酸核糖转移酶(QPT)和S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)。尽管已提出了两种候选基因(A622和NBB1)，但尚未阐明催化烟酸衍生物和甲基吡咯啉阳离子之间缩合步骤的烟碱合酶。参见US2007/0240728A1和US2008/0120737A1。A622编码异黄酮还原酶样蛋白。此外，几种转运蛋白可参与烟碱的转运。已克隆并表征了称为MATE的转运蛋白基因(Morita et al.,PNAS 106:2447-52(2009))。

在一个方面，提供的烟草植物与对照烟草植物相比，还包含一个或多个基因的增加或降低水平的mRNA、蛋白质或两者，所述基因编码选自下组的产物：PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1。另一方面，提供的烟草植物还包含直接抑制一个或多个基因表达的转基因，所述基因编码选自下组的产物：PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1。在另一方面，提供的烟草植物还包含抑制一个或多个基因的表达或活性的转基因或突变，所述基因编码选自下组的产物：PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1。在另一方面，提供的烟草植物还包含过表达一个或多个基因的转基因，所述基因编码选自下组的产物：PMT、MPO、QPT、ADC、ODC、PRAI、SAMS、BBL、MATE、A622和NBB1。

还公开了使用本领域已知的任何合适的转化方法用所述重组构建体或表达盒转化烟草植物。将多核苷酸序列引入烟草植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。“稳定转化”是指引入植物的目标核苷酸构建体整合到植物基因组中并能够被其后代遗传的转化。“瞬时转化”是指将序列引入植物并仅在植物中瞬时表达或仅瞬时存在。

将多核苷酸引入到本公开的植物细胞中的合适方法包括微量注射(Crossway etal.(1986)Biotechniques 4:320-334)，电穿孔(Shillito et al.(1987)Meth.Enzymol.153:313-336；Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602-5606)，农杆菌介导的转化(美国专利号5,104,310、5,149,645、5,177,010、5,231,019、5,463,174、5,464,763、5,469,976、4,762,785、5,004,863、5,159,135、5,563,055和5,981,840)，直接基因转移(Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3:2717-2722)，和弹道粒子加速(参见例如美国专利号4,945,050、5,141,131、5,886,244、5,879,918和5,932,782；Tomeset al.(1995)in Plant Cell,Tissue,and Organ Culture Fundamental Methods,ed.Gamborg和Phillips(Springer-Verlag,Berlin)；McCabe et al.(1988)Biotechnology6:923-926)。还参见Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Christou etal.(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology 6:923-926(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182(大豆)；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；De Wet et al.(1985)inThe Experimental Manipulation of Ovule Tissues,ed.Chapman et al.(Longman,N.Y.),pp.197-209(花粉)；Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Reports 9:415-418以及Kaeppler et al.(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(晶须介导的转化)；D'Halluin etal.(1992)Plant Cell4:1495-1505(电穿孔)。

在另一方面，重组构建体或表达盒可通过使植物与病毒或病毒核酸接触而引入植物中。通常，此类方法涉及将本公开的表达盒掺入病毒DNA或RNA分子中。公认的是，用于表达盒的启动子也涵盖用于通过病毒RNA聚合酶转录的启动子。用于将多核苷酸引入植物并表达其中编码的涉及病毒DNA或RNA分子的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta et al.(1996)Molecular Biotechnology 5:209-221。

可随后使用克隆方法繁殖的任何植物组织，无论是通过器官发生还是胚胎发生，都可用重组构建体或表达盒转化。“器官发生”意指从分生组织中心依次发育出芽和根的过程。“胚胎发生”意指从体细胞或配子以一致的方式(而非依次地)一起发育芽和根的过程。适用于所述各种转化方案的示例性组织包括但不限于愈伤组织、现有的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)、下胚轴、子叶、叶盘、花粉、胚等。

在一个方面，所提供的烟草植物来自选自下组的烟草类型：烤制熟化烟草、晾制熟化烟草、深色晾制熟化烟草、深色烤制熟化烟草、Galpao烟和东方烟。另一方面，所提供的烟草植物来自选自下组的烟草类型：白肋烟、马里兰烟和深色烟草。

在一个方面，提供的烟草植物在烤制熟化烟草背景中或表现出一种或多种本文所述的烤制熟化烟草特征。烤制熟化烟草(也称为弗吉尼亚或亮烟草)占世界烟草产量的约40％。由于烤制熟化烟草在烤制过程中达到金黄至深橙色，因此烤制熟化烟草通常也被称为“亮烟草(bright tobacco)”。烤制熟化烟草具有清淡，明亮的香气和味道。烤制熟化烟草通常糖含量高，油含量低。主要的烤制熟化烟草生长国家是阿根廷、巴西、中国、印度、坦桑尼亚和美国。在一个方面，提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子在选自下组的烤制熟化烟草背景中：CC 13、CC 27、CC 33、CC 37、CC 65、CC 67、CC 700、GF 318、GL 338、GL 368、GL 939、K 346、K 399、K 326、NC 102、NC 196、NC 291、NC 297、NC 299、NC 471、NC 55、NC606、NC 71、NC 72、NC 92。PVH 1118、PVH 1452、PVH 2110、SPEIGHT 168、SPEIGHT 220、SPEIGHT 225、SPEIGHT 227、SPEIGHT 236，以及基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种。在另一方面，提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子在选自下组的烤制熟化烟草背景中：Coker 48、Coker 176、Coker 371-Gold、Coker 319、Coker 347、GL 939、K 149、K326、K 340、K 346、K 358、K 394、K 399、K 730、NC 27NF、NC 37NF、NC 55、NC 60、NC 71、NC72、NC 82、NC 95、NC 297、NC 606、NC 729、NC 2326、McNair373、McNair 944、Ox 207、Ox414NF、Reams 126、Reams 713、Reams744、RG 8、RG 11、RG 13、RG 17、RG 22、RG 81、RGH 4、RGH 51、Speight H-20、Speight G-28、Speight G-58、Speight G-70、Speight G-108、Speight G-111、Speight G-117、Speight 168、Speight 179、Speight NF-3、Va 116、Va182，以及基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种。参见WO2004/041006A1。在另一方面，低生物碱或低烟碱烟草植物、种子、杂交种、品种或品系在选自下组的任何烤制熟化烟草背景中：K326、K346和NC196。在一个方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自表15中列出的品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种的烤制熟化烟草品种。参见WO2004/041006A1。

在一个方面，提供的烟草植物在晾制熟化烟草背景中或表现出一种或多种本文所述的晾制熟化烟草特征。晾制熟化烟草包括白肋烟、马里兰烟和深色烟草。共同点是熟化主要没有人工的热度和湿度来源。白肋烟颜色浅至深棕色，油含量高，糖含量低。白肋烟在谷仓中晾制熟化。主要的白肋烟生长的国家是阿根廷、巴西、意大利、马拉维，美国马里兰烟草非常蓬松，具有良好的燃烧特性，低烟碱和中性香味。主要的马里兰生长国家包括美国和意大利。在一个方面，提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子在选自下组的白肋烟背景中：Clay 402、Clay 403、Clay502、Ky 14、Ky 907、Ky 910、Ky 8959、NC 2、NC 3、NC 4、NC 5、NC2000、Tn 86、Tn 90、Tn 97、R 610、R 630、R 711、R 712、NCBH129、Bu 21×Ky 10、HB04P、Ky14×L 8、Kt 200、Newton 98、Pedigo 561、Pf561和Va 509。在一个方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自表16中列出的烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种的白肋烟品种。在另一方面，低生物碱或低烟碱烟草植物、种子、杂交种、品种或品系在选自下组的任何白肋烟背景中：TN 90、KT 209、KT 206、KT 212和HB4488。在另一方面，提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子在选自下组的马里兰烟背景中：Md 10、Md 40、Md 201、Md 609、Md 872和Md 341。在另一方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自表17中所列的烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种的马里兰烟品种。

在一个方面，所提供的烟草植物处于深色晾制熟化烟草背景中或表现出本文所述的一种或多种深色晾制熟化烟草草特性。晾黑烟草与其他类型的区别主要在于通过其熟化过程使深色晾制熟化烟草具有中等至深棕色的颜色和独特的香味。深色晾制熟化烟草主要用于生产嚼烟和鼻烟。在一个方面，所提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子是在选自下组的深色晾制熟化烟草背景中：Sumatra、Jatim、Dominican、Cubano、Besuki、Onesucker、Green River、Virginia sun-cured和Paraguan Passado，以及基本上衍生自任何一种前述品种的任何品种。

在一个方面，所提供的烟草植物是在深色烤制熟化烟草背景中或表现出本文所述的一种或多种深色烤制熟化烟草特征。深色烤制熟化烟草通常在封闭的烤房的地板上用低燃烧的木火烤制。它们的叶子具有低糖含量但高烟碱含量。深色烤制熟化烟草用于制造管状掺合物、香烟、嚼烟、鼻烟和强烟味雪茄。深色烤制熟化烟草的主要生长区域是美国田纳西、肯塔基和弗吉尼亚。在一个方面，所提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子是在选自下组的深色烤制熟化烟草背景中：Narrow Leaf Madole、Improved Madole、Tom RossonMadole、Newton's VH Madole、Little Crittenden、Green Wood、Little Wood、SmallStalk Black Mammoth、DT 508、DT 518、DT 592、KY 171、DF 911、DF 485、TN D94、TN D950、VA 309和VA 359。在一个方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自表18中列出的烟草品种和基本上衍生自前述品种中的任一种的任何品种的深色烤制熟化烟草品种。

在一个方面，提供的烟草植物在东方烟背景中或表现出本文所述的一种或多种东方烟特征。由于东方烟典型地生长在东地中海地区，例如土耳其、希腊、保加利亚、马其顿、叙利亚、黎巴嫩、意大利和罗马尼亚，因此它们也被称为希腊烟、香薰烟和土耳其烟。如今东方品种特有的小的植物和叶子尺寸以及其独特的香味特征是植物在过去几个世纪中发展适应不良土壤和胁迫气候条件的结果。在一个方面，本文提供的低生物碱或低烟碱烟草植物或种子在选自下组的东方烟背景中：Izmir、Katerini、Samsun、Basma and Krumovgrad、Trabzon、Thesalian、Tasova、Sinop、Izmit、Hendek、Edirne、Semdinli、Adiyanman、Yayladag、Iskenderun、Duzce、Macedonian、Mavra、Prilep、Bafra、Bursa、Bucak、Bitlis、Balikesir和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种。在一个方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自表19中列出的烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种的东方烟品种。

在一个方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自表20中所列的烟草品种以及基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种的雪茄烟品种。

在一个方面，本文提供的烟草植物或种子或经修饰的烟草植物或种子是选自表21中列出的烟草品种和基本上衍生自前述品种中任一种的任何品种的烟草品种。

在一个方面，本文所述的经修饰的烟草植物、种子或细胞来自选自下组的品种：表15、表16、表17、表18、表19、表20和表21中所列的烟草品种。

在一个方面，本文描述的烟草植物、种子、杂交种、品种或品系(其可是低生物碱的、低烟碱的、高生物碱的或高烟碱的)基本上衍生自或处于以下烟草的遗传背景下：BU64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker176、Coker319、Coker 371Gold、Coker 48、CU 263、DF911、Galpao tobacco、GL26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、`Perique`tobacco、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA 309、or VA359、Maryland 609、HB3307PLC、HB4488PLC、KT206LC、KT209LC、KT210LC、KT212LC、R610LC、PVH2310、NC196、KTD14LC、KTD6LC、KTD8LC、PD7302LC、PD7305LC、PD7309LC、PD7318LC、PD7319LC、PD7312LC、ShireyLC或根据本领域已知的标准烟草育种技术的任何商业烟草品种。

上述提到的深色晾制熟化、白肋、马里兰、深色烤制熟化或东方类型的所有特定品种仅出于示例性目的而列出。任何其他深色晾制熟化、白肋、马里兰、深色烤制熟化或东方品种在本申请中同样考虑。

还提供了所述烟草植物的群体。在一个方面，烟草植物的群体的种植密度为每英亩约5,000至约8000、约5,000至约7,600、约5,000至约7,200、约5,000至约6,800、约5,000至约6,400、约5,000至约6,000、约5,000至约5,600、约5,000至约5,200、约5,200至约8,000、约5,600至约8,000、约6,000至约8,000、约6,400至约8,000、约6,800至约8000，约7200至约8000，或约7600至约8000株植物。在另一方面，烟草植物的群体在低至中等生育力的土壤类型中。

还提供了所述烟草植物的种子的容器。本公开的烟草种子的容器可包含任何数量、重量或体积的种子。例如，容器可容纳至少或大于约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000或更多的种子。或者，所述容器可容纳至少或大于约1盎司、5盎司、10盎司、1磅、2磅、3磅、4磅、5磅或更多的种子。烟草种子的容器可是本领域可获得的任何容器。作为非限制性实施例，容器可是盒、袋、包、小袋、膜卷(taperoll)、管或瓶。

还提供了由所述低生物碱或低烟碱烟草植物制成的熟化烟草材料。还提供了由所述烟草植物制成的具有较高水平的总生物碱或烟碱的熟化烟草材料。

“熟化”是减少水分并破坏叶绿素的陈化过程，使烟叶呈金黄色，且通过该过程将淀粉转化为糖。因此，与收获的绿叶相比，熟化烟草具有较高的还原糖含量和较低的淀粉含量。在一个方面，所提供的绿叶烟草可使用常规手段进行熟化，例如，烤制熟化、仓房熟化、火烤熟化、晾制熟化或晒制熟化。参见例如Tso(1999,Chapter 1in Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)对不同类型熟化方法的描述。熟化烟草通常以含水量范围为10％-约25％、在压力条件下在木桶(例如，大桶(Hogshead))或纸板箱中陈化数年(例如，两至五年)。参见美国专利号4,516,590和5,372,149。然后，可以进一步加工熟化和陈化烟草。进一步的加工包括在真空下在引入或不引入蒸汽的情况下在各种温度下、在巴氏灭菌和发酵下调节烟草。典型地，发酵的特征在于高的初始水分含量、放热和10-20％的干重损失。例如，参见美国专利号4,528,993、4,660,577、4,848,373、5,372,149；美国公开号2005/0178398；和Tso(1999,Chapter 1inTobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,BlackwellPublishing,Oxford)。可进一步加工熟化、陈化和发酵的烟草(例如，切割、切碎、膨化或混合)。例如，参见美国专利号4,528,993；4,660,577；和4,987,907。在一个方面，本公开的熟化烟草材料是晒制熟化的。在另一方面，本公开的熟化烟草材料是烤制熟化、晾制熟化或火烤熟化的。

从本公开的烟草品系、品种或杂交种获得的烟草材料可用于制备烟草制品。如本文所用，“烟草制品”被定义为旨在供人类使用或消费的由烟草制成或衍生的任何产品。

所提供的烟草制品包括但不限于香烟产品(例如卷烟和比迪烟)、雪茄制品(例如雪茄包装烟草和小雪茄)、烟斗烟制品、衍生自烟草的制品、烟草衍生的烟碱产品、无烟烟草制品(例如湿鼻烟、干鼻烟和嚼烟)、薄膜、可咀嚼物、薄片、成型部件、凝胶、可消耗单元、不溶性基质、中空成型件、再造烟草、膨化烟草等。参见例如美国专利公开号US2006/0191548。

如本文所用，“卷烟”是指具有“棒”和“填料”的烟草制品。卷烟“棒”包括卷烟纸、过滤嘴、滤棒(用于容纳过滤材料)、将卷烟纸(包括填料)保持至过滤嘴上的接装纸，以及将这些部件保持在一起的所有胶。“填料”包括(1)所有烟草，包括但不限于再造烟草和膨化烟草，(2)非烟草替代品(包括但不限于草本植物、非烟草植物材料和其他可伴随烟草卷入卷烟纸内的烟草香料)，(3)外壳，(4)调味剂，和(5)所有其他添加剂(混合到烟草和替代品中并卷至卷烟内)。

如本文所用，“再造烟草”是指由烟草粉尘和其他烟草废料制成的一部分烟草填料的，其被加工成薄片形式并切割成条以模拟烟草。除节约成本外，再造烟草对于其通过使用氨和糖之间的反应来加工香味而产生对卷烟味道的贡献是非常重要的。

如本文所用，“膨化烟草”是指一部分烟草填料，其通过合适气体的膨胀而加工，使得烟草“膨化”，导致密度降低和更大的填充能力。其降低了卷烟中使用的烟草的重量。

衍生自本公开的植物的烟草制品还包括卷烟和其他吸烟制品，特别是包括过滤元件的那些烟制品，其中可抽吸材料的棒包括在烟草混合物内的熟化烟草。在一个方面，本公开的烟草制品选自下组：小雪茄、非通风凹陷过滤嘴香烟、通风凹陷过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟、卷烟、嚼烟、烟叶、水烟、烟碎和烟丝。在另一方面，本公开的烟草制品是无烟烟草制品。无烟烟草制品不燃烧，包括但不限于嚼烟、湿无烟烟草、鼻烟(snus)和干鼻烟。嚼烟是粗分的烟叶，其典型地包装在大的袋状包装中，并以插塞或扭转的方式使用。湿无烟烟草是潮湿的、更精细的烟草，其以松散形式或以小袋形式提供，且典型地包装在圆罐中，且用作置于成年烟草消费者的脸颊和牙龈之间的夹(pinch)或小袋中。鼻烟是经过热处理的无烟烟草。干鼻烟是置于口中或鼻用的细磨烟草。在另一方面，本公开的烟草制品选自下组：散叶嚼烟(loose leaf chewing)、塞嚼烟(plug chewing tobaccl)、湿鼻烟(moistsnuff)和鼻烟(nasal snuff)。在又一方面，本公开的烟草制品选自下组：电子加热的卷烟、电子烟、电子汽化装置。

在一个方面，本公开的烟草制品可以是混合烟草制品。在另一方面，本公开的烟草制品可是低烟碱烟草制品。在另一方面，本公开的烟草制品可包含小于约3mg/g水平的去甲烟碱。例如，此类制品中去甲烟碱的含量可以为3.0mg/g、2.5mg/g、2.0mg/g、1.5mg/g、1.0mg/g、750μg/g、500pg/g、250pg/g、100pg/g、75pg/g、50pg/g、25pg/g、10pg/g、7.0pg/g、5.0pg/g、4.0pg/g、2.0pg/g、1.0pg/g、0.5pg/g、0.4pg/g、0.2pg/g、0.1pg/g、0.05pg/g、0.01pg/g，或不可检测。

在一个方面，提供的熟化烟草材料或烟草制品包含选自下组的平均烟碱或总生物碱水平：基于干重的约0.01％、0.02％、0.05％、0.75％、0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.35％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、5％、6％、7％、8％和9％。在另一方面，提供的熟化烟草材料或烟草制品包含选自下组的平均烟碱或总生物碱水平：基于干重的约0.01％-0.02％、0.02％-0.05％、0.05％-0.75％、0.75％-0.1％、0.1％-0.15％、0.15％-0.2％、0.2％-0.3％、0.3％-0.35％、0.35％-0.4％、0.4％-0.5％、0.5％-0.6％、0.6％-0.7％、0.7％-0.8％、0.8％-0.9％、0.9％-1％、1％-1.1％、1.1％-1.2％、1.2％-1.3％、1.3％-1.4％、1.4％-1.5％、1.5％-1.6％、1.6％-1.7％、1.7％-1.8％、1.9％-2％、2％-2.1％、2.1％-2.2％、2.2％-2.3％、2.3％-2.4％、2.4％-2.5％、2.5％-2.6％、2.6％-2.7％、2.7％-2.8％、2.8％-2.9％、2.9％-3％、3％-3.1％、3.1％-3.2％、3.2％-3.3％、3.3％-3.4％、3.4％-3.5％以及3.5％-3.6％。在另一方面，所提供的熟化烟草材料或烟草制品包含选自下组的平均烟碱或总生物碱水平：基于干重的约0.01％-0.1％、0.02％-0.2％、0.03％-0.3％、0.04％-0.4％、0.05％-0.5％、0.75％-1％、0.1％-1.5％、0.15％-2％、0.2％-3％和0.3％-3.5％。

本公开还提供了用于育种包含所需水平的总生物碱或烟碱(例如低烟碱或无烟碱)的烟草品系、栽培品种或品种的方法。可通过任何已知的方法进行育种。DNA指纹、SNP映射(mapping)、单倍型映射或类似技术可用于标记辅助选择(MAS)育种程序以将所需性状或等位基因转移或育种到烟草植物中。例如，育种者可使用F1杂交种植物在F₂代或回交世代中产生分离的群体，或进一步将F1杂交种植物与具有农学上所需的基因型的其他供体植物杂交。可使用本领域已知的或本文列出的技术之一筛选F2代或回交世代植物的所需的农学性状或所需的化学特征。根据预期的遗传模式或所用的MAS技术，可在每个回交循环之前进行所选植物的自花授粉以帮助鉴定所需的个体植物。可重复回交或其他育种程序直到回复轮回亲本的所需表型。本公开中的轮回亲本可以是烤制熟化品种、白肋烟品种、深色晾制熟化品种、深色烤制熟化品种或东方烟品种。其他育种技术在例如Wernsman,E.A.和Rufty,R.C.1987.Chapter Seventeen.Tobacco.Pages 669-698In:Cultivar Development.CropSpecies.W.H.Fehr(ed.),MacMillan Publishing Go.,Inc.,New York,N.Y.中可以找到，在此将其全文引入作为参考。

使用所述烟草植物的植物育种程序的结果包括本公开的有用品系、栽培品种、品种、后代、近交系和杂交种。如本文所用，术语“品种”是指具有恒定特征的植物群体，其将其与相同物种的其他植物区分。虽并非总是，品种通常可商品出售。尽管具有一种或多种区别性性状，但品种的特征还在于该品种内个体之间的总体变化非常小。“纯系”品种可通过几代自花授粉和选择，或使用组织或细胞培养技术从单个亲本无性繁殖而产生。品种可基本上衍生自另一品系或品种。根据《保护植物新品种国际公约》(1961年12月2日；1972年11月10日，1978年10月23日以及1991年3月19日于日内瓦修订)，品种“基本上衍生自”初始品种，如果：a)其主要衍生自初始品种，或衍生自主要衍生于初始品种的品种，同时保留由初始品种的基因型或基因型组合产生的基本特征的表达；b)与所述初始品种明显可区分；以及c)除衍生作用产生的差异外，其在由起始品种的基因型或基因型组合产生的基本特征的表达上与起始品种一致。例如，通过选择天然或诱导的突变体，体细胞克隆变体，来自起始品种、回交或转化的植物的变体个体，可获得基本上衍生的品种。第一烟草品种和第一品种基本上衍生自的第二烟草品种被认为具有基本相同的遗传背景。与品种不同的“品系”最通常表示一组非商业使用的植物，例如在植物研究中。品系典型地显示个体间一种或多种目标性状的总体变化很小，尽管个体间其他性状可能有一些变化。

在一个方面，本公开提供了将低烟碱性状渗入到烟草品种中的方法，所述方法包括：(a)将包含低烟碱性状的第一烟草品种与不具有低烟碱性状的第二烟草品种杂交以产生一种或多种后代烟草植物；(b)针对与低烟碱性状连锁的多态性标记，对所述一种或多种后代烟草植物进行基因分型，其中所述多态性标记在染色体区间中，所述染色体区间侧接选自下组的SNP标记中的任两个：SEQ ID No.125-145和193-201；和(c)选择包含低烟碱性状的后代烟草植物。在另一方面，这些方法还包括将选择的后代烟草植物与第二烟草品种回交。在又一个方面，这些方法还包括：(d)将选择的后代植物与自身或与第二烟草品种杂交以产生一种或多种进一步的后代烟草植物；以及(e)选择包含低烟碱性状的另一后代烟草植物。在一个方面，步骤(e)的选择包括标记辅助选择。在一个方面，这些方法产生包含低烟碱性状的单基因转化。在一个方面，这些方法产生包含Nic1b_ERF基因渗入的单基因转化。在一个方面，第二烟草品种是优良品种。在另一方面，这些方法的基因分型步骤涉及一种或多种分子标记测定。在另一方面，该方法使用的多态性标记包括选自下组的多态性：单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)、DNA序列的简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)和标签SNP。在另一方面，与LA Burley 21相比，选择的后代烟草植物在Nic1b_ERF基因座包含较短的染色体渗入。

在另一方面，本公开提供将低烟碱性状渗入到烟草品种中的方法，所述方法包括：(a)将包含低烟碱性状的第一烟草品种与不具有低烟碱性状的第二烟草品种杂交以产生一种或多种后代烟草植物；(b)针对与低烟碱性状连锁的多态性标记，对所述一种或多种后代烟草植物进行基因分型，其中所述多态性标记在选自下组的SNP标记中的任一个的20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM内：SEQ ID No.125-145和193-201或具有选下组的序列的任何基因座内：SEQ ID No.1、3-37、146、149、152-156、202、203和184-186；以及(c)选择包含低烟碱性状的后代烟草植物。在一个方面，该方法包括同时或并行选择与Nic1b_ERF基因座相关或紧密连锁的一种或多种分子标记以及与Nic2基因座相关或紧密连锁的一种或多种分子标记。

在一个方面，本公开提供了选择具有低烟碱性状的烟草植物的方法，所述方法包括：(a)从烟草种质集合中分离核酸；(b)测定核酸中与Nic1b_ERF基因座紧密连锁的一个或多个标记；以及(c)基于所述标记测定选择具有低烟碱性状的烟草植物。在一个方面，所测定的与Nic1b_ERF基因座紧密连锁的一个或多个标记在选自下组的SNP标记中的任一个的约20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM内：SEQ ID No.125-145和193-201，或具有选自下组的序列的任何基因座内：SEQ ID No.3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54、153、154、158、159和202-205。在另一方面，该方法还包括测定与Nic2基因座紧密连锁的一个或多个标记。在一个方面，所测定的与Nic2基因座紧密连锁的一个或多个标记在位于ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168之一中的任何一个多态性基因座的约20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM内。在一个方面，该方法还包括测定选择的植物的烟碱水平以确定低烟碱性状。

还公开了将低烟碱性状渗入到烟草品种中的方法，所述方法包括：(a)将包含低烟碱性状的第一烟草品种与不具有低烟碱性状的第二烟草品种杂交以产生一种或多种后代烟草植物；(b)针对与低烟碱性状连锁的多态性标记，对所述一种或多种后代烟草植物进行基因分型，其中所述多态性标记在染色体区间中，所述染色体区间侧接选自下组的SNP标记中的任两个：SEQ ID No.125-145和193-201；和(c)选择包含低烟碱性状的后代烟草植物。在一个方面，这些方法产生包含低烟碱性状的单基因转化。一方面，这些方法产生包含Nic2基因渗入的单基因转化。在一个方面，第二烟草品种是优良品种。在另一方面，这些方法的基因分型步骤涉及一种或多种分子标记测定。在另一方面，该方法使用的多态性标记包括选自下组的多态性：单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)、DNA序列的简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)和标签SNP。另一方面，与LA Burley 21相比，选择的后代烟草植物在Nic2基因座包含较短的染色体缺失。

如本文所用，“基因座”是多态性核酸、性状决定簇、基因或标记所在的染色体区域。本公开的基因座包含群体中的一个或多个多态性；例如，在一些个体中存在替代等位基因。如本文所用，“等位基因”是指特定基因座处的替代核酸序列。等位基因的长度可小至1个核苷酸碱基，但典型地较大。例如，第一等位基因可出现在一条染色体上，而第二等位基因出现在第二同源染色体上，例如作为杂合个体的不同染色体出现，或者在群体中的不同纯合或杂合个体之间出现。如本文所用，术语“染色体区间”是指位于单个染色体上的基因组DNA的连续线性跨度。

如本文所用，厘摩(“cM”)是重组频率的测量单位。1cM等于一个基因座上的标记与第二个基因座上的标记由于在单代中杂交而分离的几率为1％。本文提及的基因距离可使用Kosambi函数从重组值计算(Kosambi,The estimation of map distances fromrecombination values.Annals of Eugenics,12:172-75(1944))。

如本文所用，“紧密连锁”或“关联”意指标记或基因座在另一标记或基因座的约20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM内。例如，20cM表示标记和基因座之间的重组频率等于或小于约20％。

如本文所用，“渗入(introgression/introgress)”是指遗传基因座的所需等位基因从一个遗传背景传递到另一个。

如本文所用，“杂交(crossed/cross)”意指通过受精(例如细胞、种子或植物)产生后代，且包括植物之间的杂交(有性)和自受精(自交)。

如本文所用，“回交(backcross/backcrossing)”是指后代植物重复地与其亲本之一回交的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待渗入的所需基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或多次)是指基因或基因座被渗入其中的亲本植物。初始杂交产生F1代。术语“BC1”是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，等等。在一个方面，反复进行回交，每个连续回交世代的后代个体自身回交至相同的亲本基因型。

如本文所用，“单基因转化的”或“单基因转化”是指使用称为回交的植物育种技术或通过基因工程开发的植物，其中除通过回交技术或通过基因工程转移到品种中的单基因外，还恢复了品种的基本上所有所需的形态学和生理学特征。

如本文所用，“优良品种”意指由育种和选择产生的具有优良农艺性能的任何品种。

如本文所用，在标记辅助选择或育种的背景中的“选择(selecting或selection)”是指基于某些预定标准通常从群体中挑选或选择所需个体的行为。

如本文所用，术语“性状”是指可受基因型影响的细胞或生物体的一种或多种可检测特征。表型可用肉眼观察，或通过本领域已知的任何其他评估手段观察，例如显微镜检查、生物化学分析、基因组分析、对特定疾病耐受性的测定等。在一些情况下，表型直接由单个基因或基因座控制，例如“单基因性状”。在其他情况下，表型是几种基因的结果。

如本文所用，“标记测定”意指使用特定方法检测特定基因座处的多态性的方法，例如测量至少一种表型(诸如种子颜色、花颜色或其他视觉上可检测的性状)、限制性片段长度多态性(RFLP)、单碱基延伸、电泳、序列比对、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、基于微阵列的技术和核酸测序技术等。

如本文所用，“标记辅助选择”(MAS)是基于标记基因型选择表型的方法。“标记辅助的选择育种”是指在一种或多种植物中选择所需性状的方法，通过检测植物的一个或多个核酸，然后选择具有所述一个或多个核酸的植物或种质，其中所述核酸与所需性状连锁。

如本文所用，“多态性”是指群体中一种或多种变化的存在。多态性可表现为核酸的核苷酸序列的变化或蛋白质的氨基酸序列的变化。多态性包括存在一个或多个个体的群体中一个或多个基因座处的核酸序列或核酸特征的一个或多个变化。变化可包括但不限于一个或多个核苷酸碱基改变、一个或多个核苷酸的插入或一个或多个核苷酸的缺失。多态性可由核酸复制中的随机过程，通过诱变，作为移动基因组元件的结果，由拷贝数变化和在减数分裂过程中产生，诸如不等杂交，基因组复制和染色体断裂和融合。变化通常可见于种群中或可在低频率下存在，前者在一般植物育种中具有更大的效用，而后者可能与罕见但重要的表型变化有关。有用的多态性可包括单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)、DNA序列的简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)和标签SNP。基因标记、基因、DNA衍生的序列、RNA衍生的序列、启动子、基因的5’非翻译区、基因的3’非翻译区、microRNA、siRNA、耐受基因座、卫星标记、转基因、mRNA、ds mRNA、转录谱和甲基化模式也包含多态性。此外，前述拷贝数的存在、缺失或变化可包括多态性。

如本文所用，“SNP”或“单核苷酸多态性”是指当基因组序列中的单核苷酸(A、T、C或G)改变或可变时发生的序列变异。当SNP映射到基因组上的位点时，存在“SNP标记”。

如本文所用，“标记”或“分子标记”或“标记基因座”是用于表示足够独特以表征基因组上的特定基因座的核酸或氨基酸序列的术语。任何可检测的多态性性状都可用作标记，只要其为有差别地遗传的，并表现出与目标表型性状的连锁不平衡。因此，每个标记是具有独特核苷酸序列的特定DNA片段的指示物。映射位置提供特定标记对于彼此的相对位置的度量。当描述性状与给定标记连锁时，应理解其序列影响性状的实际DNA片段通常与标记共分离。如果在性状的两侧鉴定标记，则可获得性状的更精确和确定的定位。通过测量杂交后代中标记的出现，可通过相对简单的分子测试来检测性状的存在，而不实际评估性状本身的出现，这可能困难和耗时，因为性状的实际评估需要将植物生长到形状可表达的阶段和/或环境条件。在一个方面，用Nic1b_ERF或Nic2_ERF基因座，使用本领域已知的方法(诸如Qgene Version 2.23(1996))和默认参数测量，所用的标记表现出2或更高、3或更高、4或更高、5或更高、6或更高、7或更高、8或更高，或9或更高的LOD得分。

应理解，本公开的任何烟草植物可还包含其他的农学上所需的性状，例如通过使用本领域已知的技术用基因构建体或转基因转化。非限制性地，所需性状的实例是除草剂抗性、害虫抗性、疾病抗性；高产量；高等级指数值；可治愈性；熟化质量；机械可收获性；保持能力；叶质量；高度、植物成熟(例如，早熟、早中熟、中熟，中晚熟或晚熟)；茎尺寸(例如，小、中或大茎)；或每株植物的叶数(例如，小(例如，5-10片叶)、中(例如，11-15片叶)或大(例如，16-21片叶)，或任何组合。在一个方面，公开的低烟碱或无烟碱的烟草植物或种子包含表达一种或多种杀虫蛋白的一种或多种转基因，例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的晶体蛋白或蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的营养杀虫蛋白，诸如VIP3(参见例如Estruch et al.(1997)Nat.Biotechnol.15:137)。在另一方面，烟草植物还包含赋予对褐色茎腐病的抗性(美国专利号5,689,035)或对孢囊线虫的抗性(美国专利号5,491,081)的渗入性状。

本公开还提供了烟草植物，其包含改变的烟碱或总生物碱水平，但具有与没有此类烟碱水平改变的相应初始烟草植物的产量相当的产量。在一个方面，低烟碱或无烟碱烟草品种提供选自下组的产量：约1200-3500、1300-3400、1400-3300、1500-3200、1600-3100、1700-3000、1800-2900、1900-2800、2000-2700、2100-2600、2200-2500和2300-2400lbs/英亩。在另一方面，低烟碱或无烟碱烟草品种提供选自下组的产量：约1200-3500、1300-3500、1400-3500、1500-3500、1600-3500、1700-3500、1800-3500、1900-3500、2000-3500、2100-3500、2200-3500、2300-3500、2400-3500、2500-3500、2600-3500、2700-3500、2800-3500、2900-3500、3000-3500、以及3100-3500lbs/英亩。在另一方面，低烟碱或无烟碱的烟草植物提供除nic1b_erf突变、nic2突变、Nic1b_ERF转基因、Nic2转基因或其组合外具有基本相同的遗传背景的对照植物的产量的65％-130％、70％-130％、75％-130％、80％-130％、85％-130％、90％-130％、95％-130％、100％-130％、105％-130％、110％-130％、115％-130％或120％-130％的产量。在另一方面，低烟碱或无烟碱的烟草植物提供除nic1b_erf突变、nic2突变、Nic1b_ERF转基因、Nic2转基因或其组合外具有基本相同的遗传背景的对照植物的产量的70％-125％、75％-120％、80％-115％、85％-110％或90％-100％的产量。

在一个方面，公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)不表现出选自下组的LA BU21性状中的一种或多种、两种或更多、三种或更多或所有：较低产量、延迟成熟和衰老、对昆虫食草的较高敏感性、打顶后增加的多胺含量、较高的叶绿素、单位叶面积更多叶肉细胞、以及熟化后较差的终产物质量。在一个方面，公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)不表现出选自下组的LA BU21性状中的两种或更多种：较低产量、延迟成熟和衰老、对昆虫食草的较高敏感性、打顶后增加的多胺含量、较高的叶绿素、单位叶面积更多的叶肉细胞、以及熟化后较差的终产物质量。在一个方面，公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)不表现出选自下组的三种或更多种LABU21性状：较低产量、延迟成熟和衰老、对昆虫食草的较高敏感性、打顶后增加的多胺含量、较高的叶绿素、单位叶面积更多的叶肉细胞，以及熟化后较差的终产物质量。在一个方面，与LA BU21、LAFC53或LNKY171相比，公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)表现出较低水平的选自下组的LA BU21性状的一种或更多、两种或更多、三种或更多或全部：较低的产量、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草的较高敏感性、打顶后增加的多胺含量、较高的叶绿素、单位叶面积更多的叶肉细胞以及熟化后较差的终产物质量。在一个方面，与LA BU21、LAFC53或LNKY171相比，公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)表现出较低水平的选自下组的LA BU21性状的两种或更多：较低的产量、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草的较高敏感性、打顶后增加的多胺含量、较高的叶绿素、单位叶面积更多的叶肉细胞以及熟化后较差的终产物质量。在一个方面，与LA BU21、LAFC53或LNKY171相比，公开的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)表现出较低水平的选自下组的LA BU21性状的三种或更多或全部：较低的产量、延迟的成熟和衰老、对昆虫食草的较高敏感性、打顶后增加的多胺含量、较高的叶绿素、单位叶面积更多的叶肉细胞、以及熟化后较差的终产物质量。

在一个方面，所公开的经修饰的烟草植物(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱烟草品种)包含赋予所需性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)而基本上不影响选自下组的性状的修饰：产量、成熟和衰老、对昆虫食草的敏感性、打顶后多胺含量、叶绿素水平、单位叶面积的叶肉细胞数和熟化后的终产物质量。

在一个方面，所公开的经修饰的烟草植物包含赋予所需性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且还包含与未经修饰的对照植物基本上相当的性状，其中所述性状选自下组：产量、成熟和衰老、对昆虫食草的敏感性、打顶后多胺含量、叶绿素水平、单位叶面积叶肉细胞数和熟化后的终产物质量。

在一个方面，公开的经修饰的烟草植物包含赋予所需性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰且还包含相对于未经修饰的对照植物的产量大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于100％、大于105％、大于110％、大于115％、大于120％、大于125％、大于130％、大于135％或大于140％的产量。在一个方面，公开的经修饰的烟草植物包含赋予所需性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰且还包含相对于未经修饰的对照植物的产量为70％-140％、75％-135％、80％-130％、85％-125％、90％-120％、95％-115％或100％-110％的产量。在一个方面，公开的经修饰的烟草植物包含赋予所需性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰且还包含相对于未经修饰的对照植物的产量为70％-80％、75％-85％、80％-90％、85％-95％、90％-100％、95％-105％、105％-115％、110％-120％、115％-125％、120％-130％、125％-135％或130％-140％的产量。

在一个方面，公开的经修饰的烟草植物包含赋予所需性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰且还包含打顶后的多胺含量，其相对于未经修饰的对照植物的打顶后多胺含量大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于100％、大于105％、大于110％、大于115％、大于120％、大于125％、大于130％、大于135％或大于140％。在一个方面，公开的经修饰的烟草植物包含赋予所需性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且还包含打顶后多胺含量，其相对于未经修饰的对照植物的打顶后多胺含量为70％-140％、75％-135％、80％-130％、85％-125％、90％-120％、95％-115％或100％-110％。在一个方面，公开的经修饰的烟草植物包含赋予所需性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且还包含打顶后多胺含量，其相对于未经修饰的对照植物的打顶后多胺含量为70％-80％、75％-85％、80％-90％、85％-95％、90％-100％、95％-105％、105％-115％、110％-120％、115％-125％、120％-130％、125-135％、或130％-140％。

在一个方面，公开的经修饰的烟草植物包含赋予所需性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且还包含叶绿素水平，其相对于未经修饰的对照植物的叶绿素水平大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于100％、大于105％、大于110％、大于115％、大于120％、大于125％、大于130％、大于135％或大于140％。在一个方面，所公开的经修饰的烟草植物包含赋予所需性状(例如低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且还包含叶绿素水平相对于未经修饰的对照植物的叶绿素水平的70％-140％、75％-135％、80％-130％、85％-125％、90％-120％、95％-115％或100％-110％。在一个方面，所公开的经修饰的烟草植物包含赋予所需性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且还包含相对于未经修饰的对照植物的叶绿素水平为70％-80％、75％-85％、80％-90％、85％-95％、90％-100％、95％-105％、105％-115％、110％-120％、115％-125％、120％-130％、125％-135％、130％-140％的叶绿素水平。

在一个方面，公开的经修饰的烟草植物包含赋予所需性状(例如，低烟碱，无烟碱或低生物碱)的修饰，且还包含相对于未经修饰的对照植物的单位叶面积叶肉细胞数大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于100％、大于105％、大于110％、大于115％、大于120％、大于125％、大于130％、大于135％或大于140％的单位叶面积叶肉细胞数。在一个方面，公开的经修饰的烟草植物包含赋予所需性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且还包含相对于未经修饰的对照植物单位叶面积叶肉细胞数为70％-140％、75％-135％、80％-130％、85％-125％、90％-120％、95％-115％，或100％-110％的单位叶面积叶肉细胞数。在一个方面，公开的经修饰的烟草植物包含赋予所需性状(例如，低烟碱、无烟碱或低生物碱)的修饰，且还包含相对于未修饰的对照植物的单位叶面积叶肉细胞数为70％-80％、75％-85％、80％-90％、85％-95％、90％-100％、95％-105％、105％-115％、110％-120％、115％-125％、120％-130％、125％-135％，或130％-140％的单位叶面积叶肉细胞数。

在一个方面，公开的低烟碱或无烟碱烟草品种适用于机器收获。在另一方面，公开的低烟碱或无烟碱烟草品种是机械收获的。

在一个方面，提供的烟草植物是杂交种植物。杂交种可通过阻止第一品种的雌性亲本植物(例如，种子亲本)的自花授粉，使得来自第二品种的雄性亲本植物的花粉使雌性亲本植物受精，且使得F1杂交种种子在雌性植物上形成来产生。雌性植物的自花授粉可通过在花发育的早期阶段将花去雄来阻止。或者，可使用雄性不育形式阻止在雌性亲本植物上形成花粉。例如，雄性不育可由雄性不育(MS)或转基因雄性不育产生，其中转基因抑制微孢子形成和/或花粉形成，或自身不相容性。含有MS的亲本植物特别有用。在雌性亲本植物是MS的方面，可从雄性可育植物收获花粉并人工施用于MS雌性亲本植物的花柱，并收获得到F1种子。

植物可用于形成单交烟草F1杂交种。将来自父本植物的花粉人工转移至去雄的母本植物或雄性不育的母本植物以形成F1种子。或者，可进行三向杂交，其中单交F1杂交种用作母本并与不同的父本杂交。作为另一种选择，可创建双杂交杂交种，其中两个不同单交的F1后代自身杂交。当形成双杂交杂交种时，自交不亲和性可特别有利地用于防止母本的自花授粉。

在一个方面，低烟碱或无烟碱烟草品种是雄性不育的。在另一方面，低烟碱或无烟碱烟草品种是细胞质雄性不育的。雄性不育烟草植物可通过本领域已知的任何方法产生。产生雄性不育烟草植物的方法描述于Wernsman,E.A.,and Rufty,R.C.1987.ChapterSeventeen.Tobacco.Pages 669-698In:Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr(ed.),MacMillan Publishing Go.,Inc.,New York,N.Y.761pp中。

在另一方面，提供的烟草部分包括但不限于叶、茎、根、种子、花、花粉、花药、胚珠、梗节、果实、分生组织、子叶、下胚轴、荚、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、芽、细胞和原生质体。在一个方面中，提供的烟草部分不包含种子。在一个方面，本公开提供了烟草植物细胞、组织和器官，其并非繁殖材料且不介导植物的天然繁殖。在另一方面，本公开还提供了烟草植物细胞、组织和器官，其为繁殖材料并介导植物的天然繁殖。在另一方面，本公开提供不能通过光合作用维持自身的烟草植物细胞、组织和器官。在另一方面，本公开提供了体细胞烟草植物细胞。体细胞(与种系细胞相反)不介导植物繁殖。

提供的细胞、组织和器官可来自种子、果实、叶、子叶、下胚轴、分生组织、胚、胚乳、根、芽、茎、荚、花、花序、茎秆、梗、花柱、柱头、花托、花瓣、萼片、花粉、花药、花丝、子房、胚珠、果皮、韧皮部、维管组织。在另一方面，本公开提供了烟草植物叶绿体。在另一方面，本公开提供表皮细胞、气孔细胞、叶或根毛、贮藏根或块茎。在另一方面，本公开提供了烟草原生质体。

本领域技术人员理解烟草植物通过种子自然繁殖，而非通过无性生殖或无性繁殖。在一个方面，本公开内容提供了烟草胚乳。在另一方面，本公开提供了烟草胚乳细胞。在另一方面，本公开提供雄性或雌性不育烟草植物，其在没有人为干预的情况下不能繁殖。

在一个方面，本公开提供了核酸分子，其包含与选自下组的序列至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性：SEQ ID NO:1-72、147、150、157-161、187-189和202-205、及其片段。在一个方面，本公开提供了包含与选自下组的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多肽或蛋白质：SEQ ID NO:73-107、148、151、180-183、206、207和190-192。在另一方面，本公开提供了包含与选自下组的氨基酸序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相似性的多肽或蛋白质：SEQ ID NO:73-107、148、151、180-183、206、207和190-192。在另一方面，本公开提供了具有选自下组的氨基酸序列的蛋白质的生物活性变体：SEQ ID NO:73-107、148、151、180-183、206、207和190-192。本公开的蛋白质的生物活性变体可与该蛋白质相差少至1-15个氨基酸残基、少至10个、少至9个、少至8个、少至7个、少至6个、少至5个、少至4个、少至3个、少至2个或少至1个氨基酸残基。还提供了来自Nic1b_ERF基因座的基因或蛋白的直系同源基因或蛋白。“直系同源物”是衍生自共同祖先基因的基因，且由于物种形成而在不同物种中发现。直系同源物可在核苷酸序列和/或蛋白质序列水平上具有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性或相似性。直向同源物的功能通常在物种中高度保守。

如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸或多肽序列的背景中，是指当在指定的比较窗口上进行最大对应比对时在两个序列中相同的残基。当参照蛋白质使用序列同一性百分比时，认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不改变分子的功能特性。当序列的保守取代不同时，可向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性。由于这种保守取代而不同的序列认为具有“序列相似性”或“相似性”。

提供的核酸分子、多肽或蛋白质可以是分离的或基本上纯化的。“分离的”或“纯化的”核酸分子、多肽、蛋白质或其生物活性部分实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与多核苷酸或蛋白质伴随或相互作用的组分。例如，分离或纯化的多核苷酸或蛋白质当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。

本公开还提供了制造包含公开的烟草植物的烟草材料的烟草制品的方法。在一个方面，方法包括调节由烟草植物制成的陈化烟草材料以将其水分含量从约12.5％-约13.5％增加至约21％，将调节的烟草材料共混以产生所需的掺合物。在一个方面，制造烟草制品的方法还包括将掺合物包被(casing)或调味。通常，在包被过程中，将包被或调味汁材料加入到掺合物中，以通过平衡化学组成来提高它们的质量并产生某些所需的风味特征。在Tobacco Production,Chemistry and Technology,Edited by L.Davis andM.Nielsen,Blackwell Science,1999中可找到该包被方法的更多细节。

提供的烟草材料还可使用包括但不限于热处理(例如，烹饪、烘烤)、调味、酶处理、膨化和/或熟化的方法进行加工。可使用这些技术加工发酵的和未发酵的烟草。合适的经加工的烟草的实例包括深色晾制熟化烟草、深色烤制熟化烟草、白肋烟、烤制熟化烟草和雪茄填充或包装烟，以及整个叶茎加工制作的制品。在一个方面，烟草纤维包括基于鲜重至多70％的深色烟草。例如，烟草可通过美国公开号2004/0118422或2005/0178398中所述的加热、排湿和/或巴氏灭菌步骤进行调节。

提供的烟草材料可进行发酵。发酵的特征典型地在于高的初始水分含量、产热和10-20％的干重损失。参见，例如，美国专利号4,528,993；4,660,577；4,848,373；和5,372,149。除修饰叶的香味外，发酵可改变叶的颜色和/或质地。同样在发酵过程中，可产生逸出气体，可吸收氧气，可改变pH，且可改变保留的水量。参见例如美国公开号2005/0178398和Tso(1999,Chapter 1in Tobacco,Production,Chemistry and Technology,Davis&Nielsen,eds.,Blackwell Publishing,Oxford)。熟化的，或熟化且发酵的烟草可在掺入至口腔制品中前进一步加工(例如，切丝、膨胀、掺合、研磨或粉碎)。在一些情况下，烟草是长切发酵熟化湿烟草，在与共聚物和任选的香料和其他添加剂混合之前，其烘箱挥发物含量为48-50重量％。

在一个方面，提供的烟草材料可被加工成所需尺寸。在一个方面，烟草纤维被加工成具有小于200微米的平均纤维尺寸。在一个方面，烟草纤维为75-125微米。在另一方面，烟草纤维被加工成具有75微米或更小的尺寸。在一个方面，烟草纤维包括长切烟草，其可被切丝或切碎成约10根/英寸至约110根/英寸的宽度和约0.1英寸至约1英寸的长度。双切烟草纤维可具有一定范围的粒度，使得约70％的双切烟草纤维在-20目至80目的筛目尺寸之间。

提供的烟草材料可被加工成具有约10重量％或更高；约20重量％或更高；约40重量％或更高；约15重量％-约25重量％；约20重量％-约30重量％；约30重量％-约50重量％；约45重量％-约65重量％；或约50重量％-约60重量％的烘箱挥发物含量。本领域技术人员将理解，“湿”烟草典型是指具有约40重量％-约60重量％(例如，约45重量％-约55重量％，或约50重量％)的烘箱挥发物含量的烟草。如本文所用，“烘箱挥发物”通过计算在110℃下在预加热强制通风烘箱中干燥样品3.25小时之后样品的重量损失百分比来测定。口腔制品可具有与用于制备口腔制品的烟草纤维的烘箱挥发物含量不同的总烘箱挥发物含量。所描述的处理步骤可减少或增加烘箱挥发物含量。

以下列表提供了第一组示例性实施方案。

1.烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其在Nic1b基因座中包含突变，其中所述烟草植物在熟化后能够产生USDA等级指数值为50或更高的叶。

2.实施方案1的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物还包含Nic2基因座的ERF基因中的突变。

3.实施方案1的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物还在选自下组的两个或更多、三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多或所有七个基因中包含一个或多个突变：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。

4.实施方案1的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物还在ERF189、ERF115或两者中包含一个或多个突变。

5.实施方案1的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有选自下组的USDA等级指数值的叶：55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高以及95或更高。

6.实施方案1的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有与对照植物在相似条件下生长和熟化时相当的USDA等级指数值的叶，其中所述对照植物与所述烟草植物除所述突变外具有基本相同的遗传背景。

7.实施方案1的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物能够产生在熟化时USDA等级指数值为对照植物在相似条件下生长和熟化时的USDA等级指数值的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的叶，其中所述对照植物与所述烟草植物除所述突变外具有基本相同的遗传背景。

8.实施方案1的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物包含为对照植物在相似生长条件下生长时的烟碱水平的1％以下、2％以下、5％以下、8％以下、10％以下、12％以下、15％以下、20％以下、25％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下或80％以下的烟碱水平，其中所述对照植物与所述烟草植物除所述突变外具有基本相同的遗传背景。

9.实施方案1的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物包含选自下组的烟碱水平：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％和小于0.05％。

10.实施方案1的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物还包含直接抑制一种或多种编码选自下组产物的基因的表达或活性的转基因或突变：PMT、MPO、QPT、BBL、A622、天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚胺酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、烟碱吸收通透酶(NUP)和MATE转运蛋白。

11.烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其在Nic1b基因座中包含突变，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有与相似条件下生长和熟化时的对照植物相当的USDA等级指数值，其中所述对照植物与所述烟草植物除所述突变外具有基本相同的遗传背景。

12.实施方案11的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物还在Nic2基因座的ERF基因中包含突变。

13.实施方案11的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物在选自下组的两个或更多、三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多或所有七个基因中包含一个或多个突变：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。

14.实施方案11的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物还在ERF189、ERF115或两者中包含一个或多个突变。

15.实施方案11的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有选自下组的USDA等级指数值的叶：55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高和95或更高。

16.实施方案11的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有对照植物的等级指数的至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％的USDA等级指数值的叶。

17.实施方案11的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物包含为在相似生长条件下生长的对照植物的烟碱水平的1％以下、2％以下、5％以下、8％以下、10％以下、12％以下、15％以下、20％以下、25％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下或80％以下的烟碱水平。

18.实施方案11的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物还包含直接抑制一种或多种编码选自下组产物的基因的表达或活性的转基因或突变：PMT、MPO、QPT、BBL、A622、天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚胺酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、烟碱吸收通透酶(NUP)和MATE转运蛋白。

19.包含nic1b突变的烟草品种的植物或烟草基因型，其中所述烟草品种具有在相似生长条件下生长时的对照烟草品种的叶等级指数相当的叶等级指数，其中所述对照烟草品种与所述烟草品种除所述突变外具有基本相同的遗传背景。

20.实施方案19的植物或烟草基因型，其中所述烟草品种还在Nic2基因座的ERF基因中包含突变。

21.实施方案19的植物或烟草基因型，其中所述烟草植物在选自下组的两个或更多、三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多或所有七个基因中还包含一个或多个突变：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。

22.实施方案19的植物或烟草基因型，其中所述烟草植物还在ERF189、ERF115或两者中包含一个或多个突变。

23.非转基因烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包含选自下组的烟碱水平：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％和小于0.05％，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有50或更高、55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高和95或更高的USDA等级指数值的叶。

24.实施方案23的非转基因烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述非转基因烟草植物包含小于2.0％的烟碱水平且能够产生在熟化时具有70或更高的USDA等级指数值的叶。

25.实施方案23的非转基因烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述非转基因烟草植物包含小于1.0％的烟碱水平且能够产生在熟化时具有70或更高的USDA等级指数值的叶。

26.烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其在Nic1b基因座中包含非转基因突变，其中所述非转基因突变将所述烟草植物的烟碱水平降低至在相似生长条件下生长时的对照植物的烟碱水平的1％以下、2％以下、5％以下、8％以下、10％以下、12％以下、15％以下、20％以下、25％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下或80％以下，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有与对照植物的USDA等级指数值相当的USDA等级指数值的叶，且其中所述对照植物与所述烟草植物除所述非转基因突变外具有基本相同的遗传背景。

27.实施方案1-26中任一项的烟草植物的群体。

28.熟化烟草材料，其来自实施方案1-26中任一项的烟草植物。

29.实施方案28的熟化烟草材料，其中所述熟化烟草材料通过选自下组的熟化方法制备：烤制熟化、晾制熟化、火烤熟化和晒制熟化。

30.烟草掺合物，其包含实施方案28的熟化烟草材料。

31.实施方案30的烟草掺合物，其中所述熟化烟草材料构成所述烟草掺合物中熟化烟草的约至少10重量％、至少15重量％、至少20重量％、至少25重量％、至少30重量％、至少35重量％、至少40重量％、至少45重量％、至少50重量％、至少55重量％、至少60重量％、至少65重量％、至少70重量％、至少75重量％、至少80重量％、至少85重量％、至少90重量％或至少95重量％。

32.实施方案30的烟草掺合物，其中所述熟化烟草材料构成所述烟草掺合物中熟化烟草的约至少10体积％、至少15体积％、至少20体积％、至少25体积％、至少30体积％、至少35体积％、至少40体积％、至少45体积％、至少50体积％、至少55体积％、至少60体积％、至少65体积％、至少70体积％、至少75体积％、至少80体积％、至少85体积％、至少90体积％或至少95体积％。

33.烟草制品，其包含实施方案28的熟化烟草材料。

34.实施方案33的烟草制品，其中所述烟草制品选自下组：香烟、小雪茄烟、非通风凹陷过滤嘴香烟、通风凹陷过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟、卷烟、嚼烟、叶烟、烟碎和烟丝。

35.实施方案33的烟草制品，其中所述烟草制品是无烟烟草制品。

36.实施方案35的烟草制品，其中所述无烟烟草制品选自下组：散叶嚼烟、塞嚼烟、湿鼻烟和鼻烟。

37.再造烟草，其包含实施方案28的熟化烟草材料。

38.烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其在Nic1b基因座中包含突变，其中所述突变在LA Burley 21品种中不存在。

39.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中与LA Burley 21品种相比，所述烟草植物在Nic1b基因座包含较短的染色体渗入。

40.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中与在相似生长条件下生长时的不具有所述突变的对照烟草植物相比，所述烟草植物包含包含较低水平的烟碱。

41.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物包含为在相似生长条件下生长的不具有所述突变的对照烟草植物中烟碱水平的1％以下、2％以下、5％以下、8％以下、10％以下、12％以下、15％以下、20％以下、25％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下或80％以下的烟碱水平。

42.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中与在相似生长条件下生长时的不具有所述突变的对照烟草植物相比，所述烟草植物包含较低水平的总生物碱。

43.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中与在相似生长条件下生长时的不具有所述突变的对照烟草植物相比，所述烟草植物包含较低水平的一种或多种选自下组的生物碱：烟碱、去甲烟碱、假木贼碱和新烟草碱。

44.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中与当在相似生长条件下生长时的不具有所述突变的对照烟草植物相比，所述烟草植物包含相似水平的一种或多种选自下组的化合物：3-甲基戊酸、戊酸、异戊酸、labdenoid、cembrenoid、糖酯和还原糖。

45.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变是纯合的。

46.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变是杂合的。

47.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变选自下组：点突变、缺失、插入、复制和倒位。

48.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变通过选自下组的方法引入：随机诱变和靶向诱变。

49.实施方案48的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述靶向诱变由大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALEN或CRISPR介导。

50.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物还在Nic2基因座的ERF基因中包含突变。

51.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变位于包含与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列的基因内：SEQ ID NO:3-37、146、149、152-156、202、203和184-186、及其片段。

52.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变降低所述基因的表达或活性。

53.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变位于包含与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列的基因内：SEQ ID NO:4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202-205和72、及其片段。

54.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变位于包含与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列的基因内：SEQ ID NO:14、17、18、19、49、52、53、202-205和54、及其片段。

55.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变位于与选自下组的序列具有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少98％，至少99％同一性的序列内：SEQ ID NO:4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、202-205、54和72、及其片段。

56.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内：SEQ ID NO:14、17、18、19、49、52、53、202-205和54、及其片段。

57.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变位于包含与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的编码序列的基因内：SEQ ID NO:49、52、53、204、205和54、及其片段。

58.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内：SEQ ID NO:49、52、53、204、205和54、及其片段。

59.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变位于编码与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的多肽的基因内：SEQ ID NO:84、87、88和89、及其片段。

60.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中与在相似生长条件下生长时的不具有所述突变的烟草植物相比，所述植物还包含降低水平的编码选自下组产物的一个或多个基因的mRNA、蛋白质或两者：PMT、MPO、QPT、BBL、MATE和A622。

61.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述植物还包含抑制一种或多种编码选自下组产物的基因的表达或活性的转基因或突变：PMT、MPO、QPT、BBL、A622、天冬氨酸氧化酶、胍丁胺脱亚胺酶(AIC)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、烟碱吸收通透酶(NUP)和MATE转运蛋白。

62.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物是杂交体。

63.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述部分选自下组：叶、茎、根、种子、花、花粉、花药、胚珠、梗节、果实、分生组织、子叶、下胚轴、荚、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、芽、细胞和原生质体。

64.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物来自选自下组的品种：烤制熟化烟草、晾制熟化烟草、深色烤制熟化烟草、Galpao烟和东方烟。

65.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物来自选自下组的品种：白肋烟、马里兰烟和深色晾制熟化烟草。

66.实施方案38的烟草植物的群体。

67.熟化烟草材料，其来自实施方案38的烟草植物。

68.实施方案67的熟化烟草材料，其中与来自没有所述突变的对照烟草植物的熟化烟草材料相比，所述熟化烟草材料包含较低水平的烟碱。

69.实施方案67的熟化烟草材料，其中所述烟草植物包含0.2％-0.6％的烟碱水平。

70.实施方案67的熟化烟草材料，其中所述烟草植物包含1.0％-3.0％的烟碱水平。

71.根据实施方案67的熟化烟草材料，其中所述熟化烟草材料通过选自下组的熟化方法制备：烤制熟化、晾制熟化、火烤熟化和晒制熟化。

72.烟草掺合物，其包含实施方案67的熟化烟草材料。

73.烟草制品，其包含实施方案67的熟化烟草材料。

74.实施方案73的烟草制品，其中所述烟草制品选自下组：香烟、小雪茄、非通风凹陷过滤嘴香烟、通风凹陷过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟、卷烟、嚼烟、叶烟、烟碎和烟丝。

75.实施方案73的烟草制品，其中所述烟草制品是无烟烟草制品。

76.实施方案75的烟草制品，其中所述无烟烟草制品选自下组：散叶嚼烟、塞嚼烟、湿鼻烟和鼻烟。

77.再造烟草，其包含实施方案67的熟化烟草材料。

78.重组DNA构建体，其包含在烟草细胞中有功能且可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的启动子，所述多肽具有与选自下组的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:73-107、148、151、180-183、206、207和190-192、及其片段。

79.烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包含实施方案78的重组DNA构建体。

80.实施方案79的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中与不含所述重组DNA构建体的对照烟草植物相比，所述烟草植物包含更高水平的烟碱。

81.熟化烟草材料，其来自实施方案79的烟草植物。

82.烟草制品，其包含实施方案81的熟化烟草材料。

83.增加烟草植物的烟碱水平的方法，所述方法包括用实施方案78的重组DNA构建体转化烟草植物。

84.重组DNA构建体，其包含在烟草细胞中有功能且可操作地连接至编码RNA分子的多核苷酸的启动子，所述RNA分子能够结合编码具有与选自下组的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列的多肽的RNA：SEQ ID NO:73-107、148、151、180-183、206、207和190-192、及其片段，且其中所述RNA分子抑制所述多肽的表达。

85.烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包含实施方案84的重组DNA构建体。

86.实施方案85的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述RNA分子选自下组：microRNA、siRNA和反式作用siRNA。

87.实施方案85的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述多核苷酸编码双链RNA。

88.实施方案85的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中与不含所述重组DNA构建体的对照烟草植物相比，所述烟草植物包含较低水平的烟碱。

89.熟化烟草材料，其来自实施方案85的烟草植物。

90.烟草制品，其包含实施方案89的熟化烟草材料。

91.降低烟草植物的烟碱水平的方法，所述方法包括用实施方案84的重组DNA构建体转化烟草植物。

92.烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包含异源表达盒，所述异源表达盒包含基因的Nic1b抑制序列，所述基因包含选自下组的序列：SEQ ID NO:3-37、146、149、152-156、202、203和184-186、及其片段，其中所述抑制序列可操作地连接至在植物细胞中有功能的启动子，且其中所述抑制序列与选自下组序列的至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸的片段具有至少90％序列同一性：SEQ ID NO:3-37、146、149、152-156、202、203和184-186、及其片段。

93.实施方案92的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述Nic1b抑制序列能够作为选自下组的抑制性多核苷酸转录：单链RNA多核苷酸、双链RNA多核苷酸及其组合。

94.实施方案92的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述启动子选自下组：组成型启动子、诱导型启动子和组织优选型启动子。

95.实施方案92的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述启动子是根特异性启动子。

96.烟草植物或其烟草基因型或其烟草部分，其包含异源表达盒，所述异源表达盒包含基因的Nic1b抑制序列，所述基因包含选自下组序列：SEQ ID NO:4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202-205和72及其片段，其中所述抑制序列可操作地连接至在植物细胞中有功能的启动子，且其中所述抑制序列与选自下组序列的至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80个核苷酸的片段具有至少90％的序列同一性：SEQ ID NO:4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202-205和72、及其片段。

97.将低烟碱性状渗入至烟草品种中的方法，所述方法包括：

a.将包含低烟碱性状的第一烟草品种与不具有所述低烟碱性状的第二烟草品种杂交以产生一种或多种后代烟草植物；

b.针对与低烟碱性状连锁的多态性标记，对所述一种或多种后代烟草植物进行基因分型，其中所述多态性标记在侧接选自下组的SNP标记中的任意两个的染色体区间中：SEQ ID No.125-145和193-201；以及

c.选择包含低烟碱性状的后代烟草植物。

98.实施方案97的方法，其中所述方法还包括使所述选择的后代烟草植物与所述第二烟草品种回交。

99.实施方案97所述的方法，其中所述方法还包括：

d.将所选择的后代植物与自身或与第二烟草品种杂交以产生一种或多种进一步的后代烟草植物；以及

e.选择包含低烟碱性状的另一后代烟草植物。

100.实施方案99的方法，其中所述选择步骤(e)包括标记辅助的选择。

101.实施方案97的方法，其中所述方法产生包含低烟碱性状的单一基因转化。

102.实施方案97的方法，其中所述第二烟草品种是优良品种。

103.实施方案97的方法，其中所述基因分型涉及一种或多种分子标记测定。

104.实施方案97的方法，其中所述多态性标记包含选自下组的多态性：单核苷酸多态性(SNP)、DNA序列中的插入或缺失(Indel)、DNA序列的简单序列重复(SSR)、限制性片段长度多态性(RFLP)和标签SNP。

105.实施方案97的方法，其中所述基因分型包括测定位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内的核酸序列：SEQ ID NO:3-37、146、149、152-156、202、203和184-186及其片段。

106.实施方案97的方法，其中所述基因分型包括测定位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内的核酸序列：SEQ ID NO:4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202-205和72及其片段。

107.实施方案97的方法，其中所述基因分型包括测定位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内的核酸序列：SEQ ID NO:14、17、18、19、49、52、53、202-205和54及其片段。

108.实施方案97的方法，其中所述第一烟草品种选自下组：LA Burley 21、LAFC53和LNKY171。

109.实施方案97的方法，其中与LA Burley 21、LAFC53和LNKY171相比，所述选择的后代烟草植物在Nic1b基因座处包含较短的染色体渗入。

110.将低烟碱性状渗入到烟草品种中的方法，所述方法包括：

b.针对与低烟碱性状连锁的多态性标记，对所述一种或多种后代烟草植物进行基因分型，其中所述多态性标记在选自下组的SNP标记中的任一个的20cM内：SEQ ID No.125-145和193-201，或具有选自下组的序列的任何基因座内：SEQ ID No.1、3-37、146、149、152-156、202、203和184-186；以及

c.选择包含低烟碱性状的后代烟草植物。

111.实施方案110的方法，其中所述基因分型包括测定位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内的核酸序列：SEQ ID NO:3-37、146、149、152-156、202、203和184-186、及其片段。

112.实施方案110的方法，其中所述基因分型包括测定位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内的核酸序列：SEQ ID NO:4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202-205和72、及其片段。

113.实施方案110的方法，其中所述基因分型包括测定位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内的核酸序列：SEQ ID NO:14、17、18、19、49、52、53、202-205和54、及其片段。

114.选择具有低烟碱性状的烟草植物的方法，所述方法包括：

a.从烟草种质的集合中分离核酸；

b.测定所述核酸中与Nic1b基因座紧密连锁的一个或多个标记；以及

c.基于所述标记测定选择具有低烟碱性状的烟草植物。

115.实施方案114所述的方法，其中所述一种或多种标记在选自下组的SNP标记的任一种的约20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.5cM或小于0.5cM内：SEQ ID No.125-145和193-201，或具有选自下组序列的任意基因座内：SEQ ID No.1、3-37、146、149、152-156、202、203和184-186。

116.实施方案114所述的方法，其中所述测定包括测定位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内的核酸序列：SEQ ID NO:3-37、146、149、152-156、202、203以及184-186、及其片段。

117.实施方案114的方法，其中所述测定包括测定位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内的核酸序列：SEQ ID NO:4、14、15、17、18、19、37、39、49、50、52、53、54、202-205和72、及其片段。

118.实施方案114的方法，其中所述测定包括测定位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内的核酸序列：SEQ ID NO:14、17、18、19、49、52、53、202-205和54、及其片段。

119.实施方案114的方法，其中所述方法还包括测定选择的植物的烟碱水平以确定低烟碱性状。

120.实施方案114的方法，其中所述烟草种质的集合是单倍体育种群体。

121.烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包含可从LA Burley21、LA FC53和LN KY171中的任一个获得的染色体渗入，且侧接且不包含选自下组的SNP标记中的任两个：SEQ ID No.125-145和193-201，或侧接选自下组的序列的任两个基因座：SEQ ID No.1、3-37、146、149、152-156、202、203和184-186，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有50或更高、55或更高、60或更高、65或更高、70或更高、75或更高、80或更高、85或更高、90或更高、或95或更高的USDA等级指数值的叶。

122.实施方案121的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物包含选自下组的烟碱水平：小于3％、小于2.75％、小于2.5％、小于2.25％、小于2.0％、小于1.75％、小于1.5％、小于1.25％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％和小于0.05％。

123.实施方案121的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述染色体渗入侧接且不包含选自下组的SNP标记的任意两个：SEQ ID No.126-135。

124.实施方案121的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述染色体渗入侧接且不包含SNP标记SEQ ID No.129-132。

125.烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其包含可从LA Burley21、LAFC53和LNKY171中的任一个获得的第一染色体渗入，且侧接且不包含Nic1b标记No.1-207中的任意两个，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有与在相似生长条件下生长的对照植物相当的USDA等级指数值的叶，其中所述对照植物与所述烟草植物除所述突变外具有基本相同的遗传背景。

126.实施方案125的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述烟草植物包含为在相似生长条件下生长的对照植物的烟碱水平的1％以下、2％以下、5％以下、8％以下、10％以下、12％以下、15％以下、20％以下、25％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下或80％以下的烟碱水平。

127.实施方案121-126和136-141中任一项的烟草植物的群体。

128.熟化烟草材料，其来自实施方案121-126中任一项的烟草植物。

129.实施方案128的熟化烟草材料，其中所述熟化烟草材料通过选自下组的熟化方法制备：烤制熟化、晾制熟化、火烤熟化和晒制熟化。

130.烟草掺合物，其包含实施方案128的熟化烟草材料。

131.实施方案130的烟草掺合物，其中所述熟化烟草材料构成所述烟草掺合物中熟化烟草的约至少10重量％、至少15重量％、至少20重量％、至少25重量％、至少30重量％、至少35重量％、至少40重量％、至少45重量％、至少50重量％、至少55重量％、至少60重量％、至少65重量％、至少70重量％、至少75重量％、至少80重量％、至少85重量％、至少90重量％或至少95重量％。

132.实施方案130的烟草掺合物，其中所述熟化烟草材料构成所述烟草掺合物中熟化烟草的约至少10体积％、至少15体积％、至少20体积％、至少25体积％、至少30体积％、至少35体积％、至少40体积％、至少45体积％、至少50体积％、至少55体积％、至少60体积％、至少65体积％、至少70体积％、至少75体积％、至少80体积％、至少85体积％、至少90体积％或至少95体积％。

133.烟草制品，其包含实施方案128的熟化烟草材料。

134.实施方案133的烟草制品，其中所述烟草制品选自下组：香烟、小雪茄、非通风凹陷过滤嘴香烟、通风凹陷过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟、卷烟、嚼烟、叶烟、烟碎和烟丝。

135.实施方案133的烟草制品，其中所述烟草制品选自下组：散叶嚼烟、塞嚼烟、湿鼻烟和鼻烟。

136.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内：SEQ ID NO:3、13、14、146、153、154、17、18、19、202和203、及其片段。

137.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内：SEQ ID NO:3、13、14、153、154、17、18、19、202和203、及其片段。

138.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内：SEQ ID NO:3、13、14、153、154、17、18、19和203、及其片段。

139.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内：SEQ ID NO:3、13、17、18和19、及其片段。

140.实施方案38的烟草植物或其部分，其中所述突变位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内：SEQ ID NO:3、18和19、及其片段。

141.实施方案38的烟草植物或烟草基因型或其烟草部分，其中所述突变位于编码与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的多肽的基因内：SEQ ID NO:73、83、84、87、88、89、180、181、206和207、及其片段。

以下列表提供了第二组示例性实施方案。

1.烟草植物或其部分，其在Nic1b_ERF基因座中包含突变，其中所述烟草植物在熟化时能够产生USDA等级指数值为50或更高的叶。

2.实施方案1的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物是普通烟草(Nicotianatabacum)植物。

3.实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物还在Nic2基因座的ERF基因中包含突变。

4.实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物还在选自下组的两个或更多、三个或更多、四个或更多、五个或更多、六或更多或所有七个基因中包含一个或多个突变：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。

5.实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物在熟化时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。

6.实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有与对照植物在相似条件下生长和熟化时相当的USDA等级指数值的叶，其中所述对照植物与所述烟草植物除所述突变外具有基本相同的遗传背景。

7.实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物包含为在相似生长条件下生长时的对照植物的烟碱水平的40％以下的烟碱水平，其中所述对照植物与所述烟草植物除所述突变外具有基本相同的遗传背景。

8.实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物包含小于2.0％的烟碱水平。

9.烟草植物或其部分，其在Nic1b_ERF基因座中包含非转基因突变，其中所述非转基因突变使所述烟草植物的烟碱水平降低至在相似生长条件下生长时的对照植物的烟碱水平的60％以下，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有与所述对照植物的USDA等级指数值相当的USDA等级指数值的叶，且其中所述对照植物与所述烟草植物除所述非转基因突变外具有基本相同的遗传背景，其中所述烟草植物是普通烟草(Nicotiana tabacum)植物。

10.实施方案2的烟草植物的群体。

11.熟化烟草材料，其来自实施方案2的烟草植物。

12.实施方案11的熟化烟草材料，其中所述熟化烟草材料通过选自下组的熟化方法制备：烤制熟化、晾制熟化、火烤熟化和晒制熟化。

13.烟草掺合物，其包含实施方案11的所述熟化烟草材料。

14.烟草制品，其包含实施方案11的熟化烟草材料。

15.实施方案14的烟草制品，其中所述烟草制品选自下组：香烟、小雪茄烟、非通风凹陷过滤嘴香烟、通风凹陷过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟、卷烟、嚼烟、叶烟、烟碎和烟丝。

16.实施方案14的烟草制品，其中所述烟草制品是无烟烟草制品。

17.实施方案16的烟草制品，其中所述无烟烟草制品选自下组：散叶嚼烟、塞嚼烟、湿鼻烟和鼻烟。

18.烟草植物或其部分，其在Nic1b_ERF基因座中包含突变，其中所述突变在LABurley 21、LA FC53和LN KY171中不存在。

19.实施方案18的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物还在Nic2基因座的ERF基因中包含突变。

20.实施方案18的烟草植物或其部分，其中所述突变位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内：SEQ ID NO:3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54和202-205、及其片段。

21.实施方案18的烟草植物或其部分，其中所述突变位于编码与选自下组序列具有至少80％同一性的多肽的基因内：SEQ ID NO:73、83、84、87、88、89、180、181、206和207。

22.实施方案18的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物来自选自下组的品种：烤制熟化烟草、晾制熟化烟草、深色烤制熟化烟草、Galpao烟和东方烟。

23.实施方案18的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物来自选自下组的品种：白肋烟、马里兰烟和深色晾制熟化烟草。

24.熟化烟草材料，其来自实施方案18的烟草植物。

25.实施方案24的熟化烟草材料，其中所述烟草植物包含0.2％-0.6％的烟碱水平。

26.实施方案24的熟化烟草材料，其中所述烟草植物包含1.0％-3.0％的烟碱水平。

27.实施方案24的熟化烟草材料，其中所述熟化烟草材料通过选自下组的熟化方法制备：烤制熟化、晾制熟化、火烤熟化和晒制熟化。

28.烟草制品，其包含实施方案24的熟化烟草材料。

29.实施方案24的烟草制品，其中所述烟草制品选自下组：香烟、小雪茄烟、非通风凹陷过滤嘴香烟、通风凹陷过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟、卷烟、嚼烟、叶烟、烟碎和烟丝。

30.实施方案24的烟草制品，其中所述烟草制品是无烟烟草制品。

以下提供了第三组示例性实施方案：

2.实施方案1的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物是普通烟草植物。

3.实施方案1或2的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物还在Nic2基因座的ERF基因中包含突变。

4.前述实施方案中任一项的烟草植物或其部分，其中所述Nic2基因座的ERF基因是NCG1。

5.前述实施方案中任一项的烟草植物或其部分，其中所述Nic2基因座的ERF基因是ERF16。

6.前述实施方案中任一项的烟草植物或其部分，其中所述Nic2基因座的ERF基因是NCG15。

7.前述实施方案中任一项的烟草植物或其部分，其中所述Nic2基因座的ERF基因是NCG17。

8.前述实施方案中任一项的烟草植物或其部分，其中所述Nic2基因座的ERF基因是ERF130。

9.实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物还在选自下组的两个或更多、三个或更多、四个或更多、五个或更多、六个或更多或所有七个基因中包含一个或多个突变：ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168。

10.实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物在熟化时能够产生USDA等级指数值为70或更高的叶。

11.实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有与对照植物在相似条件下生长和熟化时相当的USDA等级指数值的叶，其中所述对照植物与所述烟草植物除所述突变外具有基本相同的遗传背景。

12.实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物包含为在相似生长条件下生长时的对照植物的烟碱水平的40％以下的烟碱水平，其中所述对照植物与所述烟草植物除所述突变外具有基本相同的遗传背景。

13.实施方案2的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物包含小于2.0％的烟碱水平。

14.烟草植物或其部分，其在Nic1b_ERF基因座中包含非转基因突变，其中所述非转基因突变使所述烟草植物的烟碱水平降低至在相似生长条件下生长时的对照植物的烟碱水平的60％以下，其中所述烟草植物在熟化时能够产生具有与所述对照植物的USDA等级指数值相当的USDA等级指数值的叶，且其中所述对照植物与所述烟草植物除所述非转基因突变外具有基本相同的遗传背景，其中所述烟草植物是普通烟草(Nicotiana tabacum)植物。

15.实施方案2或14的烟草植物的群体。

16.熟化烟草材料，其来自实施方案2或14的烟草植物。

17.实施方案16的熟化烟草材料，其中所述熟化烟草材料通过选自下组的熟化方法制备：烤制熟化、晾制熟化、火烤熟化和晒制熟化。

18.烟草掺合物，其包含实施方案16的所述熟化烟草材料。

19.烟草制品，其包含实施方案16的熟化烟草材料。

20.实施方案19的烟草制品，其中所述烟草制品选自下组：香烟、小雪茄烟、非通风凹陷过滤嘴香烟、通风凹陷过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟、卷烟、嚼烟、叶烟、烟碎和烟丝。

21.实施方案19的烟草制品，其中所述烟草制品是无烟烟草制品。

22.实施方案21的烟草制品，其中所述无烟烟草制品选自下组：散叶嚼烟、塞嚼烟、湿鼻烟和鼻烟。

23.烟草植物或其部分，其在Nic1b_ERF基因座中包含突变，其中所述突变在LABurley 21、LA FC53和LN KY171中不存在。

24.实施方案23的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物还在Nic2基因座的ERF基因中包含突变。

25.实施方案23或24的烟草植物或其部分，其中所述Nic2基因座的ERF基因是NCG1。

26.实施方案23-25中任一项的烟草植物或其部分，其中所述Nic2基因座的ERF基因是ERF16。

27.实施方案23-26中任一项的烟草植物或其部分，其中所述Nic2基因座的ERF基因是NCG15。

28.实施方案23-27中任一项的烟草植物或其部分，其中所述Nic2基因座的ERF基因是NCG17。

29.实施方案23-28中任一项的烟草植物或其部分，其中所述Nic2基因座的ERF基因是ERF130。

30.实施方案23-29中任一项的烟草植物或其部分，其中所述突变位于与选自下组的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的序列内：SEQ ID NO:3、13、14、17、18、19、38、48、49、52、53、54和202-205、及其片段。

31.实施方案23-30中任一项的烟草植物或其部分，其中所述突变位于编码与选自下组的序列具有至少80％同一性的多肽的基因内：SEQ ID NO:73、83、84、87、88、89、180、181、206和207。

32.实施方案23-31中任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物来自选自下组的品种：烤制熟化烟草、晾制熟化烟草、深色烤制熟化烟草和Galpao烟以及东方烟。

33.实施方案23-32中任一项所述的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物来自选自下组的品种：白肋烟、马里兰烟和深色晾制熟化烟草。

34.熟化烟草材料，其来自实施方案23-33中任一项的烟草植物。

35.实施方案34的熟化烟草材料，其中所述烟草植物包含0.2％-0.6％的烟碱水平。

36.实施方案34的熟化烟草材料，其中所述烟草植物包含1.0％-3.0％的烟碱水平。

37.实施方案34的熟化烟草材料，其中所述熟化烟草材料通过选自下组的熟化方法制备：烤制熟化、晾制熟化、火烤熟化和晒制熟化。

38.烟草制品，其包含实施方案34的熟化烟草材料。

39.实施方案34的烟草制品，其中所述烟草制品选自下组：香烟、小雪茄烟、非通风凹陷过滤嘴香烟、通风凹陷过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟、卷烟、嚼烟、叶烟、烟碎和烟丝。

40.实施方案34的烟草制品，其中所述烟草制品是无烟烟草制品。

41.经修饰的烟草植物或其部分，其在与选自下组的多核苷酸序列具有至少90％同一性的多核苷酸中包含非天然突变：SEQ ID NO:3、13、14、17-19、38、48、49、52-54、153、154、158、159、202、203、204和205。

42.实施方案41的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述多核苷酸与选自下组的多核苷酸序列具有至少95％同一性：SEQ ID NO:3、13、14、17-19、38、48、49、52-54、153、154、158、159、202、203、204和205。

43.实施方案41或42的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述多核苷酸与选自下组的多核苷酸序列具有100％同一性：SEQ ID NO:3、13、14、17-19、38、48、49、52-54、153、154、158、159、202、203、204和205。

44.实施方案41-43中任一项的经修饰的烟草植物或其部分，其中与缺乏所述突变的对照烟草植物相比，所述至少一种经修饰的烟草植物包含减少量的至少一种生物碱。

45.实施方案41-44中任一项的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述至少一种生物碱选自下组：假木贼碱、新烟草碱、烟碱和去甲烟碱。

46.经修饰的烟草植物或其部分，其在具有核酸序列的多核苷酸中包含非天然突变，所述核酸序列编码与选自下组的氨基酸序列具有至少90％同一性或相似性的多肽：SEQID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207。

47.实施方案46的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述多核苷酸具有编码与选自下组的氨基酸序列具有至少95％同一性或相似性的多肽的核酸序列：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207。

48.实施方案46或47的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述多核苷酸具有编码与选自下组的氨基酸序列具有至少100％同一性或相似性的多肽的核酸序列：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207。

49.实施方案46-48中任一项的经修饰的烟草植物或其部分，其中相对于不具有所述基因修饰或突变或重组核酸构建体的对照植物，与缺乏所述突变的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物包含降低水平的至少一种生物碱。

50.实施方案46-49中任一项的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述较高USDA等级指数值比所述对照植物的所述可比叶高至少5％。

51.前述实施方案任一项的烟草植物或其部分，其中所述至少一种生物碱选自下组：假木贼碱、新烟草碱、烟碱和去甲烟碱。

52.熟化烟草材料，其来自前述实施方案中任一项的烟草植物。

53.烟草制品，其包含实施方案52的熟化烟草材料。

54.实施方案53的烟草制品，其中所述烟草制品选自下组：香烟、小雪茄烟、非通风凹陷过滤嘴香烟、通风凹陷过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟、卷烟、嚼烟、叶烟、烟碎和烟丝、再造烟草、散叶嚼烟、塞嚼烟、湿鼻烟、鼻烟和干鼻烟或无烟烟草制品。

55.产生经修饰的烟草植物的方法，其包含：

(a)在编码包含与选自下组氨基酸序列至少90％相同或相似的氨基酸序列的多肽的内源核酸序列中，在至少一种烟草细胞中诱导非天然突变：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207；

(b)从步骤(a)选择至少一种包含所述非天然突变的烟草细胞；以及

(c)从步骤(b)中选择的所述至少一种烟草细胞再生至少一种经修饰的烟草植物；

其中与缺乏所述突变的对照烟草植物相比，所述至少一种经修饰的烟草植物包含减少量的至少一种生物碱。

56.实施方案55的方法，其中与缺乏所述突变的对照烟草植物相比,所述至少一种经修饰的烟草植物包含减少量的至少一种生物碱。

57.实施方案55或56中任一项所述的方法，其中所述内源核酸序列与选自下组的序列具有至少90％的同一性：SEQ ID NO:3、13、14、17-19、38、48、49、52-54、153、154、158、159、202、203、204和205。

58.实施方案55-57中任一项所述的方法，其中所述至少一种生物碱选自下组：假木贼碱、新烟草碱、烟碱和去甲烟碱。

59.实施方案55-58中任一项的方法，其中所述方法还包括：

(d)种植步骤(c)中再生的所述经修饰的烟草植物。

60.实施方案55-59中任一项的方法，其中所述方法还包括：

(e)将步骤(d)中生长的所述经修饰的烟草植物与第二烟草植物杂交；以及

(f)从步骤(e)中的所述杂交获得至少一种种子。

61.实施方案1-60中任一项的经修饰的烟草植物或其部分，其中与缺乏所述突变的对照烟草植物相比，所述至少一种经修饰的烟草植物包含减少量的至少一种生物碱。

62.实施方案61的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述至少一种生物碱是假木贼碱。

63.实施方案61或62的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述至少一种生物碱是新烟草碱。

64.实施方案61、62或63的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述至少一种生物碱是烟碱。

65.实施方案61、62、63或64的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述至少一种生物碱是去甲烟碱。

现已一般性地描述了本公开内容，通过参考以下实施例将更容易地理解本公开内容，除非另有说明，否则以下实施例是以举例说明的方式提供，且并非旨在限制本公开内容。

具体实施方式

实施例1：具有低生物碱性状的TN90品系和具有包含nic1和nic2缺失标记等位基因的高、中生物碱性状的植物的开发

从LA BU21(含有nic1和nic2突变的低生物碱白肋烟21，供体亲本)和优良栽培品种TN90(受体亲本)之间的杂交开发育种群体。目的是获得低生物碱植物，其与具有较差叶特征的亲本LA BU21品系相比还具有改善的叶质量。将具有所需特征(低生物碱水平，改善的叶质量)的F2植物进一步自交以获得F3代，随后获得F5代。图1显示了用于开发具有低生物碱性状的自交TN90品系的育种过程。

如图1所示，在

阵列上筛选22个F3植物，所述

阵列基于在相对于TN90烟草基因组序列数据库的属于不同烟草类型(Flue,Dark,Oriental和Burley)的几个重测序品系中观察到的约170,000个多态性SNP而开发。植物22-6显示约40.6％的受体亲本基因组恢复，并被选择用于进一步的改进。F3代也显示低生物碱水平，与LA BU21中观察到的一致。使用Nic1和Nic2 KASP测定筛选F4代(参见US2016/0374387的SEQ ID NO:135和137，分别对应于Nic1^KASP和Nic2^KASP标记)。所有192株筛选的F4植物都具有两种缺失，并且选择3株植物(ds1059-138、ds1059-143和ds1059-192)用于进一步改良。将来自这三个植物的自交种子进一步扩大并评估F5代。所有220个F5植物对于nic1^KASP和nic2^KASP缺失等位基因都是纯合的。F5植物中的生物碱水平通过测量从植物顶部的第3、4和5号叶以及打顶后2周收集的合并的叶样品来确定。并非所有植物都表现出低生物碱性状，且还观察到叶表型的显著差异，其中几个品系表现出与商业白肋烟中观察到的一致的良好叶质量(表1)。

表1：选择的F5植物和对照植物的生物碱水平和叶表型。所有F5植物对于nic1^KASP和nic2^KASP缺失等位基因均为纯合。

实施例2：与低生物碱性状相关的其他基因组区域的鉴定

实施例1的F5植物具有高生物碱水平，尽管携带纯合nic1^KASP和nic2^KASP缺失等位基因，表明nic1^KASP和nic2^KASP缺失标记不表现出与低生物碱性状的100％连锁。为研究该观察结果，对LAFC53(携带nic1和nic2基因渗入的烤制熟化型)，LN KY171(携带nic1和nic2基因渗入的深色型)，和KY171(没有nic1和nic2基因渗入的深色品种)，以及对nic1^KASP和nic2^KASP缺失等位基因纯合但显示出高生物碱水平的两(2)个F5品系(G61-36和G61-39)，和对nic1^KASP和nic2^KASP缺失等位基因纯合并表现出低生物碱水平的两(2)个F5品系(G61-31和G61-37)进行进一步的重测序。除先前重测序的品系外，以下7种品系：BU21、HI BU21、LIBU21和LA BU21使用TN90基因组数据库映射(mapping)。

映射读数的覆盖分析从而进行2000-3000bp区域(SEQ ID No.1，下文称为“LA_associated_region”)的鉴定，即此前在US2016/0374387中描述的nic1缺失片段NT1.0-Scaffold0002504下游约2百万bp。LA_associated_region在LA BU21、LI BU21、LN KY171、LAFC53以及低生物碱纯合nic1^KASP nic2^KASP F5品系、G61-31和G61-37中缺失。相反，LA_associated_region在野生型(例如TN90、BU21、K326、NLM、Katerini)以及高生物碱纯合nic1^KASP nic2^KASP F5品系、G61-36和G61-39中未缺失(即存在)。LA_associated_region没有已知的基因。丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶基因存在于该区域的上游4877bp处，且ERF(ERF189的同源物)在该区域的下游59,945bp处。

此外，F3植物(22-6)的SNP基因分型揭示，在nic1缺失区段NT1.0-Scaffold0002504下游的从1,256,063bp开始且以2,766,118bp结束(约1,510,055bp长，SEQID No.2，本文称为“Nic1b区”)的基因组区在F3植物中是杂合的(包括LA_associated_region)。这表明Nic1b区的低生物碱等位基因可能源自雪茄(LA BU21由BU21和低生物碱古巴雪茄品种间的杂交产生)并在所得F4代和后代中分离。

此外，使用含有约170,000个SNP的Axiome阵列对47个F4植物和48个F5植物进行基因分型以进一步验证生物碱水平与LA_associated_region以及Nic1b区间的相关性。对3个祖先F4代植物(ds1059-138、ds1059-143和ds1059-192)的分析显示LA_associated_region和Nic1b区是杂合的或携带LA BU21样(B)等位基因。类似地，48个F5代植物在LA_associated_region和Nic1b区表现出分离，具有B等位基因(LA BU21样)的个体表现出低生物碱水平(0.137％-0.417％，干重)，且具有杂合状态(H)或野生型等位基因(A)的个体表现出中等至高生物碱水平(1.793％-5.419％，干重)。

实施例3：Nic1b区中基因和标记的鉴定

Nic1b区的序列分析揭示了来自该区域的至少35个注释基因(表2)。这些基因被称为Nic1b雪茄(Cigar)基因(Gene)(“NCG”)1-35。在这些NCG基因中，鉴定了六个乙烯响应性转录因子样(ERF样)基因。RNA-seq数据显示，从打顶后72小时收集的根样品中，10个NCG在LA BU21植物中表现出与BU21相关的降低的表达。与BU21相比，LA BU21中七个NCG(包括六个ERF样基因中的四个)下调，而其他三个NCG上调。

对LA BU21、TN90和选择的F5植物中的35个NCG中的每一个进行重测序以鉴定存在于LA BU21中并可能导致基因功能丧失的特异性天然突变。还进行其他重测序分析以鉴定可能引起基因表达失调的非编码序列(例如，启动子)中的突变。

此外，还鉴定了Nic1b区内和Nic1b区两侧的多态性以开发SNP标记。开发21个SNP标记用于Nic1b区的基因分型(表3)。其他SNP标记提供于表4中。这些标记位于Nic1b区内并紧邻各种ERF基因。它们具有可用于区分正常生物碱品系和低生物碱品系的等位基因。

表2：Nic1b区注释基因。^ag31431和g31432代表选择性剪接(见图2)。^bg31446可表示另一种选择性剪接。

表3：Nic1b区内和周围的标记。(*)基因组位置基于TN90基因组，其也用于标示NCG基因位置。

表4：SNP标记紧邻来自Nic1b区的多个ERF基因。(*)基因组位置基于参考TN90基因组。

实施例4：开发具有所需烟碱水平的烟草品种的转基因方法。

采用过表达和抑制的方法来研究NCG的功能并开发具有所需烟碱水平的烟草品种。产生两组转基因植物，一组采用全长编码序列的过表达方法，且另一组采用人工microRNA或RNAi序列的抑制方法。测试了所有35个NCG(NCG1-NCG35)，重点在于显示TN90和LA BU21之间差异表达的所有NCG，尤其是编码ERF样蛋白的NCG。在nic1 nic2双突变背景(例如，LA BU21)中进行一些过表达研究以测试所鉴定的基因(单独或组合)补充或拯救来自突变nic1等位基因的低生物碱突变表型的能力。

为表达全长编码序列或人工microRNA序列，构建具有CsVMV启动子和NOS终止子的表达载体，以及在肌动蛋白2启动子的指导下具有卡那霉素选择标记(NPT II)并具有NOS终止子的表达盒。示例性人工microRNA序列可见于表2。本领域普通技术人员理解，其他靶序列可用于构建抑制构建体或用于基因沉默的其他转基因方法(例如，RNAi、反式作用siRNA等)。

使用DNA轰击或基因枪途径将携带目标转基因的核酸构建体导入烟草叶盘。参见例如，Sanford et al.,1993,Methods Enzymol.,217:483-510；and Okuzaki and Tabei,2012,Plant Biotechnology,29:307-310。简言之，如下将含有转化盒的质粒DNA包被在1μm金颗粒(DNA/金)上。将1μm金颗粒在180℃下烘烤12小时，并制备储备溶液(40mg/ml)。为制备用于10次注射的混合物，将100μl储备溶液与40μl表达载体DNA(1μg/μl)、100μl 2.5MCaCl₂和40μl 0.1M亚精胺在1.5ml管中混合。将混合物以13,000×g离心30s，并将沉淀用500μl 100％乙醇洗涤。将DNA/金混合物悬浮在100μl水中，并将10μl加样至macrocarrier上，干燥，然后轰击。在PDS-1000/He系统(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)中，在部分真空(711mmHg)下，使用1,100psi破裂盘轰击每板两次。Narrow Leaf Madole(NLM)和Tennessee 90(TN 90)烟草叶盘用于通过RNAi构建体和全长基因构建体进行转化。将整片烟叶(长约45×30mm)置于MS培养基上过夜，且第二天用该构建体轰击叶盘。然后，将叶切成小片(约5×5mm)并放回TOM培养基(含有20g蔗糖/L；1mg/L IAA和2.5mg/L BAP的MS培养基)，在27℃生长3-5天，然后转移到含有300mg/l卡那霉素(TOM-Kan)的TOM培养基中生长。每2-3周将组织转移至新的TOM-Kan板，持续4-6周(27℃，16h光照)。卡那霉素抗性幼芽在轰击后4-6周再生。将芽转移到MS-卡那霉素平板上生长根。然后，评估来自T1植物(和随后的世代)的叶和/或根，以确定一种或多种生物碱的量。

实施例5：随机诱变以在Nic1b区内或周围产生赋予低生物碱性状的新突变

使用甲磺酸乙酯(EMS)诱变或快中子轰击进行烟草植物的随机诱变。EMS诱变由化学诱导基因组长度上的随机点突变组成。快中子诱变由将种子暴露于中子轰击组成，其通过双链DNA断裂引起大的缺失。

对于EMS诱变，将1g(约10,000粒种子)Tennessee 90烟草(TN90)种子在0.1％Tween中洗涤15分钟，然后在30ml ddH₂O中浸泡2小时。然后，将一百五十(150)μl的0.5％EMS(Sigma，目录号M-0880)混合到种子/ddH2O溶液中，并在室温(RT；约20℃)罩下孵育8-12h(30rpm旋转)。然后，从种子中除去液体并混入1M氢氧化钠中过夜以净化和处理。然后，用100ml ddH2O洗涤种子2-4小时。然后，将洗涤的种子悬浮在0.1％琼脂溶液中。

将在琼脂溶液中的EMS处理的种子以～2000粒种子/平皿均匀地铺展在平皿中的水浸泡的Carolina’s Choice Tobacco Mix(Carolina Soil Company,Kinston,NC)上。然后，用塑料包装覆盖平板并置于生长室中。当幼苗从土壤中长出，将塑料包装刺穿以使得湿度逐渐下降。两周后，完全除去塑料包装。将平皿移至温室并用NPK肥料施肥。将幼苗重新插入浮盘并生长至移植大小。随后将植物移植到田地中。在生长过程中，植物自花授粉形成M1种子。在成熟阶段，从每株植物收获5粒种子，并对来自每株植物的种子组给出单独的名称。由此形成了M1群体。使来自每株M0植物的M1种子的混合物生长，并收集M1植物的叶子用于DNA提取。扩增Nic1b区内、周围或两侧的靶基因并测序用于突变鉴定。在所有35个NCG(NCG1-NCG35)中鉴定了突变，重点在于显示TN90和LA BU21之间差异表达的所有NCG，尤其是编码ERF样蛋白的NCG。

实施例6：靶向诱变以在Nic1b区内或周围产生赋予低生物碱性状的新突变

通过精确基因组工程技术(例如转录活化物样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、锌指核酸酶和CRISPR(Cas9系统、Cpf1系统或Csm1系统))将突变引入Nic1b基因座(例如ERF101、ERF110、ERF16、ERF130和NCG)中和其周围来产生具有低烟碱同时维持高叶质量的烟草品系。在商业烟草品种(诸如TN90、K326和Narrow Leaf Madole)中进行基因组修饰。编辑所有35个NCG(NCG1-NCG35)，重点在于显示TN 90和LA BU21之间差异表达的所有NCG，尤其是编码ERF样蛋白的NCG。

例如，设计和合成CRISPR向导RNA以识别来自NCG基因的特定靶序列。示例性的向导RNA序列提供于表2中。然后，将向导RNA和编码Cas9、Cpf1或Csm1蛋白的伴随核酸(作为DNA质粒形式或作为mRNA形式)用于转化烟草原生质体。CRISPR-Cas9/Cpf1/Csm1核糖核蛋白复合物识别特定的NCG靶序列并引入双链断裂(DSB)。内源性非同源末端连接(NHEJ)DNA修复系统固定DSB，其可引入核苷酸缺失、插入或取代并产生潜在的功能缺失突变。或者，将具有所需序列的供体核酸分子包含在原生质体转化中用作模板分子以将所需序列引入CRISPR靶位点处或周围。

从生长室中的Magenta盒中生长的TN90烟叶中分离烟草原生质体。将3-4周龄植物的充分膨胀的叶(5cm)从叶的中部切成0.5-1mm的叶条。通过浸渍叶条的两侧，将叶条转移到制备的酶溶液(1％纤维素酶R10，0.25％浸解酶R10，0.4M甘露醇，20mM KCl，20mM MES(pH5.7)，10mM CaCl₂，0.1％ BSA)中。用干燥器将叶条在黑暗中真空渗透30分钟，无需振荡，在黑暗中继续消化4小时至在室温下过夜。将原生质体在100μm尼龙过滤器中过滤并用3mlLymphoprep纯化。将原生质体离心并用W5n溶液(154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，2mMMES，991mg/l葡萄糖pH 5.7)洗涤并以5×10⁵/ml的浓度悬浮于W5n溶液中。将原生质体保持在冰上30分钟以通过重力沉降在管的底部。转移W5n溶液并在室温下将原生质体重悬浮于P2溶液中。将50μl DNA(10-20μg质粒)，500μl原生质体(2×10⁵原生质体)和550μl PEG溶液(40％，v/v 10ml 4g PEG4000，0.2M甘露醇，0.1M CaCl2)在15ml微量离心管中轻轻混合，并将混合物在室温下孵育5分钟。

将原生质体沉淀并用1ml 2X 8EN1(8EN1:MS盐，不含NH₄NO₃，MS维生素，0.2％肌醇，4mM MES，1mg/l NAA，1mg/l IAA，0.5M甘露醇，0.5mg/l BAP，1.5％蔗糖)重悬浮。转化的原生质体用等量的低分子量琼脂糖(LMA)胶化，并滴加0.2ml原生质体-LAM形成珠。将10ml8EN1加入珠中，并在7天后，取出5ml 8EN1并加入5ml 8EN2(具有0.25M甘露醇的8EN1)；再过7天(14天)后，取出10ml 8EN2并加入10ml 8EN2；又7天(21天)后，取出5ml 8EN2并加入5ml8EN3(具有3％蔗糖的8EN1且不含甘露醇)；再过7天(28天)后，取出10ml 8EN3并加入10ml8EN3。将原生质体保持两周直到微愈伤组织生长。将愈伤组织转移到NCM固体培养基中直至其达到约5mm(通常约两周)。将愈伤组织转移到TOM-Kan固体培养基中以生长芽，并用本文所述的方法再生转化的烟草植物。对愈伤组织或再生植物进行测试并选择在NCG基因中具有所需突变的基因编辑事件。产生功能丧失NCG等位基因(例如，早期终止密码子或移码)或其他类型的突变(例如，功能获得或新变体)。

类似地，也使用基因组编辑技术(例如Cas9、Cpf1或Csm1介导的CRISPR编辑系统)编辑Nic2基因座的ERF基因(ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168)。产生功能丧失ERF突变(例如，早期终止密码子)或其他类型的突变(例如，功能获得或新变体)。

实施例7：显性抑制子在抑制Nic1b区中的ERF样基因以及产生低生物碱烟草中的用途

针对来自Nic1b区的一个或多个ERF样基因(例如NCG1、NCG11、NCG12、NCG15、NCG16、ERF101、ERF110、ERF16、ERF130和NCG17)，通过将ERF相关的两亲性抑制(EAR)基序连接到它们的C端来开发显性抑制子。当与转录因子连接时，已显示EAR基序主动抑制转录因子的靶基因的表达(Hiratsu et al.,Plant J.34:733-739(2003))。

简言之，将ERF-EAR构建体置于组成型启动子(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子)的控制下，并用于通过原生质体转化或农杆菌转化野生型烟草，从而产生每种构建体的转基因品系，以及用空载体(VC)转化的对照品系。验证转基因表达。测试烟碱水平和烟碱生物合成相关酶(腐胺N-甲基转移酶(PMT)、N-甲基腐胺氧化酶(MPO)、天冬氨酸氧化酶(AO)、喹啉酸合酶(QS)、喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QPT)和PIP家族氧化还原酶A622)和液泡膜定位的MATE家族转运蛋白MATE1和MATE2(MATE1/2)的表达，以及鸟氨酸脱羧酶(ODC)、精氨酸脱羧酶(ADC)、亚精胺合酶(SPDS)、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)和S-腺苷甲硫氨酸合酶(SAMS)基因的表达水平。

实施例8：含有低烟碱的烟草品种育种

在所鉴定的Nic1b区，其内的基因和与其相关的分子标记的辅助下，培育和产生包含nic1b_erf突变(例如，Nic1b区的完全或部分缺失)，具有商业上可接受的叶质量的低生物碱烟草杂交种、品种和品系。NCG基因和标记也用于筛选来自各种烟草种质(例如不同烟草物种或普通烟草品系)的其他nic1b_erf等位基因。美国专利号No.7,700834的表8中提供了可筛选的43种烟草物种、49种黄花烟草(Nicotiana rustica)品系和约600种普通烟草(Nicotiana tabacum)品系的集合。

鉴定为具有新nic1b_erf等位基因的种质被用作培育烟草的原料。可用与标准育种方法(诸如回交或谱系方法)组合的种间或种内杂交方法将所需的nic1b_erf或nic2突变体等位基因从供体来源转移至栽培烟草。例如，将包含nic1、nic2或两者的突变等位基因的低烟碱品种(例如，供体亲本，诸如LA Burley 21)与具有所需遗传背景和农艺学优良性状的优良高烟碱品种杂交。任选测定来自该杂交的F₁后代植物的一种或多种表3中举例的分子标记。然后，将F₁后代植物与亲本优良高烟碱品种(轮回亲本)回交。用本文描述和公开的分子标记对BC1代的植物进行基因分型以选择具有较小nic1b_erf或nic2缺失区段的烟草植物。在多轮回交(例如，5-7代)后，获得新的优良烟草品种，其包含来自轮回亲本优良品系的低生物碱性状和其他所需的性状。由于Nic1b和Nic2基因座周围的遗传重组事件，这种新的优良烟草品种也没有任何与低生物碱性状相关的遗传阻力。这些重组事件将nic1b_erf和nic2突变与任何相关的有害突变解除连锁，从而减少或避免遗传阻力。使用上述育种和标记辅助选择策略，也可实现低烟碱性状与降低生物碱或TSNA水平的其他转基因或天然等位基因的聚合或叠加。

低生物碱烟草杂交种、品种或品系可制成白肋型、深色型、烤制熟化烟草型、马里兰型或东方型烟草，或可基本上衍生自BU 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CU263、DF911、Galpao tobacco、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、K149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14 x L8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、NC 100、NC 102、NC2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、`Perique`tobacco、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、VA 309、or VA359、Maryland 609、HB3307PLC、HB4488PLC、KT206LC、KT209LC、KT210LC、KT212LC、R610LC、PVH2310、NC196、KTD14LC、KTD6LC、KTD8LC、PD7302LC、PD7305LC、PD7309LC、PD7318LC、PD7319LC、PD7312LC、ShireyLC或根据本领域已知的标准烟草育种技术的任何商业烟草品种。

实施例9：来自Nic1b区的其他基因

从Nic1b区鉴定了几种基因，包括非编码RNA。其列于表5中。除ERF16外，与LA BU21和低生物碱F5同胞植物相比，所有这些基因在TN90和高生物碱F5同胞植物中显示出更高的表达水平。ERF16表现出在高生物碱和低生物碱植物中以相对相似的水平表达。如实施例4-7所述进一步研究这些其他的基因。例如，采用过表达和抑制的方法来研究这些基因的功能并开发具有所需烟碱水平的烟草品种。产生两组转基因植物，一组采用全长编码序列的过表达途径，另一组采用人工microRNA或RNAi序列的抑制途径。此外，还采用突变途径(随机诱变或靶向编辑)来产生这些基因的突变等位基因。

在表13和图3中提供了在Nic1b区或周围的过表达选择的基因或序列区段的结果。35S启动子用于驱动过表达。在同一天盆栽LA BU21中的各个T₀转化体，包括对照构建体和ERF130的过表达构建体，LA_associated_region在LA BU21中缺失(即，SEQ ID No.1，称为“Nic1bΔ”，其不含注释基因，参见实施例2)，g32081(β-葡萄糖苷酶18样基因)和ERF16。盆栽后12周对植株打顶。通过测量收集自植物顶部的第3、4、5和6号叶的合并叶层片样品，并在打顶后2周测定生物碱水平。对每种构建体测试4或5个独立的T₀植物，测定其总生物碱或单独的生物碱的平均水平。如图3所示，这组生物碱数据表明ERF16的过表达促进烟碱产生(相对于对照增加76％)。其他少量生物碱(包括去甲烟碱、假木贼碱和新烟草碱)在ERF16过表达植物中也表现出增加，这都有助于总生物碱相对于对照增加76％。过表达ERF130、Nic1bΔ序列或g32081没有观察到烟碱或生物碱水平的明显变化。

实施例10：来自染色体7的多个转录因子在正常生物碱和低生物碱烟草品系之间的差异化表达

表6中所示，从染色体7鉴定了几种其他的转录因子以显示BU21和LA BU21之间的差异表达水平。如实施例4-7所述进一步研究这些其他的基因。例如，采用过表达和抑制途径来研究这些基因的功能并开发具有所需烟碱水平的烟草品种。产生两组转基因植物，一组是使用全长编码序列的过表达途径，另一组是使用人工microRNA或RNAi序列的抑制途径。此外，还采用突变途径(随机诱变或靶向编辑)来产生这些基因的突变等位基因。

实施例11：来自Nic1b区的各种ERF基因参与烟碱生物合成。

如实施例4中所述，使用MIR6147主链设计人工microRNA(“amiRNA”)构建体以抑制来自或接近Nic1b区的各种ERF基因(统称为“Nic1b_ERF”)。一些人工microRNA被设计成特异性地抑制单独的Nic1b_ERF。其他microRNA被设计为同时靶向多个Nic1b_ERF。表2中提供了一些示例性的成熟人工microRNA序列。

用Nic1b_ERF特异性amiRNA构建体转化的T₀植物在其相应的具有amiRNA-GUS构建体的对照植物同一天盆栽。从植物收集用于基因表达研究的根组织，同时将其重新植入更大的盆中。通过测量收集自植物顶部的3、4、5和6号叶的合并叶层片样品，并在打顶后2周测定生物碱水平。简言之，使用液/液萃取将约0.5g烟草萃取到含有内标物的有机溶剂中，并通过具有火焰离子化检测(FID)的气相色谱(GC)进行分析。结果可按原样或干重计的重量百分比(Wt％)报告。报告基于干重的数据需要烘箱挥发物(OV)测定。除非另有说明，本文所示的总生物碱或单独生物碱水平或烟碱水平是基于干重(例如，总生物碱百分比或烟碱百分比)的。在QuantStudio 5或QS12K(Thermo Fisher Scientific)上以肌动蛋白作为对照使用多重qPCR方法进行初步基因表达筛选。还在定制开放阵列(OpenArray)上筛选植物的选择子集，所述阵列具有一式三份的18个基因，包括QuantStudio QS12K仪器上的肌动蛋白对照基因。

表7总结了通过人工microRNA抑制所选的单独的Nic1b_ERF的一组独立的T₀转化体的生物碱数据。在某些例外情况下(例如，18GH2083)，通过人工microRNA抑制单独的Nic1b_ERF减少了HI BU21背景中的烟碱(即，nic2单突变体)，但在野生型背景中未减少烟碱(例如，t-NL Madole(PhPh)SRC)(表7-9)。这可能表明Nic1b_ERF之间存在冗余，且还表明nic2单突变体提供了更敏化的背景用于评估每个单独的Nic1b_ERF在烟碱调节中的作用。在HI BU21植物中，抑制单独的Nic1b_ERF将烟碱水平降低至对照植物的约50％-90％(表7和图4)。观察到的amiRNA植物中烟碱的减少与多个烟碱生物合成基因的基因表达减少一致(表10)。

产生T₁植物并进一步分析卡那霉素抗性分离比，生物碱水平和烟碱生物合成基因表达。使多个amiRNA杂交到单个植物中以同时抑制多个Nic1b_ERF。

实施例12：通过操作与Nic1b和/或Nic2基因座相关的ERF基因来调节烟碱水平。

为在烟草中获得所需的烟碱水平，通过过表达或下调以及通过转基因或诱变方法操作两组ERF基因。每组ERF聚集在Nic1b或Nic2区周围。第一组ERF包括ERF101、ERF110、ERFnew、ERF199、ERF19、ERF130、ERF16、ERF29、ERF210和ERF91L2，其在此聚集于Nic1b区周围(单独的Nic1b_ERF和全体Nic1b_ERF)。参见表11和Kajikawa et al.,,Plantphysiol.2017,174:999-1011。该第一ERF组的核心成员包括ERFnew、ERF199、ERF19、ERF29、ERF210和ERF91L2。该第一组还可包括JRE5L2。第二组ERF包括ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、ERF17和ERF168(单独的Nic2_ERF和全体Nic2_ERF)，其似乎在HI BU21中缺失(即，nic2单突变体)。参见Shoji et al.,Plant Cell,(10):3390-409(2010)。第2组核心成员包括ERF189和ERF115。第二组也可扩展到更大的组，包括ERF163、ERF91L1、ERF104ΔC、ERF221、ERF115、ERF168、ERF17、ERF179、ERF17L1、ERF189、ERF17L2ΔC、JRE5L1、ERF104L1ΔC和ERF168L1ΔC。参见表12和Kajikawa et al.,,Plant physiol.2017,174:999-1011。

转基因途径包括基于RNA干扰的基因抑制(例如，基于反义、共抑制、发夹或反向重复的RNAi，人工microRNA，人工反式作用小干扰(ta-si)RNA)和显性负抑制子(例如，ERF相关两亲性抑制(EAR)基序)。基于转基因或基于顺基因的抑制可特异性地针对单个ERF基因，或同时针对ERF基因的子集。显性负抑制子可通过例如用内源性ERF编码序列在框内敲入EAR基序编码序列而顺式产生。

诱变途径包括化学(例如，基于EMS的TILLING)或物理(例如，辐射)的随机诱变和基因组编辑。可使用本文所述的任何基因组编辑技术，包括例如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶和CRISPR(Cas9系统、Cpf1系统或Csm1系统)。

转基因或诱变途径用于产生第一和第二组ERF的突变等位基因，关注核心成员。产生功能丧失(即无效)等位基因和弱突变等位基因。产生Nic2_ERF突变体等位基因的各种组合以抑制Nic2_ERF的水平或活性且潜在地产生类似于HI BU21或LA FC53中发现的nic2突变体等位基因的水平或活性。产生Nic1b_ERF突变体等位基因的各种组合以抑制Nic1b_ERF的水平或活性且潜在地产生类似于在LI BU21或LA FC53中发现的nic1突变体等位基因的水平或活性。将不同Nic2_ERF和Nic1b_ERF基因中的突变等位基因进一步组合产生或渗入到单一烟草植物中，以产生低生物碱烟草品系，其烟碱和总生物碱水平与LA BU21、LA FC53或LN KY171中发现的那些相似。

实施例13：通过经由毛状根中的过表达或显性EAR抑制子融合操作Nic1b_ERF基因来调节烟碱水平

如实施例12所述，各种Nic1b_ERF序列与显性EAR抑制子结构域融合并在烟草毛状根中过表达。毛状根不用茉莉酮酸甲酯诱导。测试单个根的转基因表达水平，将其分成组(+、++、+++)。用显示相似表达的根接种至少一种液体培养物/构建体(5根/培养物)。测定下游基因表达(PMT、QPT和亚精胺合酶(对照基因)的定量RT-PCR)和生物碱水平。结果总结在表14中。

ERF199-EAR显性抑制子的表达(过量表达水平：++/+++)导致PMT和QPT基因的表达降低(图5A)，以及烟碱和去甲烟碱(而非假木贼碱和新烟草碱)的表达降低(图5B)。测试ERF199-EAR的三个生物复制以及载体对照(vc，三个生物复制一个池)。这些显性抑制数据提示ERF199诱导PMT表达，从而诱导烟碱和去甲烟碱产生。此外，ERF199未表现出强烈影响QPT表达，并因此在ERF199-EAR抑制子品系中假木贼碱和新烟草碱的产生仅有轻微变化。

ERF29-EAR显性抑制子的表达(过表达水平：(+)/+)导致PMT和QPT基因的表达降低(图6A)，以及烟碱、去甲烟碱和新烟草碱(但非假木贼碱)的表达降低(图6B)。测试ERF29-EAR的三个生物复制以及载体对照样品(vc，两个生物复制一个池)。这些显性抑制数据表明ERF29诱导PMT表达，从而诱导烟碱和去甲烟碱产生。此外，ERF29也表现影响QPT表达并因此影响新烟草碱产量。

ERF210-EAR显性抑制子的表达(过表达水平：+++)导致PMT和QPT基因的表达适度降低(图7A)，以及烟碱、去甲烟碱和新烟草碱(而非假木贼碱)的轻微降低(图7B)，其结果与图4中基于人工microRNA的抑制数据一致。测试ERF210-EAR的一个生物复制以及载体对照样品(vc，一个生物复制一个池)。这些显性抑制数据表明ERF210轻微影响PMT和QPT表达，并因此对烟碱和去甲烟碱产生具有轻微影响。

ERF16-EAR显性抑制子的表达(过表达水平：(+)/+)导致PMT表达降低(图8A)，以及烟碱、去甲烟碱和新烟草碱(而非假木贼碱)的减少(图8B)。测试ERF16-EAR的两个生物复制以及载体对照(vc，一个生物复制一个池)。这些显性抑制数据表明ERF16诱导PMT表达，从而诱导烟碱和去甲烟碱产生，该观察结果与图3所示的转基因数据一致。此外，ERF16似乎不会强烈影响QPT表达，并因此在ERF16-EAR抑制子品系中假木贼碱的产量未改变。

ERF130-EAR显性抑制子的表达(过表达水平：++)导致PMT表达降低(图9A)，以及烟碱、去甲烟碱和新烟草碱(而非假木贼碱)的减少(图9B)。测试ERF130-EAR的三个生物复制以及载体对照(vc，两个生物复制一个池)。这些显性抑制数据表明ERF130诱导PMT表达，从而诱导烟碱和去甲烟碱产生。此外，ERF130似乎仅轻微影响QPT表达，因此在ERF130-EAR抑制子品系中新烟草碱的产生也轻微改变。

测试ERF91过表达和ERF91-EAR显性抑制子的表达。ERF91过表达导致PMT和QPT的表达增强，因此烟碱、去甲烟碱和新烟草碱水平增加(图10A和10B，示为“ERF91 I”)。ERF91-EAR显性抑制子的表达(过表达水平：++)未表现出使得PMT表达降低(图10A，示为“ERF91II”)，且因此缺乏烟碱、去甲烟碱和新烟草碱的显著降低(图10B，示为“ERF91 II”)。

也分别测试了ERF101和ERFnew的过表达。ERF101过表达导致PMT和QPT的表达增强，因此烟碱和新烟草碱水平增加(图11A和11B)。ERFnew过表达还使得PMT和QPT的表达增强，因此烟碱、去甲烟碱和新烟草碱水平增加(图12A和12B，ERFnew标记为ERF17delN)，该观察结果支持ERFnew在烟碱产量中的作用，且与图4中观察到的基于人工microRNA的抑制数据一致。

实施例14：EMS产生的NIC1b-ERF突变植物的产生和评估

筛选此前创建的TN90白肋烟背景中的EMS烟草种子群体的Nic1b区内的基因突变。使用标准技术创建EMS群体。通过使用Sanger测序鉴定候选植物，以通过分析来自每个样品8株植物的合并DNA鉴定M₂代中目标基因中的点突变。示例性突变总结于表22中。

使用上述方法分析候选植物中M₂代的植物形态和生物碱水平。通过从打顶后两周的植物的叶子取样并测量烟碱、去甲烟碱、假木贼碱和新烟草碱的量(以干重的百分比)，来分析候选植物中的生物碱水平。代表2018和2019生长季节的测量值(分别在2019和2020采样)在图13-20中示出。NCG1和ERF16中示例性突变的取样统计显示在表23中，表明与同时生长的野生型TN90相比生物碱水平的统计学显著降低。NCG15中两个示例性突变的取样统计显示在表24中，表明与同时生长的野生型TN90相比，MS13657系的突变产生生物碱水平的显著降低。选择表现出所需生物碱水平和野生型形态的候选植物的种子用于进一步育种。

表5：来自染色体7上Nic1b区或其周围的其他基因。起始和终止基因组位置基于参考TN90基因组提供。提供了每个基因的基因组编码DNA序列(如果适用，包括内含子)、cDNA序列和蛋白质或其他编码RNA序列的序列标识号(SEQ ID No.)。

表6：来自染色体7的转录因子，其在正常生物碱和减少生物碱的烟草品系之间表现出差异化表达。起始和终止基因组位置基于参考TN90基因组提供。提供了每个基因的基因组编码DNA序列(如果适用，包括内含子)、cDNA序列和蛋白质或其他编码RNA序列的序列标识号(SEQ ID No.)。

表7：一组T₀转化体证明通过人工microRNA抑制单独的Nic1b_ERF减少HI BU21背景中的烟碱(即，t-HI Burley 21，nic2单突变体)。MIR6147主链用于人工microRNA(“aMIR6147”)。列“转化％”表示从烟碱到去甲烟碱的转化百分比。来自多个T₀ CUS对照转化体的平均烟碱水平用于确定每个单独的Nic1b_ERF amiRNA T₀转化体中的相对烟碱水平。在初始盆栽后16周将植物打顶，2周后采集叶样品用于生物碱分析。

表8：用靶向HI BU21背景(即，t-HI Burley 21，nic2单突变体)中的单独的Nic1b_ERF的人工microRNA转化的第二组T₀植物。在初始盆栽后15周，将该组T₀植物打顶，2周后收集叶样品用于生物碱分析。与表7中的植物相比，这些植物早1周打顶，这可能导致对照植物缺乏同一性(烟碱水平范围1.52％-2.78％)，且因此amiRNA植物未能显示一致的烟碱减少。使用与表7中相同的amiRNA构建体组。列“转化％”表示从烟碱到去甲烟碱的转化百分比。来自多个T₀ CUS对照转化体的平均烟碱水平用于确定每个单独的Nic1b_ERF amiRNA T₀转化体中的相对烟碱水平。

表9：用靶向t-NL Madole(PhPh)SRC背景中的单独的Nic1b_ERF的人工microRNA转化的一组T0植物(即，具有黑胫病抗性和减少去甲烟碱的三个烟碱脱甲基酶基因突变的Narrow Leaf Madole)。在最初的盆栽后18周将该组T₀植物打顶，2周后收集叶样品用于生物碱分析。与表7中的植物相比，这些植物在两周后打顶。在该组植物中未观察到一致的烟碱减少，这表明与野生型背景(例如，t-NL Madole(PhPh)SRC)相比，nic2单突变体提供了更敏化的背景用于评估每个单独的Nic1b_ERF在烟碱调节中的作用。使用与表7中相同的amiRNA构建体组。列“转化％”表示从烟碱到去甲烟碱的转化百分比。多个T₀ CUS对照转化体的平均烟碱水平用于确定每个单独的Nic1b_ERF amiRNA T₀转化体中的相对烟碱水平。

表10：选择的Nic1b_ERF人工microRNA T₀转化体中的基因表达。“表达％”是指相对于基于多个对照T₀转化体的平均表达水平的表达水平百分比。烟碱减少与预期的Nic1b_ERF靶标的抑制和多个烟碱生物合成基因(PMT1a、BBLa、A622、ODC、MATE2、QPT2_2)的表达降低相关。所有转化体都在t-HI Burley 21背景中。ND表示未确定。

表11：在Nic1b区处或周围选择ERF基因。每个ERF基因在染色体7上的基因组坐标显示为起始和终止。ERF命名法基于Rushton等，TOBFAC：烟草转录因子的数据库，BMCBioinformatics 2008,9:53。从TobFac数据集获得每个Nic1b_ERF的DNA序列，并用于探查烟草基因组数据库以鉴定注释基因模型、转录物和染色体坐标。提供了每个基因的基因组编码DNA序列(如适用，包括内含子)、cDNA序列和多肽序列的序列标识号(SEQ ID No.)。

表12：在Nic2区处或周围选择ERF基因。每个ERF基因在染色体19上的基因组坐标显示为起始和终止。ERF命名法基于Rushton et al.,TOBFAC:the database of tobaccotranscription factors,BMC Bioinformatics2008,9:53；Shoji et al.,Plant Cell,(10):3390-409(2010)；and Kajikawa et al.,,Plant physiol.2017,174:999-1011。从TobFac数据集或从NCBI数据库获得每个Nic2_ERF的DNA序列，并用于探查烟草基因组数据库以鉴定注释基因模型、转录物和染色体坐标。提供了每个基因的基因组编码DNA序列(如果适用，包括内含子)、cDNA序列和多肽序列的序列标识号(SEQ ID No.)。

表13：在LA BU21(即，SEQ ID No.1，称为“Nic1bΔ”，其不含注释基因，参见实施例2)或g32081(β-葡萄糖苷酶18样基因)中缺失的LA_associated_region，ERF 16而非ERF130的过表达使得LA BU21中烟碱和总生物碱的增加。对照构建体示为ag-45EV。

表14：各种Nic1b_ERF基因(具有或不具有显性EAR抑制子结构域)的毛状根表达及其对下游基因表达(PMT和QPT)和生物碱水平的影响的总结。

靶标

PMT表达

QPT表达

烟碱

去甲烟碱

假木贼碱

新烟草碱

ERF199-EAR

降低

未受影响

降低

未受影响

ERF29-EAR

降低

未受影响

降低

ERF210-EAR

略降低

未受影响

略降低

ERF16-EAR

降低

未受影响

降低

未受影响

略降低

ERF130-EAR

略降低

未受影响

降低

未受影响

降低

ERF91L2

增加

ERF101

增加

未受影响

增加

ERFnew

增加

未受影响

增加

表15.烤制熟化烟草品种

表16.白肋烟品种

表17.马里兰烟品种

Maryland 10(TC 498)
	Maryland 14D2(TC 499)
Maryland 201(TC 503)
	Maryland 21(TC 500)
Maryland 341(TC 504)
	Maryland 40
Maryland 402
	Maryland 59(TC 501)
Maryland 601
	Maryland 609(TC 505)
Maryland 64(TC 502)
	Maryland 872(TC 506)
Maryland Mammoth(TC 507)

表18.深色烤制熟化烟草品种

表19.东方烟品种。

Bafra(TI 1641)	Edirne(TI 1671)	Samsun(TC 536)
			Bahce(TI 1730)	Ege(TI 1642)	Samsun 959(TI 1570)
Bahia(TI 1416)	Ege-64(TI 1672)	Samsun Evkaf(TI 1723)
			Bahia(TI 1455)	Izmir(Akhisar)(TI 1729)	Samsun Holmes NN(TC 540)
Baiano(TI 128)	Izmir(Gavurkoy)(TI 1727)	Samsun Maden(TI 1647)
			Basma	Izmir Ege 64	Samsun NO 15(TC 541)
Basma(TI 1666)	Izmir-Incekara(TI 1674)	Samsun-BLK SHK Tol(TC 542)
			Basma Drama	Izmir-Ozbas(TI 1675)	Samsun-Canik(TI 1678)
Basma Hybrid(PhPh)	Jaka Dzebel(TI 1326)	Samsun-Maden(TI 1679)
			Basma Zihna I	Kaba-Kulak	Saribaptar 407-Izmir Region
Bitlis(TI 1667)	Kagoshima Maruba(TI 158)	Smyrna(TC 543)
			Bitlis(TI 1725)	Katerini	Smyrna No.23(TC 545)
Bubalovac(TI 1282)	Katerini S53	Smyrna No.9(TC 544)
			Bursa(TI 1650)	Krumovgrad 58	Smyrna-Blk Shk Tol(TC 546)
Bursa(TI 1668)	MS Basma	Trabzon(TI 1649)
			Canik(TI 1644)	MS Katerini S53	Trabzon(TI 1682)
Djebel 174(TI 1492)	Nevrokop 1146	Trapezund 161(TI 1407)
			Djebel 359(TI 1493)	Ozbas(TI 1645)	Turkish(TC 548)
Djebel 81	Perustitza(TI 980)	Turkish Angshit(TI 90)
			Dubec 566(TI 1409)	Prilep(TI 1291)	Turkish Samsum(TI 92)
Dubec 7(TI 1410)	Prilep(TI 1325)	Turkish Tropizoid(TI 93)
			Dubek 566(TI 1567)	Prilep 12-2/1	Turkish Varotic(TI 89)
Duzce(TI 1670)	Prilep 23	Xanthi(TI 1662)

表20.雪茄烟品种

表21.其他烟草品种

Chocoa(TI 319)
	Hoja Parada(TI 1089)
Hoja Parado(Galpoa)(TI 1068)
	Perique(St.James Parrish)
Perique(TC 556)
	Perique(TI 1374)
Sylvestris(TI 984)
	TI 179

表22：在NIC1b-ERF基因中鉴定的EMS产生的突变

表23：NIC1b-ERF基因NCG1和ERF16中选择的突变的生物碱取样统计

表24：NIC1b-ERF基因NCG17中两个选择的突变的生物碱取样统计

Claims

1.经修饰的烟草植物或其部分，其在与选自下组的多核苷酸序列具有至少90％同一性的多核苷酸中包含非天然突变：SEQ ID NO:3、13、14、17-19、38、48、49、52-54、153、154、158、159、202、203、204和205。

2.权利要求1所述的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述多核苷酸与选自下组的多核苷酸序列具有至少95％同一性：SEQ ID NO:3、13、14、17-19、38、48、49、52-54、153、154、158、159、202、203、204和205。

3.权利要求1所述的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述多核苷酸与选自下组的多核苷酸序列具有100％同一性：SEQ ID NO:3、13、14、17-19、38、48、49、52-54、153、154、158、159、202、203、204和205。

4.权利要求1所述的经修饰的烟草植物或其部分，其中与缺乏所述突变的对照烟草植物相比，所述至少一种经修饰的烟草植物包含减少量的至少一种生物碱。

5.权利要求4所述的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述至少一种生物碱选自下组：假木贼碱、新烟草碱、烟碱和去甲烟碱。

6.经修饰的烟草植物或其部分，其在具有核酸序列的多核苷酸中包含非天然突变，所述核酸序列编码与选自下组的氨基酸序列具有至少90％同一性或相似性的多肽：SEQ IDNO:73、83、84、87-89、180、181、206和207。

7.权利要求6所述的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述多核苷酸具有编码与选自下组的氨基酸序列具有至少95％同一性或相似性的多肽的核酸序列：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207。

8.权利要求6所述的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述多核苷酸具有编码与选自下组的氨基酸序列具有100％同一性或相似性的多肽的核酸序列：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207。

9.权利要求6所述的经修饰的烟草植物或其部分，其中相对于不具有所述基因修饰或突变或重组核酸构建体的对照植物，与缺乏所述突变的对照烟草植物相比，所述经修饰的烟草植物包含降低水平的至少一种生物碱。

10.权利要求6所述的经修饰的烟草植物或其部分，其中所述较高USDA等级指数值比所述对照植物的所述可比叶高至少5％。

11.权利要求9所述的烟草植物或其部分，其中所述至少一种生物碱选自下组：假木贼碱、新烟草碱、烟碱和去甲烟碱。

12.熟化烟草材料，其来自权利要求6所述的烟草植物。

13.烟草制品，其包含权利要求12所述的熟化烟草材料。

14.权利要求13所述的烟草制品，其中所述烟草制品选自下组：香烟、小雪茄烟、非通风凹槽过滤嘴香烟、通风凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟、雪茄烟、卷烟、嚼烟、叶烟、烟碎和烟丝、再造烟草、散叶嚼烟、塞嚼烟、湿鼻烟、鼻烟和干鼻烟或无烟烟草制品。

15.产生经修饰的烟草植物的方法，其包含：

(a)在至少一种烟草细胞中，在编码包含与选自下组的氨基酸序列至少90％相同或相似的氨基酸序列的多肽的内源核酸序列中诱导非天然突变：SEQ ID NO:73、83、84、87-89、180、181、206和207；

16.权利要求15所述的方法，其中与缺乏所述突变的对照烟草植物相比，所述至少一种经修饰的烟草植物包含减少量的至少一种生物碱。

17.权利要求15所述的方法，其中所述内源核酸序列与选自下组的序列至少90％相同：SEQ ID NO:3、13、14、17-19、38、48、49、52-54、153、154、158、159、202、203、204和205。

18.权利要求15所述的方法，其中所述至少一种生物碱选自下组：假木贼碱、新烟草碱、烟碱和去甲烟碱。

19.权利要求15所述的方法，其中所述方法还包括：

(d)使步骤(c)中再生的所述经修饰的烟草植物生长。

20.权利要求19所述的方法，其中所述方法还包括：

(f)从步骤(e)中的所述杂交获得至少一种种子。