CN116179560A

CN116179560A - 一种输卵管特异性表达艾塞那肽的转基因鸡的制备方法

Info

Publication number: CN116179560A
Application number: CN202211108050.2A
Authority: CN
Inventors: 张自富; 胡静; 麻冰洁; 赵瑜; 秦清明; 赵聘; 赵云焕
Original assignee: Xinyang Agriculture and Forestry University
Current assignee: Xinyang Agriculture and Forestry University
Priority date: 2022-09-09
Filing date: 2022-09-13
Publication date: 2023-05-30

Abstract

本发明属于转基因鸡的制备技术领域，公开一种输卵管特异性表达艾塞那肽的转基因鸡的制备方法。（1）、构建表达载体质粒pCSII‑ERE‑OV‑EXE；（2）、将包装质粒pCAG‑HIVgp、包膜蛋白质粒pCMV‑VSV‑G‑RSV‑Rev和表达载体质粒pCSII‑ERE‑OV‑EXE按质量比1∶1∶2的比例转染293T细胞，培养、过滤，获得慢病毒溶液；（3）、新鲜鸡种蛋取回消毒后，孵化；（4）、将发育至第14‑15期的种蛋取出，表面消毒，上下轻轻晃动使胚胎脱离内层壳膜；在种蛋赤道附近打出一个直径4 mm的小孔，剔除蛋壳膜，用显微注射仪将1µL滴度为1×10⁹TU/mL的慢病毒溶液注射到鸡胚卵黄外周静脉血管中，封堵注射口，封闭蛋壳开口，标记后继续孵化至出雏。本发明方法与经典的生产转基因家禽方法相比，节约了大量的人力、物力、财力，效率提高了上百倍。

Description

一种输卵管特异性表达艾塞那肽的转基因鸡的制备方法

技术领域

本发明属于转基因鸡的制备技术领域，具体涉及一种输卵管特异性表达艾塞那肽的转基因鸡的制备方法。

背景技术

近些年来制备转基因动物作为生物反应器生产药物蛋白已经取得了许多可喜的突破性进展，开创出了诱人、广阔的应用前景。从发展趋势来看，在不久的将来必定会成为生物工程技术研究领域最活跃、最具有实践应用价值的内容之一。最初，哺乳动物的乳腺反应器被认为是一个最有希望和前途的生物反应器之一，可是家畜世代间隔长、成本高，特别是乳汁中乳蛋白和乳脂肪的生化复杂性给重组蛋白的纯化带来许多意想不到的困难。与哺乳动物相比，禽类具有体格小、成本低、世代周期短、繁殖力高、卵中天然存在蛋白酶抑制剂、良好的无菌环境、好储存、易提纯等优点，特别是卵中表达的重组蛋白形成的三维结构糖基化更接近于人类蛋白质。所以，禽类输卵管生物反应器将逐步成为转基因动物和生物制药研究领域中最具活力的热点，并很可能成为未来最具有竞争力的新兴高技术产业之一。

但是，由于禽类独特的生殖、生理特点和胚胎发育的复杂性，致使在哺乳动物中已经广泛应用的许多转基因技术并不适用于禽类。到目前为止，研究报道较多的是利用逆转录病毒载体法制备出了转基因鸡，尤其是属于逆转录病毒科中的慢病毒，具有容纳外源目的基因片段大、可感染非分裂期细胞、整合到细胞染色体上并能长期稳定表达、不易发生基因沉默、免疫反应弱、安全性高等优点，已逐渐成为转基因研究中应用广泛的载体工具之一，也被公认为制备转基因禽类最有效和最成功的方法之一。近年来，已有利用转基因鸡输卵管生物反应器生产重组蛋白的研究报道，包括β-内酰胺酶、人干扰素α-2b、人单克隆抗体、单链Fv-Fc融合蛋白、两种治疗性蛋白、人溶菌酶、人防御素4、溶酶体酸性脂肪酶（Kanuma）等。但是，以上报道均是将慢病毒注射到发育第Ⅹ期的胚盘下腔，先生产出性系嵌合体，再生产出转基因个体。制备转基因家禽的整个技术流程繁杂，要求条件很高。另外，也有报道通过分离早期鸡胚血液或性腺中的原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）生产转基因鸡，但是PGCs的分离、培养、传代等关键技术还一直未能获得完全突破。

艾塞那肽（Exenatide）是从墨西哥巨蜥蜴毒液中分离出来的一种含有39个氨基酸的多肽序列，分子质量4.186KDa，分子式：C₁₈₄H₂₈₂N₅₀O₆₀S，等电点：pH4.86。与胰高血糖素样肽（Glucagon-Like Peptide1，GLP-1）具有53%的同源性，与GLP-1同作用于G-蛋白偶联受体，并具有更高的亲和力。艾塞那肽是首个获准上市的肠促胰岛素类似物抗糖尿病药物，也是目前为止公认最好的治疗Ⅱ型糖尿病的首选药物。在治疗Ⅱ型糖尿病方面，具有可促进胰岛素分泌，保护β细胞功能，改善外周胰岛素敏感性，减轻体重，保护肝脏功能，半衰期长的优点。2012年美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市，商品名为百泌达（Byetta）。

毫无疑问，如能建立一种新的简便、高效、稳定的可表达外源基因艾塞那肽的转基因鸡将具有广阔的应用前景和经济发展潜力。

发明内容

本发明的目的旨在于提供一种输卵管特异性表达艾塞那肽的转基因鸡的制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种输卵管特异性表达艾塞那肽的转基因鸡的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）、构建表达载体质粒pCSII-ERE-OV-EXE，其结构如下：

；其中，LTR：长末端重复序列；ERE，雌激素应答元件，如SEQ ID No.2 所示；OV Promoter，鸡卵清蛋白基因启动子，如 SEQ ID No.3 所示；EXE，艾塞那肽cDNA序列，如SEQ ID No.1 所示；IRES，内部核糖体进入位点；SinLTR，自我灭活长末端重复序列；

（2）、慢病毒包装

将包装质粒pCAG-HIVgp、包膜蛋白质粒pCMV-VSV-G-RSV-Rev和表达载体质粒pCSII-ERE-OV-EXE按质量比1∶1∶2的比例转染293T细胞，培养、过滤，获得慢病毒溶液；

（3）、新鲜鸡种蛋取回消毒后，孵化；

（4）、将发育至第14-15期的种蛋取出，表面消毒，上下轻轻晃动使胚胎脱离内层壳膜；在种蛋赤道附近打出一个直径4 mm的小孔，仔细剔除蛋壳膜，在显微镜下用显微注射仪将1µL 滴度为1×10⁹TU/mL的慢病毒溶液注射到鸡胚卵黄外周静脉血管中，封堵注射口，封闭蛋壳开口，标记后继续孵化至出雏。

较好地，步骤（2）的具体步骤为：将包装质粒pCAG-HIVgp、包膜蛋白质粒pCMV-VSV-G-RSV-Rev和表达载体质粒pCSII-ERE-OV-EXE按质量比1∶1∶2的比例转染至直径6cm培养皿中汇合率为60-80%的293T细胞，在温度37℃，3%的CO₂培养箱中培养16h，吸除细胞上清液，培养皿中加入7.5 mL含有10 μM Forskolin的DMEM完全培养基，在37℃，10%的CO₂培养箱中孵育48h，收集上清液，4℃保存；收集的上清液用0.45μm滤膜过滤，滤液离心后，弃上清，沉淀中加入500μL HBSS，充分溶解后转移至超滤管中，离心，用HBSS清洗两次后，分装，-70℃保存备用；用时采用DMEM培养基稀释制备成慢病毒溶液，即配即用。

较好地，步骤（3）的具体步骤为：新鲜鸡种蛋取回后，先用0.1%的新洁尔灭溶液清洗，除去表面污迹，然后用70%酒精喷洒消毒，待蛋壳表面晾干后，放进孵化器里进行孵化，孵化温度为37.5℃，相对湿度为55-65%，90度角，2h间隔自动翻蛋。

较好地，步骤（4）中的显微注射仪采用的注射针的制备步骤为：将规格为外径100μm、内径80 μm、长度10cm 的BJ-40细玻管，在拉针仪拉针后用断针仪熔断，外径为20-30μm，然后在磨针仪上30度角斜面，快速磨针；在显微镜下观察针尖的完整性；将合格的玻璃针浸泡在75%乙醇中，用抽吸装置清洗内壁5次，在无水乙醇中清洗5次，置于超净台中晾干，紫外照射过夜，待用。

有益效果：本发明把显微注射法、慢病毒载体法两种转基因技术与早期鸡胚PGCs迁移规律的生殖生理特点结合起来，选择鸡胚发育至14-15期，血液中PGCs向生殖原基迁移高峰期，将高滴度的慢病毒载体注入血管中，随血液循环而感染其中的PGCs，最终获得了可表达外源基因（艾塞那肽）的转基因鸡；与经典的生产转基因家禽方法相比，不仅省去复杂的倒三期培养体系及PGCs的分离、纯化、培养、建系、转染、筛选后再注回同期受体胚胎等一系列繁杂程序操作，而且节约了大量的人力、物力、财力，转基因鸡的制备综合效率（G0代孵化率，G1代阳性率等）整整提高了上百倍；本发明建立的简便、高效、稳定生产转基因鸡的创新技术体系，在卵清蛋白特异性启动子调控作用下，利用鸡输卵管天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在鸡蛋中生产一些具有重要价值的药用蛋白，具有广阔的应用前景和经济发展潜力。

附图说明

图1：卵黄外周血管显微注射演示图。

图2：G0代公鸡精液基因组DNA的PCR检测检测结果：1–11泳道，阳性个体；MW，DNAmarker；PC，阳性对照（pCSII-ERE-OV-EXE质粒）；NC，阴性对照（未注射慢病毒鸡精液基因组DNA）。

图3：G1代5只公鸡血液基因组的PCR及Southern Blot检测：A PCR检测5只G1代阳性公鸡，泳道1-5为G1代中的5只阳性个体，GAPDH基因扩增作为内参，MW为DNA marker，PC为阳性对照，NC为阴性对照；B 5只G1代血液基因组DNA的Southern Blot检测，泳道1-5与A中泳道1-5相对应，泳道1-5个体血液基因组DNA（10-20 ug）经Hind Ⅲ单酶切后用引物做探针杂交；C泳道1-5个体血液基因组DNA经PstI和EcoRI双酶切后杂交结果，PC为阳性对照，NC为阴性对照；所述PC为80 pg的pCSII-ERE-OV-EXE质粒，所述NC为未注射慢病毒鸡血液基因组DNA。

图4：G2代转基因鸡蛋清中艾塞那肽浓度测定。

图5：组织免疫化学检测艾塞那肽在输卵管上皮的表达。

具体实施方式

为使本发明更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面实施例中，pCSII-EF-MCS、pCAG-HIVgp和pCMV-VSV-G-RSV-Rev购自上海吉凯基因生物科技公司；DMEM完全培养基购自Gibco公司；人胚肾293T细胞，UltraRapidLentiviral Titer Kit 试剂盒购自Invitrogen公司；PCR预混液、血液及精液基因组提取试剂盒、RNase A酶购自于天根生物科技有限公司，DIG High Prime DNA Labeling andDetection Starter Kit II购自罗氏公司；PCR引物合成上海英骏生物技术有限公司，限制性内切酶EcoRI、PstI 和Hind III购自NEB公司；免疫染色一抗稀释液，免疫荧光染色二抗稀释液购于碧云天生物技术公司；封闭液购于碧云天生物技术公司，编号P0102。

实施例1

一种输卵管特异性表达艾塞那肽的转基因鸡的制备方法，步骤如下：

（1）、表达载体质粒pCSII-ERE-OV-EXE的构建：

（1.1）、参照GeneBank中墨西哥巨蜥蜴艾塞那肽（Exenatide）基因的cDNA序列，根据鸡体内氨基酸表达情况，进行密码子优化，加上酶切位点后化学合成艾塞那肽基因的cDNA序列（123bp，如SEQ ID No.1 所示），连接入T载体中，进行测序验证；

（1.2）、依据GeneBank中鸡基因组测序公布信息，分别设计引物，两端添加酶切位点，应用高保真酶，在实验对象白来航鸡的基因组中，分别扩增雌激素反应元件(EstrogenResponse Elements，ERE)( 675bp，如SEQ ID No.2 所示)和卵清蛋白基因启动子序列（包括：启动子序列+第一外显子+第一内含子+第二外显子一部分）(2785bp，如SEQ ID No.3 所示)两种片段（参照文献Lillico S, Sherman A, McGrew M, et al. Oviduct-specificexpression of two therapeutic proteins in transgenic hens [J]. Proc Natl AcadSci, 2007, 104(6):1771-1776），将扩增好的片段连接入T载体中，进行测序验证；

（1.3）、将T载体中扩增序列依次酶切，依次加入卵清蛋白基因启动子序列（2785bp）、雌激素反应元件（ERE，675bp)、艾塞那肽基因的cDNA序列（123bp），构建于慢病毒表达载体pCSII-EF-MCS中，得到表达质粒载体pCSII-ERE-OV-EXE载体，进行酶切鉴定后测序进一步验证；表达载体质粒pCSII-ERE-OV-EXE的结构如下：

；

其中，LTR：长末端重复序列；ERE，雌激素应答元件；OV Promoter，鸡卵清蛋白基因启动子；EXE，艾塞那肽cDNA序列；IRES，内部核糖体进入位点；SinLTR，自我灭活长末端重复序列；

（2）、慢病毒包装、滴度测定

将包装质粒pCAG-HIVgp、包膜蛋白质粒pCMV-VSV-G-RSV-Rev和表达载体质粒pCSII-ERE-OV-EXE按质量比1∶1∶2的比例应用磷酸钙法转染至直径6cm培养皿中汇合率约为70%的人胚肾293T细胞；在温度37℃，3%的CO₂培养箱中培养16h，吸除细胞上清液，直径6cm的培养皿中加入7.5mL含有10μM Forskolin的DMEM完全培养基，在37℃，10%的CO₂培养箱中孵育48h，收集上清液4℃保存；收集的上清液用0.45um滤膜过滤，滤液在离心力50000g，温度20℃离心2h，弃上清，沉淀中加入500μL HBSS，充分溶解后转移至0.5 mL的超滤管中，14 000g离心30min，用HBSS清洗两次后，分装-70℃保存备用；用时采用DMEM培养基稀释制备成滴度为1×10⁹TU/mL的慢病毒溶液，即配即用；参照UltraRapid LentiviralTiter Kit 试剂盒说明测定病毒滴度；

（3）、新鲜鸡种蛋消毒、孵化

新鲜白来航鸡种蛋取回后，先用0.1%的新洁尔灭溶液清洗，除去表面污迹，然后用70%酒精喷洒消毒，待蛋壳表面晾干后，放进孵化器里进行孵化，孵化温度为37.5℃，相对湿度为55-65%，90度角，2h间隔自动翻蛋；

（4）、血管显微注射慢病毒

将规格为外径100 μm、内径80 μm、长度10cm 的BJ-40细玻管，在拉针仪拉针后用断针仪熔断，外径为20-30μm，然后在磨针仪上30度角斜面，快速磨针；在显微镜400倍下观察针尖的完整性；将合格的玻璃针浸泡在75%乙醇中，用抽吸装置清洗内壁5次，在无水乙醇中清洗5次，置于超净台中晾干，紫外照射过夜，待用；

将发育至14-15期大约孵化时间约52-55h的鸡胚，取出，用酒精棉擦拭表面消毒，上下轻轻晃动使胚胎脱离内层壳膜；用牙科钻在种蛋赤道附近打出一个直径4mm的小孔，仔细剔除蛋壳膜，在体式显微镜30倍下用显微注射仪将1µL滴度为1×10⁹TU/mL的慢病毒溶液缓慢注射到鸡胚卵黄外周静脉血管中（实验操作演示图见图1），液体石蜡封堵注射口，用parafilm封闭蛋壳开口，标记后继续孵化至出雏。

多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）检测

对发育至性成熟期G0代公鸡精液基因组及G1后代血液基因组分别采用血液及精液基因组提取试剂盒进行提取，进行PCR检测。参照慢病毒载体pCSII-ERE-OV-EXE中EXE序列信息，利用Primer 5.0软件设计引物，进行PCR扩增，上游引物：5'-CATGCACATGAGAGGTGGATATAG-3'，下游引物：5'-GGTGTACATGATCAGCATGCTCTA-3'；扩增长度为465 bp的包含EXE基因片段；PCR扩增体系25µL：基因组DNA 2µL，上游引物（10µmol/L）1.5µL，下游引物（10µmol/L）1.5µL，PCR预混液12.5 µL，ddH₂O 7.5µL；PCR 反应程序：94℃预变性5min，94℃30s，62℃45s，72℃45s；72℃延伸5min，共25个循环。取PCR产物5µL，1%琼脂糖凝胶电泳检测。根据三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因序列设计特异性引物进行PCR扩增，上游引物：TGCCATCACAGCCACAGAAG，下游引物：ACTTTCCCCACAGCCTTAGCAG；PCR扩增体系25µL：基因组DNA 2µL，上游引物（10µmol/L）1.5µL，下游引物（10µmol/L）1.5µL，PCR预混液12.5µL，ddH₂O 7.5µL；PCR 反应程序：94℃预变性5 min，94℃30 s，56℃45 s，72℃30 s；72℃延伸5 min，共25个循环；扩增片段长度为248bp作为参照。

印迹（Southern Blot）分析

对PCR检测阳性G1代个体及野生型个体（未注射慢病毒的白来航鸡），提取两份血液DNA 10-20µg，37℃水浴条件下，一份DNA参照NEB公司说明书EcoRI和PstI双酶切消化过夜，另一份参照NEB公司说明书Hind III酶单切消化过夜，分别用2%琼脂糖凝胶电泳分离后转移到尼龙膜上。根据质粒载体pCSII-ERE-OV-EXE序列，随机引物法标记探针，上游引物：TCTGTCCAAACCTAAAGTTTAC ，下游引物：TCGATAAACAGTCTCACGGCCTCT；PCR扩增体系25µL：基因组DNA 2µL，上游引物（10µmol/L）1.5µL，下游引物（10µmol/L）1.5µL，PCR预混液12.5 µL，ddH₂O 7.5µL；PCR 反应程序：94℃预变性5min，94℃30s，56℃45s，72℃45s；72℃延伸5min，共35个循环；PCR扩增出一段长641bpDNA 片段，作为Southern Blot的探针。地高锌核酸探针标记Southern Blot按罗氏公司DIG High Prime DNA Labeling and DetectionStarter KitⅡ说明进行操作。

组织免疫化学检测

取G2代母鸡输卵管组织在PBS配制的4%多聚甲醛中固定2h，然后用PBS洗涤20min，4℃下30%蔗糖溶液中培养过夜，组织包埋于石蜡中，10μm厚度切片，将切片固定后封闭液中封闭2h；免疫染色一抗以1∶100的比例稀释，并在4℃下孵育过夜；免疫荧光染色二抗以1∶400的比例稀释并在室温下孵育2h。使用激光共聚焦显微镜拍照分析。野生型鸡输卵管组织切片作为阴性对照。所述免疫染色一抗为小鼠艾塞那肽抗体（制备方法参考文献：宋晓宇等. 生物化学杂质. 第6卷第4期1900年8月. 289-293页），所述免疫荧光染色二抗为HRP标记的山羊抗鼠二抗。

艾塞那肽蛋白提取及定量

将来自G2代转基因母鸡和野生型（未注射慢病毒的白来航鸡）各30枚蛋收集蛋清，与6倍体积冰冻的浓度为50 mM醋酸钠缓冲液（pH5.0）在4℃下混合2h，去除大部分的卵粘蛋白；将所得混合物分装后储存在-20℃供进一步分析。使用ELISA试剂盒测定蛋清中人艾塞那肽浓度，每个样品做两个重复，取两个重复均值作为一次测量值，每个样品至少测定三次，然后根据吸光值、稀倍数和标准曲线计算出每个样品的艾塞那肽浓度，再计算浓度均值和标准差。

结果与分析

（1）、G0代公鸡精液、G1代血液DNA的PCR及Southern Blot检测

实验操作72枚白来航鸡种蛋，鸡胚发育至第14-15期（孵化约52-55h），于卵黄外周静脉血管显微注射1μL病毒滴度为1×10⁹TU/mL慢病毒，孵化出雏56只，孵化率77.8%（56/72）。至性成熟阶段，采集到16只公鸡精液提取DNA后进行PCR检测，其中11只公鸡阳性，阳性率68.7%（11/16）(图2)。挑选5只阳性信号强的公鸡单笼饲养，与3-5只野生型白来航母鸡配种，收集种蛋，标记后进行孵化。对G1代进行血液DNA检测，在60只G1代中检测出5只阳性转基因鸡（编号：68，76，209，288，289）（图3A），转基因效率为8.3%（5/60）。为了进一步验证，对G1代5只阳性个体进行了Southern Blot检测，经HindIII单酶切杂交实验结果显示外源基因单拷贝插入，且有不同的插入位点，符合孟德尔遗传（图3B），经PstI和EcoRI双酶切杂交实验结果显示均为转基因鸡后代（图3C）。对G1代转基因鸡扩繁生产G2代。

（2）、G2代转基因鸡卵清蛋白中艾塞那肽的检测

为了进一步检测转入外源基因是否出现基因沉默现象，对转基因鸡后代蛋清中的艾塞那肽的含量进行测定。对G2代阳性母鸡（编号：209，288，289），待发育至性成熟期产蛋后，连续收集30个鸡蛋，根据ELISA试剂盒说明书，对蛋清中的艾塞那肽进行测定，野生型白来航作对照。结果见图4，结果显示：三只G2代转基因母鸡（编号：209，288，289）蛋清中艾塞那肽含量为分别为：39.19±1.32μg/mL，42.78±2.10μg/mL，53.61±2.54μg/mL，平均为45.19μg/mL，野生型白来航鸡未检测出。

（3）、G2代母鸡输卵管上皮免疫组织化学检测

为了进一步验证外源基因（艾塞那肽）在卵清蛋白基因特异性启动子调控下仅在输卵管上皮特异性表达，对G2代转基因母鸡输卵管组织进行了免疫组织化学检测，野生型白来航鸡作为对照。结果见图5，结果显示：在G2代转基因母鸡输卵管上皮组织中有较强的红色抗体信号，对照组无阳性信号，进一步证实本发明不仅成功制备了表达艾塞那肽的转基因鸡，且外源基因(艾塞那肽)仅在输卵管上皮组织表达，具有组织表达特异性。

Claims

1.一种输卵管特异性表达艾塞那肽的转基因鸡的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）、构建表达载体质粒pCSII-ERE-OV-EXE，其结构如下：

；其中，LTR：长末端重复序列；ERE，雌激素应答元件，如SEQ ID No.2 所示；OV Promoter，鸡卵清蛋白基因启动子，如SEQ ID No.3 所示；EXE，艾塞那肽cDNA序列，如SEQ ID No.1 所示；IRES，内部核糖体进入位点； SinLTR，自我灭活长末端重复序列；

（2）、慢病毒包装

（3）、新鲜鸡种蛋取回消毒后，孵化；

2.如权利要求1所述的输卵管特异性表达艾塞那肽的转基因鸡的制备方法，其特征在于，步骤（2）的具体步骤为：

将包装质粒pCAG-HIVgp、包膜蛋白质粒pCMV-VSV-G-RSV-Rev和表达载体质粒pCSII-ERE-OV-EXE按质量比1∶1∶2的比例转染至直径6cm培养皿中汇合率为60-80%的293T细胞，在温度37℃，3%的CO₂培养箱中培养16h，吸除细胞上清液，培养皿中加入7.5 mL含有10 μMForskolin的DMEM完全培养基，在37℃，10%的CO₂培养箱中孵育48h，收集上清液，4℃保存；收集的上清液用0.45μm滤膜过滤，滤液离心后，弃上清，沉淀中加入500μL HBSS，充分溶解后转移至超滤管中，离心，用HBSS清洗两次后，分装，-70℃保存备用；用时采用DMEM培养基稀释制备成慢病毒溶液，即配即用。

3.如权利要求1所述的输卵管特异性表达艾塞那肽的转基因鸡的制备方法，其特征在于，步骤（3）的具体步骤为：新鲜鸡种蛋取回后，先用0.1%的新洁尔灭溶液清洗，除去表面污迹，然后用70%酒精喷洒消毒，待蛋壳表面晾干后，放进孵化器里进行孵化，孵化温度为37.5℃，相对湿度为55-65%，90度角，2h间隔自动翻蛋。

4.如权利要求1所述的输卵管特异性表达艾塞那肽的转基因鸡的制备方法，其特征在于，步骤（4）中的显微注射仪采用的注射针的制备步骤为：将规格为外径100 μm、内径80 μm、长度10cm 的BJ-40细玻管，在拉针仪拉针后用断针仪熔断，外径为20-30μm，然后在磨针仪上30度角斜面，快速磨针；在显微镜下观察针尖的完整性；将合格的玻璃针浸泡在75%乙醇中，用抽吸装置清洗内壁5次，在无水乙醇中清洗5次，置于超净台中晾干，紫外照射过夜，待用。