CN116179511B

CN116179511B - Cpf1蛋白在制备用于核酸检测的试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN116179511B
Application number: CN202310247428.5A
Authority: CN
Inventors: 石军超; 丰媛媛; 马培翔; 唐进; 罗昀昀; 黄行许
Original assignee: Zhejiang Lab
Current assignee: Hangzhou Nuka Intelligent Technology Co ltd
Priority date: 2023-03-10
Filing date: 2023-03-10
Publication date: 2023-12-22
Anticipated expiration: 2043-03-10
Also published as: CN116179511A

Abstract

本发明公开了Cpf1蛋白在制备用于核酸检测的试剂盒中的应用，涉及生物技术领域。利用本发明所述的新核酸酶在检测核酸片段时，可以克服传统的Cas12a的不足，提高PAM的识别范围，加快反应的速度，显著提高检测时的信号强度从而减少检测时间、提高检测效率，且灵敏度高、特异性高、准确性高、检测可视化(可在荧光灯下肉眼直接可视检测)、成本低、无需复杂大型实验设备、操作简便。这些优势使得本发明的检测方法更加适用于基层实验和临床一线的快速检测和鉴定诊断。

Description

Cpf1蛋白在制备用于核酸检测的试剂盒中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及Cpf1蛋白在制备用于核酸检测的试剂盒中的应用。

背景技术

CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)系统最初来源于细菌的RNA引导的适应性免疫系统，用于抵御入侵细菌和古菌的核酸成分，CRISPR是指成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)，是由可以感染原核生物的噬菌体DNA片段衍生来的，它可以检测并摧毁能引起相似感染的其他噬菌体中相似的DNA，因此对原核生物抗噬菌体至关重要，所以该序列是许多原核生物的免疫系统。Cas蛋白是指CRISPR-associated蛋白，它是CRISPR系统中的相关蛋白。CRISPR基因座由一个编码Cas蛋白的操纵子及一个重复间隔序列(repeat spacer)构成，可以利用CRISPR序列中间隔序列(spacer)对应的RNA指引，识别并且切割特定与其序列互补的DNA链，即Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸([1]R，B.，et al.，CRISPR provides acquired resistance againstviruses in prokaryotes.Science(New York，N.Y.)，2007，315(5819)：p.1709-12.[2]LA，M.and S.EJ，CRISPR interference limits horizontal gene transfer instaphylococci by targeting DNA.Science(New York，N.Y.)，2008，322(5909)：p.1843-5.)。其中，CRISPR-Cpf1(Cpf1)属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。Cpf1酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine，T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)(B，Z.，et al.，Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cassystem.Cell，2015，163(3)：p.759-71.术语解释PAM是指前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif)，是Cas12切割所必须，FnCas12a的PAM为TTN序列，LbCas12a的PAM为TTTV(V代指A、C或G)序列。)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟(I，F.，et al.，The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processesprecursor CRISPR RNA.Nature，2016，532(7600)：p.517-21.)，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)(B，Z.，et al.，Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease ofa class 2CRISPR-Cas system.Cell，2015，163(3)：p.759-71.)。当CRISPR/Cpf1蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性(JS,C.，et al.，CRISPR-Cpf1 target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.Science(New York,N.Y.)，2018，360(6387)：p.436-439.)。

Cpf1是具有核酸内切酶活性，核酸内切酶的配体离子通常为镁离子。现有以Cpf1为基础的核酸检测，信号强度仍旧不高，从而导致在实际检测中的检测时间过长，低浓度样品检测效率低等缺陷。

各种新出现的CRISPR-Cas系统为基因调控和基因组工程提供了强大的工具，不仅用于在基因编辑领域，而且在分子诊断方面也有极大的应用潜力。特别是基于Cpf1的旁切活性，可以开发成高特异性检测核酸的诊断工具，甚至可以区分单核苷酸多态性(SNP)。在crRNA介导下，Cpf1蛋白结合靶标dsDNA序列，激活顺式切割活性，而同时在非特异性靶标ssDNA上显示出非特异性的旁切活性。基于Cpf1的旁切活性，特别适合开发用于检测病毒或者基因组突变位点的dsDNA靶标序列检测。虽然基于目前的Cpf1已经可以用于特异性检测，但仍有进一步完善的地方。Cpf1蛋白检测的第一个挑战是Cpf1蛋白质的活性受到前间区序列邻近基序的限制，只能检测部分核酸靶点，如LbCpf1倾向于识别含有TTTV的PAM序列。Cpf1蛋白检测的第二个挑战是反应的速度有限，很难在短时间内快速的达到饱和信号。传统的Cas12核酸酶的活性如提高检测灵敏度，和开发PAM识别范围更广的新型Cas12a蛋白酶。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中Cas12a检测dsDNA靶标序列PAM范围受限，以及检测灵敏度不够高，检测所需时间长等缺陷。提供了一种新型Cas12a核酸酶在制备用于核酸检测的试剂盒中的应用，加入Mn²⁺离子可以激活其旁路切割活性，进而实现检测的目标。该核酸酶的PAM识别范围比传统的核酸酶更大，反应速度更快，做到了更快更灵敏的检测。

具体的技术方案如下：

本发明提供了Cpf1蛋白在制备用于核酸检测的试剂盒中的应用，所述Cpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种核酸检测试剂盒，其包括Cpf1检测体系，所述Cpf1检测体系包括：向导RNA、Cpf1蛋白、核酸探针和含锰离子的溶液；

所述向导RNA为引导Cpf1蛋白特异性结合所述核酸的crRNA；

所述Cpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述含锰离子的溶液可以为硫酸锰、氯化锰或醋酸锰溶液。本发明实施例的示例中优选所述含锰离子的溶液为氯化锰溶液；

和/或，所述核酸探针为单链DNA探针。

优选的，所述核酸探针为单链DNA探针，所述单链DNA探针优选包括荧光标记，更优选为在其两端分别具有荧光基团和荧光淬灭基团，进一步更优选为在5’端具有荧光基团和3’端具有荧光淬灭基团。所述荧光基团可为本领域常规，例如为6-FAM、TET、CY3、CY5或ROX。

所述荧光淬灭基团可为本领域常规，例如为BHQ1、BHQ2或BHQ3。所述单链DNA探针可按本领域常规方法进行制备，其序列例如可以为TTATT。

Cas12a可以在RNA的引导下识别DNA核酸序列，但是传统Cas12a蛋白PAM识别范围有限，如LbCpf1 PAM为TTTV，而我们发现的新型Cas12a蛋白酶，识别PAM范围更广，扩大了识别的范围。此外，我们发现Cas12a蛋白酶在Mn²⁺存在下，切割效率有极大提升，靶标分子能更快被检测到。

优选的，在本发明实施例的示例中，所用的含锰离子的溶液中锰离子的终浓度为10mM。

具体的，所述Cpf1检测体系具体组成成分为：200ng Cpf1蛋白、25pM核酸探针、1μMcrRNA、2μL待测样品，最终体积为20μL。

本发明中，一旦待测样品靶标核酸、crRNA和Cas12a蛋白形成三元复合体时，该复合物会切割体系中其他的单链DNA分子。通过设计crRNA靶向靶标核酸；向检测体系中加入crRNA和Cas12a蛋白；当靶标DNA存在时，Cas12a与crRNA以及靶标DNA形成三元复合体，同时该复合物行使其trans切割的活性并切割带荧光信号标记的单链DNA(两头分别连有发光基团和淬灭基团，被切断后发光基团可以发光)，从而发出荧光。因此，通过检测荧光即可得知待检测体系中是否含有靶标DNA分子，检测原理具体可以见图1。

优选的，所述检测试剂盒还包括反应缓冲液，所述反应缓冲液包括NaCl、Tris-HCl和BSA(bovine serum albumin)；所述反应缓冲液的pH为7.5。

在本发明实施例的示例中，反应缓冲液为100mM NaCl，50mM Tris-HCl，100μg/mLBSA，pH 7.5。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种非诊断目的的核酸的检测方法，利用所述的核酸检测试剂盒中所述的Cpf1检测体系检测所述核酸。

优选的，所述Cpf1检测体系的反应温度为37℃，所述Cpf1检测体系的反应时间为5分钟。

所述检测方法中，利用核酸快速释放试剂释放待测样品中的核酸；

所述核酸通过扩增得到，优选利用RT-RPA扩增待测样品中的核酸。

所述检测方法还包括读取结果的步骤，利用酶标仪或荧光灯下肉眼进行读取。

本发明提供的用于核酸快速检测的核酸检测试剂盒既可利用酶标仪荧光检测也可以利用荧光肉眼检测。本发明中核酸探针(例如ssDNA FQ reporter)，当使用酶标仪荧光检测时，设定检测激发光为485nm-520nm；当使用肉眼直接检测时，选用可产生485nm波长光源的发光器进行检测。

本发明中，通常可以对临床样品进行灭活处理，释放待检样品中核酸。在等温条件下，对病毒RNA进行反转录(RT)获得cDNA，并进行聚合酶扩增(PCR)。扩增产物可与Cas12a-crRNA复合物结合，激活ssDNA的反式切割。与ssDNA偶联的由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter在切割时产生荧光信号。

所述的检测方法，具体步骤包括：

(1)获取待测样品的DNA；

(2)使用检测体系进行检测，检测体系在37℃下反应5分钟；检测体系的具体成分为：200ng Cpf1蛋白、25pM核酸探针、1μM crRNA、10ng待测样品的DNA，最终体积为20μL；反应缓冲液100mM NaCl，50mM Tris-HCl，100μg/mL BSA，10mM MnCl₂，pH 7.5；

(3)使用酶标仪检测步骤(2)中检测体系中的荧光值。

本发明中，所述的核酸探针一般也可称为荧光-淬灭单链DNA(ssDNA)报告系统，其一般含有荧光基团和淬灭基团，在完整状态荧光被淬灭基团淬灭，在反应过程中被切割之后，从而发出荧光。

在本发明实施例的示例中，所述核酸探针为5’端-6-FAM/TTATT/BHQ1-3’端。

作为优选，所述Cpf1蛋白为经过密码子优化的Cpf1蛋白，针对多种不同来源的Cpf1蛋白核酸序列进行原核密码子优化获得序列，构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白。

术语解释：

术语crRNA是指CRISPR RNA，是短的引导Cas12a(Cpf1)到结合到靶标DNA序列的RNA。

术语CRISPR是指成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats)，该序列是许多原核生物的免疫系统。

术语Cas蛋白是指CRISPR-associated蛋白，它是CRISPR系统中的相关蛋白。

术语Cpf1(又称Cas12a)是指crRNA依赖的内切酶，它是CRISPR系统分类中V型(type V)的酶。

术语PAM是指前间区序列邻近基序(protospacer-adjacent motif)，是Cas12a切割所必须，FnCas12a的PAM为TTN序列，LbCas12a的PAM为TTTN序列。

术语RT-RPA(reverse transcription-recombinase polymeraseamplification)为本领域常规含义，通常是指反转录等温扩增，又称逆转录重组酶聚合酶扩增。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的有益效果在于：

利用本发明所述的新核酸酶在检测核酸片段时，可以克服传统的Cpf1的不足，提高PAM的识别范围，加快反应的速度，显著提高检测时的信号强度从而减少检测时间、提高检测效率，且灵敏度高、特异性高、准确性高、检测可视化(可在荧光灯下肉眼直接可视检测)、成本低、无需复杂大型实验设备、操作简便。这些优势使得本发明的检测方法更加适用于基层实验和临床一线的快速检测和鉴定诊断。

附图说明

图1为可编程核酸酶的检测原理图。

图2为核酸酶的表达纯化图。

图3为LbCas12a及Cas12a-68对基因片段(MERS-upE)检测图。

图4为不同离子对Cas12a蛋白旁切活性检测图。

图5为Cas12-68切割含有不同PAM序列的核酸的效率图。

图6为Cas12-68对Kras基因及其突变片段检测图。

图7为Cas12a-68对细胞样品中的核酸片段检测图。

图8为LbCpf1及Cas12a-68 DNA单碱基差异片段检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

本发明中，常规试剂如Tris-Base(即Tris碱，中文名也称为三(羟甲基)氨基甲烷)、牛血清白蛋白(BSA)、NaCl、Tris-HCl(即Tris盐酸盐，中文别名：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、MgSO₄、MnCl₂和甘油等购自国药公司；检测用核酸片段和RNA合成由北京擎科生物科技有限公司完成；荧光基团标记的ssDNA由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

本发明的检测原理具体如图1所示，一旦待测样品靶标核酸、crRNA和Cas12a蛋白形成三元复合体时，该复合物会切割体系中其他的单链DNA分子。具体为：通过设计crRNA靶向靶标核酸；向检测体系中加入crRNA和Cas12a蛋白；当靶标DNA存在时，Cas12a与crRNA以及靶标DNA形成三元复合体，同时该复合物行使其trans切割的活性并切割带荧光信号标记的单链DNA(两头分别连有发光基团和淬灭基团，被切断后发光基团可以发光)，从而发出荧光。因此，通过检测荧光即可得知待检测体系中是否含有靶标DNA分子。

本发明中还将检测的荧光数值进行归一化处理。归一化方法有两种形式，一种是把数变为(0，1)之间的小数，一种是把有量纲表达式变为无量纲表达式。本发明实施例的示例中优选把数变为(0，1)之间的小数的归一化方法。

带荧光信号标记的单链DNA即单链DNA报告基因(ssDNA-FQ)为5’端具有荧光基团和3’端具有荧光淬灭基团。所述荧光基团可以为6-FAM、TET、CY3、CY5或ROX，但不限于此；所述荧光淬灭基团可以为BHQ1、BHQ2或BHQ3，但不限于此。单链DNA为两头分别连有发光基团和淬灭基团，被切断后发光基团可以发光，从而发出荧光。

通过检测反应体系荧光强度判定Cas蛋白识别PAM序列的特异性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：Cas12a蛋白酶检测靶标DNA序列

1.Cas12a蛋白酶的准备

本实施例中的毛螺菌科Cpf1(Lachnospiraceae Cpf1，LbCpf1)，又称LbCas12a(基因序列如SEQ ID NO.4)，以及新型Cas12a蛋白酶基因(基因序列如SEQ ID NO.2)经过密码子优化，使其更适合在大肠杆菌菌株中表达。用加NcoI和BamHI引物对基因进行PCR扩增，pET28a质粒载体同样用NcoI和BamHI进行双酶切，然后PCR产物和质粒酶切产物，用T4连接酶进行切割位点酶连反应。酶连反应产物转化DH5α感受态细胞，挑选单克隆，进行测序鉴定。提取正常插入基因片段的质粒载体，然后转化BL21感受态细胞。LbCpf1和Cas12a-68蛋白在大肠杆菌中表达，收集培养基中的细菌，超声裂解菌体，镍柱亲和层析纯化，使用不同浓度咪唑洗脱目的蛋白，其中Cas12a-68蛋白表达结果如图2所示，在250和500mM咪唑洗脱液中可以看到明显的蛋白条带。实验中所用Cas12a-68和LbCas12a氨基酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3所示。

如图2所示，纯化的蛋白质在SDS-PAGE检测，证明新型核酸酶Cas12a-68可以由大肠杆菌表达，并用镍柱纯化，纯度可以达到85％以上。

2.Cas12a蛋白酶用于MERS病毒片段(MERS-upE)的检测

a.准备核酸

crRNAs由北京擎科生物科技有限公司完成合成，合成的crRNAs序列如表1所示。

表1 crRNA序列

crRNA	序列(5’-3’)
		Mers-cr2+	UaaUUUcUacUaagUgUagaUGACAUAUGGAAAACGAACUAUGU
kRas-crRNA1	UaaUUUcUacUaagUgUagaUagcUUgUggcgUaggcaagagUg
		kRas-crRNA2	UaaUUUcUacUaagUgUagaUcUacgccacaagcUccaacUacc
kRas-crRNA3	UaaUUUcUacUaagUgUagaUgcUUgUggcgUaggcaagagUgc
		kRas-crRNA4	UaaUUUcUacUaagUgUagaUccacAagcUccaacUaccacaag
kRas-crRNA5	UaaUUUcUacUaagUgUagaUgagcUUgUggcgUaggcaagagU
		kRas-crRNA6	UaaUUUcUacUaagUgUagaUccUacgccacAagcUccaacUac
kRas-crRNA7	UaaUUUcUacUaagUgUagaUacgccacAagcUccaacUaccac
		Let7a-crRNA	UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAACUAUACAACCUACUACCUCA

b.CRISPR/Cas12a-Based荧光检测

实验中crRNA由一个与Cas12a相互作用的21nt区域和一个用于目标DNA识别的23nt可编程引导区域(称为间隔)组成，crRNA序列见表1。由苏州金唯智生物科技有限公司合成了一个以FAM和BHQ1标记的单链DNA报告基因(ssDNA-FQ)，序列为5’-FAM-TTATT-BHQ1-3’。

检测体系为20μL，具体成分如下：200ng纯化Cas12a(Cas12a-68或LbCas12a)，25pMssDNA-FQ，1μM crRNA，10ng dsDNA样品(MERS病毒基因片段，序列如SEQ ID NO.16所示)，最终体积为20μL。反应在37℃下孵育反应。

在检测系统中，crRNA与Cas12a结合形成核糖核蛋白复合物，Cas12a-crRNA识别靶标序列后激活Cas12a的核酸酶活性，切割反应体系内双链DNA，同时激活Cas12a的反式切割活性，切割反应体系内ssDNA，ssDNA-FQ就会被裂解。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光值，激发波长为485nm，发射波长为520nm。每0.5分钟记录一次信号，持续0.5小时。

在MERS病毒基因片段(MERS-upE)检测中，LbCas12a蛋白荧光强度比较高，旁切活性高。新型Cas12a蛋白中，Cas12a-68有微弱旁切活性，5分钟时荧光信号结果如图3所示。如图3所示，常规检测体系中，LbCpf1蛋白可以切割ssDNA片段，释放荧光基团，可以用于MERS病毒基因片段的检测，而Cas12a-68蛋白在该体系下无法切割ssDNA片段，检测反应几乎无荧光信号，也就是Casl2a-68在常规检测体系中无法检测MERS基因片段。

3.Mn²⁺离子对Cas12a蛋白酶旁切活性的影响

除常规检测体系外，我们发现Mn²⁺能极大提升蛋白酶的旁切活性。检测体系20μL，具体成分如下：200ng纯化Cas12a(Cas12a-68或LbCas12a)，25pM ssDNA-FQ，1μM crRNA，10ng dsDNA样品(MERS病毒基因片段)，最终体积为20μL。反应在37℃下孵育反应。其中检测体系还加有反应缓冲液，反应缓冲液成分为100mM NaCl，50mM Tris-HCl，100μg/mL BSA(bovine serum albumin)，pH 7.5。在反应缓冲液中分别加入2μL浓度为10mM CaCl₂、CoCl₂、CuCl₂、FeCl₂、NiCl₂、MgCl₂、MnCl₂、ZnCl₂及EDTA，对比不同金属离子对Cas12a蛋白酶旁切活性的影响。

结果如图4所示，实验结果表明，在Mn²⁺条件下，蛋白活性得到了极大提升，Cas12a-68蛋白酶的活性相比于LBCas12a提升更高，5分钟时Cas12a-68的荧光数值相对于LbCas12a提升了55％。

相对于原始反应缓冲液10×NEBuffer r3.1，Cas12a和LbCas12a的荧光信号都有所提升，但Cas12a-68的信号提升更多。该结果说明，在Mn²⁺存在的条件下，Cas12-68能比LbCas12a更快检测到靶标分子，荧光信号也更强。后续实验中，Cas12a-68蛋白酶反应体系都添加了Mn²⁺。

实施例2：PAM对Cas12a-68蛋白酶检测的影响

根据实施例1中的步骤3，合成四个核苷酸的PAM位点，NNNN，每个N都具有A、T、C、G四种可能，共64条核酸，正反向序列信息如下：

MerS_F：ccattagtctctcNNNNgacatatggaaaacgaactatgttaccctttgtccaag，

MerS_R：cttggacaaagggtaacatagttcgttttccatatgtcNNNNgagagactaatgg，

正反向单链序列分别合成，合成时溶解至100μM，然后取10μL正向引物和PAM对应的10μL反向引物，将20μL短链DNA于95℃恒温2分钟，随后自然降温至室温，单链DNA会退火聚合成双链DNA。

反应缓冲液为100mM NaCl，50mM Tris-HCl，100μg/mL BSA(bovine serumalbumin)，pH 7.5，10mM MnCl₂。每个反应中加入200ng纯化Cas12a-68，25pM ssDNA-FQ，1μMcrRNA，10ng dsDNA(即含不同PAM的MERS基因片段)，最终反应体积为20μL。37℃下反应15分钟，然后用荧光检测仪器读取荧光信号数值。进行64个荧光检测反应，分别读取不同PAM下反应的荧光数值，数值经过归一化处理(即将该系列数值变成0-1间的小数)，然后做不同PAM下的荧光强度热图。

实验结果如图5所示，Cas12a-68不仅可以识别传统Cas的TTTV的PAM位点，而且可以识别AGTN、GTTN、GCCN、GGCA和ATCT等多种位点。

实施例3：人基因片段及人源细胞样品中的核酸片段检测

1.核酸制备

核酸的准备：crRNAs及Kras部分基因片段及Kras基因片段由北京擎科生物科技有限公司完成合成，序列如表1和表2所示。

表2

人源细胞的准备：人外周血单个核细胞采购于上海赛笠生物科技有限公司，提取mRNA。然后逆转录成cDNA，由Kras基因上引物，扩展长度为200bp左右的基因片段。Kras基因上引物的序列如表3所示。

表3

引物	序列(5’-3’)
		Mers_R	cacacataatctagtagccgtaagg
Mers_F	CCATGGGCtaccatgctg
		Kras-F	ATGACTGAATATAAACTTGTG
Kras-R	GTCCCTCATTGCACTGTACTC

2.人基因片段检测

在Kras基因组G12C位点，因为没有传统的PAM的识别区域，如没有TTTV序列，传统的Cas12a蛋白酶，无法检测到。而我们新的Cas12a-68蛋白酶，在Mn²⁺存在下有着更高的反应活性，且具有更宽泛的PAM识别区域，可以用于Kras G12C位点的检测。

如图6所示，我们设计7条crRNA序列，序列信息如表1所示。从图6可以看出，crRNA2和crRNA5能在5min内明显区分出野生型和G12C突变的Kras基因片段，而crRNA2和crRNA5对应的PAM分别为TTGC和GTTG，而这两个PAM序列是传统Cas12蛋白酶无法识别的。

如图6所示，LbCas12a因为没有合适的PAM序列，不论是野生型还是G12C突变型，其荧光信号都非常弱，无法检测。使用Cas12a-68蛋白酶，crRNA1、crRNA3、crRNA4、crRNA6、crRNA7无法区别Kras野生型和G12C突变，而crRNA2和crRN5能明显区分野生型和突变型。证明Cas12a-68可以检测传统Cas12a无法检测的位点。

3.人源细胞来源基因片段检测

除体外Kras片段PCR产物检测外，还从人外周血单个核细胞中，提取mRNA，逆转录成cDNA，然后特异性扩展Kras片段，该片段为野生型，无G12C突变。cDNA中的Kras片段产物与体外Kras片段，一起用于检测。

检测结果如图7所示，用Cas12a-68，crRNA2和crRNA5进行实验，能在5min时就很好区别Kras G12C突变及人源细胞来源的野生型Kras片段。

实施例4：Cas12a-68蛋白酶检测的特异性

为了测定这一体系的检测的特异性，我们将序列相近的let7a和let7f的微小RNA，按照实施例1的步骤进行的反应条件进行反应。其双链核苷酸序列见表2，两者只有1个碱基的差异。

反应结果如图8所示，在Mn²⁺存在下，与crRNA(见表1)正常配对的let7a荧光强度很高，而有一个碱基差异的let7f位置荧光信号较弱。而传统的LbCpf1蛋白即使在crRNA与let7a正确配对的情况下，荧光信号也比较低，无法明显区分一个碱基差异的DNA片段。表明Cas12-68蛋白酶可以精准区分1个碱基差异的DNA片段。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.Cpf1蛋白在制备用于核酸检测的试剂盒中的应用，所述Cpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种核酸检测试剂盒，包括Cpf1检测体系，其特征在于，所述Cpf1检测体系包括：向导RNA、Cpf1蛋白、核酸探针和含锰离子的溶液；

所述向导RNA为引导Cpf1蛋白特异性结合核酸的crRNA；

所述Cpf1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求2所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述含锰离子的溶液为氯化锰溶液；

所述核酸探针为单链DNA探针；

所述单链DNA探针包括荧光标记；

所述单链DNA探针在其5’端和3’端分别具有荧光基团和荧光淬灭基团；

或所述单链DNA探针在其5’端具有荧光基团和3’端具有荧光淬灭基团。

4.如权利要求3所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为6-FAM、TET、CY3、CY5或ROX，所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3。

5.如权利要求2所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述Cpf1检测体系具体组成成分为：200 ng Cpf1蛋白、25 pM核酸探针、1 μM crRNA、2 μL待测样品，最终体积为20 μL。

6.如权利要求2所述的核酸检测试剂盒，其特征在于，还包括反应缓冲液，所述反应缓冲液包括NaCl、Tris-HCl和BSA；所述反应缓冲液的pH为7.5。

7.一种非诊断目的的核酸的检测方法，其特征在于，利用如权利要求2-6中任一项所述的核酸检测试剂盒中所述的Cpf1检测体系检测所述核酸。

8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述Cpf1检测体系的反应温度为37℃，所述Cpf1检测体系的反应时间为5分钟。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中，利用核酸快速释放试剂释放待测样品中的核酸；

10.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，具体步骤包括：

（1）获取待测样品的DNA；

（2）使用检测体系进行检测，检测体系在37℃下反应5分钟；检测体系的具体成分为：200 ng Cpf1蛋白、25 pM核酸探针、1 μM crRNA、10 ng待测样品的DNA，最终体积为20 μL；反应缓冲液100 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，100 μg/mL BSA，10 mM MnCl₂，pH 7.5；

（3）使用酶标仪检测步骤（2）中检测体系中的荧光值。