CN116179476B - 一种提高精子活力的增强液及其提升精子活力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高精子活力的增强液及其提升精子活力的方法。一种提高精子活力的增强液，所述提高精子活力的增强液包括兴奋剂、重组人胰岛素和平衡液，其中，所述兴奋剂包括2‑脱氧腺苷、己酮可可碱或咖啡因。所述平衡液选自一种或多种无机盐溶液；所述无机盐选自NaCl、KCl、CaCl2·2H2O、KH2PO4和MgSO4·7H2O。本发明分别选择兴奋剂2‑脱氧腺苷、己酮可可碱、咖啡因用于提高精子活力，通过提高冷冻保存的精子细胞内cAMP水平，在重组人胰岛素的协同作用下，进一步促进细胞物质代谢水平，并有效促进精子正常者和弱精子症患者的精子活力，对提高体外受精成功率有促进作用。
Description
技术领域
本发明属于辅助生殖技术领域，具体涉及一种提高精子活力的增强液及其提升精子活力的方法。
背景技术
目前，由于社会竞争的加剧，男性面临着越来越大的工作压力，又加上环境污染加剧，更多的影响精子产生和成熟的化学物质经各种途径被男性吸收，导致男性产生精子的数量下降，精子的活性降低；据统计，男性不孕症占所有不孕症的35-50％，而少弱精子症是导致男性不孕症的重要因素。精液中精子密度低于20*10个/ml为少精子症；精液中a+b级精子少于50％或a级精子＜25％为弱精子症。
而弱精子症可以将自身精子冷冻于具有相应资质的医疗机构中，以防生育风险，精子冷冻技术已较成熟，精子冷冻可以作为不孕不育者的一种辅助生育手段，但是冷冻保存精子会降低人类精子的活力，
美国专利US09861656B2，采用了菊粉和磷脂化合物的混合物来改善精子活力，利用磷脂修饰精子膜的脂质组成进而修复因过氧化而造成的细胞膜损伤，但此方法并未解决精子在冷冻后细胞物质代谢能力低下的问题，对精子的代谢刺激不足。而且只研究了改性剂对正常精子的精子活力影响，而没有探究改性剂对弱精子症的精子活力影响，而弱精子症受精更为困难，因此探讨改性剂对弱精子症在冷冻后的精子活力影响越来越重要。
基于此，本发明提供了一种技术手段，来解决上述技术方案的不足。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种提高精子活力的增强液及其提升精子活力的方法，以解决现有技术中的不能有效促进弱精子症患者的精子活力，对提高体外受精成功率有促题。
本发明其中一个实进作用的问施例提供了提高精子活力的增强液。
一种提高精子活力的增强液，所述提高精子活力的增强液包括兴奋剂、重组人胰岛素和平衡液，
其中，所述兴奋剂包括2-脱氧腺苷、己酮可可碱或咖啡因中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述平衡液选自一种或多种无机盐溶液；
所述无机盐选自NaCl、KCl、CaCl2·2H2O、KH2PO4和MgSO4·7H2O的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述提高精子活力的增强液包括如下质量分数的成分：
在其中一个实施例中，所述提高精子活力的增强液的pH在7.2-7.6。
本发明其中一个实施例还提供了提高精子活力的增强液来提升精子活力的方法，所述方法包括如下步骤：
S1：将精子、兴奋剂、重组人胰岛素和平衡液添加至培养基中，进行培养，得到培养液；
S2：将所述培养液与冷冻保护液混合均匀，装入冷冻管内进行静置，再转至液氮中放置6-8d后，进行水浴待完全融化，取出。
在其中一个实施例中，所述冷冻保护液中的成分包括血清替代品、HTF-HEPES培养液、甘油混合物的一种或多种。
在其中一个实施例中，S1步骤中，所述精子筛分为高运动精子和低运动精子，所述筛分的方法，是使用双密度梯度离心法进行筛选。
术语“高运动精子”的定义为总运动精子比例≥40％，前向运动精子比例≥32％。
术语“低运动精子”的定义为总运动精子比例<40％，前向运动精子比例<32％。
S2步骤中，所述静置的温度为2-6℃，所述静置的时间为28-32min。
在其中一个实施例中，S2步骤中，所述冷冻管的温度保持在23-27℃。
在其中一个实施例中，S2步骤中，所述水浴的温度为35-39℃。
在其中一个实施例中，S2步骤中，所述培养液与冷冻保护液的体积比为1:1-1:3。
本发明所提供的提高精子活力的增强液及其制备方法具有以下有益效果：
1、本发明分别选择兴奋剂2-脱氧腺苷、己酮可可碱、咖啡因用于提高精子活力，通过提高冷冻保存的精子细胞内cAMP水平，在重组人胰岛素的协同作用下，进一步促进细胞物质代谢水平，并有效促进精子正常者和弱精子症患者的精子活力，对提高体外受精成功率有促进作用。
2、本发明通过添加兴奋剂后再添加重组人胰岛素促进剂与兴奋剂协同进一步促进精子的细胞代谢，提供受精成功率，同时通过添加平衡盐溶液将培养基的pH调节至7.2-7.6，以提供适合精子的生存环境，进而辅助提高精子的活力。
附图说明
图1示出了测试例中，高运动和低运动精子在不同培养基中的渐进运动性对比图；
图2示出了测试例中，高运动和低运动精子在不同培养基中的总运动性对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种提高精子活力的增强液，所述提高精子活力的增强液包括兴奋剂、重组人胰岛素和平衡液，
其中，所述兴奋剂包括2-脱氧腺苷、己酮可可碱或咖啡因。
所述平衡液选自一种或多种无机盐溶液；
所述无机盐选自NaCl、KCl、CaCl2·2H2O、KH2PO4和MgSO4·7H2O。
所述提高精子活力的增强液包括如下质量分数的成分：
所述提高精子活力的增强液的pH在7.4。
本实施例的提高精子活力的增强液来提升精子活力的方法，所述方法包括如下步骤：
S1：将精子、兴奋剂、重组人胰岛素和平衡液添加至培养基中，进行培养，得到培养液；
S2：将所述培养液与冷冻保护液混合均匀，装入冷冻管内进行静置，再转至液氮中放置6-8d后，进行水浴待完全融化，取出。
所述冷冻保护液中的成分包括血清替代品、HTF-HEPES培养液、甘油混合物的一种或多种。
S1步骤中，所述精子筛分为高运动精子，所述筛分的方法，是使用双密度梯度离心法进行筛选；
S2步骤中，所述静置的温度为4℃，所述静置的时间为30min。
S2步骤中，所述冷冻管的温度保持在25℃。
S2步骤中，所述水浴的温度为37℃。
S2步骤中，所述培养液与冷冻保护液的体积比为1:1。
实施例2
一种提高精子活力的增强液，所述提高精子活力的增强液包括兴奋剂、重组人胰岛素和平衡液，
其中，所述兴奋剂包括2-脱氧腺苷、己酮可可碱或咖啡因。
所述平衡液选自一种或多种无机盐溶液；
所述无机盐选自NaCl、KCl、CaCl2·2H2O、KH2PO4和MgSO4·7H2O。
所述提高精子活力的增强液包括如下质量分数的成分：
所述提高精子活力的增强液的pH在7.4。
本实施例的提高精子活力的增强液来提升精子活力的方法，所述方法包括如下步骤：
S1：将精子、兴奋剂、重组人胰岛素和平衡液添加至标准培养基中，进行培养，得到培养液；
S2：将所述培养液与冷冻保护液混合均匀，装入冷冻管内进行静置，再转至液氮中放置7d后，进行水浴待完全融化，取出。
所述冷冻保护液中的成分包括血清替代品、HTF-HEPES培养液、甘油混合物的一种或多种。
S1步骤中，所述精子筛分为低运动精子，所述筛分的方法，是使用双密度梯度离心法进行筛选；
S2步骤中，所述静置的温度为4℃，所述静置的时间为30min。
S2步骤中，所述冷冻管的温度保持在25℃。
S2步骤中，所述水浴的温度为37℃。
S2步骤中，所述培养液与冷冻保护液的体积比为1:1。
对比例1
本对比例和实施例1相比，区别在于：不添加重组人胰岛素，其余条件保持不变。
对比例2
本对比例和实施例2相比，区别在于：不添加重组人胰岛素，其余条件保持不变。
对比例3
一种提高精子活力的增强液，所述提高精子活力的增强液包括兴奋剂、重组人胰岛素和平衡液，
其中，所述兴奋剂包括2-脱氧腺苷、己酮可可碱或咖啡因。
所述平衡液选自一种或多种无机盐溶液；
所述无机盐选自NaCl、KCl、CaCl2·2H2O、KH2PO4和MgSO4·7H2O。
所述提高精子活力的增强液包括如下质量分数的成分：
所述提高精子活力的增强液的pH在7.4。
本对比例还提供了提高精子活力的增强液来提升精子活力的方法，所述方法包括如下步骤：
S1：将精子、兴奋剂、重组人胰岛素和平衡液添加至培养基中，进行培养，得到培养液；
S2：将所述培养液与冷冻保护液混合均匀，装入冷冻管内进行静置，再转至液氮中放置7d后，进行水浴待完全融化，取出。
所述冷冻保护液中的成分包括血清替代品、HTF-HEPES培养液、甘油混合物的一种或多种。
S1步骤中，所述精子筛分为高运动精子，所述筛分的方法，是使用双密度梯度离心法进行筛选；
S2步骤中，所述静置的温度为4℃，所述静置的时间为30min。
S2步骤中，所述冷冻管的温度保持在25℃。
S2步骤中，所述水浴的温度为37℃。
S2步骤中，所述培养液与冷冻保护液的体积比为1:1。
对比例4
一种提高精子活力的增强液，所述提高精子活力的增强液包括兴奋剂、重组人胰岛素和平衡液，
其中，所述兴奋剂包括2-脱氧腺苷、己酮可可碱或咖啡因。
所述平衡液选自一种或多种无机盐溶液；
所述无机盐选自NaCl、KCl、CaCl2·2H2O、KH2PO4和MgSO4·7H2O。
所述提高精子活力的增强液包括如下质量分数的成分：
所述提高精子活力的增强液的pH在7.4。
本对比例还提供了提高精子活力的增强液来提升精子活力的方法，所述方法包括如下步骤：
S1：将精子、兴奋剂、重组人胰岛素和平衡液添加至标准培养基中，进行培养，得到培养液；
S2：将所述培养液与冷冻保护液混合均匀，装入冷冻管内进行静置，再转至液氮中放置7d后，进行水浴待完全融化，取出。
所述冷冻保护液中的成分包括血清替代品、HTF-HEPES培养液、甘油混合物的一种或多种。
S1步骤中，所述精子筛分为低运动精子，所述筛分的方法，是使用双密度梯度离心法进行筛选；
S2步骤中，所述静置的温度为4℃，所述静置的时间为30min。
S2步骤中，所述冷冻管的温度保持在25℃。
2步骤中，所述水浴的温度为37℃。
S2步骤中，所述培养液与冷冻保护液的体积比为1:1。
对比例5
本对比例和对比例3相比，区别在于：将兴奋剂替换为己酮可可碱，其余条件保持不变。
对比例6
本对比例和对比例4相比，区别在于：将兴奋剂替换为己酮可可碱，其余条件保持不变。
对比例7
本对比例和对比例3相比，区别在于：将兴奋剂替换为咖啡因，其余条件保持不变。
对比例8
本对比例和对比例3相比，区别在于：将兴奋剂替换为咖啡因，其余条件保持不变。
本发明实施例1-2、对比例1-8中所述的培养基的成分和质量分数如下表1所述。
表1培养基的成分和质量分数
测试例
对实施例1-2、对比例1-8的样品，进行高运动精子和低运动精子的渐进运动性和总运动性的测试。
测试所采用的方法为：计算机辅助精子分析(CASA仪)。实验步骤：缓慢摇动培养皿，使精子悬液混匀。用1ml定量加液器吸取一定量的精子悬液，加入温度为37℃的培养基中，吸取精子悬液至显微镜的预温载物台中，用显微镜观察精子形态，显微镜预热镜台保持温度为37℃。使用CASA仪测试精子的运动轨迹，分析前向运动(渐进运动性)和总活力(总运动性)。
所得结果如表2所示。
表2高运动精子和低运动精子的渐进运动性和总运动性的测试结果
表2示出了实施例1、实施例2由于增加了兴奋剂可以明显改善精子的渐进运动性和总运动性。
具体地，从表2中可以看出，特别是对于低运动精子，改善效果更为明显，同时相比于对比例1、对比例2而言，对比例1、对比例2中由于未加入兴奋剂，因此无论是高运动精子或是低运动精子的活性都较低，实施例1、实施例2在添加了兴奋剂的基础上，增加重组人胰岛素可以进一步增加精子的渐进运动性和总运动性。
同时对比例3、对比例4中在培养基中添加2-脱氧腺苷作为兴奋剂，相对于对比例5、对比例6添加己酮可可碱作为兴奋剂，对比例7、对比例8添加咖啡因作为兴奋剂，高运动精子或是低运动精子的活性都是最佳的。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (1)
1.一种提高精子活力的增强液，其特征在于，
所述提高精子活力的增强液由如下质量分数的成分组成：
2-脱氧腺苷 0.02~0.12%
己酮可可碱 0.03~0.14%
咖啡因 0.04~0.12%
重组人胰岛素 0.0017~0.0025%
NaCl 0.46~0.69%
KCl 0.01~0.07%
CaCl2·2H2O 0.01~0.15%
KH2PO4 0.01~0.07%
MgSO4·7H2O 0.01~0.12%
水 余量；
所述提高精子活力的增强液的pH在7.2-7.6。
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