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CN116162602A - 一种新型的从微载体收获产物的方法 - Google Patents

一种新型的从微载体收获产物的方法 Download PDF

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CN116162602A
CN116162602A CN202310087871.0A CN202310087871A CN116162602A CN 116162602 A CN116162602 A CN 116162602A CN 202310087871 A CN202310087871 A CN 202310087871A CN 116162602 A CN116162602 A CN 116162602A
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liquid
filter screen
cells
microcarriers
harvest
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CN202310087871.0A
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刘宇骁
金优萍
王鹤霖
张明芳
顾晓旭
杨琳
许月英
孟益锋
胡秀华
蒋俊俊
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Hangzhou Mingde Biotechnology Development Co ltd
Hangzhou Mingde Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Mingde Biotechnology Development Co ltd
Hangzhou Mingde Biomedical Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种新型的从微载体收获产物的方法。具体地，本发明提供一种由细胞培养物中收获细胞产物的方法，包括步骤：采用具有100‑1000目的滤网通过切向流模式对含有所述产物的细胞培养物进行缓冲液交换，收获穿过所述滤网的含产物的换出液，所述细胞培养物含有用于所述细胞贴壁的微载体，所述细胞分泌所述产物或所述细胞经裂解以释放所述产物。

Description

一种新型的从微载体收获产物的方法
技术领域
本发明涉及生物反应器领域，具体涉及从微载体收获产物的方法。
背景技术
微载体是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。将微载体加入培养液中，通过持续搅动，可使得微载体始终保持悬浮状态。微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，如HEK 293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞等，进行疫苗和蛋白质产品的生产。
在微载体收获工艺中，在罐内原位裂解是一种直接便捷的收获方式，细胞原位裂解后，实现高效微载体与料液的分离，一直都是一个难题。细胞裂解后大量宿主蛋白和宿主DNA释放导致整体料液黏度增高，分离难度加大。部分病毒对剪切力和离心力敏感，且稳定性差，需要在短时间内完成料液的收获。传统工艺使用的方法主要有离心，自然沉降，过滤。离心是实验室规模最常用的分离方法，需要将料液从罐体中转移到罐外再进行离心操作，离心工艺操作繁琐，不利于工艺放大。自然沉降是微载体培养工艺换液和收获常用方式，单次换液回收率一般低于80％，而且控制流速的前提下依然容易将少量的微载体带入收获液中，同时高度依赖反应器设计结构，对于一次性反应器常需要设计定制。除此之外，自然沉降耗时过长，对于稳定性差的病毒，具有较大挑战。过滤是使用率较高的分离方式，近年来基于微载体分离需求上市了一系列的分离装置，如Eppendorf生产的Spin filter，ThermoFisher Scientific公司生产的HarvestainerTMMicrocarrier Separation System，Cytiva的分离罐以及一些大孔径膜滤器都可以用于微载体的分离。但各个产品都有一定的局限性，如Spin filter的最大生产规模只有50L，不利于放大；Harvestainer不能实现连续分离，价格高昂，规格灵活度差，不具备工艺开发规模的产品，放大有一定风险；Cytiva的外置分离罐高度依赖定制化，而且装置成本昂贵。
发明内容
为了解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供一种新的从微载体收获产物的方法。
本发明提供一种由细胞培养物中收获细胞或细胞产物的方法，包括步骤：采用具有100-1000目(优选200-500目)的滤网通过切向流模式对含有所述细胞或细胞产物的细胞培养物进行缓冲液交换，收获穿过所述滤网的含细胞或细胞产物的换出液，所述细胞培养物含有用于所述细胞贴壁的微载体，所述细胞分泌所述产物或所述细胞经裂解以释放所述产物。
在一个或多个实施方案中，所述方法用于收获细胞，包括步骤：
(1)使用微载体培养细胞，获得含细胞以及微载体的细胞培养物，
任选的(2)富集微载体，获得微载体浓缩液和第一收获液，所述第一收获液含待收获的细胞，
(3)采用具有100-1000目(优选200-500目)的滤网通过切向流模式对步骤(1)获得的细胞培养物或步骤(2)获得的微载体浓缩液进行缓冲液交换，收获穿过所述滤网的含细胞的换出液，即第二收获液，所述第二收获液含待收获的细胞，
任选的(4)合并第一收获液和第二收获液，获得收获液。
在一个或多个实施方案中，所述方法用于收获细胞产物，包括步骤：
(1)使用微载体培养细胞，获得含产物、细胞或细胞部分以及微载体的细胞培养物，
任选的(2)富集微载体，获得微载体浓缩液和第一收获液，所述第一收获液含待收获的细胞产物，
(3)采用具有100-1000目(优选200-500目)的滤网通过切向流模式对步骤(1)获得的细胞培养物或步骤(2)获得的微载体浓缩液进行缓冲液交换，收获穿过所述滤网的含产物的换出液，即第二收获液，所述第二收获液含待收获的细胞产物，
任选的(4)合并第一收获液和第二收获液，获得收获液。
在一个或多个实施方案中，所述方法用于收获细胞产物，其中步骤(1)包括：
(1.1)在培养基中于微载体上在适合生产产物的条件下培养细胞，所述细胞分泌所述产物，从而获得所述细胞培养物，或
(1.2)在培养基中于微载体上在适合生产产物的条件下培养细胞，裂解细胞，获得所述细胞培养物。
在一个或多个实施方案中，所述细胞是贴壁细胞。
在一个或多个实施方案中，所述细胞是真核细胞，例如动物细胞。在一个或多个实施方案中，所述细胞是Vero细胞。
在一个或多个实施方案中，所述产物是病毒或蛋白。在一个或多个实施方案中，所述病毒包括：单纯疱疹病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、轮状病毒、肠病毒、肝炎病毒，腺病毒，腺相关病毒，慢病毒或其任意组合；具体地，所述病毒包括单纯疱疹病毒；更具体地，所述病毒包括HSV-1病毒。
在一个或多个实施方案中，所述微载体包括2D微载体，如Cytodex-1；3D多孔微载体，如Cytopore-2；片状载体，如Fibra-Cel；更具体地，所述微载体包括Cytodex-1。
在一个或多个实施方案中，细胞培养物中微载体的浓度为1-20g/L，优选2-16.47g/L，更优选3-6g/L。
在一个或多个实施方案中，所述裂解是由裂解剂裂解细胞，或由病毒裂解细胞。
在一个或多个实施方案中，所述裂解剂包含NaCl、MgCl2、磷酸盐缓冲液和核酸酶中的一种或多种。NaCl的终浓度为0.01-10M，优选0.1-1.0M，更优选0.5M。MgCl2的终浓度为0.1-20M，优选1-5M，更优选4mM。核酸酶终浓度为0.1-200U/mL，优选1-100U/mL，更优选20U/mL。
在一个或多个实施方案中，用于裂解细胞的病毒是所述产物。
在一个或多个实施方案中，裂解温度为15-60℃，优选20-50℃，更优选35℃。裂解时间为0.5-24h，优选1-10h，更优选2-3h。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)包括：采用具有100-1000目(优选200-500目)的滤网通过切向流模式进行微载体富集，获得微载体浓缩液和穿过所述滤网的含产物的换出液，即第一收获液。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)中，切向流模式的液体流速为0.1-20L/min，优选0.5-10L/min，更优选1.0L/min。在一个或多个实施方案中，所述切向流是交替切向流。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)获得的微载体浓缩液中微载体的浓度约为2-40g/L，优选4-14g/L，例如4.52-13.18g/L。
在一个或多个实施方案中，第一收获液与微载体浓缩液的体积比为0～20:1；其中0代表不浓缩。优选地第一收获液与微载体浓缩液的体积比为1:1。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)在反应容器中进行，该反应容器具有以下任一或多个或全部参数：
表面通气速率0.1-10L/min，优选0.5-5L/min，更优选1.0L/min，
底部通气速率0.001-0.1L/min，优选0.001-0.05L/min，更优选0.009L/min，
搅拌转速10-200rpm，优选30-90rpm，更优选60rpm，
搅拌桨直径10-200mm，优选30-90mm，更优选60mm，
截流装置透过端压力控制≥0Psi。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)在反应容器中进行，该反应容器具有以下任一或多个或全部参数：
表面通气速率0.1-10L/min，优选0.5-5L/min，更优选1.0L/min，
底部通气速率0.001-0.1L/min，优选0.001-0.05L/min，更优选0.009L/min，
搅拌转速10-200rpm，优选30-90rpm，更优选60rpm，
搅拌桨直径10-200mm，优选30-90mm，更优选60mm，
截流装置透过端压力控制≥0Psi。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)的缓冲液交换使用包含NaCl、MgCl2、磷酸盐缓冲液的缓冲液进行。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)中，换液速率为1-200mL/min/79cm2，优选10-100mL/min/79cm2，例如40mL/min/79cm2。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)中，切向流模式的液体流速为0.1-20L/min，优选0.5-10L/min，更优选1.0L/min。在一个或多个实施方案中，所述切向流是交替切向流。
在一个或多个实施方案中，收获液体积如下式所示：
V初始-V浓缩后+n×V浓缩后
V初始是指步骤(1)获得的细胞培养物的体积，V浓缩后为微载体浓缩液体体积，n为0-20。其中，(V初始-V浓缩后)是通过步骤(2)获得的第一收获液体积，优选地，n为0-8，更优选地，n为0-4。对于V初始，如果步骤(1)不包括裂解，则V初始指细胞培养后反应器内的体积；如果步骤(1)包括裂解，则V初始指裂解后反应器内的体积，即细胞培养物和裂解剂体积之和。
在一个或多个实施方案中，若存在步骤(2)，并且第一收获液与微载体浓缩液的体积比为0～20:1，则步骤(4)中，当收获液体积为细胞培养物和裂解剂体积之和的1-4倍时停止换液，优选1-2倍，更优选1-1.5倍，细胞或细胞产物(例如病毒)的收率最高。
在一个或多个实施方案中，若不存在步骤(2)，则步骤(4)中，当收获液体积为细胞培养物和裂解剂体积之和的1-6倍时停止换液，优选2-5倍，更优选2.5-3.5倍时，细胞或细胞产物(例如病毒)的收率最高。
在一个或多个实施方案中，使用截流装置进行步骤(2)和/或步骤(3)，所述截流装置与反应容器流体连通。所述截流装置包括设有入液口和第一出液口的本体，所述本体内设有连接在入液口和第一出液口之间的液流通道，所述液流通道通过设在本体上的滤网与本体分开，所述本体上还设有与滤网和本体之间的区域流体连通的第二出液口，当第二出液口的压力小于液流通道中的压力时，从入液口流入所述装置的来自反应容器的液体穿过所述滤网流入滤网和本体之间的区域并从第二出液口流出。
在一个或多个实施方案中，滤网设置为，使得液流通道中液体流动方向与液体穿过滤网的方向垂直。
在一个或多个实施方案中，裂解的细胞培养物从入液口进入液流通道，向第二出液口施加负压，含所述产物的换出液从第二出液口流出。
在一个或多个实施方案中，所述负压由与第二出液口连接的泵(例如蠕动泵)产生。
在一个或多个实施方案中，所述本体为不锈钢本体。
在一个或多个实施方案中，所述滤网是金属滤网，优选不锈钢滤网。
在一个或多个实施方案中，所述滤网为100-1000目，优选200-500目(孔径30-75μm)。
在一个或多个实施方案中，液流通道中的液体往复运动。
在一个或多个实施方案中，所述滤网是圆柱形滤网，所述本体是围绕所述滤网的外壳，所述滤网的两端与所述本体密封连接；所述第二出液口是设置在本体外壁上的一个或多个通孔。所述密封连接是焊接连接。如图6所示。
在一个或多个实施方案中，所述入液口、第一出液口和第二出液口是TC25接口。
在一个或多个实施方案中，所述装置由Reppligen C24控制器控制。
附图说明
图1，实施例1结果展示。
图2，实施例2结果展示。
图3，实施例3结果展示。
图4，实施例4结果展示。
图5，实施例5(对比例)结果展示。
图6，截流装置示意图。
具体实施方式
以下为本发明具体实施方式的详细说明。此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在给出数值或范围时，本文所用术语“约”指该数值或范围在给定数值或范围的20％以内、10％以内和5％以内。
本文所用术语“包含”、“包括”和其等同形式包括“含有”以及“由……组成”的含义，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。
发明人发现，通过切向流过滤，将含产物(例如病毒)的滤出液控制在1-4倍的初始工作体积(例如经过原位裂解的细胞培养物)，可以获得较好的产物收率。结合原位裂解，可以实现不间断连续分离。因此，针对现有收获工艺的弊端，发明人开发了一种操作简单、分离迅速、剪切力低且便于工艺放大的收获方法。在本发明的一个实施方式中，贴附有细胞的微载体培养液在反应器中进行原位裂解和预处理，使细胞内的蛋白或病毒产品充分释放，然后再利用截流装置进行收获/换液，通过直接换液或浓缩换液(仅对罐内微载体进行浓缩)进行微载体与料液的连续分离。在合适的换液体积条件下，收率可达到95％以上。而且该方法可实现高密度培养装置和收获装置的一体化，操作上简单便捷，减少生产成本且利于工艺放大。本发明的截留装置经放大可以容易地实现50L以上规模的分离。
因此，本发明提供一种由细胞培养物中收获由细胞生产的产物的方法，包括步骤：采用具有100-1000目(例如100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000目或其中任意两个数值之间的范围)的滤网通过切向流模式对含有所述产物的细胞培养物进行缓冲液交换，收获穿过所述滤网的含产物的换出液，所述细胞培养物含有用于所述细胞贴壁的微载体，所述细胞分泌所述产物或所述细胞经裂解以释放所述产物。所述滤网为100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000目或其中任何范围，优选200-500目。
不同于本领域常见方法，本发明在换出液中收获产物。在一个或多个实施方案中，所述方法包括步骤：
(1)使用微载体培养细胞，获得含产物、细胞或细胞部分以及微载体的细胞培养物，
任选的(2)富集微载体，获得微载体浓缩液和第一收获液，
(3)采用具有100-1000目(优选200-500目)的滤网通过切向流模式对步骤(1)获得的细胞培养物或步骤(2)获得的微载体浓缩液进行缓冲液交换，收获穿过所述滤网的含产物的换出液，即第二收获液，和
任选的(4)合并第一收获液和第二收获液，获得收获液。
在微载体系统中，细胞在小固体颗粒的表面上繁殖，该固体颗粒通过缓慢搅拌而悬浮于生长培养基中。细胞附着于微载体，并逐渐生长至铺满微载体表面。微载体系统将细胞生长所需表面与均匀悬浮培养的优点结合起来提高了产量。细胞培养物中微载体的浓度为1-20g/L，优选2-16.47g/L，更优选3-6g/L。所述微载体包括2D微载体，如Cytodex-1；3D多孔微载体，如Cytopore-2；片状载体，如Fibra-Cel。
-步骤(1)，使用微载体培养细胞，获得含产物、细胞或细胞部分以及微载体的细胞培养物
本发明方法可用于收获分泌型产物或非分泌型产物。产物可以是病毒、蛋白或任何可由细胞生产的物质。对于分泌产物，无需经过细胞裂解即可直接进行本发明的由细胞培养物中收获细胞产物的方法。对于非分泌产物，本发明方法在收获细胞产物前还包含裂解细胞的步骤。因此，在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括：(1.1)在培养基中于微载体上在适合生产产物的条件下培养细胞，所述细胞分泌所述产物，从而获得所述细胞培养物，或(1.2)在培养基中于微载体上在适合生产产物的条件下培养细胞，裂解细胞，获得所述细胞培养物。所述裂解可以是由裂解剂裂解细胞，或由作为产物的病毒裂解细胞。
本文中，细胞的裂解包括原位和非原位裂解。在本发明的某些方面，可用低渗溶液、高渗溶液、冻融、超声破碎、冲击流、微流体化、洗涤剂或由作为产物本身的病毒使细胞非原位裂解。在其它方面，可用低渗溶液、高渗溶液、洗涤剂或由作为产物本身的病毒使细胞原位裂解。本文所用的术语“原位”指细胞位于组织培养装置(例如细胞培养罐)内，而“非原位”指细胞从组织培养装置中被取出。裂解后液体中微载体浓度降低，约为2-14g/L，例如2.4-13.18g/L。
本领域技术人员可以根据细胞、产物、培养系统来选择合适的裂解剂和裂解条件。例如，用于裂解Vero细胞的示例性裂解剂包含NaCl、MgCl2、磷酸盐缓冲液和核酸酶中的一种或多种，其中，NaCl的终浓度为0.01-10M，MgCl2的终浓度为0.1-20M，核酸酶终浓度为0.1-200U/mL，裂解温度为15-60℃，裂解时间为0.5-24h。
本发明方法适合收获任何可由细胞产生的病毒或蛋白。所述病毒包括但不限于：单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、轮状病毒、肠病毒、肝炎病毒，腺病毒，腺相关病毒，慢病毒或其任意组合。示例性地，所述病毒包括单纯疱疹病毒，例如HSV-1病毒。
任何可用作生物反应器的细胞均可用于本发明的方法来生产产物，包括但不限于细菌、真菌、动物细胞、植物细胞。示例性地，所述细胞是真核细胞。在一个或多个实施方案中，所述细胞是Vero细胞或293细胞。
本发明方法还可包括步骤：在培养基中于微载体上在适合生产产物的条件下培养细胞。根据所需的产物和所用的宿主细胞，本领域技术人员容易确定培养细胞的条件。
在本发明的其它方面，提供了一种根据下述方法制得的HSV-1病毒，该方法包括使宿主细胞生长，用HSV-1病毒感染宿主细胞，通过使细胞与裂解剂接触来收获并裂解宿主细胞产生细胞裂解液，采用200-500目的滤网浓缩该细胞裂解液，采用200-500目的滤网交换该细胞裂解液的缓冲液，收获穿过所述滤网的含HSV-1病毒的换出液。
在一些实例中，所述方法还包括从所述换出液中分离出病毒颗粒(例如层析)的步骤。根据所需的产物和所用的宿主细胞，本领域技术人员容易确定分离出病毒颗粒的方法。
-步骤(2)，富集微载体，获得微载体浓缩液和第一收获液，
本文中，“富集”和“浓缩”具有相同的含义，可互换使用，都表示减小含感兴趣物质(例如微载体)的液体的体积。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)的富集微载体包括：采用具有100-1000目(优选200-500目)的滤网通过切向流模式进行微载体富集，获得微载体浓缩液和穿过所述滤网的含产物的换出液，即第一收获液。浓缩后的微载体浓度约为2-40g/L，优选4-14g/L，例如4.52-13.18g/L。在某些实施方案中，第一收获液与微载体浓缩液的体积比为0～20:1，优选为0～15:1，更优选为0～10:1，更优选为0～5:1，更优选为0～3:1，更优选为0.5～2:1。
在一个实施方案中，步骤(2)在反应容器中进行，该反应容器具有以下任一或多个或全部参数：表面通气速率0.1-10L/min，底部通气速率0.001-0.1L/min，搅拌转速10-200rpm，搅拌桨直径10-200mm，截流装置透过端压力控制≥0Psi。优选地，步骤(2)包括：采用具有100-1000目(优选200-500目)的滤网通过切向流模式进行浓缩，收获穿过所述滤网的含产物的换出液；所述切向流模式的液体流速为0.1-20L/min；所述切向流优选交替切向流。
-步骤(3)
在步骤(3)中，通过对步骤(1)获得的细胞培养物(不存在富集步骤(2)时)或步骤(2)获得的微载体浓缩液(存在富集步骤(2)时)进行缓冲液交换，使得产物(例如病毒)与其他杂质(例如细胞或裂解产生的细胞部分)分离，获得第二收获液。在具体实施方案中，采用具有100-1000目(优选200-500目)的滤网通过切向流模式对步骤(1)获得的细胞培养物或步骤(2)获得的微载体浓缩液进行缓冲液交换，收获穿过所述滤网的含产物的换出液，即第二收获液。
在一个实施方案中，步骤(3)在反应容器中进行，该反应容器具有以下任一或多个或全部参数：表面通气速率0.1-10L/min，底部通气速率0.001-0.1L/min，搅拌转速10-200rpm，搅拌桨直径10-200mm，截流装置透过端压力控制≥0Psi。步骤(3)的缓冲液交换使用包含NaCl、MgCl2、磷酸盐缓冲液的缓冲液进行；步骤(3)中，换液速率为1-200mL/min；步骤(3)中，切向流模式的液体流速为0.1-20L/min；所述切向流优选是交替切向流。
-步骤(4)合并第一收获液和第二收获液，获得收获液
收获液，即两次换出液之和，的体积如下式所示：
V初始-V浓缩后+n×V浓缩后
V初始是指步骤(1)获得的细胞培养物的体积，V浓缩后为浓缩后反应器内剩余料液体积，n为0-20(例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或任意两个数值之间的范围)。其中，(V初始-V浓缩后)是通过浓缩所收获的体积。优选地，n为0-8，更优选地，n为0-4。在控制收获体积的前提下，细胞或细胞产物(例如病毒)的收率最高。对于V初始，如果步骤(1)不包括裂解，则V初始指细胞培养后反应器内的体积；如果步骤(1)包括裂解，则V初始指裂解后反应器内的体积，即细胞培养物和裂解剂体积之和。
例如，若存在步骤(2)，并且第一收获液与微载体浓缩液的体积比为0～20:1，则步骤(3)中，当收获液体积为细胞培养物和裂解剂体积之和的1-4倍时停止换液，优选1-2倍，更优选1-1.5倍，更优选约1.5倍时，病毒的收率最高。优选地，第一收获液与微载体浓缩液的体积比为0～15:1，更优选为0～10:1，更优选为0～5:1，更优选为0～3:1，更优选为0.5～2:1。
若不存在步骤(2)，则步骤(3)中，当收获液体积为细胞培养物和裂解剂体积之和的1-6倍时停止换液，优选2-5倍，更优选2.5-3.5倍，更优选约2.5倍时，病毒的收率最高。
本发明提供截留装置，用于步骤(2)和(3)，所述截流装置与反应容器流体连通。所述截流装置包括设有入液口和第一出液口的本体，所述本体内设有连接在入液口和第一出液口之间的液流通道，所述液流通道通过设在本体上的滤网(如上所述，100-1000目，优选200-500目)与本体分开，所述本体上还设有与滤网和本体之间的区域流体连通的第二出液口，当第二出液口的压力小于液流通道中的压力时，从入液口流入所述装置的来自反应容器的液体穿过所述滤网流入滤网和本体之间的区域并从第二出液口流出。液流通道中的液体往复运动。所述入液口、第一出液口和第二出液口是TC25接口。所述本体为不锈钢本体。所述滤网是金属滤网，优选不锈钢滤网。裂解的细胞培养物从入液口进入液流通道，向第二出液口施加负压，含所述产物的换出液从第二出液口流出。所述负压由与第二出液口连接的泵(例如蠕动泵)产生。本领域技术人员可选择合适的控制器控制所述装置，例如Repligen C24控制器。
在优选实施方案中，滤网设置为，使得液流通道中液体流动方向与液体穿过滤网的方向垂直。所述滤网是圆柱形滤网，所述本体是围绕所述滤网的外壳，所述滤网的两端与所述本体密封连接；所述第二出液口是设置在本体外壁上的一个或多个通孔。所述密封连接是焊接连接。如图6所示。
本发明的方法不限于收获细胞产物，还可以用于由细胞培养物中收获细胞，与收获细胞产物的过程相比，收获细胞的方法不需要细胞分泌产物或裂解步骤，细胞培养后可以直接开始浓缩和换液。具体地，所述方法包括步骤：(1)使用微载体培养细胞，获得含细胞以及微载体的细胞培养物，任选的(2)富集微载体，获得微载体浓缩液和第一收获液，(3)采用具有100-1000目(优选200-500目)的滤网通过切向流模式对步骤(1)获得的细胞培养物或步骤(2)获得的微载体浓缩液进行缓冲液交换，收获穿过所述滤网的含细胞的换出液，即第二收获液，任选的(4)合并第一收获液和第二收获液，获得收获液。上述步骤的具体实施方案参见前述针对收获细胞产物的方法中的描述。
在本文中，浓度、含量、百分数和其它数值均可用范围的形式表示。也应理解，使用这种范围形式只是为了方便和简洁，应该被弹性地解读为包括范围上下限所明确提及的数值，还应包括该范围内包括的所有单个数值或子范围。
实施例
下面结合实施例对本发明提供的精氨酸荧光探针进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
在本实例中所用病毒培养液中的微载体初始浓度为3g/L，微载体种类为Cytodex-1，病毒类别为HSV-1，细胞为Vero细胞，使用图6所示的截留装置进行换液，所用金属滤网为200目(孔径为75μm)，搭配Repligen C24控制器使用，运行方式为交替切向流(ATF)模式。控制参数如表1所示
1.1微载体细胞裂解
1.1.1裂解液添加，在生物反应中分别加入微载体-病毒培养液1523mL、5×裂解液(含2.5M NaCl，20mM MgCl2的磷酸盐缓冲液)379mL、核酸酶68μL。培养液与5×裂解液的体积比为4:1，核酸酶添加终浓度为20U/mL。加入裂解液稀释后微载体理论浓度为2.40g/L。
1.1.2裂解，加入1.1.1中描述组分后，于35℃，60rpm裂解2-3h，其他参数设置见表1。
表1实验参数设置
微载体密度(初始密度) 3g/L
微载体种类 Cytodex-1
表面通气速率(压缩空气) 1.0L/min
底部通气速率(压缩空气) 0.009L/min
搅拌转速 60rpm
搅拌桨直径 60mm
截流装置透过端压力控制 ≥0Psi
1.2换液收获
使用图6所示的截留装置进行换液。开启ATF，开启换液，换液Buffer为1×裂解液(含0.5M NaCl，4mM MgCl2的磷酸盐缓冲液)，换液速率为40mL/min，ATF的P/E flow速率为1.0L/min，其他实验参数与裂解阶段保持一致，具体见表1。每换液一定体积后取样检测病毒滴度，HSV-1病毒滴度的测定方法为空斑法，依据病毒滴度计算回收率。当总换液体积为1.73L(工作体积的0.92倍)时收率达到71.03％，总换液体积为3.47L(工作体积的1.84倍)时收率达到85.79％，总换液体积为5.20L(工作体积的2.75倍)时收率达到114.50％，总换液体积为6.92L(工作体积的3.67倍)时收率达到105.08％。当总换液体积超过5.16L，HSV收率没有明显变化，此时理论运行最短时间为4.16h。
实施例2
在本实例中所用病毒培养液中的微载体初始浓度为3g/L，微载体种类为Cytodex-1，病毒类别为HSV-1，细胞为Vero细胞，使用图6所示的截留装置进行浓缩和换液，所用金属滤网为200目(孔径为75μm)，搭配Repligen C24控制器使用，运行方式为ATF模式。
2.1微载体细胞裂解
2.1.1裂解液添加，在生物反应中分别加入微载体病毒培养液1583mL、393mL 5×裂解液(含2.5M NaCl，20mM MgCl2的磷酸盐缓冲液)、核酸酶70.8μL。培养液与5×裂解液的体积比为4:1，核酸酶添加终浓度为20U/mL。加入裂解液稀释后微载体理论浓度为2.40g/L。
2.1.2裂解，加入1.1.1中描述组分后，于35℃，60rpm裂解2-3h，其他参数设置见表1。
2.2微载体浓缩
使用图6所示的截留装置进行浓缩。裂解完成后，开启ATF，开启收获泵，收获速率为40mL/min，将罐内体积浓缩到931mL，浓缩后微载体理论浓度为5.13g/L。浓缩操作步骤获得微载体浓缩液和第一收获液。
2.3换液收获
使用图6所示的截留装置进行换液。开启换液，换液Buffer为1×裂解液(含0.5MNaCl，4mM MgCl2的磷酸盐缓冲液)，换液速率为40mL/min，ATF的P/E flow速率为1.0L/min，其他实验参数与裂解阶段保持一致，具体见表1。每换液一定体积后取样检测病毒滴度并进行收率计算。换液步骤的收获液为第二收获液。
2.4总收获体积
浓缩操作步骤的收获体积(第一收获液)为1.08L(初始工作体积(裂解后的体积)的0.55倍)，收率为60.72％。当总收获体积(浓缩步骤的收获体积加上换液步骤的收获体积)为1.98L(初始工作体积的1.01倍)时，收率达到156.58％，当总收获体积为2.91L(初始工作体积的1.48倍)时收率达到123.06％，当总收获体积为3.84L(初始工作体积的1.96倍)时收率达到119.41％，当总收获体积为4.77L(初始工作体积的2.43倍)时收率达到136.25％。通过浓缩换液的方式，当总收获体积超过1.98L(初始工作体积的1.01倍)时，继续进行换液收获，HSV收率没有明显变化，此时理论运行最短时间为2.83h。
实施例3
在本实例中所用病毒培养液中的微载体初始浓度为3g/L,微载体种类为Cytodex-1，病毒类别为HSV-1，细胞为Vero细胞，使用图6所示的截留装置进行浓缩和换液，所用金属滤网为500目(孔径为30μm)，搭配Repligen C24控制器使用，运行方式为ATF模式。
3.1微载体细胞裂解
3.1.1在生物反应中分别加入微载体培养液1510mL、5×裂解液(含2.5MNaCl，20mMMgCl2的磷酸盐缓冲液)376mL、核酸酶67.6μL。培养液与5×裂解液的体积比为4:1，核酸酶添加终浓度为20U/mL。加入裂解液稀释后微载体理论浓度为2.40g/L。
3.1.2加入1.1.1中描述组分后，于35℃，60rpm裂解2-3h，其他参数设置见表1。
3.2微载体浓缩
使用图6所示的截留装置进行浓缩。裂解完成后，开启ATF，开启收获泵，收获速率为40mL/min，将罐内体积浓缩到992mL，浓缩后微载体理论浓度为4.52g/L。浓缩操作步骤获得微载体浓缩液和第一收获液。
3.3换液收获
使用图6所示的截留装置进行换液。开启换液，换液Buffer为1×裂解液(含0.5MNaCl，4mM MgCl2的磷酸盐缓冲液)，换液速率为40mL/min，ATF的P/E flow速率为1.0L/min，其他实验参数与裂解阶段保持一致，具体见表1。每换液一定体积后取样检测病毒滴度并进行收率计算。换液步骤的收获液为第二收获液。
3.4总收获体积
浓缩操作步骤的收获体积(第一收获液)为0.88L(初始工作体积(裂解后的体积)的0.47倍)，收率为60.12％。当收总收获体积(浓缩步骤的收获体积加上换液步骤的收获体积)为1.87L(初始工作体积的1.00倍)时收率达到88.37％，当收总收获体积为2.86L(初始工作体积的1.53倍)时收率达到99.49％，当总收获体积为3.85L(初始工作体积的2.05倍)时收率达到95.55％。当总收获体积为4.83L(初始工作体积的2.58倍)时收率达到114.08％。通过浓缩换液的方式，当总收获体积超过2.86L(初始体积的1.53倍)时，继续进行换液收获，HSV收率没有明显变化，此时理论运行最短时间为3.19h。
实施例4
在本实例中所用病毒培养液中的微载体初始浓度为3g/L，通过额外添加微载体的方式将裂解液中微载体浓度提升至5.81g/L，微载体种类为Cytodex-1，病毒类别为HSV-1，细胞为Vero细胞，使用图6所示的截留装置进行浓缩和换液，所用金属滤网为200目(孔径为75μm)，搭配Repligen C24控制器使用，运行方式为ATF模式。
4.1微载体细胞裂解
4.1.1在生物反应中分别加入微载体培养液1754.8mL、5×裂解液(含2.5M NaCl，20mM MgCl2的磷酸盐缓冲液)500mL、核酸酶89.8μL、微载体母液247mL(微载体浓度为37.5g/L)。培养液与5×裂解液的体积比为4:1，核酸酶添加终浓度为20U/mL。
4.1.2加入1.1.1中描述组分后，于35℃，60rpm裂解2-3h，其他参数设置见表1。
4.2微载体浓缩
使用图6所示的截留装置进行浓缩。裂解完成后，从反应器中取出251.3mL裂解后样品用作其他实验，取样后反应器中总体积为2236.5mL。开启ATF，开启收获泵，收获速率为40mL/min，将罐内体积浓缩到998.5mL，浓缩后微载体理论浓度为13.18g/L。浓缩操作步骤获得微载体浓缩液和第一收获液。
4.3换液收获
使用图6所示的截留装置进行换液。开启换液，换液Buffer为1×裂解液(含0.5MNaCl，4mM MgCl2的磷酸盐缓冲液)，换液速率为40mL/min，ATF的P/E flow速率为1.0L/min，其他实验参数与裂解阶段保持一致，具体见表1。每换液一定体积后取样检测病毒滴度并进行收率计算。换液步骤的收获液为第二收获液。
4.4总收获体积
浓缩操作步骤的收获体积(第一收获液)为1.25L(初始工作体积(裂解后的体积)的0.56倍)，收率为41.83％。当总收获体积(浓缩步骤的收获体积加上换液步骤的收获体积)为2.24L(初始工作体积的1.00倍)时收率达到84.97％，当总收获体积为3.23L(初始工作体积的1.44倍)时收率达到94.83％。当总收获体积为4.21L(初始工作体积的1.88倍)时收率达到75.34％。当总收获体积为5.20L(初始工作体积的2.33倍)时收率达到79.99％。当总收获体积超过3.23L(初始体积的1.44倍)时，继续进行换液收获，HSV收率没有明显变化，此时理论运行最短时间为3.34h。
实施例5(对比例)
在本实例中所用病毒培养液中的微载体初始浓度为3g/L，通过额外添加微载体的方式将裂解液中微载体浓度提升至5.81g/L，过滤压力<1bar，微载体种类为Cytodex-1，病毒类别为HSV-1，细胞为Vero细胞，使用滤器过滤的方式对微载体裂解液进行收获，所用滤器为赛多利斯SartoScale Disposable Sartopure PP3滤器，孔径为50μm，过滤面积为17.3cm2。
5.1取如4.1描述裂解后的微载体病毒裂解液251.3mL，利用滤器进行过滤，过滤速率为2.88mL/min，管路内径为0.125cm，外径为0.250cm。当过滤体积为201.9mL时，压力检测器显示值超过1bar，停止过滤，收获端体积为178.0mL。
5.2利用1×裂解液(含0.5M NaCl，4mM MgCl2的磷酸盐缓冲液)对管路及滤器进行冲洗，过滤速率为0.87mL/min，收获端累计收获体积232.3mL。取样检测进行收率计算。通过滤器过滤的收率为73.7％。收获体积与初始体积比值为1.15。
通过滤器过滤的方式，虽然能获得较小的收获体积，但其收率远低于通过截留装置所获得的HSV收率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种由细胞培养物中收获细胞产物的方法，包括步骤：采用具有100-1000目的滤网通过切向流模式对细胞培养物进行缓冲液交换，收获穿过所述滤网的含产物的换出液，所述细胞培养物含有用于所述细胞贴壁的微载体，所述细胞分泌所述产物或所述细胞经裂解以释放所述产物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)使用微载体培养细胞，获得含产物、细胞或细胞部分、以及微载体的细胞培养物，
任选的(2)富集微载体，获得微载体浓缩液和第一收获液，
(3)采用具有100-1000目(优选200-500目)的滤网通过切向流模式对步骤(1)获得的细胞培养物或步骤(2)获得的微载体浓缩液进行缓冲液交换，收获穿过所述滤网的含产物的换出液，即第二收获液，
任选的(4)合并第一收获液和第二收获液，获得收获液。
3.一种由细胞培养物中收获细胞的方法，包括步骤：采用具有100-1000目的滤网通过切向流模式对细胞培养物进行缓冲液交换，收获穿过所述滤网的含细胞的换出液，所述细胞培养物含有用于所述细胞贴壁的微载体。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)使用微载体培养细胞，获得含细胞以及微载体的细胞培养物，
任选的(2)富集微载体，获得微载体浓缩液和第一收获液，
(3)采用具有100-1000目(优选200-500目)的滤网通过切向流模式对步骤(1)获得的细胞培养物或步骤(2)获得的微载体浓缩液进行缓冲液交换，收获穿过所述滤网的含细胞的换出液，即第二收获液，
任选的(4)合并第一收获液和第二收获液，获得收获液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：
(1.1)在培养基中于微载体上在适合生产产物的条件下培养细胞，所述细胞分泌所述产物，从而获得所述细胞培养物，或
(1.2)在培养基中于微载体上在适合生产产物的条件下培养细胞，裂解细胞，获得所述细胞培养物，
优选地，
细胞培养物中微载体的浓度为1-20g/L。
6.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：采用具有100-1000目(优选200-500目)的滤网通过切向流模式进行微载体富集，获得微载体浓缩液和穿过所述滤网的含细胞或产物的换出液，即第一收获液，
优选地，
步骤(2)中，切向流模式的液体流速为0.1-20L/min，和/或
所述切向流是交替切向流，和/或
微载体浓缩液中微载体的浓度约为2-40g/L，和/或
第一收获液与微载体浓缩液的体积比为0～20:1。
7.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述方法具有选自以下的一个或多个特征：
所述细胞是贴壁细胞；优选地，所述细胞是真核细胞，
所述产物是病毒或蛋白；优选地，所述病毒包括：单纯疱疹病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、轮状病毒、肠病毒、肝炎病毒，腺病毒，腺相关病毒，慢病毒或其任意组合，
所述微载体包括2D微载体、3D多孔微载体或片状载体，
所述裂解是由裂解剂裂解细胞，或由病毒裂解细胞，
所述裂解剂包含NaCl、MgCl2、磷酸盐缓冲液和核酸酶中的一种或多种。
8.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，收获液体积如下式所示：
V初始-V浓缩后+n×V浓缩后
V初始是指步骤(1)获得的细胞培养物的体积，V浓缩后为微载体浓缩液体体积，n为0-20，
优选地，若存在步骤(2)，并且第一收获液与微载体浓缩液的体积比为0～20:1，则步骤(4)中，当换出液体积为细胞培养物和裂解剂体积之和的1-4倍时停止换液，
优选地，若不存在步骤(2)，则步骤(4)中，当换出液体积为细胞培养物和裂解剂体积之和的1-6倍时停止换液。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，使用截流装置进行步骤(2)和/或步骤(3)，所述截流装置与反应容器流体连通，所述截流装置包括设有入液口和第一出液口的本体，所述本体内设有连接在入液口和第一出液口之间的液流通道，所述液流通道通过设在本体上的滤网与本体分开，所述本体上还设有与滤网和本体之间的区域流体连通的第二出液口，当第二出液口的压力小于液流通道中的压力时，从入液口流入所述装置的来自反应容器的液体穿过所述滤网流入滤网和本体之间的区域并从第二出液口流出，
优选地，
裂解的细胞培养物从入液口进入液流通道，向第二出液口施加负压，含所述产物的换出液从第二出液口流出，
滤网设置为，使得液流通道中液体流动方向与液体穿过滤网的方向垂直，
所述滤网为100-1000目，优选200-500目，或
所述滤网是圆柱形滤网，所述本体是围绕所述滤网的外壳，所述滤网的两端与所述本体密封连接；所述第二出液口是设置在本体外壁上的一个或多个通孔。
10.一种截留装置，所述截流装置通过入液口与反应容器流体连通，所述截流装置包括设有入液口和第一出液口的本体，所述本体内设有连接在入液口和第一出液口之间的液流通道，所述液流通道通过设在本体上的滤网与本体分开，所述本体上还设有与滤网和本体之间的区域流体连通的第二出液口，当第二出液口的压力小于液流通道中的压力时，从入液口流入所述装置的来自反应容器的液体穿过所述滤网流入滤网和本体之间的区域并从第二出液口流出，
优选地，
裂解的细胞培养物从入液口进入液流通道，向第二出液口施加负压，含所述产物的换出液从第二出液口流出，
滤网设置为，使得液流通道中液体流动方向与液体穿过滤网的方向垂直，
所述滤网为100-1000目，优选200-500目，或
所述滤网是圆柱形滤网，所述本体是围绕所述滤网的外壳，所述滤网的两端与所述本体密封连接；所述第二出液口是设置在本体外壁上的一个或多个通孔。
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