CN116121117A - 一种高活性脂肪酶菌株、筛选方法及其酶应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高活性脂肪酶菌株、筛选方法及其酶应用。所述高活性脂肪酶菌株已于2022年10月26日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M 20221663。本发明中高活性脂肪酶菌株HSU‑7在脂肪酶中活性属于较高水平，跟大多数脂肪酶相比HSU‑7具有较高的酶活力的同时也具有较高的耐高温性质，菌株HSU‑7产脂肪酶最适温度和pH值分别是45℃和5.0；K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺对该脂肪酶酶活力有一定促进作用；此外，在1％，15％和30％(v/v)的有机溶剂甲醇和DMSO可稍微使酶活力提高，添加乙醇和异丙醇会略微降低该脂肪酶的酶活力，但仍可使脂肪酶酶活力维持在80％。

Description

一种高活性脂肪酶菌株、筛选方法及其酶应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种高活性脂肪酶菌株、筛选方法及其酶应用。

背景技术

随着社会的不断进步与发展，生活水平的提高，能源问题已经是当今社会发展不可忽视的重要问题。目前可供我们使用的能源有煤炭、天然气、石油等，但被大量使用与消耗的依旧是化石能源。化石能源为不可再生能源其大量使用已造成能源危机，同时CO₂排放量大量增加，大气中CO₂的大量增多导致温室效应与全球变暖是化石能源大量使用造成的重要环境问题。化石能源的不可再生与环境污染问题迫使我们开发高效可再生的清洁能源。

生物柴油是一种新型的可再生清洁能源，可由植物油、动物油、或微生物油脂等非食用性油脂与甲醇或乙醇经酯转化而形成脂肪酸甲酯或乙酯。生物柴油具有原料来源广泛、燃料性能好、可再生和环保等优势。目前，生物柴油主要采用化学法生产，但该方法因其工艺复杂、产品不易回收且能耗较高等问题不被提倡使用，但通过脂肪酶酯交换反应生成生物柴油上述问题则变成优势。大力发展生物柴油对经济可持续发展和减轻环境污染具有重要意义，故利用脂肪酶制备生物柴油具有广阔的市场前景。

脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶隶属于羧基酯水解酶类，可催化甘油三酯分解成甘油二酯、甘油单酯、甘油和脂肪酸等。目前主要应用于食品、生物能源、洗涤剂、制革、医药品和污水处理等行业，是用途最广泛的酶制剂之一，已成为酶工程研究领域的热点和重点。

目前脂肪酶的工业化生产主要利用微生物发酵。产脂肪酶的微生物种类很多，目前已发现有65个种属的微生物可以产生脂肪酶。我国也在20世纪60年代开始开展脂肪酶的研究开发，并于1969年将解脂假丝酵母(Candida lipolytica)发酵生产的脂肪酶制剂供应市场，但到目前为止，只有解脂假丝酵母和扩展青霉(Penicillium expansum)2种菌所产生的脂肪酶实现了工业化生产，与国外尚有一定差距。因此筛选开发脂肪酶活力高、产量高、应用成本低的新型脂肪酶产生菌具有重要的研究意义。

针对上述情况，本发明以松树下腐烂松果附近土壤为原料，采用三丁酸甘油酯平板筛选出一株产脂肪酶菌株HSU-7，并对其酶学性质进行研究。

发明内容

本发明采用橄榄油为唯一碳源的溴钾酚紫培养基从黄山当地松树林中腐烂松果附近采集的土样中筛选到菌株HSU-7，通过形态学及分子生物学方法，鉴定其为产脂肪酶菌株，该菌株产脂肪酶活力高、产量高、应用成本低。

本发明的第一方面是：提供一种高活性脂肪酶菌株，分离自采集于黄山当地松树林腐烂松果附近土壤中；命名为高活性脂肪酶菌株HSU-7，所述高活性脂肪酶菌株已于2022年10月26日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M 20221663。

经过分离纯化后，该高活性脂肪酶菌株在三丁酸甘油酯平板上形成白的菌落，并在菌落周围形成非常明显的透明水解圈；水解圈直径(D)为36.0mm，高活性脂肪酶菌株HSU-7菌落直径(d)为10.0mm，水解圈直径(D)与菌落直径(d)比值为3.60。同时，观察发现高活性脂肪酶菌株HSU-7在三丁酸甘油酯平板上形成的菌落呈不规则的圆形，菌落整体上较为干燥。

进一步地，所述高活性脂肪酶菌株的分离方法包括：采取土样，溶于无菌水中，静置后吸取备用；取样后在富集培养基上进行恒温富集培养，吸取50-200μL涂布于三丁酸甘油酯平板上恒温培养，采用NaOH滴定法进一步筛选与确定其酶活力大小。

进一步地，所述富集培养基包括酵母浸膏2g、(NH₄)₂SO₄ 2g、NaCl 1.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、K₂HPO₄ 5g、橄榄油乳化液12mL、水1000mL。

进一步地，所述橄榄油乳化液配制方法包括：配置2％聚乙烯醇溶液；取2.0g聚乙烯醇边搅拌边加入蒸馏水中，可加热溶解，冷却后定容100mL；橄榄油与聚乙烯醇溶液1:3的体积比混合，在组织混匀器上乳化20到25min，即可得到橄榄油乳化液。

进一步地，所述三丁酸甘油酯平板包括蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、三丁酸甘油酯2mL、琼脂20g、水100mL。

本发明的第二方面是：

本发明采取平板划线法得到高活性脂肪酶菌株HSU-7单菌落，利用通用引物进行16S rRNA扩增，构建系统进化树，明确该菌株的分类地位。

其中，高活性脂肪酶菌株的16S rRNA基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三方面是：提供所述高活性脂肪酶菌株的应用，包括以下应用：

作为洗涤剂用脂肪酶的应用；

作为制革工业用脂肪酶的应用；

作为造纸工业用脂肪酶的应用；

作为纺织工业用脂肪酶的应用；

作为食品工业用脂肪酶的应用；

作为制药工业用脂肪酶的应用；

作为化工工业用脂肪酶的应用。

本发明的优点在于：

(1)本发明高活性脂肪酶菌株在最适温度45℃和最适pH值下，发酵天数达到五天时酶活力达到最大值，为72.22U·mL-1；张传丽等筛选得到菌株TZ-1，在最佳产酶条件下的酶活性为22.7U·mL-1(张传丽,孙会刚,崔珏,陈学红,高兆建,唐兆成,李同祥.高产脂肪酶菌株的筛选及其酶学性质分析[J].食品科技,2019,44(11):30-35)；谢康庄等得到酶活力最高的菌株M18酶活为11.0U·mL-1(谢康庄,颜道民,郑旭,任海姣,侯爱香.湘西腊肉中高产脂肪酶真菌的筛选[J].轻工科技,2019,35(4):1-4)；马抒晗等从各地采取了70份样品，大部分初筛菌株所产脂肪酶酶活很低,均小于10U·mL-1,部分甚至小于1U·mL-1(马抒晗,张玮佳,吴茜,姜腾飞,乔代蓉,曹毅.高产脂肪酶菌株的筛选鉴定及酶学、转酯特性[J].应用与环境生物学报,2014,20(4):602-608.)。综上所述，本发明高活性脂肪酶菌株HSU-7在脂肪酶中活性属于较高水平。

(2)本发明中菌株HSU-7产脂肪酶具有较好的耐高温性质。在35、45、55℃处理1h和2h时相对酶活力无明显的变化，当温度为65℃处理2h酶活力仍保持在75％左右，75℃下相对酶活力达到30％。而桑鹏等提取的脂肪酶在55℃条件下处理两小时酶活为初始酶活的60％左右(桑鹏,刘林波,陈贵元,杨力权.大理弥渡热泉耐热脂肪酶产生菌的筛选及其酶活性研究[J].中国饲料,2020(3):27-31.)；马抒晗等筛选的菌株在4℃、50℃及60℃下，2h内酶活较为稳定，可保持在初始酶活的85％以上，而在70℃下，脂肪酶相对不稳定，2h降低到20％；张传丽等筛选得到菌株TZ-1在60℃时，脂肪酶热稳定性有较大幅度降低，2h内剩余酶活仅为初始酶活的62％。所以，跟大多数脂肪酶相比菌株HSU-7产脂肪酶具有较高的酶活力的同时也具有较好的耐高温性质。

(3)酶活力测定结果显示菌株HSU-7产脂肪酶最适温度和pH值分别是45℃和5.0；Cu²⁺、Ni⁺和Fe³⁺、Zn²⁺离子对该脂肪酶活力有明显的降低，说明该脂肪酶对这些离子不耐受，而K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺对该脂肪酶酶活力有一定促进作用；此外，在1％，15％和30％(v/v)的有机溶剂甲醇和DMSO可稍微使酶活力提高，添加乙醇和异丙醇会略微降低该脂肪酶的酶活力，但仍可使脂肪酶酶活力维持在80％。但当添加Triton X-100时，浓度为1％时相对酶活力大于80％，该脂肪酶在此浓度下比较耐受，但是在15％和30％时相对酶活力明显降低，则说明在此浓度下脂肪酶不耐受。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为高活性脂肪酶菌株HSU–7菌落形态；

图2为不同温度对脂肪酶活力的影响对比图；

图3为不同pH值对脂肪酶酶活力的影响对比图；

图4为不同发酵天数对脂肪酶酶活力的影响对比图；

图5为不同金属离子对脂肪酶酶活力的影响对比图；

图6为不同有机溶剂对脂肪酶酶活力的影响对比图；

图7为不同高温对脂肪酶酶活的影响对比图；

图8为基于菌株HSU-7 16S rRNA序列构建系统进化树。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

本发明提供的一种高活性脂肪酶菌株，其分离自黄山学院黄山松树林中腐烂松果处，刮去表层1-2cm浮土后采取收集土样，装于提前灭菌的铝盒中带回实验室备用。

本发明中所使用的主要仪器包括：超净工作台(ZHJH-C2109B型，上海智城分析仪器公司)、恒温培养箱(ZGP-2050，上海智城分析仪器公司)、高压蒸汽灭菌锅(SQ510C，重庆雅马拓科技有限公司)、高速冷冻离心机(AvantiJ-E型，美国贝克库尔特公司)、振荡培养箱(MQD-B2R型，上海旻泉仪器有限公司)、三孔恒温电热水槽(DK-8D型，上海匡贝实业)、紫外可见分光光度计(UV-765型，上海精密科学仪器公司)、电子天平(AE224，上海恒平科学仪器有限公司)。

本发明中所使用的实验试剂包括：棕榈酸对硝基苯酯、对硝基苯酚、三丁酸甘油酯购自上海阿拉丁试剂有限公司；(NH₄)₂SO₄、MgSO₄·7H₂O、K₂HPO₄、KCl、Fe₂(SO₄)₃、ZnCl₂、NiCl₂·6H₂O、CuCl₂、CaCl₂、MnCl₂、蔗糖、甲醇、乙醇、异丙醇、聚乙烯醇等购自上海国药集团化学试剂有限公司。橄榄油、盐酸、蛋白胨、琼脂、Triston X-100购自上海生工生物工程有限公司。氨基丁三醇(Solarbio公司)；阿拉伯树胶粉(天津北辰生物科技有限公司)；溴甲酚紫(天津光复试剂有限公司)。

其中，

富集培养基：酵母浸膏2g、(NH4)₂SO₄ 2g、NaCl 1.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、K₂HPO₄5g、橄榄油乳化液12mL、水1000mL。

三丁酸甘油酯平板：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、三丁酸甘油酯2mL、琼脂20g、水100mL。

发酵培养基：(NH₄)₂SO₄ 1g、MgSO₄·7H₂O 1g、K₂HPO₄ 1g、蔗糖5g、橄榄油5mL、蛋白胨30g、水1000mL、pH值自然。

橄榄油乳化液配制：配置2％聚乙烯醇溶液；取2.0g聚乙烯醇边搅拌边加入蒸馏水中，可加热溶解，冷却后定容100mL；橄榄油与聚乙烯醇溶液1:3的体积比混合，在组织混匀器上乳化20到25min，即可得到橄榄油乳化液，现配现用。

本发明利用对硝基苯酚法用于酶活测定实验，该方法步骤包括：准确配制1mmol·L^-1的标准对硝基苯酚溶液，取9支干净试管标好序号，根据表1按序号依次加入异丙醇、标准对硝基苯酚溶液和tris-Hcl缓冲液混匀室温反应20min，后置于沸水浴中煮沸10min，冷却至室温后定容至5mL，用紫外分光光度计于410nm处测定溶液的吸光度，重复3次并绘制对硝基苯酚标准曲线。多次试验测得对硝基苯酚浓度(X)与其吸光值(Y)的回归方程为：Y＝0.0155X+0.0123(R²＝0.9999)，线性关系较好，可以用于后续的酶活测定实验。

表1

序号	1	2	3	4	5	6	7	8	9
										异丙醇/mL	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
对硝基苯酚/μL	0	100	150	200	250	300	350	400	500
										缓冲液/mL	2.26	2.16	2.11	2.06	2.01	1.96	1.91	1.86	1.76
水/mL	2.49	2.49	2.49	2.49	2.49	2.49	2.49	2.49	2.49

实施例1

1、高活性脂肪酶菌株HSU-7的分离与纯化

(1)初筛菌种的制备：将采集的土样称取5g溶于45mL无菌水中1:10稀释，用无菌玻璃棒充分搅拌混匀；静置1h后，吸取10mL溶液保存于15mL无菌试管中作原始菌种样本。

(2)高活性脂肪酶菌株HSU-7的分离与纯化：从上述所得的原始菌种样本中抽取5mL加入到装有50mL富集培养基的三角瓶中，在37℃振荡培养箱中180r·min^-1温富集培养72h。取上述富集液用无菌水分别稀释至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7。分别吸取100μL涂布于三丁酸甘油酯平板上，倒置于37℃恒温培养箱中恒温培养2～3d。观察三丁酸甘油酯平板周围是否出现透明水解圈。分别测量菌落直径(d)和水解圈直径(D)，然后采用NaOH滴定法进一步筛选与确定其酶活力大小。采用平板划线法对筛选出的菌株进行进一步纯化，当纯化出稳定的单菌落时，将其编号并保存备用。

其中NaOH滴定法步骤包括：取用体积比为3％的聚乙二醇溶液制备含100g·L-1的橄榄油乳化液；取该底物乳化液5mL，加入4mL 0.025mol·L-1的磷酸缓冲液组成反应体系，置于40℃水浴中保温5min，加入1mL发酵上清粗酶液开始精确计时，继续保温15min后取出，立即加入95％的乙醇15mL终止酶反应，以加入高温灭活酶液为对照；将酶促反应后的底物与对照分别加入15mL蒸馏水稀释，并加入3滴酚酞指示剂，用0.05mol·L-1的NaOH溶液滴定水解产生的游离脂肪酸，根据两者耗碱量的差值计算酶活大小。

2、形态学观察：

采用橄榄油作为唯一碳源，利用三丁酸甘油酯平板从黄山松树林中腐烂松果处的土壤中筛选到一种高活性脂肪酶菌株HSU-7，如图1所示。由图1结果可知，高活性脂肪酶菌株HSU-7在三丁酸甘油酯平板上形成白的菌落，并在菌落周围形成非常明显的途明水解圈；水解圈直径(D)为36.0mm，高活性脂肪酶菌株HSU-7菌落直径(d)为10.0mm，水解圈直径(D)与菌落直径(d)比值为3.60。同时，观察发现高活性脂肪酶菌株HSU-7在三丁酸甘油酯平板上形成的菌落呈不规则的圆形，菌落整体上较为干燥。

3、对该种高活性脂肪酶菌株HSU-7的菌株进行测定：

选取D/d比值大的菌株之一HSU-7菌株观察其菌落特征，并用试剂盒提取其基因组DNA；采用通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′及1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′扩增该菌株的16S rDNA序列并送至上海生工生物工程有限公司测序。对测序的结果进行分析和拼接，并将拼接后的16S rDNA序列置于NCBI数据库进行比对分析。从比对结果中选取序列一致性较高的序列，利用软件Clustal X 2.1和MEGA6.06构建该菌株的分子进化树，鉴定菌株HSU-7的种类。

利用分子系统学分析，获得高活性脂肪酶菌株HSU-7的16S rRNA序列，构建系统进化树如图8所示，发现该菌株与Burkholderia cepacia、Burkholderia aenigmatica和Burkholderia territorii位于同一分支。因此，进一步确定该菌株为伯克氏菌属Burkholderia sp.，命名为Burkholderia sp.HSU–3。

高活性脂肪酶菌株的16S rRNA基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2

1、高活性脂肪酶粗酶液制备

从-80℃的冰箱中取出保存的菌株HSU-7，划线于三丁酸甘油酯平板上复苏。然后从复苏的菌株中选取单克隆菌落接种于发酵培养基中，于28℃恒温振荡培养箱中180r·min^-1恒温发酵两天。发酵后培养液于4℃高速冷冻离心机中12000r·min^-1离心10min，所获得上清液即为该脂肪酶的粗酶液。

2、脂肪酶最佳反应温度测定：

采用对硝基苯酚法，用天平准确称取3mg对硝基苯酚棕榈酸酯于烧杯中，加入10mL异丙醇搅拌至完全溶解转移至棕色试剂瓶中于4℃下保存作为反应底物溶液。取6支干净的试管，分别加入2.25mL pH值8.0加入了Triston X-100的Tris-Hcl缓冲液和0.25mL上述底物溶液混匀后室温反应20min，然后向其中加入0.01mL粗酶液混合均匀，并分别置于25、35、45、55、65和75℃水浴锅中恒温反应15min，然后在沸水中水浴10min终止反应。冷却至室温后定容至5mL，用紫外分光光度计于波长410nm下测定溶液的吸光值，重复三次。同时，以煮沸失活的粗酶液作为对照组，在相同情况下测定对照组溶液的吸光值，分别计算该脂肪酶的酶活力。

其中，酶活是指在一定条件下每毫升粗酶液，每分钟分解对硝基苯酚棕榈酸酯产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量。

采用对硝基苯酚棕榈酸酯为底物，测定菌株HSU-7产生的脂肪酶在不同温度下该脂肪酶酶活力如图2所示，从实验结果可知，温度在25～45℃时，该脂肪酶的酶活力随反应温度的升高而升高；在45℃时，该脂肪酶酶活力最大，为42.55U·mL^-1。而当反应温度继续升高至55～75℃，酶活力迅速降低至35.86、21.99、13.94U·mL^-1。因此，45℃时为该脂肪酶的最适反应温度。

3、脂肪酶最佳反应pH测定：

在温度为45℃时，利用对硝基苯酚法(江慧芳,王雅琴,刘春国.三种脂肪酶活力测定方法的比较及改进[J].化学与生物工程,2007(8):72-75.)测定该脂肪酶在pH值4、5、6、7和8条件下的酶活力。

在上述最适温度45℃下，测定菌株HSU-7产生的脂肪酶在不同pH下的酶活力如图3所示。

从实验结果可知，菌株HSU-7产生的脂肪酶在pH值为5是酶活力最大，为54.48U·mL-1；当pH减小到4是酶活力迅速减小到18.41U·mL-1；当pH值增加到7和8是酶活力迅速减小到45.74U·mL-1和42.60U·mL-1。

因此上述结果表明，pH值为5和6时该脂肪酶酶活力相对稳定，且pH值为5为最适pH。

4、脂肪酶的最佳发酵天数

在温度为45℃时，pH为5时，利用对硝基苯酚法测定该脂肪酶在发酵培养基中于恒温振荡培养箱中培养1、2、3、4、5和6天条件下的酶活力。

在上述最适温度45℃和最适pH下，测定菌株HSU-7在发酵培养基中发酵不同天数脂肪酶酶活力如图4所示。

从实验结果知，在发酵天数1～5d时，该脂肪酶的酶活力随发酵天数的增加而升高；在发酵天数达到五天时酶活力达到最大值，为72.22U·mL^-1。而当发酵天数达到6d时，该脂肪酶活力迅速减小，为62.81U·mL^-1。

因此，发酵天数5d为该脂肪酶最佳发酵天数。

5、不同金属离子对脂肪酶酶活的影响

准确配制浓度为1mmol·L-1的KCl、MnCl、ZnCl₂、CaCl₂和HgCl₂等金属离子溶液，取干净大试管分别向各支试管加入对应金属离子溶液5mL和0.1mL粗酶液混合均匀后每支试管分装0.51mL(对照组加灭活酶液，试验组加粗酶液)于45℃水浴锅中预处理30min，向反应液中加入上述金属离子处理，利用对硝基苯酚法比较不同金属离子对该脂肪酶酶活的影响。

在最适pH 5.0、最适反应温度45℃和最加发酵天数5d时的脂肪酶活力为100％，测定金属离子Cu²⁺、K⁺、Mn²⁺、Ni⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等对该脂肪酶活力的影响，对比图如图5所示)。

由实验结果知，Cu²⁺、Ni⁺和Fe³⁺、Zn²⁺离子对该脂肪酶活力有明显的降低，使其酶活力分别降至61.74％、88.73％、9.93％和25.63％；Mn²⁺对该脂肪酶酶活力的影响不大，使其酶活力基本稳定在99.65％以上；而K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺对该脂肪酶酶活力有一定促进作用，使其酶活力提升至107.82％以上。

6、不同有机溶剂对脂肪酶酶活的影响

准确配制浓度为1％、15％和30％(v/v)的Triton X-100、甲醇、乙醇、二甲基亚砜和异丙醇，取干净大试管分别向各支试管加入对应金属离子溶液5mL和0.1mL粗酶液混合均匀后每支试管分装0.51mL(对照组加灭活酶液，试验组加粗酶液)于45℃水浴锅中预处理30min，向反应液中加入上述有机溶剂处理，利用对硝基苯酚法比较不同有机溶剂对该脂肪酶酶活的影响。

在最适pH 5.0、最适反应温度45℃和最加发酵天数5d时的脂肪酶活力为100％，测定添加1％、15％和30％(v/v)不同浓度和有机溶剂对该脂肪酶活力的影响，对比图如图6所示。

由图可知，添加甲醇和DMSO对酶活的影响不大，基本保持不变；添加乙醇和异丙醇会略微降低该脂肪酶的酶活力，但仍可使脂肪酶酶活力维持在80％以上；则说明该脂肪酶对此有机溶剂有一定的耐受力。但当添加Triton X-100时，浓度为1％时相对酶活力大于80％，该脂肪酶在此浓度下比较耐受，但是在15％和30％时相对酶活力明显降低，则说明在此浓度下脂肪酶不耐受。

7、高温对脂肪酶酶活的影响

将酶液至于不同的温度，0、35、45、55、65和75℃下分别保存1h和2h，以0℃作为对照组，利用对硝基苯酚法比较酶液在不同温度保存下对该脂肪酶酶活的影响。

以温度为0℃的条件下的酶活力为100％，分别测定该脂肪酶在35、45、55、65和75℃处理1h和2h对酶活力的影响，结果如图7所示。由图可知，在35、45、55℃处理1h和2h时，相对酶活力无明显的变化则说明该脂肪酶在这些温度下耐受。当温度达到65℃时，相对酶活力保持在75％左右，相对酶活力降低，但仍具有一定的耐受性。当温度增加到75℃时，相对酶活力只有30％左右，酶活力大幅降低。由结果可知该脂肪酶为耐热脂肪酶。

本发明采用三丁酸甘油酯平板从黄山松树树下腐烂松果附近土壤中筛选出一株耐热和耐酸的脂肪酶菌株HSU-7，其产生脂肪酶的最佳发酵天数、温度和pH值分别是5d、45℃和5.0，是一种耐热和耐酸的脂肪酶；其在最适条件下酶活可高达72.22U·mL^-1。同时，该脂肪酶对温度、pH、金属离子和有机溶剂都具有不同程度的耐受性

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (8)

1.一种高活性脂肪酶菌株，其特征在于，所述高活性脂肪酶菌株已于2022年10月26日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M20221663。

2.根据权利要求1所述的高活性脂肪酶菌株，其特征在于，所述高活性脂肪酶菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的高活性脂肪酶菌株，其特征在于，所述高活性脂肪酶菌株的分离方法包括：采取土样，溶于无菌水中，静置后吸取备用；取样后在富集培养基上进行恒温富集培养，吸取50-200μL涂布于三丁酸甘油酯平板上恒温培养，采用NaOH滴定法进一步筛选与确定其酶活力大小。

4.根据权利要求3所述的高活性脂肪酶菌株，其特征在于，所述富集培养基包括酵母浸膏2g、(NH₄)₂SO₄ 2g、NaCl 1.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、K₂HPO₄ 5g、橄榄油乳化液12mL、水1000mL。

5.根据权利要求4所述的高活性脂肪酶菌株，其特征在于，所述橄榄油乳化液配制方法包括：配置2％聚乙烯醇溶液；取2.0g聚乙烯醇边搅拌边加入蒸馏水中，可加热溶解，冷却后定容100mL；橄榄油与聚乙烯醇溶液1:3的体积比混合，在组织混匀器上乳化20到25min，即可得到橄榄油乳化液。

6.根据权利要求3所述的高活性脂肪酶菌株，其特征在于，所述三丁酸甘油酯平板包括蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、三丁酸甘油酯2mL、琼脂20g、水100mL。

7.如权利要求1所述的高活性脂肪酶菌株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：采取平板划线法得到高活性脂肪酶菌株HSU-7单菌落，利用通用引物进行16S rRNA扩增，构建系统进化树，明确该菌株的分类地位。

8.如权利要求1所述的高活性脂肪酶菌株的应用，其特征在于，包括以下应用：

作为洗涤剂用脂肪酶的应用；

作为制革工业用脂肪酶的应用；

作为造纸工业用脂肪酶的应用；

作为纺织工业用脂肪酶的应用；

作为食品工业用脂肪酶的应用；

作为制药工业用脂肪酶的应用；

作为化工工业用脂肪酶的应用。

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