CN116121105A

CN116121105A - 一株兼具生防和促生功能的耐盐碱贝莱斯芽孢杆菌ys-at-ds1及其应用

Info

Publication number: CN116121105A
Application number: CN202211163601.5A
Authority: CN
Inventors: 于镇华; 喻江; 胡岩峰; 李彦生; 王新珍; 龙永; 毛梦凡
Original assignee: Agricultural Science Center Of Northeast Institute Of Geography And Agricultural Ecology Of Chinese Academy Of Sciences
Current assignee: Agricultural Science Center Of Northeast Institute Of Geography And Agricultural Ecology Of Chinese Academy Of Sciences
Priority date: 2022-09-23
Filing date: 2022-09-23
Publication date: 2023-05-16

Abstract

本发明公开了本发明所述的耐盐碱生防促生细菌Bacillus velezensis YS‑AT‑DS1能够抵抗以立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)为代表的一类病原菌；可通过激活番茄SITIPs基因，缓解南方根结线虫对TIP1.1、TIP1.2、TIP1.3表达的抑制作用，进而抑制南方根结线虫的侵染和发育；同时，该菌可分泌生长素，促进小麦和大豆发芽，以及拟南芥和番茄生长。

Description

一株兼具生防和促生功能的耐盐碱贝莱斯芽孢杆菌YS-AT-DS1及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株兼具生防和促生功能的耐盐碱贝莱斯芽孢杆菌YS-AT-DS1及其应用。

背景技术

植物病虫害严重影响着作物产量，长期以来化学农药是植物病虫害防治的主要方式，但长期不合理的化学农药施用威胁生态环境稳定。因此，生物防治得到了越来越广泛的关注。

芽孢杆菌属由于其特有的产孢子特性，在细菌不死亡的情况下孢子可以完成向粉剂转换，相比其它生防细菌具有明显的优势。目前应用较多的芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等。

东北黑土区是我国粮食生产重要地区之一，但是土壤盐碱化问题十分严重，而目前分离获得的芽孢杆菌菌株可适宜于高盐高碱条件下的较少，限制了其在东北黑土区的应用。

TIP(Tonoplast intrinsic proteins)是一类定位于植物液泡膜上的水通道蛋白，属于aquaporin水通道蛋白亚家族成员，主要负责水、小分子量中性溶质等分子的跨膜运输，并且在植物响应生物胁迫和非生物胁迫过程中发挥重要作用。有研究发现，通过抑制植物TIPs基因表达来控制水分运输有利于植物寄生线虫的侵染和发育，拟南芥TIP基因突变体增加了对植物寄生线虫的敏感性(Baranowski et al.2019)，说明TIPs基因正向调控寄主对植物寄生线虫的抗性。目前尚未发现有贝莱斯芽孢杆菌对植物中TIPs基因具有激活作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)YS-AT-DS1及其应用，不仅补充了现有适用于盐碱地生防芽孢杆菌菌种资源，同时也发现该菌株可对多种作物生长具有促进作用。

一株兼具生防和促生功能的耐盐碱贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis YS-AT-DS1，该菌具有较强的耐盐、耐碱特性，其生长耐受的NaCl浓度＞9％(w/v)，能耐受的pH值为8.0～12.5，同时还兼有广谱抗菌活性，可拮抗立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)，对南方根结线虫(Meloidogyne incognita)具有防控作用，并且在L-色氨酸诱导下具有分泌IAA能力，可促进植物生长。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一株从中国山东省东营市滩涂中分离获得的耐盐碱生防促生细菌贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis YS-AT-DS1，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉，保藏日期：2021年3月23日，保藏编号CCTCC NO:M2021239。

所述的耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1，其菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，略凸起，乳白色。

所述的耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1，其16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示，该菌系统分类属于Bacillus velezensis属。

所述的耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1，其生长耐受的NaCl浓度＞9％(w/v)，能耐受的pH为8.0～12.5。

所述的耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1，具有广谱抗菌活性，可拮抗立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)，PDA培养基培养抑菌半径分别为1.04±0.18cm、1.70±0.20cm和1.04±0.15cm。

本发明的另一目的在于可为制备缓解植物盐碱胁迫和促进植物生长的微生物菌剂或生物肥料提供候选菌株(耐盐碱生防促生细菌贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisYS-AT-DS1)，该菌可促进盐碱胁迫下大豆种子萌发，且可促进盐碱胁迫下拟南芥生长和大豆生长。

所述的耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1，在L-色氨酸诱导下分泌IAA能力可达到3.07μg·mL^-1；

所述的耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1，可促进小麦种子胚芽鞘增长196.76％，胚芽鞘增粗19.48％，根长增加53.30％，种子鲜重增加2％；

所述的耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1，可促进拟南芥在碱性条件下生长；

所述的耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1，可促进大豆种子在高盐碱浓度下发芽，提高大豆苗期地上生物量；

所述的耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1，可促进番茄株高、根鲜重和茎鲜重分别增加22.68％，50％和59.31％。

所述的耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1，对南方根结线虫(Meloidogyneincognita)二龄幼虫J2的致死率可达71.62％，根结数减少32.14％。

所述的耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1，对番茄SITIP1.1、SITIP1.2和SITIP1.3基因表达具有显著诱导作用，能够缓解南方根结线虫对SITIP1.1和SITIP1.3表达的抑制作用。

本发明的优点和有益效果为：

本发明所述的耐盐碱生防促生细菌Bacillus velezensis YS-AT-DS1能够抵抗以立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)为代表的一类病原菌；可通过激活番茄SITIPs基因，缓解南方根结线虫对TIP1.1、TIP1.2、TIP1.3表达的抑制作用，进而抑制南方根结线虫的侵染和发育；同时，该菌可分泌生长素，促进小麦和大豆发芽，以及拟南芥和番茄生长。因此，相比其它已报道的菌株，本发明所述的耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1一方面可兼具生防和促生的双重作用，有利于一菌多用，为制备微生物生防菌剂或促生菌肥或促生菌剂的应用提供菌种资源和技术支撑，缓解化学肥料过剩施用的环境危害；另一方面该菌具有盐碱环境适应性，不仅可适用于含盐量＞9％(w/v)的高盐土壤，还可适用于pH值8.0～12.5的重度碱地，具有一定的降碱能力，便于推广应用，可用于盐碱地改良的微生物制剂，为盐碱地综合利用提供安全有效的微生物资源。

附图说明

图1(a)是本发明耐盐碱生防促生细菌Bacillus velezensis YS-AT-DS1在LB培养基上的菌落生长观察图；图1(b)为在透射电镜(TEM)下观察到的菌株形态；

图2是本发明耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1的16S rDNA系统发育树；

图3是本发明耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1的不同NaCl浓度下生长曲线；

图4是本发明耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1的不同pH条件下生长曲线；

图5是本发明耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1的降碱率曲线；

图6是本发明耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1对不同植物病原菌拮抗效果图，其中

a：立枯丝核菌R.solani，b：燕麦镰刀菌F.avenaceum，c：禾谷镰刀菌F.graminearum；

图7是本发明耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1促进小麦种子萌发观察图；

图8是本发明耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1促进盐碱条件下大豆种子萌发观察图；

图9是本发明耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1促进盐碱条件下拟南芥(A)、大豆(B)和番茄(C)生长观察图。

图10本发明耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1对南方根结线虫(Meloidogyneincognita)二龄幼虫J2致死率(A)、死亡率表型(B)和根结数(C)的影响

图11本发明耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1对番茄SITIP1.1、SITIP1.2和SITIP1.3基因的诱导表达作用(A)、耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1缓解根结线虫对番茄TIP基因表达的抑制作用(B)。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

保藏信息

贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis YS-AT-DS1，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉，保藏日期：2021年3月23日，保藏编号CCTCC NO:M2021239。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例一：

耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1的分离纯化

样品来源：中国山东省东营市滩涂

LB培养基(固体):胰蛋白胨10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，琼脂15g，H₂O1000mL，pH 7.0～7.2，121℃灭菌30min。

LB培养基(液体):胰蛋白胨10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，H₂O 1000mL，pH7.0～7.2，121℃灭菌30min。

分离和纯化步骤：采集山东省东营市滩涂土壤，取5g供试土壤加入装有45mL无菌水的锥形瓶中，同时加入灭菌玻璃珠便于土壤颗粒在震荡过程中能更好地散开，使微生物充分分散于无菌水中，摇床振荡30min(28℃，180rpm·min^-1)。振荡结束后进行逐级梯度稀释至10^–6，选取上述各浓度梯度菌悬液100μL涂布于NaCl浓度为9％的LB固体培养基中用于细菌菌株分离。将平板倒置放入28℃恒温培养箱中培养48～72h后，从分离获得的多株菌株中选取菌落形态、颜色、粘稠度以及大小不同的菌株，反复挑取单一菌落划线培养，分别继代培养4～5代，即可得到纯的、形态一致的单菌落。

实施例二：

耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1的鉴定

(1)生物学鉴定

耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1在LB固体培养基平板上菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，略凸起，乳白色(见图1a)。

(2)系统分类鉴定

采用菌落PCR鉴定方法，用接种环挑取盐碱促生细菌YS-AT-DS1在LB固体培养基平板上菌落于15μL无菌水中，12000rpm离心5min，弃上清，再用15μL无菌水悬浮，重复一次，95℃水浴5min，置于冰上，以处理后菌悬液为PCR鉴定模板，用细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGCTACCTTGTTACGACT T-3')扩增得到目的基因片段。PCR反应体系采用10μL体系，体系如下：27F和1492R引物(50pmol)各0.1μL、YS-AT-DS1菌悬液0.3μL、dNTP(2.5mM TaKaRa)1μL、rTaq buffer(TaKaRa)1μL、rTaq聚合酶(5U·μL^-1，TaKaRa)0.3μL、无菌水7.2μL，以不加菌悬液为对照。扩增条件为：94℃ 3min，94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1min(28个循环)，72℃ 5min，将PCR产物提交生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序所得菌株YS-AT-DS1的16S rDNA如序列表SEQ NO.1所述。

将得到的测序序列与GenBank中的核酸数据进行BLAST(National Center forBiotechnology Information[http://www.ncbi.nlm/nih.gov])同源性比对，结果显示，菌株YS-AT-DS1与Bacillus velezensis CR502同源性为100，用软件MOLECULAREVOLUTIONARY GENETIC ANALYSIS software(MEGA 11.0)构建系统进化树。结果如图2所示，菌株YS-AT-DS1与Bacillus velezensis序列可构成稳定的进化分支，与Bacillusvelezensis CR-502同源性为100％；

实施例三：

耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1耐盐、耐碱能力评价

(1)耐盐能力评价

在含有0、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％(w/v)NaCl的LB培养基中接种种子菌液，1％接种量，30℃振荡培养48h，测定光吸收值(OD₆₀₀)，绘制生长曲线(见图3)。不同NaCl浓度培养基不接种菌液为对照组。结果显示菌株YS-AT-DS1在NaCl浓度0％～9％(w/v)的LB培养基中均可生长。

(2)耐碱能力评价

设定以下pH梯度：8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0，用1N NaOH或1N HCl调节pH值，1％接种量，30℃振荡培养48h，测定光吸收值(OD₆₀₀)，绘制生长曲线(图4)，不同pH梯度培养基不接种菌液为对照组。结果显示菌株YS-AT-DS1在pH值8.0～12.5的范围内可生长。

(3)降碱能力测定

将保存菌株活化后以5％接种量接入到pH8.5～11.5的LB液体培养基中，48h后观察菌株生长情况并测定发酵后菌液pH值，计算如下：η＝(pH前－pH后)/pH前*100％；

式中：η为菌株降碱能力，pH前为菌株发酵前培养基的pH值；pH后为菌株发酵后培养基的pH值，以百分比为纵坐标绘制菌株降碱率曲线，如图5所示。

实施例四：

耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1生防能力鉴定

采用对峙培养法，测定耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和燕麦镰刀菌(Fusariumavenaceum)的抑菌能力。将病原菌0.5cm菌饼接于PDA培养基平板中央，等距离三点接种耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1菌悬液5μL，3次重复，以无菌水为对照，28℃恒温培养，待对照病原菌长满平板时，测定抑菌圈半径(cm)。耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1对Rhizoctoniasolani、Fusarium graminearum和Fusarium avenaceum的抑菌半径分别为1.04±0.18cm、1.70±0.20cm和1.04±0.15cm。平板对峙实验结果如图6。

实施例五：

耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1分泌IAA能力定性测定

Salkowski比色反应剂：0.5M的FeCl₃溶液，取0.811g的FeCl₃溶在10mL纯水中；35％HClO₄溶液，取出70％HClO₄ 25mL加水至50mL。取1mL 0.5M的FeCl₃溶液，加上49mL的35％HClO₄溶液。

Salkowski比色IAA母液：取0.1g IAA粉末加入50mL 50％的乙醇；将混合好的母液取5mL，加入95mL 50％乙醇，得到100μg·mL^-1的IAA标准液；取100μg·mL^-1的IAA标准液配置1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90的IAA标准液；取50％乙醇充当0μg·mL^-1标准液。测定各浓度标准液的吸光值，作标准曲线。

采用改良Salkowski比色法测定耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1分泌IAA能力。先用接种环挑取斜面保存分离菌株于40μL无菌水中，涡旋混匀，即为耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1菌悬液，取菌悬液10μL于含色氨酸LB液体培养基1.5mL的离心管中(100μg·mL^-1色氨酸)，每个离心管含有1mL培养基，重复3次，取1mL无菌水加入色氨酸LB液体培养基中为对照，置于30℃摇床，180rpm振荡培养3d。培养后将菌悬液10000rpm离心10min，取上清液100μL加入酶标板中，再加入200μL Salkowski比色液，避光静置反应35min，测定其OD₄₉₀值。利用吸光值线性公式计算耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1可分泌IAA3.07μg·mL^-1。

实施例六：

耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1促进小麦种子萌发

将YS-AT-DS1菌株接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养24h后，4℃离心收集菌体，用无菌水洗涤2次后重悬于无菌水中，在600nm处用无菌水调整菌悬液为1.0，小麦种子70％酒精消毒10min后，用无菌水冲洗5次。室温下，将种子浸于菌悬液中过夜，置于含无菌水湿润的滤纸培养皿中，以无菌水浸泡小麦种子过夜为对照，28℃恒温培养7d后，结果显示，菌株YS-AT-DS1具有促小麦种子萌发作用，促进小麦种子胚芽鞘增长196.76％，胚芽鞘增粗19.48％，根长增加53.30％，种子鲜重增加2％。(见附图7)。

实施例七：

耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1大豆早期幼苗在盐碱胁迫条件下生长

将YS-AT-DS1菌株接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养24h后，4℃离心收集菌体，用无菌水洗涤2次后重悬于无菌水中，在600nm处用无菌水调整菌悬液为1.0，大豆种子用70％酒精消毒10min后，用无菌水冲洗5次。室温下，将种子浸于菌悬液24小时，以无菌水浸泡24小时的大豆种子为对照，将种子置于不同盐碱浓度梯度条件下于28℃恒温培养5天后，结果显示，菌株YS-AT-DS1具有促进大豆种子萌发作用，如附图8所示YS-AT-DS1在不同盐碱条件下对大豆早期幼苗生长的促生效果图。图中，每个pH/盐胁迫条件下左侧为不接菌处理，右侧为用1OD的YS-AT-DS1菌液浸种处理。

实施例八：

(1)耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1促进拟南芥在碱性条件下生长

将YS-AT-DS1菌株接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养24h后，获得菌悬液。在pH9.5，1/2MS固体平板中一侧先接种拟南芥种子，4℃放置3d后，于另一侧接种10μL菌悬液，30℃光照培养箱观察7d。如附图9A所示接种YS-AT-DS1的拟南芥在pH 9.5的MS培养基中培养7天后的表型。结果显示，菌株YS-AT-DS1可促进拟南芥生长。

(2)耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1促进大豆生长

将YS-AT-DS1菌株接种于LB液体培养基中，28℃振荡培养48h后，获得菌悬液。将菌悬液离心，向其中加入无菌水，在OD₆₀₀条件下，制成OD₆₀₀≈1的菌悬液，用该菌悬液浸泡大豆种子过夜，同时，以无菌水浸泡种子作为对照，第二天将对照种子和用菌液浸泡的种子播种在pH为7.5的碱性土壤中，三次重复，在幼苗生长的第14天，向浸种处理的幼苗生长盆中浇灌40mLOD₆₀₀＝1的菌液，于幼苗生长第24天收获大豆地上植株和根部，测量株高和根种，根体积等。如附图9B所示，菌株YS-AT1可促进盐碱条件下大豆生长。

(3)耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1促进番茄生长

将番茄种子(中蔬4号Chinese vegetable tomato NO.4)于1％次氯酸钠中消毒5min，无菌水冲洗3次。在蛭石中萌发5～7d后，移栽至花盆并放置在光照培养箱生长3周。每棵植株接种YS-AT-DS1菌悬液20mL，继续培养14d后，重复接菌一次，28d后测量番茄株高、根鲜重和茎鲜重(未接种菌作为control组)，结果如表1。结果表明番茄株高、根鲜重和茎鲜重分别增加22.68％、50％和59.31％。如附图9C所示。

表1 YS-AT-DS1对番茄的促生作用

Treatment	株高(cm)	根鲜重(FW/g)	地上鲜重(FW/g)
				Control	14.68±0.52b	1.38±0.21b	2.63±0.20b
YS-AT-DS1	18.01±0.54a	2.07±0.11a	4.19±0.26a

实施例九：

耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1发酵液对南方根结线虫J2致死作用

收集YS-AT-DS1发酵液，0.22μm滤菌器过滤处理后，添加到24孔板培养板，每孔490μL，添加无菌水设置为对照组。南方根结线虫卵孵化后收集J2幼虫，无菌水冲洗3次，调至浓度100条/μL。每孔加入10μL线虫悬液，24小时后统计线虫死亡率，结果显示YS-AT-DS1发酵液处理后J2致死率为71.62％。见图10A所示，图中的1X发酵液、5X发酵液分别代表发酵液原液和稀释5倍后的发酵液。图10B为用显微镜观察到的菌液处理和对照中的线虫形态，其中有活力线虫呈弯曲状，不弯曲代表线虫已死亡。

实施例十：

耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1对根结线虫繁殖的抑制作用。

将番茄种子(中蔬4号)置于1％次氯酸钠中消毒5min，无菌水冲洗3次。在蛭石中萌发5～7d后，移栽至花盆并放置在光照培养箱生长3周。每棵植株接种YS-AT-DS1菌悬液20mL，继续培养3d后，每株接种1000条J2幼虫，35d后，YS-AT-DS1处理组番茄根系上的根结数比未接菌对照组减少32.14％，说明YS-AT-DS1对南方根结线虫有明显的生防作用。见图10C所示。

实施例十一：

耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1对番茄TIP基因的诱导作用

参照实例八(3)，YS-AT-DS1菌悬液处理0小时，24小时，72小时后，收集番茄根组织，利用天根RNA Easy Fast植物组织RNA提取试剂盒提取总RNA，使用天根FastKing DNADispelling RT SuperMix FastKing Kit反转录试剂盒(含去除基因组DNA)合成cDNA。采用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒(诺唯赞)在荧光定量PCR仪(罗氏

480System)上进行qRT-PCR分析。反应体系为：2×SuperReal PreMix Plus 10μL、正反向引物(10μmol·L^-1)各0.4μL、模板cDNA 1μL，最后加ddH2O至20μL。循环条件为：预变性95℃持续15min，变性95℃持续10s，退火/延伸60℃持续30s，共40个循环。以番茄SIEF4基因为内参基因(GATTGGTGGTATTGGAACTGTC；AGCTTCGTGGTGCATCTC)，使用2^-ΔΔCT法计算基因SITIP1.1，SITIP1.2和SITIP1.3的相对表达量。如附图11A所示，YS-AT-DS1菌悬液处理24小时，SITIP1.1和SITIP1.3被显著诱导，分别比对照组升高了6.98倍和7.43倍；处理72小时后，SITIP1.2和SITIP1.3的表达量增加了2.7倍和5.0倍，表明YS-AT-DS1激活了番茄中液泡水通道蛋白TIPs介导的水分及离子转运途径。

实施例十二：

耐盐碱生防促生细菌YS-AT-DS1缓解根结线虫对番茄TIP基因的抑制作用

参照实例十，收集无菌水处理、YS-AT-DS1菌悬液单独处理、YS-AT-DS1+线虫共处理3天后的番茄根组织，提取RNA并获得cDNA。qRT-PCR分析番茄根SITIP1.1(GAAGGAGGGAGGAAGCCACT；CCAACCGAAACCGCTACGA)、SITIP1.2(GTCAGGGTTCTGGTATGGC；AAGGTAACAGCAGGGTTGACG)、SITIP1.3(GCTGGTTCAGGATCTGGCAT；CGGCAGGATTTACGTGACCT)的相对表达量。已有报道，植物液泡水通道蛋白在调控植物寄生线虫取食位点过程中发挥重要作用(Shukla et al.2018)，降低植物TIP基因有助于增加寄主植物对线虫的感病性(Baranowski et al.2019)。如附图11B所示，根结线虫侵染3天后番茄根中SITIP1.1、SITIP1.2和SITIP1.3下调表达，而添加YS-AT-DS1菌悬液后能够恢复线虫对水通道蛋白基因SITIP1.1和SITIP1.3表达的抑制作用，SITIP1.1和SITIP1.3表达水平相比线虫单独处理组上升了8.66倍和3.36倍，说明YS-AT-DS1通过激活番茄水通道蛋白基因SITIP1.1和SITIP1.3表达提高了植物对根结线虫的抗性。

综上，YS-AT-DS1菌株对根结线虫具有较好的防效作用，其发酵液对根结线虫的J2幼虫有直接的杀线虫活性，添加该菌悬液能显著减少番茄根结数，抑制根结线虫繁殖，并能显著诱导植物液泡膜水通道蛋白基因SITIP表达，具有开发新型生防菌剂的潜力。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims

1.一株兼具生防和促生功能的耐盐碱贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis YS-AT-DS1，其保藏编号为：CCTCC NO:M2021239。

2.根据权利要求1所述的兼具生防和促生功能的耐盐碱贝莱斯芽孢杆菌在盐碱胁迫下促进植物生长中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物为大豆、小麦、番茄或拟南芥。

4.一种根据权利要求1所述的兼具生防和促生功能的耐盐碱贝莱斯芽孢杆菌在盐碱土地改良中的应用。

5.一种根据权利要求1所述的兼具生防和促生功能的耐盐碱贝莱斯芽孢杆菌在生物防治中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，兼具生防和促生功能的耐盐碱贝莱斯芽孢杆菌在防御立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)中的应用。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，兼具生防和促生功能的耐盐碱贝莱斯芽孢杆菌在防治南方根结线虫(Meloidogyne incognita)中的应用。

8.一种微生物菌剂，其特征在于，采用权利要求1所述的兼具生防和促生功能的耐盐碱贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis YS-AT-DS1或其发酵产物制备。

9.一种将权利要求8所述的微生物菌剂作为土壤改良剂的应用。

10.一种如权利要求8所述的微生物菌剂在促进盐碱胁迫下植物生长中的应用。