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CN116124921A - 一种蜈蚣配方颗粒的特征谱图构建方法及质量控制方法 - Google Patents

一种蜈蚣配方颗粒的特征谱图构建方法及质量控制方法 Download PDF

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CN116124921A
CN116124921A CN202211558806.3A CN202211558806A CN116124921A CN 116124921 A CN116124921 A CN 116124921A CN 202211558806 A CN202211558806 A CN 202211558806A CN 116124921 A CN116124921 A CN 116124921A
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CN
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characteristic spectrum
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CN202211558806.3A
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黄茜茜
万丽娟
翟红伟
瞿彩丽
胡辉
丁苗
孙中伟
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Original Assignee
Jingpai Zhengtang Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种蜈蚣配方颗粒的特征谱图构建方法及质量控制方法，所述的蜈蚣配方颗粒UPLC特征图谱的建立方法包括如下步骤：（1）精密称取蜈蚣配方颗粒，制备得到蜈蚣配方颗粒供试品溶液；（2）将蜈蚣配方颗粒供试品溶液和蜈蚣对照药材参照物溶液采用超高效液相色谱仪分析并比对，得到蜈蚣配方颗粒UPLC特征图谱。本发明构建的蜈蚣配方颗粒的特征图谱，充分展示了蜈蚣配方颗粒的化学成分特征，本发明构建的特征图谱全面的反应样品的特征峰信息，且方法稳定，精密度高，重现性较好；本发明通过蜈蚣配方颗粒的UPLC特征图谱和次黄嘌呤含量测定，能够更加有效的评价蜈蚣配方颗粒的质量，同时为制定蜈蚣配方颗粒工艺标准、质量标准提供科学、合理依据。

Description

一种蜈蚣配方颗粒的特征谱图构建方法及质量控制方法
技术领域
本发明涉及到中药配方颗粒领域，具体公开了一种蜈蚣配方颗粒的特征谱图构建方法及质量控制方法，属中药质量控制领域。
背景技术
蜈蚣作为常用的大宗中药品种，具有息风止痉、解毒散结、通络止痛功效，临床用于疔疮、小儿急慢惊风、诸疼痛、痈疽、抽搐、半身不遂、跌打损伤、瘿瘤瘰疬等方面。
传统中药饮片临床使用以汤剂为主，汤剂的活性成分是中药临床有效性的物质基础，蜈蚣配方颗粒以水为溶剂，经现代工业提取、浓缩、干燥、制粒而制成，作为新的饮片形式代替传统饮片供临床辨证论治、随证加减、配方使用。目前，现有技术已对蜈蚣药材、饮片进行了较全面的研究，但诸类研究均未涉及到蜈蚣配方颗粒质量控制领域的应用型研究。本发明使用超高效液相色谱法(UPLC)和化学成分定量分析，为蜈蚣配方颗粒的质量控制提供更为全面、专属性的定量和半定量信息。
发明内容
本发明的目的是提供一种蜈蚣配方颗粒的特征谱图构建方法及质量控制方法，本发明从特征图谱和含量控制蜈蚣配方颗粒的质量，该方法专属性强，分析时间短，能够有效提升蜈蚣配方颗粒的质量控制水平。
本发明所要解决的上述技术问题，通过如下技术方案予以实现：
一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，包括Sp1蜈蚣配方颗粒特征图谱共有特征峰的确定：
取蜈蚣对照药材，按对照药材参照物溶液制备方法，制备对照药材参照物溶液，取若干批蜈蚣配方颗粒，按供试品溶液制备方法，制备若干蜈蚣配方颗粒供试品溶液，分别在规定色谱条件下，进行UPLC检测，使用《中药色谱特征图谱相似度评价软件》对对照药材参照物和若干蜈蚣配方颗粒特征图谱进行共有峰标识，确定分离度较好，色谱峰纯度较高、与蜈蚣配方颗粒药效相关且与蜈蚣对照药材特征峰数目一致的9个共有峰为蜈蚣配方颗粒特征图谱的特征峰；
各特征峰的相对保留时间为：
1号峰：相对保留时间为0.81；
2号峰：相对保留时间为1.00；
3号峰：相对保留时间为1.20；
4号峰：相对保留时间为1.58；
5号峰：相对保留时间为1.00；
6号峰：相对保留时间为1.17；
7号峰：相对保留时间为1.27；
8号峰：相对保留时间为1.48；
9号峰：相对保留时间为1.58；
所述UPLC特征图谱的9个特征峰中，1号峰为尿嘧啶，2号峰为次黄嘌呤，3号峰为黄嘌呤，5号峰为肌苷，以2号峰为对照峰S1，以5号峰为对照峰S2，
2号峰和5号峰以外的各特征峰的相对保留时间差异应保持在10％范围内。
进一步地，上述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，还包括Sp2特征峰的指认：
S1对照品溶液制备：取尿嘧啶对照品，精密称定，加20-40％甲醇制成溶液，即得；取次黄嘌呤对照品，精密称定，加20-40％甲醇制成溶液，即得；取黄嘌呤对照品，精密称定，加20-40％甲醇制成溶液即得；取肌苷对照品，精密称定，加20-40％甲醇制成溶液；
S2供试品溶液的制备：取蜈蚣配方颗粒粉末，精密称定，精密加入甲醇，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S3比对：分别取尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷对照品溶液及蜈蚣配方颗粒供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定，在蜈蚣配方颗粒特征图谱中找到与尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷保留时间一致的特征峰，并指认。
进一步地，上述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，还包括Sp3蜈蚣配方颗粒UPLC特征图谱标准的确定：S1样品的测定、S2相似度评价、S3蜈蚣配方颗粒UPLC特征图谱标准；
S1样品的测定：对比若干批蜈蚣配方颗粒的特征图谱，与次黄嘌呤参照物相应的峰为S1峰，与肌苷参照物相应的峰为S2峰，计算特征峰1、3、4与参照峰S1的相对保留时间和相对峰面积，计算特征峰6、7、8、9与参照峰S2的相对保留时间和相对峰面积；
S2相似度评价：将若干批蜈蚣配方颗粒HPLC特征图谱使用《中药色谱特征图谱相似度评价系统》进行匹配，以平均数法或中位数法生成对照图谱，以2号和5号峰为参照峰，进行全峰匹配，用中药色谱特征图谱相似度评价系统计算蜈蚣配方颗粒供试品特征图谱与蜈蚣对照药材特征图谱R的相似度；
S3蜈蚣配方颗粒UPLC特征图谱标准：根据若干批蜈蚣配方颗粒样品的研究结果，最终确定蜈蚣配方颗粒特征图谱中呈现9个与对照药材特征图谱相对应的色谱峰，其中峰2、峰5应与相应的对照品参照物峰保留时间相一致，以次黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3和峰4与S1峰的相对保留时间，以肌苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6、峰7、峰8和峰9与S2峰的相对保留时间，应在规定值的±10％范围之内，规定值为：峰1：0.81；峰3：1.20；峰4：1.58；峰6：1.17；峰7：1.27；峰8：1.48；峰9：1.58；按中药色谱特征图谱相似度评价系统计算，蜈蚣配方颗粒供试品特征图谱与对照品特征图谱的相似度应不得低于0.9。
进一步地，上述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，
所述规定色谱条件为：色谱柱柱温为23-27℃，以甲醇为流动相A，以0.07-0.13％的磷酸，进行梯度洗脱，流速为0.22-0.27mL/min，检测波长为210-270nm，进样量为0.5-1.5μL，理论板数按次黄嘌呤峰计算≥3000，色谱柱采用规格为2.1×150mm 1.8μm的WatersACQUITY UPLC HSS-T3、2.1mm×150mm1.8μm的Endeavorsil C18或2.1×150mm 1.6μm的Waters ACQUITYUPLC Cortecs-T3 C18；
梯度洗脱条件为：0-6min，流动相A的体积分数为0％，流动相B的体积分数为100％；6-10min，流动相A的体积分数变化为0％-10％，流动相B的体积分数变化为100％-90％；10-20min，流动相A的体积分数变化为10％-50％，流动相B的体积分数变化为90％-50％。
进一步地，上述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，所述供试品溶液制备方法为：取蜈蚣配方颗粒0.1～0.3g，精密称定，置于容器中，精密加入20％～40％甲醇20～30mL，称定重量，超声处理20～40分钟，放冷，再称定重量，用20％～40％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
进一步地，上述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，所述蜈蚣配方颗粒的制备方法为：取蜈蚣饮片，加水煎煮，滤过，浓缩成清膏，清膏出膏率范围为20％～33％，加辅料，干燥，再加辅料，混匀，制粒，即得，出粒率为35％～45％，出粒率＝蜈蚣配方颗粒质量/蜈蚣饮片质量。
进一步地，上述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，所述蜈蚣对照药材参照物溶液的制备方法为：取蜈蚣对照药材，置于容器中，加30％甲醇溶剂，加热回流，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为蜈蚣对照药材参照物溶液。
进一步地，上述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，
S1对照品溶液制备：取尿嘧啶对照品，精密称定，加30％甲醇制成每1mL含10μg的溶液，即得；取次黄嘌呤对照品，精密称定，加30％甲醇制成每1mL含40μg的溶液，即得；取黄嘌呤对照品，精密称定，加30％甲醇制成每1mL含5μg的溶液即得；取肌苷对照品，精密称定，加30％甲醇制成每1mL含10μg的溶液；
S2供试品溶液的制备：取蜈蚣配方颗粒粉末0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S3比对：分别取尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷对照品溶液及蜈蚣配方颗粒供试品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，测定，在蜈蚣配方颗粒特征图谱中能找到与尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷保留时间一致的特征峰。
进一步地，上述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，色谱条件为：采用规格为2.1mm×150mm，1.8μm的Endeavorsil C18色谱柱，柱温为25℃，以甲醇为流动相A，以0.1％的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.25mL/min，检测波长为245nm，进样量为1μL，理论板数按次黄嘌呤峰计算≥3000。
本发明还提供一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法的验证方法，包括S1专属性考察、S2重复性考察、S3稳定性考察；
S1专属性考察：考察缺蜈蚣的阴性样品和溶剂对蜈蚣配方颗粒特征峰的影响，取缺蜈蚣的阴性样品按供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液，取蜈蚣配方颗粒供试品溶液、对照药材参照物溶液、溶剂、阴性样品溶液，按规定的色谱条件进样分析，记录色谱图，通过专属性实验结果表明该构建方法能正确检测所指认的特征峰，不受提取溶剂和辅料的干扰；
S2重复性考察：取蜈蚣配方颗粒，研细，平行若干份，按规定供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在规定色谱条件下进样分析，以2号峰次黄嘌呤峰为参照峰S1，以5号峰肌苷峰为参照峰S2，计算峰1、峰3和峰4与S1峰的相对保留时间，计算峰6、峰7、峰8和峰9与S2峰的相对保留时间并计算RSD值，实验结果显示，在重复性考察中，各特征峰的相对保留时间RSD在0.04％～0.29％范围内，相对峰面积RSD在0.06％～1.25％范围内，表明该方法重复性良好；
S3稳定性考察：取蜈蚣配方颗粒，研细，制备供试品溶液，在规定色谱条件下分别在不同时间进样，以次黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3和峰4与S1峰的相对保留时间，以肌苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6、峰7、峰8和峰9与S2峰的相对保留时间，并计算RSD值，实验结果显示，同一份供试品溶液在规定时间内多次进样测定，各特征峰的相对保留时间RSD在0.02％～0.64％范围内，各特征峰的相对峰面积RSD在0.22％～1.37％范围内，相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于2.0％，表明供试品溶液在规定时间内相对稳定性良好。
进一步地，上述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法的验证方法，
S2重复性考察：取蜈蚣配方颗粒，研细，取0.3g，平行6份，按规定供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在规定色谱条件下进样分析，连续进样6次，以2号峰次黄嘌呤峰为参照峰S1，以5号峰肌苷峰为参照峰S2，计算峰1、峰3和峰4与S1峰的相对保留时间，计算峰6、峰7、峰8和峰9与S2峰的相对保留时间并计算RSD值，实验结果显示，在重复性考察中，各特征峰的相对保留时间RSD在0.04％～0.25％范围内，相对峰面积RSD在0.40％～0.92％范围内，表明该方法重复性良好；
S3稳定性考察：取蜈蚣配方颗粒，研细，取0.3g，制备供试品溶液，在规定色谱条件下分别在0小时、3小时、6小时、9小时、12小时、18小时、24小时进样分析，以次黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3和峰4与S1峰的相对保留时间，以肌苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6、峰7、峰8和峰9与S2峰的相对保留时间，并计算RSD值，实验结果显示，同一份供试品溶液在24小时内多次进样测定，各特征峰的相对保留时间RSD在0.02％～0.20％范围内，各特征峰的相对峰面积RSD在0.64％～1.45％范围内，相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于2.0％，表明供试品溶液在24小时内相对稳定性良好。
进一步地，上述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法的验证方法，其特征在于，所述不同时间为0小时、3小时、6小时、9小时、12小时、18小时、24小时，所述规定时间为24小时。
一种蜈蚣配方颗粒的质量控制方法，
(1)用不同批次蜈蚣配方颗粒制备供试品，分别吸取蜈蚣对照药材和供试品蜈蚣配方颗粒样品溶液注入超高效液相色谱仪，测定相应特征峰及峰面积；
(2)通过外标法计算；
待测样品特征图谱中应呈现9个与对照药材特征图谱相对应的色谱峰，其中峰2、峰5应与相应的对照品参照物峰保留时间相一致，以次黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3和峰4与S1峰的相对保留时间，以肌苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6、峰7、峰8和峰9与S2峰的相对保留时间，应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.81(峰1)、1.20(峰3)、1.58(峰4)和1.17(峰6)、1.27(峰7)、1.48(峰8)、1.58(峰9)；按中药色谱特征图谱相似度评价系统计算，蜈蚣配方颗粒供试品特征图谱与蜈蚣对照药材特征图谱的相似度应不得低于0.9。
本发明的有益效果是：本发明构建的蜈蚣配方颗粒的特征图谱，充分展示了蜈蚣配方颗粒的化学成分特征，本发明构建的特征图谱全面的反应样品的特征峰信息，且方法稳定，精密度高，重现性较好；本发明通过蜈蚣配方颗粒的UPLC特征图谱和次黄嘌呤含量测定，能够更加有效的评价蜈蚣配方颗粒的质量，同时为制定蜈蚣配方颗粒工艺标准、质量标准提供科学、合理依据。
附图说明
图1为15批蜈蚣配方颗粒的UPLC特征图谱；
图2为蜈蚣对照药材参照物溶液特征图谱；
图3为对照品混合溶液和蜈蚣配方颗粒供试品的特征图谱，S1为对照品混合溶液的特征图谱，S2为蜈蚣配方颗粒供试品的特征图谱，1号峰为尿嘧啶，2号峰为次黄嘌呤，4号峰为黄嘌呤，5号峰为肌苷；
图4为10批蜈蚣配方颗粒供试品溶液的特征图谱、对照药材参照物溶液特征图谱；
图5为蜈蚣配方颗粒特征图谱专属性考察图谱，S1为阴性对照品溶液特征图谱，S2为30％甲醇溶液图谱，S3蜈蚣对照药材溶液特征图谱，S4为蜈蚣配方颗粒供试品溶液特征图谱；
图6为蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定专属性考察图谱，S1为阴性样品图谱，S2为30％甲醇图谱，S3为次黄嘌呤对照品溶液图谱，S4为蜈蚣配方颗粒供试品溶液图谱；
图7为蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定峰纯度考察图谱；
图8为次黄嘌呤标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例及附图对本发明的实施方案进行详细描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建
1.主要仪器、试剂与试药
1.1主要仪器：Waters H-Class超高效液相色谱仪(沃特世公司)；EndeavorsilC18(2.1×150mm，1.8μm)色谱柱，ME204E万分之一分析天平(赛多利斯公司)；XP26百万分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)；JJ600电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)；SK8200XS超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；DZKW-S-8水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；Milli-Q Direct超纯水系统(默克股份有限公司)。
1.2主要试剂：甲醇(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；磷酸(FisherScientific，色谱纯)；水为经过ELGA超纯水系统过滤得到超纯水。
1.3主要试药：尿嘧啶(中国食品药品检定研究院，含量：99.6％)；次黄嘌呤(中国食品药品检定研究院，含量：99.4％)；黄嘌呤(中国食品药品检定研究院，含量：100.0％)；肌苷(中国食品药品检定研究院，含量：98.5％)；蜈蚣对照药材(中国食品药品检定研究院)；蜈蚣配方颗粒(批号：CWG-01～CWG-10来源：劲牌持正堂药业有限公司)。
2.试验方法
2.1蜈蚣配方颗粒的制备方法：取蜈蚣饮片2500g，加水煎煮，滤过，浓缩成清膏(清膏出膏率范围为20％～33％)，加辅料适量，干燥(或干燥，粉碎)，再加辅料适量，混匀，制粒，制成1000g，即得。蜈蚣配方颗粒中所添加的辅料为麦芽糊精。
2.2超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1mm×150mm，1.8μm的Endeavorsil C18色谱柱，柱温为25℃，以甲醇为流动相A，以0.1％的磷酸，进行梯度洗脱，流速为0.25mL/min，检测波长为245nm，进样量为1μL，理论板数按次黄嘌呤峰计算≥3000。
2.3梯度洗脱条件为：0-6min，流动相A的体积分数为0％，流动相B的体积分数为100％；6-10min，流动相A的体积分数变化为0％-10％，流动相B的体积分数变化为100％-90％；10-20min，流动相A的体积分数变化为10％-50％，流动相B的体积分数变化为90％-50％。
2.4参照物溶液的制备：取蜈蚣对照药材约1g，置具塞锥形瓶中，加30％甲醇50ml，加热回流30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。取次黄嘌呤和肌苷对照品，加30％甲醇制成每1mL含次黄嘌呤40μg、肌苷10μg的混合对照品作为对照品参照物溶液。
2.5供试品溶液的制备：取蜈蚣配方颗粒粉末(过二号筛)约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.蜈蚣配方颗粒特征图谱共有特征峰的确定
3.1取15批蜈蚣配方颗粒样品，按供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，取蜈蚣对照药材，按对照药材参照物溶液制备方法，制备对照药材参照物溶液，在规定色谱条件下，进样测定，使用《中药色谱特征图谱相似度评价软件》对15批蜈蚣配方颗粒特征图谱进行共有峰标识，确定分离度较好，色谱峰纯度较高、与蜈蚣配方颗粒药效相关且与蜈蚣对照药材特征峰数目一致的9个共有峰为蜈蚣配方颗粒特征图谱的特征峰，如图1所示，蜈蚣对照药材特征图谱见图2。
4.特征峰的指认
4.1超高效液相色谱仪分析的色谱条件为：采用规格为2.1mm×150mm，1.8μm的Endeavorsil C18色谱柱，柱温为25℃，以甲醇为流动相A，以体积分数0.1％的磷酸水溶液为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.25mL/min，检测波长为245nm，进样量为1μL，理论板数按次黄嘌呤峰计算≥3000。
4.2梯度洗脱条件为：0-6min，流动相A的体积分数为0％，流动相B的体积分数为100％；6-10min，流动相A的体积分数变化为0％-10％，流动相B的体积分数变化为100％-90％；10-20min，流动相A的体积分数变化为10％-50％，流动相B的体积分数变化为90％-50％。
4.3对照品溶液制备：取尿嘧啶对照品，精密称定，加30％甲醇制成每1mL含10μg的溶液，即得；取次黄嘌呤对照品，精密称定，加30％甲醇制成每1mL含40μg的溶液，即得；取黄嘌呤对照品，精密称定，加30％甲醇制成每1mL含5μg的溶液即得；取肌苷对照品，精密称定，加30％甲醇制成每1mL含10μg的溶液。
4.4供试品溶液的制备：取蜈蚣配方颗粒粉末(过二号筛)约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.5比对：分别取尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷对照品溶液及蜈蚣配方颗粒供试品溶液各1μL，注入超高效液相色谱仪，测定，实验结果见图3所示，在蜈蚣配方颗粒特征图谱中能找到与尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷保留时间一致的特征峰。
5.蜈蚣配方颗粒UPLC特征图谱标准的确定
5.1样品的测定
按照蜈蚣配方颗粒UPLC特征图谱测定方法，测定10批蜈蚣配方颗粒的特征图谱，与次黄嘌呤参照物相应的峰为S1峰，与肌苷参照物相应的峰为S2峰，计算特征峰1、3、4与参照峰S1的相对保留时间和相对峰面积，计算特征峰6、7、8、9与参照峰S2的相对保留时间和相对峰面积，结果见表1、表2。
表110批蜈蚣配方颗粒相对保留时间特征图谱
Figure BDA0003983714810000071
表210批蜈蚣配方颗粒相对峰面积特征图谱
Figure BDA0003983714810000072
实验结果显示，与次黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、3、4与S1峰的相对保留时间和相对峰面积，10批蜈蚣配方颗粒特征峰1的相对保留时间RSD值为0.24％-0.80％，相对峰面积RSD值为12.21％-57.74％；与肌苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6、7、8、9与S2峰的相对保留时间和相对峰面积，其相对保留时间RSD值在0.39％-0.69％范围内，相对峰面积RSD值在19.93％-34.11％范围内；说明不同批次的蜈蚣配方颗粒各特征峰的相对保留时间比较稳定，相对峰面积批与批之间有较大的差异，不符合质量控制要求。规定：供试品特征图谱中应呈现9个与对照药材特征图谱相对应的色谱峰，其中峰2、峰5应与相应的对照品参照物峰保留时间相一致。以次黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3和峰4与S1峰的相对保留时间。以肌苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6、峰7、峰8和峰9与S2峰的相对保留时间，应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.81(峰1)、1.20(峰3)、1.58(峰4)和1.17(峰6)、1.27(峰7)、1.48(峰8)、1.58(峰9)。
5.2相似度评价
将10批蜈蚣配方颗粒HPLC特征图谱使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行匹配，以平均数法(或中位数法)生成对照图谱，以2号和5号峰为参照峰，进行全峰匹配，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算供试品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，见图4和表3。
表310批蜈蚣配方颗粒相似度评价表
Figure BDA0003983714810000081
实验结果显示，10批样品特征图谱相似度均在0.9以上，相似度较高，计算10批蜈蚣配方颗粒与标准对照特征图谱相似度，根据结果可知，各批次特征图谱之间相似度均不小于0.9。
5.3蜈蚣配方颗粒UPLC特征图谱标准
根据10批蜈蚣配方颗粒样品的研究结果，最终确定蜈蚣配方颗粒特征图谱标准为：供试品特征图谱中应呈现9个与对照药材特征图谱相对应的色谱峰，其中峰2、峰5应与相应的对照品参照物峰保留时间相一致。以次黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3和峰4与S1峰的相对保留时间。以肌苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6、峰7、峰8和峰9与S2峰的相对保留时间，应在规定值的±10％范围之内，规定值为：0.81(峰1)、1.20(峰3)、1.58(峰4)和1.17(峰6)、1.27(峰7)、1.48(峰8)、1.58(峰9)；按中药色谱特征图谱相似度评价系统计算，蜈蚣配方颗粒供试品特征图谱与对照品特征图谱的相似度应不得低于0.9。
6.蜈蚣配方颗粒特征图谱方法学验证
6.1专属性考察
本次实验考察缺蜈蚣的阴性样品和甲醇溶剂对蜈蚣配方颗粒特征峰的影响。取缺蜈蚣的阴性样品按供试品制备方法制备阴性样品溶液。取蜈蚣配方颗粒供试品溶液、对照药材参照物溶液、30％甲醇溶液、阴性样品溶液，按规定的色谱条件进样分析，记录色谱图，结果见图5。
实验结果显示，通过专属性实验结果表明该分析方法能正确检测所指认的特征峰，不受提取溶剂和辅料的干扰。
6.2重复性考察
取蜈蚣配方颗粒(批号CWG05)，研细，取0.3g，平行6份，按规定供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在规定色谱条件下进样分析，连续进样6次，以2号峰次黄嘌呤峰为参照峰S1，以5号峰肌苷峰为参照峰S2，计算峰1、峰3和峰4与S1峰的相对保留时间和相对峰面积，计算峰6、峰7、峰8和峰9与S2峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值。实验结果见表4和表5。
表4蜈蚣配方颗粒相对保留时间特征图谱重复性考察结果
Figure BDA0003983714810000091
表5蜈蚣配方颗粒相对峰面积特征图谱重复性考察结果
Figure BDA0003983714810000092
实验结果显示，在重复性考察中，同一份供试品溶液，连续进样6次，各特征峰的相对保留时间RSD在0.04％～0.29％范围内，相对峰面积RSD在0.06％～1.25％范围内，表明该方法重复性良好。
6.3稳定性考察
取蜈蚣配方颗粒(批号CWG-09)，研细，取0.3g，制备供试品溶液，在规定色谱条件下分别在0小时、3小时、6小时、9小时、12小时、18小时、24小时进样分析，以次黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S1峰，计算峰1、峰3和峰4与S1峰的相对保留时间和相对峰面积，以肌苷参照物峰相对应的峰为S2峰，计算峰6、峰7、峰8和峰9与S2峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD值。实验结果见表6和表7。
表6蜈蚣配方颗粒相对保留时间特征图谱稳定性考察结果
Figure BDA0003983714810000093
Figure BDA0003983714810000101
表7蜈蚣配方颗粒相对峰面积特征图谱稳定性考察结果
Figure BDA0003983714810000102
实验结果显示，同一份供试品溶液在24小时内多次进样测定，各特征峰的相对保留时间RSD在0.02％～0.64％范围内，各特征峰的相对峰面积RSD在0.22％～1.37％范围内，相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于2.0％，表明供试品溶液在24小时内相对稳定性良好。
实施例2
蜈蚣配方颗粒成分含量测定方法的确定
1.仪器、试剂与试药
1.1主要仪器：Waters超高效液相色谱仪(沃特世公司)；Waters ACQUITYUPLCHSS-T3 C18(2.1×150mm，1.8μm)，Waters ACQUITY UPLC Cortecs-T3 C18(2.1×150mm，1.6μm)，Endeavorsil C18(2.1×150mm，1.8μm)，万分之一天平(赛多利斯公司)，十万分之一天平(赛多利斯有限公司)，百万分之一天平(赛多利斯公司)，电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)；SK8200XS超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；DZKW-S-8水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司)；Milli-Q Direct超纯水系统(默克股份有限公司)。
1.2主要试剂
甲醇(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；磷酸二氢钾(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)、甲醇(Fisher Scientific，色谱纯)、水为经过ELGA超纯水系统过滤得到超纯水)。
1.3主要试药
次黄嘌呤对照品(含量99.4％，中国食品药品检定研究院)；蜈蚣配方颗粒(批号：CWG-01～CWG-10来源：劲牌持正堂药业有限公司)。
2.色谱条件
采用规格为2.1mm×150mm，1.8μm的Waters HSS-T3 C18色谱柱，柱温30℃，流速为0.2 mL/min，检测波长为245nm，进样量为1μL，以甲醇为流动相A，以10mM磷酸二氢钾水溶液为流动相B进行洗脱，洗脱条件为：流动相A的体积分数为0％，流动相B的体积分数为100％。
3.对照品溶液的制备
取次黄嘌呤对照品，精密称定，加30％甲醇制成每1mL含40μg的溶液，即得。
4.供试品溶液的制备
4.1提取溶剂考察
取蜈蚣配方颗粒(CWG-09)，研细，取0.3g，精密称定，平行6组，每组2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入水、10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，在规定的色谱条件测定，取每组平均值，再取6组平均值，实验结果见表8。
表8对不同提取溶剂提取蜈蚣配方颗粒中次黄嘌呤含量的考察
Figure BDA0003983714810000111
实验结果显示：水溶液的提取效率最高，10％甲醇和30％甲醇溶液的提取两者无明显区别，50％甲醇溶液提取不充分。因此，考虑到水溶液和10％甲醇溶液提取杂峰较多，综合考虑选择30％甲醇溶液为提取溶剂，与特征图谱项下供试品溶液制备方法保持一致。
4.2提取方式考察
取蜈蚣配方颗粒(CWG-09)，研细，取0.3g，精密称定，平行2组，每组2份，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇20mL，称定重量，分别超声处理30分钟、加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，按规定色谱条件下测定，取每组平均值，再取2组平均值，实验结果见表9。
表9取蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定不同提取方式考察
Figure BDA0003983714810000112
实验结果表明，超声和回流提取供试品溶液次黄嘌呤的含量有差异，超声提取比加热回流提取含量高，选择超声处理。
4.3溶剂用量考察
取蜈蚣配方颗粒(CWG-09)，研细，分别取0.1g、0.2g、0.3g和0.5g，精密称定，平行3组，每组2份，置20mL容量瓶中，加入30％甲醇适量，分别超声处理30分钟，放冷，再用30％甲醇定容至20mL，摇匀，滤过，取续滤液，在规定色谱条件测定，取平均值，实验结果见表10。
表10提取蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定溶剂用量的考察
Figure BDA0003983714810000113
实验结果表明：不同提取溶剂用量对供试品溶液次黄嘌呤含量测定影响不大，考虑实验室环境影响，含量和特征图谱供试品处理方法一致，在保证特征图谱特征峰的条件下，样品取样量选择0.3g，定容至20mL。
4.4提取时间考察
取蜈蚣配方颗粒(CWG-09)，研细，取0.3g，精密称定，平行3组，每组2份，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇20mL，称定重量，分别超声处理20分钟、30分钟和40分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，在规定色谱条件下测定，实验结果见表11。
表11取蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定提取时间的考察
Figure BDA0003983714810000121
实验结果表明：不同提取时间对供试品溶液次黄嘌呤含量测定影响不大，10分钟已能提取完全，考虑到实验环境影响，为保证充分提取，将超声时间定为30分钟。
4.5供试品溶液制备方法的确定
取蜈蚣配方颗粒，研细，取0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％甲醇20mL，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用30％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.方法学验证
5.1专属性考察
本次实验考察缺蜈蚣的阴性样品和溶剂30％甲醇对蜈蚣配方颗粒中次黄嘌呤含量测定的影响。取缺蜈蚣的阴性样品按供试品制备方法制备阴性样品溶液。取蜈蚣配方颗粒(CWG-09)供试品溶液、次黄嘌呤对照品溶液、30％甲醇溶液与阴性样品溶液注入液相色谱仪，按规定的色谱条件下测定，结果见图6。蜈蚣配方颗粒的辅料为麦芽糊精，因此，缺蜈蚣的阴性样品溶液即为麦芽糊精制成的溶液。
实验结果显示，阴性样品和甲醇溶液色谱图中在与次黄嘌呤相应的保留时间处没有色谱峰，说明辅料及溶剂对次黄嘌呤的测定无干扰，以本法测定蜈蚣配方颗粒中次黄嘌呤的含量具有专属性。
5.2峰纯度考察
取蜈蚣配方颗粒(CWG-09)制备供试品溶液、次黄嘌呤对照品溶液，取供试品溶液、次黄嘌呤对照品溶液各1μL，注入液相色谱仪，在规定的色谱条件下以PDA检测器进行190nm～400nm扫描检测，计算峰纯度。结果见图7和表12。
表12峰结果
Figure BDA0003983714810000122
实验结果显示，样品中次黄嘌呤峰未检测到杂质峰，纯度因子在计算出的阈值限值内，说明在该色谱条件下，次黄嘌呤峰纯度符合定量要求。
5.3线性关系考察
精密称取对照品次黄嘌呤16.75mg，加30％甲醇溶解并定容至20mL，摇匀，分别得次黄嘌呤对照品母液浓度为837.5mg/L。分别取浓度为837.5mg/L的次黄嘌呤对照品溶液母液1mL、2mL至10mL容量瓶中，再将稀释的溶液逐级稀释0.1倍、0.2倍，得次黄嘌呤浓度分别为2.09475mg/L、8.375mg/L、16.75mg/L、41.875mg/L、83.75mg/L、167.5mg/L的对照品溶液。分别精密吸取上述6个不同浓度的对照品溶液1μL在取蜈蚣配方颗粒含量测定色谱条件下进行色谱分析，得到各浓度的色谱峰的峰面积。以峰面积为纵坐标(y)，对照品浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，结果见表13，标准曲线见图8。
表13取蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定线性考察结果
Figure BDA0003983714810000131
5.4稳定性考察
取蜈蚣配方颗粒(CWG-09)，研细，取0.3g，精密称定，制备供试品溶液，在规定的色谱条件分别在0、3、6、12、18、24小时进样，计算不同时间点次黄嘌呤峰面积RSD值，测定结果见表14。
表14取蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定稳定性考察结果
Figure BDA0003983714810000132
实验结果显示，同一份供试品溶液在不同时间点进样，次黄嘌呤峰面积RSD为0.48％，说明供试品溶液在24小时内稳定性良好。
5.5重复性考察
取蜈蚣配方颗粒(CWG-09)，研细，取0.3g，精密称定，平行6份，制备6份供试品溶液，在规定的色谱条件进行测定，计算次黄嘌呤含量及RSD值，测定结果见表15。
表15取蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定重复性考察结果
Figure BDA0003983714810000133
Figure BDA0003983714810000141
实验结果显示，同一批样品，连续测定6次，次黄嘌呤含量均值为4.39mg/g，6次测定RSD值为1.88％，说明该方法重复性良好。
5.6准确度试验
精密称定次黄嘌呤对照品6.615mg，置10mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品加样母液。取蜈蚣配方颗粒(CWG-09)，研细，取0.15g，平行6份，精密称定，置于20mL容量瓶，分别精密加入对照品加样母液1mL，加入30％甲醇适量，超声处理(功率250W，频率53kHz)20分钟，放冷，用30％甲醇定容至20mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。在规定的色谱条件进样测定，计算次黄嘌呤的含量和加样回收率，结果见表16。
表16次黄嘌呤含量测定加样回收率考察结果
Figure BDA0003983714810000142
实验结果显示，次黄嘌呤的加样回收率范围为101.03％～104.11％，平均回收率为102.82％，RSD为1.19％，表明该方法准确性良好。
5.7中间精密度考察
选择不同的测定时间、不同的高效液相色谱仪、不同实验人员(人员2)，取蜈蚣配方颗粒(CWG-09)，研细，取0.3g，平行6份，精密称定，制备6份供试品溶液，在规定的色谱条件进样测定，计算次黄嘌呤含量及RSD值，结果见表17。
表17取蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定中间精密度考察结果
Figure BDA0003983714810000143
Figure BDA0003983714810000151
实验结果显示，不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定值RSD小于2.0％，说明该分析方法中间精密度良好。
5.8耐用性考察
5.8.1不同色谱柱考察
比较不同色谱柱对取蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定的影响，本次考察了3种色谱柱。
取蜈蚣配方颗粒(CWG-09)，研细，取0.3g，精密称定，制备供试品溶液，色谱条件除了色谱柱分别为Waters ACQUITY UPLC HSS-T3(2.1×150mm，1.8μm)，Waters ACQUITYUPLC Cortecs-T3 C18(2.1×150mm，1.6μm)，Endeavorsil C18(2.1×150mm，1.8μm)，其它色谱条件不变，实验结果见表18。
表18蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定不同色谱柱耐用性考察结果
Figure BDA0003983714810000152
实验结果：比较不同色谱柱的分离效果及含量值，各色谱柱分离效果良好，含量RSD为1.38％，表明该分析方法在不同色谱柱下分析耐用性较好。
5.8.2不同柱温考察
比较柱温分别为23℃、25℃和27℃对取蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定的影响。取取蜈蚣配方颗粒(批号：CWG-09)，研细，取0.3g，精密称定，制备供试品溶液，除柱温分别为23℃、25℃和27℃，其他条件色谱条件均不变，分别进样测定，计算不同柱温下次黄嘌呤的含量，实验结果见表19。
表19取蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定不同柱温耐用性考察结果
Figure BDA0003983714810000153
实验结果显示，比较三种不同柱温(±2℃)的取蜈蚣配方颗粒的含量值，含量RSD为0.23％，表明该分析方法在柱温±2℃范围内耐用性良好。
5.8.3不同考察
比较流速分别为0.2mL/min、0.25mL/min和0.3mL/min对取蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定的影响。取取蜈蚣配方颗粒(批号：CWG-09)，研细，取0.3g，精密称定，制备供试品溶液，除流速分别为0.2mL/min、0.25mL/min和0.3mL/min，其余色谱条件均同，分别进样测定，测定不同流速下次黄嘌呤含量，实验结果见表20。
表20取蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定不同流速耐用性考察结果
Figure BDA0003983714810000154
Figure BDA0003983714810000161
实验结果显示，三种不同流速(±0.05mL/min)下，取蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定值RSD为0.13％，表明该分析方法在流速±0.05mL/min范围内耐用性良好。
5.9蜈蚣配方颗粒样品测定
蜈蚣配方颗粒成分含量测定方法，包括如下步骤：
(1)分别吸取对照品溶液和待测蜈蚣配方颗粒样品溶液注入超高效液相色谱仪，测定相应峰面积。
(2)通过外标法计算，即得。
所述检测成分为次黄嘌呤。
测定结果见表21。
表2110批取蜈蚣配方颗粒次黄嘌呤含量测定结果表
Figure BDA0003983714810000162
10批蜈蚣配方颗粒含量范围1.93～4.15mg/g，均值2.847mg/g，平均值±3SD范围为0.63～4.72 mg/g，保留一位小数，规定蜈蚣配方颗粒含量限度为：本品每1g含次黄嘌呤(C5H4N4O)应为0.6mg～4.7mg。

Claims (10)

1.一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，包括Sp1蜈蚣配方颗粒特征图谱共有特征峰的确定：
取蜈蚣对照药材，按对照药材参照物溶液制备方法，制备对照药材参照物溶液，取若干批蜈蚣配方颗粒，按供试品溶液制备方法，制备若干蜈蚣配方颗粒供试品溶液，分别在规定色谱条件下，进行UPLC检测，使用《中药色谱特征图谱相似度评价软件》对对照药材参照物和若干蜈蚣配方颗粒特征图谱进行共有峰标识，确定分离度较好，色谱峰纯度较高、与蜈蚣配方颗粒药效相关且与蜈蚣对照药材特征峰数目一致的9个共有峰为蜈蚣配方颗粒特征图谱的特征峰；
各特征峰的相对保留时间为：
1号峰：相对保留时间为0.81；
2号峰：相对保留时间为1.00；
3号峰：相对保留时间为1.20；
4号峰：相对保留时间为1.58；
5号峰：相对保留时间为1.00；
6号峰：相对保留时间为1.17；
7号峰：相对保留时间为1.27；
8号峰：相对保留时间为1.48；
9号峰：相对保留时间为1.58；
所述UPLC特征图谱的9个特征峰中，1号峰为尿嘧啶，2号峰为次黄嘌呤，3号峰为黄嘌呤，5号峰为肌苷，以2号峰为对照峰S1，以5号峰为对照峰S2，
2号峰和5号峰以外的各特征峰的相对保留时间差异应保持在10%范围内。
2.根据权利要求1所述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，还包括Sp2特征峰的指认：
S1对照品溶液制备：取尿嘧啶对照品，精密称定，加20-40%甲醇制成溶液，即得；取次黄嘌呤对照品，精密称定，加20-40%甲醇制成溶液，即得；取黄嘌呤对照品，精密称定，加20-40%甲醇制成溶液即得；取肌苷对照品，精密称定，加20-40%甲醇制成溶液；
S2供试品溶液的制备：取蜈蚣配方颗粒粉末，精密称定，精密加入甲醇，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S3比对：分别取尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷对照品溶液及蜈蚣配方颗粒供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定，在蜈蚣配方颗粒特征图谱中找到与尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、肌苷保留时间一致的特征峰，并指认。
3.根据权利要求1所述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，还包括Sp3蜈蚣配方颗粒UPLC特征图谱标准的确定：S1样品的测定、S2相似度评价、S3蜈蚣配方颗粒UPLC特征图谱标准；
S1样品的测定：对比若干批蜈蚣配方颗粒的特征图谱，与次黄嘌呤参照物相应的峰为S1峰，与肌苷参照物相应的峰为S2峰，计算特征峰1、3、4与参照峰 S1的相对保留时间和相对峰面积，计算特征峰6、7、8、9与参照峰S2的相对保留时间和相对峰面积；
S2相似度评价：将若干批蜈蚣配方颗粒HPLC特征图谱使用《中药色谱特征图谱相似度评价系统》进行匹配，以平均数法或中位数法生成对照图谱，以2号和5号峰为参照峰，进行全峰匹配，用中药色谱特征图谱相似度评价系统计算蜈蚣配方颗粒供试品特征图谱与蜈蚣对照药材特征图谱R的相似度；
S3蜈蚣配方颗粒UPLC特征图谱标准：根据若干批蜈蚣配方颗粒样品的研究结果，最终确定蜈蚣配方颗粒特征图谱中呈现9个与对照药材特征图谱相对应的色谱峰，其中峰 2、峰5 应与相应的对照品参照物峰保留时间相一致，以次黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S1 峰，计算峰1、峰3和峰4与S1峰的相对保留时间，以肌苷参照物峰相对应的峰为S2 峰，计算峰6、峰7、峰8和峰9与S2峰的相对保留时间，应在规定值的±10%范围之内，规定值为：峰1：0.81；峰3：1.20；峰4：1.58；峰6：1.17；峰7：1.27；峰8：1.48；峰9：1.58；按中药色谱特征图谱相似度评价系统计算，蜈蚣配方颗粒供试品特征图谱与对照品特征图谱的相似度应不得低于0.9。
4.根据权利要求1所述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，所述规定色谱条件为：色谱柱柱温为23-27℃，以甲醇为流动相A，以0.07-0.13%的磷酸为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.22 -0.27 mL/min，检测波长为210 - 270nm，进样量为0.5-1.5μL，理论板数按次黄嘌呤峰计算≥3000，色谱柱采用规格为2.1×150mm 1.8µm的WatersACQUITY UPLC HSS- T3 、2.1mm×150mm 1.8μm的Endeavorsil C18或2.1×150mm 1.6µm的Waters ACQUITY UPLC Cortecs- T3 C18；
梯度洗脱条件为：0-6min，流动相A的体积分数为0%，流动相B的体积分数为100%；6-10min，流动相A的体积分数变化为0%-10%，流动相B的体积分数变化为100%-90%；10-20min，流动相A的体积分数变化为10%-50%，流动相B的体积分数变化为90%-50%。
5.根据权利要求1所述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，所述供试品溶液制备方法为：取蜈蚣配方颗粒0.1~0.3g，精密称定，置于容器中，精密加入20%~40%甲醇20~30mL，称定重量，超声处理20~40分钟，放冷，再称定重量，用20%~40%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.根据权利要求1所述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，所述蜈蚣配方颗粒的制备方法为：取蜈蚣饮片，加水煎煮，滤过，浓缩成清膏，清膏出膏率范围为20%～33%，加辅料，干燥，再加辅料，混匀，制粒，即得，出粒率为35%~45%，出粒率=蜈蚣配方颗粒质量/蜈蚣饮片质量。
7.根据权利要求1所述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法，其特征在于，所述蜈蚣对照药材参照物溶液的制备方法为：取蜈蚣对照药材，置于容器中，加30%甲醇溶剂，加热回流，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为蜈蚣对照药材参照物溶液。
8.一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法的验证方法，其特征在于，包括S1专属性考察、S2重复性考察、S3稳定性考察；
S1专属性考察：考察缺蜈蚣的阴性样品和溶剂对蜈蚣配方颗粒特征峰的影响，取缺蜈蚣的阴性样品按供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液，取蜈蚣配方颗粒供试品溶液、对照药材参照物溶液、溶剂、阴性样品溶液，按规定的色谱条件进样分析，记录色谱图，通过专属性实验结果表明该构建方法能正确检测所指认的特征峰，不受提取溶剂和辅料的干扰；
S2重复性考察：取蜈蚣配方颗粒，研细，平行若干份，按规定供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在规定色谱条件下进样分析，以2号峰次黄嘌呤峰为参照峰S1，以5号峰肌苷峰为参照峰S2，计算峰1、峰3和峰4与S1峰的相对保留时间，计算峰6、峰7、峰8和峰9与S2峰的相对保留时间并计算RSD值，实验结果显示，在重复性考察中，各特征峰的相对保留时间RSD在0.04% ~ 0.29%范围内，相对峰面积RSD在0.06% ~ 1.25%范围内，表明该方法重复性良好；
S3稳定性考察：取蜈蚣配方颗粒，研细，制备供试品溶液，在规定色谱条件下分别在不同时间进样，以次黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S1 峰，计算峰1、峰3和峰4与S1峰的相对保留时间，以肌苷参照物峰相对应的峰为S2 峰，计算峰6、峰7、峰8和峰9与S2峰的相对保留时间，并计算RSD值，实验结果显示，同一份供试品溶液在规定时间内多次进样测定，各特征峰的相对保留时间RSD在0.02% ~ 0.64%范围内，各特征峰的相对峰面积RSD在0.22% ~ 1.37%范围内，相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于2.0%，表明供试品溶液在规定时间内相对稳定性良好。
9.根据权利要求8所述的一种蜈蚣配方颗粒特征图谱的构建方法的验证方法，其特征在于，所述不同时间为0小时、3小时、6小时、9小时、12小时、18小时、24小时，所述规定时间为24小时。
10.一种蜈蚣配方颗粒的质量控制方法，其特征在于，
（1）用不同批次蜈蚣配方颗粒制备供试品，分别吸取蜈蚣对照药材和供试品蜈蚣配方颗粒样品溶液注入超高效液相色谱仪，测定相应特征峰及峰面积；
（2）通过外标法计算；
待测样品特征图谱中应呈现9个与对照药材特征图谱相对应的色谱峰，其中峰 2、峰5应与相应的对照品参照物峰保留时间相一致，以次黄嘌呤参照物峰相对应的峰为S1 峰，计算峰1、峰3和峰4与S1峰的相对保留时间，以肌苷参照物峰相对应的峰为S2 峰，计算峰6、峰7、峰8和峰9与S2峰的相对保留时间，应在规定值的±10%范围之内，规定值为：0.81（峰1）、1.20（峰3）、1.58（峰4）和1.17（峰6）、1.27（峰7）、1.48（峰8）、1.58（峰9）；按中药色谱特征图谱相似度评价系统计算，蜈蚣配方颗粒供试品特征图谱与蜈蚣对照药材特征图谱的相似度应不得低于0 .9。
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