CN116115736A - 一种bmp9在制备抑制成骨细胞衰老的制剂或药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种BMP9在制备抑制成骨细胞衰老的制剂或药物中的应用，本发明证明了BMP9可减少老年小鼠的骨量丢失、具有保护老年小鼠骨骼微结构的作用、提高其抗骨折能力等作用，作为抗衰老药物治疗老年性骨质疏松症等中的应用前景。

Description

一种BMP9在制备抑制成骨细胞衰老的制剂或药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别涉及一种BMP9在制备抑制成骨细胞衰老的制剂或药物中的应用。

背景技术

随着人口老龄化加剧，年龄相关性骨质疏松症和骨折已成为日益严重的全球性公共卫生问题。最新的数据显示，在2000年，有900万例骨质疏松性骨折(160万例髋部骨折，170万例前臂骨折和140万例椎骨骨折)发生；到2050年，全球髋部骨折的发病率预期在女性和男性中将分别增加240％和310％。在女性中，1年内发生骨折的人数将超过乳腺癌、心肌梗死或中风的人数总和。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种一种BMP9在制备抑制成骨细胞衰老的制剂或药物中的应用。

本发明的一种BMP9在制备抑制成骨细胞衰老的制剂或药物中的应用。

本发明的一种BMP9在制备抑制连续传代和/或过氧化氢刺激诱导的成骨细胞衰老的制剂或药物中的应用。

本发明的一种BMP9在制备老年骨质疏松症制剂或药物中的应用。

本发明的一种BMP9在制备老年抗骨折制剂或药物中的应用。

本发明的一种所述应用，所述制剂或药物包括单方制剂或复方制剂。

有益效果

本发明中BMP9可减少老年小鼠的骨量丢失、具有保护老年小鼠骨骼微结构的作用、提高其抗骨折能力等。表明了BMP9在制备老年性骨质疏松症制剂或药物中的应用和制备老年性抗骨折制剂或药物中的应用。

附图说明

图1为小鼠体内BMP9过表达的验证；其中A.分别对6月龄和20月龄小鼠进行过表达BMP9的AAV2/9尾静脉注射，12周后进行验证；B.肝脏BMP9 mRNA表达水平；C.6月龄小鼠尾静脉注射后肝脏BMP9蛋白表达水平；D.20月龄小鼠尾静脉注射后肝脏BMP9蛋白表达水平；E.6月龄和20月龄小鼠尾静脉注射后血清BMP9水平。6M+AAV-CON组n＝9；6M+AAV-BMP9组n＝7；20M+AAV-CON组n＝9；20M+AAV-BMP9组n＝8。数据表示为平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；

图2为BMP9减少老年小鼠骨量流失；其中A.成年和老年小鼠分别过表达BMP9后股骨2D图像、松质骨和皮质骨3D重建图像；B.成年和老年小鼠分别过表达BMP9，对照组尾静脉注射空载AAV；C.股骨松质骨体积骨密度；D.股骨皮质骨体积骨密度。6M+AAV-CON组n＝9；6M+AAV-BMP9组n＝7；20M+AAV-CON组n＝9；20M+AAV-BMP9组n＝8。数据表示为平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图3为BMP9改善老年小鼠骨骼微结构；A.成年和老年小鼠分别过表达BMP9后股骨松质骨骨体积分数；B.股骨骨小梁厚度；C.骨小梁离散度；D.松质骨结构模式指数；E.股骨皮质骨骨体积分数；F.股骨皮质骨厚度；G.成年和老年小鼠分别过表达BMP9椎骨HE染色。数据表示为平均值±标准差。6M+AAV-CON组n＝9；6M+AAV-BMP9组n＝7；20M+AAV-CON组n＝9；20M+AAV-BMP9组n＝8。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图4为BMP9改善老年小鼠骨生物力学参数，A.弹性模量；B.弯曲强度；C.最大弯曲负荷；D.断裂能量。6M+AAV-CON组n＝9；6M+AAVBMP9组n＝7；20M+AAV-CON组n＝9；20M+AAV-BMP9组n＝8。数据表示为平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图5为BMP9提高改善老年小鼠骨转换状态；其中A.老年小鼠过表达BMP9后血清骨形成标志PINP水平(n＝7)；B.老年小鼠过表达BMP9后血清骨吸收标志CTX-1水平(n＝7)；C.老年小鼠过表达BMP9后骨组织成骨细胞特异基因表达(n＝6)；D.老年小鼠过表达BMP9后骨组织破骨细胞特异基因表达(n＝6)；E.骨组织TRAP染色。数据表示为平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图6为BMP9改善成骨细胞复制性衰老，促成骨分化，A.连续传代后的MC3T3E1细胞给予小鼠重组BMP9蛋白处理，β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞；B.计数β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例；C.免疫荧光检测γ-H2AX阳性细胞D.qPCR检测P21、P53的mRNA表达；E.qPCR检测Ccl5、Nfkb1、Mmp的mRNA表达；F.qPCR检测Vcam1、Hmgb1、Cxcl5的mRNA表达；G.成骨分化诱导7天后ALP染色检测各组细胞分化程度；H.成骨分化关键转录因子Runx2、Osx的mRNA表达；I.成骨细胞特异基因Alp、Ocn、Col1a1的mRNA表达；J.成骨分化关键转录因子Runx2、Osx的蛋白表达。N＝3次生物学重复。数据表示为平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图7为BMP9改善H2O2诱导的成骨细胞衰老，促成骨分化；A.H2O2诱导衰老的MC3T3E1细胞给予小鼠重组BMP9蛋白处理，β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞；B.计数β-半乳糖苷酶染色阳性细胞比例；C.免疫荧光检测γ-H2AX阳性细胞；D.qPCR检测P21、P53的mRNA表达；E.qPCR检测Ccl5、Nfkb1、Mmp的mRNA表达；F.qPCR检测Vcam1、Hmgb1、Cxcl5的mRNA表达；G.成骨分化诱导7天后ALP染色检测各组细胞分化程度；H.成骨分化关键转录因子Runx2、Osx的mRNA表达；I.成骨细胞特异基因Alp、Ocn、Col1a1的mRNA表达；J.成骨分化关键转录因子Runx2、Osx的蛋白表达。N＝3次生物学重复。数据表示为平均值±标准差。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

分别对6月龄的成年小鼠和20月龄老年小鼠进行腺相关病毒尾静脉注射，其中实验组小鼠注射BMP9过表达的腺相关病毒，对照组小鼠注射空载病毒(图1A)。尾静脉注射12周后，分别取血和肝脏进行BMP9过表达的验证。qPCR和WB结果显示肝脏中BMP9的表达量明显上调(图1.B-D)，Elisa结果提示实验组成年和老年小鼠血清中BMP9含量均显著升高(图1.E)，证明BMP9在小鼠体内过表达成功。

对小鼠股骨进行micro-CT检测。2D和3D重组成像图提示，对照组老年小鼠与对照组成年小鼠相比，股骨远端松质骨结构明显稀疏、骨量减少，股骨中段皮质骨厚度明显变薄；过表达BMP9的老年小鼠松质骨结构和皮质骨厚度均显著增加，而过表达BMP9的成年小鼠骨量则无明显变化(图2A)。另外，分别对松质骨和皮质骨进行骨密度的检测，发现BMP9在老年小鼠的过表达可显著提高骨密度，在成年小鼠身上这一作用并不明显(图2.B-D)。提示BMP9可减少老年小鼠的骨量丢失。

一般老年小鼠的骨骼微结构遭到破坏，其中松质骨体积分数(BV/TV)和小梁骨厚度(Tb.Th)，而小梁骨离散度(Tb.Sp)和结构模式指数(SMI)在老年小鼠均升高；过表达BMP9后，以上参数均得到显著改善(图3.A-D)。皮质骨方面，发现老年小鼠的骨体积分数(BV/TV)和皮质骨厚度(Ct.Th)较成年小鼠显著下降；BMP9体内过表达可提高皮质骨体积分数和厚度，差异均具有统计学意义(图3.E,F)。同时通过对小鼠椎骨切片进行HE染色可直观地看到，老年鼠小梁骨厚度变薄、离散度增加，而BMP9过表达则可明显改善这一现象。成年小鼠过表达BMP9则未引起明显的骨微结构变化(图3.G)。这些结果提示BMP9具有保护老年小鼠骨骼微结构的作用。

随年龄增长，小鼠骨量减少、抗骨折能力降低。与成年小鼠相比，老年鼠股骨生物力学参数值下降，其中骨弹性模量、弯曲强度、最大弯曲负荷和断裂能量等均显著降低。BMP9在老年鼠的过表达则可明显提升这些生物力学参数(图4)，证明BMP9改善老年鼠生物力学表现，提高其抗骨折能力。

骨骼系统处于骨形成和骨转换的动态平衡状态，随年龄增长，骨转换水平下调。对老年小鼠进行BMP9过表达后进一步检测血清骨形成和骨吸收标志物PINP和CTX-1，BMP9显著提高PINP在血清的水平，差异具有统计学意义；CTX-1则呈下降趋势，但未达统计学差异(图5.A,B)。进一步测量了骨组织中成骨细胞和破骨细胞特异性的标志基因的表达，发现BMP9可显著提高老年小鼠骨OSX、ALP、OCN和Col1a1的表达；而破骨细胞标志基因中只有Nfatc1和Dc-stamP的表达成下降趋势(图5.C,D)。TRAP染色结果则显示BMP9作用下老年小鼠骨组织中破骨细胞数量相对减少，但差异并不十分显著(图5.E)。以上提示BMP9对老年小鼠骨转换的调控作用更多地以促进骨形成为主。同样，这一作用在成年小鼠身上并不明显。

为了进一步探讨BMP9对衰老成骨细胞的保护作用，首先在体外利用反复传代的成骨细胞系MC3T3E1构建复制性衰老的细胞模型。在体外培养过程中发现，快速反复传代至P15以后的MC3T3E1细胞出现衰老的形态变化，具体表现为细胞胞体变大、胞内颗粒增多、增殖变慢等，因此利用P17代细胞作为衰老细胞模型，用P5-7代细胞作为正常对照进行后续实验。细胞分组设为：P7+Vehicle、P17+Vehicle、P17+BMP9组，其中P17+BMP9组给予100ng/ml的BMP9处理3天，P17+Vehicle组给予同等体积分数的PBS缓冲液处理同样时间。分别通过半乳糖苷酶染色、衰老基因表达测定、DNA损伤修复标志γ-H2AX检测和SASPs的表达验证反复传代后的成骨细胞衰老表型以及BMP9的作用；利用碱性磷酸酶(ALP)染色、成骨分化特异性基因的表达评价不同分组的成骨细胞分化能力的改变。

β-半乳糖苷酶检测提示反复传代后衰老的成骨细胞数量显著增多，对染色阳性的细胞进行计数，衰老细胞的比例可达48.69％，BMP9处理后这一比例则下降至19.45％，差异具有统计学意义(图6.A,B)。免疫荧光检测提示γ-H2AX阳性的细胞数量在反复传代后也明显增多，BMP9干预可减少这一类细胞的产生(图6C)。另外利用qPCR检测衰老特异性基因P16、P21和P53的表达，发现反复传代后的成骨细胞以P21的升高为主，P53的表达并无明显增多趋势，而P16基因在MC3T3E1细胞中的表达丰度较低，考虑成骨细胞的衰老可能主要由P21进行介导；BMP9的加入则显著降低P21的表达水平(图6.D)。衰老相关分泌性因子Ccl5、Mmp9、Nfkb1、Vcam1、Hmgb1和Cxcl5的表达水平也在P17细胞中明显升高，并可被BMP9下调(图6.E,F)。以上细胞表型说明BMP9对反复传代引起的成骨细胞衰老具有改善作用。

碱性磷酸酶染色提示反复传代后的MC3T3E1细胞成骨分化程度减低，BMP9可逆转这一变化(图6.G)。反复传代后，成骨细胞分化特异性的转录因子Runx2和Osx在RNA和蛋白水平的表达均降低，BMP9则能上调二者的表达；同时介导成骨分化的Alp、Ocn和Col1a1在BMP9的作用下也得到上调(图6.HJ)。以上结果说明BMP9在体外改善成骨细胞复制性衰老状态，提高成骨分化能力。

利用H2O2诱导MC3T3E1细胞衰老，验证BMP9的作用。

细胞分组设为：正常对照组、H2O2组、H2O2+BMP9组，结合CCK8细胞活性测定结果筛选合适的H2O2浓度作用于MC3T3E1细胞2小时，随后用PBS缓冲液清洗细胞后，更换为正常完全培养液再培养3天，即可进行衰老表型的检测。H2O2+BMP9组的处理为在更换正常完全培养液的同时，加入终浓度100ng/ml的小鼠BMP9重组蛋白，共同培养3天。

使用200nM浓度的H2O2处理后进行β半乳糖苷酶染色并计数衰老细胞个数，有高达64.16％的成骨细胞显示出衰老状态；BMP9处理可显著下调衰老细胞比例至36.65％，差异具有统计学意义(图7.A,B)。免疫荧光检测提示γ-H2AX阳性的细胞数量在H2O2处理后也显著增多，BMP9则明显抑制这一趋势(图7.C)。同时，衰老特异性基因P21的表达在H2O2作用下显著升高，BMP9能有效下调其在RNA和蛋白水平的表达。有意思的是，在这一衰老模型中同样观察到P53的表达并未随H2O2的诱导而显著上调，基于衰老表型在不同种类细胞中的特异性表现，考虑对于MC3T3E1细胞来说，P53并非导致衰老的关键调控基因(图7.D)。另外也对衰老相关分泌性因子Ccl5、Mmp9、Nfkb1、Vcam1、Hmgb1和Cxcl5的表达进行了检测，发现在H2O2作用下升高的这些SASPs均可被BMP9下调(图7.E,F)。以上说明BMP9对H2O2引起的成骨细胞衰老具有改善作用。

进一步分析了成骨细胞分化功能的改变。碱性磷酸酶染色提示H2O2作用下的MC3T3E1细胞成骨分化的能力减弱，BMP9可重新上调其分化水平(图7.G)。衰老组成骨细胞分化特异性的转录因子Runx2和Osx在RNA和蛋白水平的表达均降低，BMP9可上调二者的表达；同时介导成骨分化的Alp、Ocn和Col1a1在BMP9的作用下也得到上调(图7.H-J)。说明BMP9在对H2O2诱导的成骨细胞衰老的改善作用。证明了BMP9对不同诱导条件下的成骨细胞衰老状态均存在抑制作用。

Claims (5)

1.一种BMP9在制备抑制成骨细胞衰老的制剂或药物中的应用。

2.一种BMP9在制备抑制连续传代和/或过氧化氢刺激诱导的成骨细胞衰老的制剂或药物中的应用。

3.一种BMP9在制备老年性骨质疏松症制剂或药物中的应用。

4.一种BMP9在制备老年性抗骨折制剂或药物中的应用。

5.一种权利要求1-4任一所述应用，其特征在于，所述制剂或药物包括单方制剂或复方制剂。

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