CN116103179A - 一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法及应用，该方法具体的制备步骤如下：步骤1、制备培养基；步骤2、种子菌液制备；步骤3、菌种培养扩大；步骤4、制备液体活性乳化剂；步骤5、制备营养盐溶液；步骤6、制备活性辅助剂；步骤7、载体吸附，将步骤3中得到的复合液体微生物降解菌剂、活性辅助剂、以及载体按照7‑10:1:9‑12质量比混合，静置吸附反应32‑45h后于32‑45℃烘干至含水率不高于30％，得到复合活性固体菌剂。本发明通过制备培养基、种子菌液制备、菌种培养扩大、添加液体活性乳化剂、添加营养盐溶液、载体吸附后最终得到含水率不高于30％的复合活性固体菌剂，本发明应用于油田措施废液残渣中烃类的降解，降解效率高，效果好。

Description

一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法及应用

技术领域

本发明属于措施废液残渣处理术领域，特别涉及一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法及应用。

背景技术

石油中含有丰富的烃类物质，大部分的烃类对土壤、环境都是有害的，比如芳香烃类物质对人及动物的毒性较大，如果经较长时间较大浓度接触，会引起恶心、头疼、眩晕等症状。此外，石油中的多环芳烃类物质具有强烈的“三致”作用。泄漏的原油等烃类物质如遇明火，会造成火灾事故；如果泄漏的烃类进入受限空间内，VOC达到爆炸下限，极易发生爆炸，甚至造成群死群伤的灾难性事故发生。

措施废液是油田石油生产过程中各个工艺环节产生的多种液体废物的混合物，针对这措施废液的处理方式，常用的方式就是将措施废液运输到处理站，进行集中处理，实现油水分离，固液分离，最终得到的固体部分即为油田措施废液残渣。这些措施废液残渣中的烃类物质依然大量存在，属于一类固体危险废弃物。

发明内容

为了克服现有技术中措施废液残渣中烃类有机物降解效率低的问题，本发明提出了一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法及应用，该复合活性菌剂能有针对性的降解油田措施废液残渣的烃类物质，尤其是烯烃和烷烃类，且降解效果好。

本发明采用的技术方案为：

一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，具体的制备步骤如下：

步骤1、制备培养基

按比例称取硫酸铵、磷酸二氢钾、牛肉膏、硫酸镁、磷酸氢钠和氯化钙并溶解于蒸馏水中，得到pH值为6.5-7.5的培养基；

步骤2、种子菌液制备

将步骤1中制备的培养基分装于四个瓶中，115-125℃下灭菌25-35min后，对四个瓶中的培养基分别接种动胶菌、微球菌、葡萄球菌以及假单胞菌；接着于35-38℃培养20-25h后，得到动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液；

步骤3、菌种培养扩大

将步骤2中得到的动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液按比例混合得到混合种子菌液，接着将混合种子菌液接种至步骤1中制备的培养基上，于35-38℃混合培养45-55h后得到复合液体微生物降解菌剂；

步骤4、制备液体活性乳化剂

将活性乳化剂与酒精按照质量比为4-5:1的比例混合均匀，然后将混合后的液体与蒸馏水按质量比为1-2:1比例进行充分溶解，得到液体活性乳化剂；

步骤5、制备营养盐溶液

按比例称取硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素溶液溶解于蒸馏水中，搅拌均匀，得到营养盐溶液；

步骤6、制备活性辅助剂

将步骤4制备的液体活性乳化剂和步骤5制备的营养盐溶液按照1-1.5:1的体积比混合，得到活性辅助剂；

步骤7、载体吸附

将步骤3中得到的复合液体微生物降解菌剂、步骤6中得到的活性辅助剂、以及载体按照7-10:1:9-12质量比混合，静置吸附反应32-45h后于32-45℃烘干至含水率不高于30％，得到复合活性固体菌剂。

所述的步骤1中，硫酸铵、磷酸二氢钾、牛肉膏、硫酸镁、磷酸氢钠和氯化钙的质量比为1:1:3:0.01:1.2:0.19-0.021。

所述的步骤3中，动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液混合质量比为1-1.01:1:1:1-1.01。

所述的步骤3中，所述的混合种子菌液的质量占培养基质量的8-12％。

所述的步骤4中，活性乳化剂为吐温60、吐温80、斯盘80或斯盘85。

所述的步骤4中，活性乳化剂、酒精和蒸馏水的体积比8-12:1:84-94。

所述的酒精为质量浓度比为75％-95％酒精。

所述的步骤5中硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素溶液与蒸馏水的质量比为2.4-2.6:4:4:2:0.5:4:5-5.1:1000；所述的微量元素溶液中Zn²⁺的质量比为2.3-2.4％；Ca²⁺的质量比为0.17-0.8％；Cu²⁺的质量比为2.0％；Fe²⁺的质量比为0.68-0.70％，其余为水溶液质量。

所述的步骤7中的载体为麸皮或豆粕。

一种处理含油残渣的复合活性菌剂的应用，所述的复合活性固体菌剂应用于油田措施废液残渣中烃类的降解。

本发明的有益效果为：

1)本发明提供的一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法中复合活性菌剂中的各种微生物菌种采用了分别制备种子菌液的培养模式，有利于复合活性菌剂中各种微生物菌种保持最大菌数比例，避免了复合在一起时，其中某一种占据绝对优势，其他菌种数量被抑制的情况发生。

2)本发明在后期的扩大培养采用混合培养模式，有利于再保证每种微生物均能发挥作用情况下，节省生产成本，减少对生产设备的投入，提高生产过程可操作性。

3)本发明与常规处理菌剂的微生物成分不同，该复合活性菌剂中，除了微生物成分外，还添加了液体活性乳化剂成分，活性乳化剂可以促进处理体系中烃类物质向水相中迁移，增加乳化效果，进而促进微生物对其的催化氧化作用，提高烃类物质的去除效果；该复合活性菌剂与常规处理菌剂不同之处还在于补充添加了营养盐溶液成分。微生物生长过程中会消耗一定量的营养盐，导致处理后期营养盐缺乏，生长缓慢，降解效率降低，添加适量营养盐，保证菌种生长过程中能持续摄取到足够的营养盐。

以下将结合附图进行进一步的说明。

附图说明

图1是本发明一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法的制备过程示意图；

图2是本发明一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法实施例1中制备的复合活性固体菌剂得扫描电镜图；

图3是XJ动胶菌、XB芽孢杆菌、W6葡萄球菌对培养基中烷烃降解实验中的空白对照GC-MS图；

图4是XJ动胶菌、XB芽孢杆菌、W6葡萄球菌对培养基中烷烃降解实验中XB芽孢杆菌属降解后的GC-MS图；

图5是XJ动胶菌、XB芽孢杆菌、W6葡萄球菌对培养基中烷烃降解实验中XJ动胶菌属降解后的GC-MS图；

图6是XJ动胶菌、XB芽孢杆菌、W6葡萄球菌对培养基中烷烃降解实验中W6葡萄球菌属降解后的GC-MS图；

图7是XJ动胶菌、XB芽孢杆菌、W6葡萄球菌对培养基中烷烃降解实验中XH微球菌属、W6葡萄球菌属、W4链球菌属降解后的芳烃GC-MS图；

图8是Ba-J1假单胞菌对混合菌群降解率的影响实验效果图；

图9是Ba-J1假单胞菌的添加量对混合菌群降解率的影响实验效果图。

具体实施方式

实施例1：

为了克服现有技术中措施废液残渣中烃类有机物降解效率低的问题，本发明提出了一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法及应用，该复合活性菌剂能有针对性的降解油田措施废液残渣的烃类物质，尤其是烯烃和烷烃类，且降解效果好。

一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，具体的制备步骤如下：

步骤1、制备培养基

按比例称取硫酸铵、磷酸二氢钾、牛肉膏、硫酸镁、磷酸氢钠和氯化钙并溶解于蒸馏水中，得到pH值为6.5-7.5的培养基；

步骤2、种子菌液制备

将步骤1中制备的培养基分装于四个瓶中，115-125℃下灭菌25-35min后，对四个瓶中的培养基分别接种动胶菌、微球菌、葡萄球菌以及假单胞菌；接着于35-38℃培养20-25h后，得到动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液；

步骤3、菌种培养扩大

将步骤2中得到的动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液按比例混合得到混合种子菌液，接着将混合种子菌液接种至步骤1中制备的培养基上，于35-38℃混合培养45-55h后得到复合液体微生物降解菌剂；

步骤4、制备液体活性乳化剂

将活性乳化剂与酒精按照质量比为4-5:1的比例混合均匀，然后将混合后的液体与蒸馏水按质量比为1-2:1比例进行充分溶解，得到液体活性乳化剂；

步骤5、制备营养盐溶液

按比例称取硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素溶液溶解于蒸馏水中，搅拌均匀，得到营养盐溶液；

步骤6、制备活性辅助剂

将步骤4制备的液体活性乳化剂和步骤5制备的营养盐溶液按照1-1.5:1的体积比混合，得到活性辅助剂；

步骤7、载体吸附

将步骤3中得到的复合液体微生物降解菌剂、步骤6中得到的活性辅助剂、以及载体按照7-10:1:9-12质量比混合，静置吸附反应32-45h后于32-45℃烘干至含水率不高于30％，得到复合活性固体菌剂。

本发明中，动胶菌、微球菌、葡萄球菌以及假单胞菌均为现有菌种，可直接在市场上购买，购买厂家可以为上海烜雅生物或上海户实医药科技有限公司，本发明中将不再进行进一步的说明。

优选的，所述的步骤1中，硫酸铵、磷酸二氢钾、牛肉膏、硫酸镁、磷酸氢钠和氯化钙的质量比为1:1:3:0.01:1.2:0.19-0.021。

本发明中，瓶为锥形瓶，其锥形结构相对稳定，不易倾倒；瓶身上设有多个刻度，以标示所能盛载的容量。

本发明步骤1中，硫酸铵、磷酸二氢钾、牛肉膏、硫酸镁、磷酸氢钠和氯化钙的质量比优选为1:1:3:0.01:1.2:0.02。制备出的培养基其PH值为6.5-7.5。本发明中，培养基的制备过程为现有技术，本发明中将不再进行进一步的说明。

优选的，所述的步骤3中，动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液混合质量比为1-1.01:1:1:1-1.01。

优选的，所述的步骤3中，所述的混合种子菌液的质量占培养基质量的8-12％。

优选的，所述的步骤4中，活性乳化剂为吐温60、吐温80、斯盘80或斯盘85。

优选的，所述的步骤4中，活性乳化剂、酒精和蒸馏水的体积比8-12:1:84-94。

优选的，所述的酒精为质量浓度比为75％-95％酒精。

本发明中，由于斯盘80或斯盘85不溶于水，溶剂选取了酒精，根据需求选取酒精的质量浓度比，其优选为80％、85％、90％。本发发明中，质量浓度比为75％-95％酒精易溶解斯盘80或斯盘85，且溶解效果好。

优选的，所述的步骤5中硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素溶液与蒸馏水的质量比为2.4-2.6:4:4:2:0.5:4:5-5.1:1000，

本发明的步骤5中，硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素溶液与蒸馏水的质量比优选为2.5:4:4:2:0.5:4:5:1000。本发明中，制备营养盐溶液的方法为现有技术，本发明中将不再进行进一步的说明。

优选的，所述的微量元素溶液中Zn²⁺的质量比为2.3-2.4％；Ca²⁺的质量比为0.17-0.8％；Cu²⁺的质量比为2.0％；Fe²⁺的质量比为0.68-0.70％，其余为水溶液质量。

本发明中，微量元素至少包括锌、铜、铁、钙，所述的步骤5中的微量元素溶液中Zn²⁺的质量比优选为2.3％；Ca²⁺的质量比优选为0.17％；Cu²⁺的质量比优选为2.0％；Fe²⁺的质量比优选为0.68％，其余为水溶液质量。

优选的，所述的步骤7中的载体为麸皮或豆粕。

本发明与常规处理菌剂的微生物成分不同，该复合活性菌剂中，除了微生物成分外，还添加了液体活性乳化剂成分，活性乳化剂可以促进处理体系中烃类物质向水相中迁移，增加乳化效果，进而促进微生物对其的催化氧化作用，提高烃类物质的去除效果。本发明中复合活性菌剂中的各种微生物菌种采用了分别制备种子菌液的培养模式，有利于复合活性菌剂中各种微生物菌种保持最大菌数比例，避免了复合在一起时，其中某一种占据绝对优势，其他菌种数量被抑制的情况发生。

本发明在后期的扩大培养采用混合培养模式，有利于再保证每种微生物均能发挥作用情况下，节省生产成本，减少对生产设备的投入，提高生产过程可操作性。该复合活性菌剂与常规处理菌剂不同之处还在于补充添加了营养盐溶液成分。微生物生长过程中会消耗一定量的营养盐，导致处理后期营养盐缺乏，生长缓慢，降解效率降低，添加适量营养盐，保证菌种生长过程中能持续摄取到足够的营养盐。

本发明通过制备培养基、种子菌液制备、菌种培养扩大、添加液体活性乳化剂、添加营养盐溶液、载体吸附后最终得到含水率不高于30％的复合活性固体菌剂，本发明的复合活性菌剂应用于油田措施废液残渣中烃类的降解，降解效率高，效果好。

实施例2：

基于实施例1的基础上，本实施例中，提供一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，具体的制备流程如图1所示，制备步骤如下：

步骤1、制备培养基

按1:1:3:0.01:1.2:0.02的质量比称取硫酸铵、磷酸二氢钾、牛肉膏、硫酸镁、磷酸氢钠和氯化钙后溶解于蒸馏水中，得到pH值为7.0的培养基；

步骤2、种子菌液制备

将步骤1中制备的培养基分装于四个锥形瓶中，115℃下灭菌35min后，分别接种动胶菌、微球菌、葡萄球菌以及假单胞菌，接着于38℃培养20h后，得到动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液；

步骤3、菌种培养扩大

将步骤2中得到的动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液按1:1:1:1的体积比混合得到混合种子菌液，混合种子菌液按照培养基质量的8％接种至步骤1中制备的培养基上，于38℃混合培养48h后得到复合液体微生物降解菌剂；

步骤4、制备液体活性乳化剂

称取吐温60并与95％酒精以10:1的体积比混合均匀，接着加入蒸馏水充分溶解，使得95％酒精与蒸馏水的体积比为1:89，得到液体活性乳化剂；

步骤5、制备营养盐溶液

称取硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素液溶解于蒸馏水中，搅拌均匀，得到营养盐溶液；

其中，硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素液与蒸馏水的质量比为2.5:4:4:2:0.5:4:5:1000。

微量元素液中Zn²⁺的质量比为2.3％；Ca²⁺的质量比为0.17％；Cu²⁺的质量比为2.0％；Fe²⁺的质量比为0.68％，其余为水溶液质量。

步骤6、制备活性辅助剂

将液体活性乳化剂和营养盐溶液按照1:1的体积比混合，得到活性辅助剂；

步骤7、载体吸附

将步骤3中得到的复合液体微生物降解菌剂、步骤6中得到的活性辅助剂、以及麸皮按照7:1:9质量比混合，静置吸附反应36h后于42℃烘干至含水率不高于30％，得到复合活性固体菌剂。

使用实施例2中制备的该复合活性固体菌剂进行了含油残渣处理的实际应用。向含油残渣中按比例加入上述复合活性固体菌剂，定期检测残渣中含油率变化情况，从而分析该菌剂的应用效果。表1是含油率为3.99％的含油残渣中按比例分别加入0％、1％、2％、3％、4％、5％复合活性固体菌剂，每隔5天检测残渣中的含油率。

表1含油率为3.99％含油残渣因不同菌剂添加量的含油率变化

从表1中可以看出，添加菌剂可以去除含油残渣中的石油烃，降低含油率。5％菌剂添加量处理效果最好，在处理30d后，含油残渣含油率可由3.99％降低至0.70％，提高了82.46％。

实施例3：

基于实施例1的基础上，本实施例中，一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，具体的制备流程如图1所示，制备步骤如下：

步骤1、制备培养基

按1:1:3:0.01:1.2:0.02的质量比称取硫酸铵、磷酸二氢钾、牛肉膏、硫酸镁、磷酸氢钠和氯化钙后溶解于蒸馏水中，得到pH值为7.0的培养基；

步骤2、种子菌液制备

将步骤1中制备的培养基分装于四个锥形瓶中，125℃下灭菌25min后，分别接种动胶菌、微球菌、葡萄球菌以及假单胞菌，接着于35℃培养25h后，得到动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液；

步骤3、菌种培养扩大

将步骤2中得到的动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液按1:1:1:1的体积比混合得到混合种子菌液，混合种子菌液按照培养基质量的10％接种至步骤1中制备的培养基上，于35℃混合培养55h后得到复合液体微生物降解菌剂；

步骤4、制备液体活性乳化剂

称取吐温80并与95％酒精以12:1的体积比混合均匀，接着加入蒸馏水充分溶解，使得95％酒精与蒸馏水的体积比为1:84，得到液体活性乳化剂；

步骤5、制备营养盐溶液

称取硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素液溶解于蒸馏水中，搅拌均匀，得到营养盐溶液；

其中，硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素液与蒸馏水的质量比为2.5:4:4:2:0.5:4:5:1000。

微量元素液中Zn²⁺的质量比为2.3％；Ca²⁺的质量比为0.17％；Cu²⁺的质量比为2.0％；Fe²⁺的质量比为0.68％，其余为水溶液质量。

步骤6、制备活性辅助剂

将液体活性乳化剂和营养盐溶液按照1:1的体积比混合，得到活性辅助剂；

步骤7、载体吸附

将步骤3中得到的复合液体微生物降解菌剂、步骤6中得到的活性辅助剂、以及豆粕按照8:1:10质量比混合，静置吸附反应45h后于32℃烘干至含水率不高于30％，得到复合活性固体菌剂。

使用实施例3中制备的复合活性固体菌剂进行了含油残渣处理的实际应用。向含油残渣中按比例加入上述复合活性固体菌剂，定期检测残渣中含油率变化情况，从而分析该菌剂的应用效果。表2是含油率为10.59％的含油残渣中按比例分别加入0％、1％、2％、3％、4％、5％复合活性固体菌剂，每隔5天检测残渣中的含油率。

表2含油率为10.59％含油残渣因不同菌剂添加量的含油率变化

从表2中可以看出，添加菌剂可以去除含油残渣中的石油烃，降低含油率。5％菌剂添加量处理效果最好，在处理30d后，含油残渣含油率可由10.59％降低至0.85％。提高了91.97％。

实施例4：

基于实施例1的基础上，本实施例中提供一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，具体的制备流程如图1所示，制备步骤如下：

步骤1、制备培养基

按1:1:3:0.01:1.2:0.02的质量比称取硫酸铵、磷酸二氢钾、牛肉膏、硫酸镁、磷酸氢钠和氯化钙后溶解于蒸馏水中，得到pH值为7.0的培养基；

步骤2、种子菌液制备

将步骤1中制备的培养基分装于四个锥形瓶中，120℃下灭菌30min后，分别接种动胶菌、微球菌、葡萄球菌以及假单胞菌，接着于36℃培养22h后，得到动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液；

步骤3、菌种培养扩大

将步骤2中得到的动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液按1:1:1:1的体积比混合得到混合种子菌液，混合种子菌液按照培养基质量的12％接种至步骤1中制备的培养基上，于36℃混合培养48h后得到复合液体微生物降解菌剂；

步骤4、制备液体活性乳化剂

称取斯盘80并与95％酒精以10:1的体积比混合均匀，接着加入蒸馏水充分溶解，使得95％酒精与蒸馏水的体积比为1:89，得到液体活性乳化剂；

步骤5、制备营养盐溶液

称取硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素液溶解于蒸馏水中，搅拌均匀，得到营养盐溶液；

其中，硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素液与蒸馏水的质量比为2.5:4:4:2:0.5:4:5:1000。

微量元素液中Zn²⁺的质量比为2.3％；Ca²⁺的质量比为0.17％；Cu²⁺的质量比为2.0％；Fe²⁺的质量比为0.68％，其余为水溶液质量。

步骤6、制备活性辅助剂

将液体活性乳化剂和营养盐溶液按照1:1的体积比混合，得到活性辅助剂；

步骤7、载体吸附

将步骤3中得到的复合液体微生物降解菌剂、步骤6中得到的活性辅助剂、以及麸皮按照10:1:9质量比混合，静置吸附反应40h后于40℃烘干至含水率不高于30％，得到复合活性固体菌剂。

使用实施例4中制备的复合活性固体菌剂进行了含油残渣处理的实际应用。向含油残渣中按比例加入上述复合活性固体菌剂，定期检测残渣中含油率变化情况，从而分析该菌剂的应用效果。表3是含油率为3.99％的含油残渣中按比例添加5％复合活性固体菌剂与不添加菌剂的对照处理实验。每隔5天检测残渣中的含油率。

表3 5％菌剂添加量对含油率为3.99％含油残渣处理效果

从表3中可以看出，添加菌剂可以去除含油残渣中的石油烃，降低含油率。5％菌剂添加量处理30d后，含油残渣含油率可由3.99％降低至0.69％。提高了82.70％。

实施例5：

基于实施例1的基础上，本实施例中提供一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，具体的制备流程如图1所示，制备步骤如下：

步骤1、制备培养基

按1:1:3:0.01:1.2:0.02的质量比称取硫酸铵、磷酸二氢钾、牛肉膏、硫酸镁、磷酸氢钠和氯化钙后溶解于蒸馏水中，得到pH值为7.0的培养基；

步骤2、种子菌液制备

将步骤1中制备的培养基分装于四个锥形瓶中，122℃下灭菌27min后，分别接种动胶菌、微球菌、葡萄球菌以及假单胞菌，接着于37℃培养21h后，得到动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液；

步骤3、菌种培养扩大

将步骤2中得到的动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液按1:1:1:1的体积比混合得到混合种子菌液，混合种子菌液按照培养基质量的11％接种至步骤1中制备的培养基上，于37℃混合培养45h后得到复合液体微生物降解菌剂；

步骤4、制备液体活性乳化剂

称取斯盘85并与95％酒精以8:1的体积比混合均匀，接着加入蒸馏水充分溶解，使得95％酒精与蒸馏水的体积比为1:94，得到液体活性乳化剂；

步骤5、制备营养盐溶液

称取硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素液溶解于蒸馏水中，搅拌均匀，得到营养盐溶液；

其中，硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素液与蒸馏水的质量比为2.5:4:4:2:0.5:4:5:1000。

微量元素液中Zn²⁺的质量比为2.3％；Ca²⁺的质量比为0.17％；Cu²⁺的质量比为2.0％；Fe²⁺的质量比为0.68％，其余为水溶液质量。

步骤6、制备活性辅助剂

将液体活性乳化剂和营养盐溶液按照1:1的体积比混合，得到活性辅助剂；

步骤7、载体吸附

将步骤3中得到的复合液体微生物降解菌剂、步骤6中得到的活性辅助剂、以及豆粕按照7:1:12质量比混合，静置吸附反应32h后于45℃烘干至含水率不高于30％，得到复合活性固体菌剂。

使用实施例5中制备的复合活性固体菌剂进行了含油残渣处理的实际应用。向含油残渣中按比例加入上述复合活性固体菌剂，定期检测残渣中含油率变化情况，从而分析该菌剂的应用效果。表4是含油率为10.59％的含油残渣中按5％比例添加复合活性固体菌剂和不添加菌剂的处理对比，每隔5天检测残渣中的含油率。

表4 5％菌剂添加量对含油率为10.59％含油残渣处理效果

从表4中可以看出，添加菌剂可以去除含油残渣中的石油烃，降低含油率。5％菌剂添加量处理30d后，含油残渣含油率可由10.59％降低至0.96％。提高了90.93％。

实施例6：

基于实施例1的基础上，本实施例中提供一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，具体的制备流程如图1所示，制备步骤如下：

步骤1、制备培养基

按1:1:3:0.01:1.2:0.02的质量比称取硫酸铵、磷酸二氢钾、牛肉膏、硫酸镁、磷酸氢钠和氯化钙后溶解于蒸馏水中，得到pH值为7.0的培养基；

步骤2、种子菌液制备

将步骤1中制备的培养基分装于四个锥形瓶中，118℃下灭菌33min后，分别接种动胶菌、微球菌、葡萄球菌以及假单胞菌，接着于38℃培养20h后，得到动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液；

步骤3、菌种培养扩大

将步骤2中得到的动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液按1:1:1:1的体积比混合得到混合种子菌液，混合种子菌液按照培养基质量的9％接种至步骤1中制备的培养基上，于38℃混合培养45h后得到复合液体微生物降解菌剂；

步骤4、制备液体活性乳化剂

称取斯盘85并与95％酒精以11:1的体积比混合均匀，接着加入蒸馏水充分溶解，使得95％酒精与蒸馏水的体积比为1:90，得到液体活性乳化剂；

步骤5、制备营养盐溶液

称取硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素液溶解于蒸馏水中，搅拌均匀，得到营养盐溶液；

其中，硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素液与蒸馏水的质量比为2.5:4:4:2:0.5:4:5:1000。

微量元素液中Zn²⁺的质量比为2.3％；Ca²⁺的质量比为0.17％；Cu²⁺的质量比为2.0％；Fe²⁺的质量比为0.68％，其余为水溶液质量。

步骤6、制备活性辅助剂

将液体活性乳化剂和营养盐溶液按照1:1的体积比混合，得到活性辅助剂；

步骤7、载体吸附

将步骤3中得到的复合液体微生物降解菌剂、步骤6中得到的活性辅助剂、以及豆粕按照9:1:11质量比混合，静置吸附反应45h后于45℃烘干至含水率不高于30％，得到复合活性固体菌剂。

使用实施例6中制备的复合活性固体菌剂进行了含油残渣处理的实际应用。向含油残渣中按比例加入上述复合活性固体菌剂，定期检测残渣中含油率变化情况，从而分析该菌剂的应用效果。表5是含油率为3.99％的含油残渣中按比例添加5％复合活性固体菌剂与不添加菌剂的对照处理实验。每隔5d检测残渣中的含油率。

表5 5％菌剂添加量对含油率为3.99％含油残渣处理效果

从表5中可以看出，添加菌剂可以去除含油残渣中的石油烃，降低含油率。5％菌剂添加量在处理30d后，含油残渣含油率可由3.99％降低至0.59％。提高了85.21％。

本发明中，图2为上述的实施例2中制备的复合活性固体菌剂得扫描电镜图，由图2可知，该复合活性固体菌剂在扫描电镜下可见菌体形态正常，浓度较高，在载体表面分布较为均匀，吸附稳固。

本发明的方法中四种菌种选择过程如下：

(1)高效石油降解菌的GC-MS分析

a、实验材料

菌株：XJ动胶菌属、XH微球菌属、XB芽孢杆菌属、W4链球菌属、W6葡萄球菌属

原油：采自长庆油田采油一厂

烷烃、芳烃：分别为原油分离组分

烷烃降解培养基：硝酸铵2.0g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾0.5g，无水氯化钙0.02g，七水硫酸镁0.5g，氯化钠5.0g，原油3.0g，蒸馏水1000mL，pH为7

芳烃降解培养基：硝酸铵2.0g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾0.5g，无水氯化钙0.02g，七水硫酸镁0.5g，氯化钠5.0g，分离芳烃3.0g，蒸馏水1000mL，pH为7

b、实验方法

①XJ动胶菌属、XB芽孢杆菌属、W6葡萄球菌属降解烷烃后GC-MS分析

将XJ动胶菌属、XB芽孢杆菌属和W6葡萄球菌属活化培养24h后，制成一定浓度的菌悬液(OD600＝0.50)，接于灭菌烷烃降解培养基中，30℃，100r/min下恒温震荡培养9d后，加入30mL石油醚萃取降解产物，将菌液离心后，转到分液漏斗，收集上层液，并用石油醚多次洗涤，合并上层液，无水硫酸钠脱水后，于65℃烘箱中烘干，置于干燥器中冷却。将回收得到的残油重新溶解在石油醚(色谱纯)中，取1μL样品进行上样GC-MS分析，同时设不接菌组作为空白对照。

GC-MS(HP-5MS，30.0m×250μm×0.25μm)运行条件：检测器温度为300℃，进样口温度为280℃，柱温80℃，恒温5min，以3℃/min升温至290℃，保留10min采用分流进样；载气为He，流速1mL/min。

②XH微球菌属、W4链球菌属、W6葡萄球菌属降解处理后芳烃的GC-MS分析

分别取W4链球菌属、W6葡萄球菌属、XH微球菌属各1mL稀释后的菌悬液加入到含有100mL芳烃降解培养基的250mL三角瓶中。每4d测一次降解率，降解持续12d，降解剩余底物用相同体积分析纯二氯甲烷萃取2次。二氯甲烷完全挥发后，用色谱纯二氯甲烷复溶，使复溶后浓度在100-500ppm，过0.22μm有机相滤膜后，装入2mL GC-MS自动进样瓶中，用GC-MS检测。不接菌种的培养基作为对照，每个样品做3个平行。

c、实验结果

①XJ动胶菌属、XB芽孢杆菌属、W6葡萄球菌属的烷烃降解后培养液GC-MS分析

XJ动胶菌、XB芽孢杆菌、W6葡萄球菌中烷烃降解菌对培养基中烷烃降解的GC-MS变化见图3至图6。

由图3可知，实验所用原油中的主要成分为C16-C28的烷烃，约占67.0％，即原油中主要为中长链和长链烷烃，短链烷烃含量相对较少。

由图4可知，经过菌株XB芽孢杆菌属的降解，可看到长链的C21、C27、C28、C35、C39峰消失，说明菌株XB芽孢杆菌属对于长链烃的降解效果显著。降解后C17明显有所增加，这是长链烃被降解为较短链烃所致。

由图5所示，经过XJ动胶菌属菌株的降解，不同碳链组分的峰高得到了明显降低，长链烃减少的十分明显，并且它们的降解范围均比XB芽孢杆菌属菌株的降解范围大，峰高的降低程度均优于XB芽孢杆菌属菌株，显示出了较宽的碳链利用范围。

由图6所示，经过W6葡萄球菌属菌株降解后，各碳链组分的峰高也均得到明显降低，特别是C13、C14、C15、C16、C18峰消失，说明W6葡萄球菌属对短碳链降解效果显著，而C22、C26、C32因为较长链烃被降解而有所增加。W6葡萄球菌属菌株的碳链利用范围最广，但峰高的降低程度不如XB芽孢杆菌属和XJ动胶菌属。

综上分析，初选的3株菌，XB芽孢杆菌属、XJ动胶菌属和W6葡萄球菌属均有较宽的碳链利用范围，均有很好的烷烃降解能力。经XB芽孢杆菌属、XJ动胶菌属和W6葡萄球菌属降解后，不同碳链组分的峰高均有不同程度的降低，其中XJ动胶菌属峰高的降低程度均优于XB芽孢杆菌属和W6葡萄球菌属，其次XB芽孢杆菌属峰高的降低程度优于W6葡萄球菌属，说明XJ动胶菌属是一株降解烷烃性能较好的菌株。3株菌降解能力的大小依次为：XJ动胶菌属>XB芽孢杆菌属>W6葡萄球菌属。

②XH微球菌属、W4链球菌属、W6葡萄球菌属的芳烃降解后培养液GC-MS分析

三株对芳烃有最好降解能力的菌种用于芳烃降解实验研究，培养液中芳烃GC-MS变化情况见图7。

由图7可知，XH微球菌属、W6葡萄球菌属和W4链球菌属降解芳烃后的峰值均低于空白对照组，尤其是XH微球菌属的降解峰值最低，W6葡萄球菌属、W4链球菌属的降解峰值相对较高。图7说明3株菌芳烃降解峰值的高低与其降解率成负相关性，降解峰值越低，降解率越大，同时说明XH微球菌属具有较好的降解芳烃的能力。表明，初选的3株菌均对芳烃有很好的降解能力，降解能力的大小为：XH微球菌属>W6葡萄球菌属>W4链球菌属。

(2)高效石油降解菌株间的拮抗分析

将下表6中的3株菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基中活化培养24h，吸取培养液按不同梯度稀释后制成菌悬液，在无菌条件下将其中一菌株的菌悬液与冷却至40℃左右的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基混合均匀后倒平板，于平板上放置三个牛津杯，然后吸取其他某一菌株的菌悬液加入牛津杯，每组设三个平行实验，30℃培养24h后观察，若出现抑菌圈，则说明两种菌株生长相拮抗，反之则无拮抗。用此方法进行3株降解菌中两两组合的拮抗实验。

表6单个菌株之间的拮抗作用分析

通过3株菌两两组合进行拮抗作用分析可知，只有菌株XB芽孢杆菌属和W4链球菌属之间存在着一定的拮抗作用。可以在平板上观察到直径约为15mm的透明抑菌圈，说明这两种菌在共同培养时一种菌会对另一株菌产生抑制作用的可能，在进行菌种组合的时候，应该考虑将其分开。

XB芽孢杆菌属和W4链球菌属与其他三株菌以及其他三株菌之间均无拮抗作用的现象。又由图7GC-MS分析可知，XJ动胶菌属、XB芽孢杆菌属和W6葡萄球菌属对于烷烃具有较好的降解能力，其中XJ动胶菌属、XB芽孢杆菌属可降解较宽范围的中长链烃和长链烃，而W6葡萄球菌属对短链烃有较好的降解能力，3株菌可互补降解烷烃。XH微球菌属、W6葡萄球菌属、W4链球菌属对于芳烃也有一定的降解效果，其中XH微球菌属的降解效果为最佳，又因为XB芽孢杆菌属和W4链球菌属之间存在拮抗作用。

综合分析后最终选取XJ动胶菌属、XH微球菌属、W6葡萄球菌属等3株菌用于构建复合菌群。

(3)假单胞菌与降解菌的拮抗分析

将保藏的Ba-J1假单胞菌与降油菌株XJ动胶菌属、XH微球菌属、W6葡萄球菌属转接活化后接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中制成菌悬液，按不同浓度梯度稀释至OD600＝0.5，在无菌条件下将Ba-J1的菌悬液与冷却至40左右的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基混合均匀后倒平板，于平板上放置3个牛津杯，然后吸取其他任一菌株的菌悬液加入牛津杯，每组设三个平行实验，于35℃培养24h后观察。

Ba-J1与各降解菌株的拮抗作用如下表7所示。

表7 Ba-J1假单胞菌与XJ动胶菌、XH微球菌、W6葡萄球菌之间的拮抗作用分析

由表7可知，Ba-J1假单胞菌与降解菌株XJ动胶菌属、XH微球菌属和W6葡萄球菌属均无拮抗作用，因此可考虑由这四种菌组成混合菌群对样品进行降油处理。

(4)假单胞菌对混合菌群降解效果的影响

将Ba-J1假单胞菌与XJ动胶菌、XH微球菌、W6葡萄球菌活化后制成菌悬液并稀释至OD600＝0.5，在无菌操作下，吸取XJ动胶菌属、XH微球菌属、W6葡萄球菌属各2mL的菌悬液混合至100mL的原油降解培养基中，在另一100mL原油降解培养基中接入4株菌各2％，在30℃、160r/min条件下摇床培养7d后用超声萃取-紫外分光光度法测其降油率。

原油降解培养基中仅接种XJ动胶菌属、XH微球菌属、W6葡萄球菌属共3株菌(对照组)

原油降解培养基中同时接入Ba-J1假单胞菌、XJ动胶菌属、XH微球菌属、W6葡萄球菌属共4株菌(处理组)

Ba-J1假单胞菌对混合菌群降解率的影响如图8所示。

由图8可知，加入Ba-J1假单胞菌后的混合菌群降解率为84.22％，明显高于不加假单胞菌Ba-J1的混合菌群降解率75.69％，说明加入含Ba-J1假单胞菌的混合菌群的降解能力明显增强。因为Ba-J1假单胞菌加入后，产生的表面活性剂可乳化样品中的油污成分，并与其他三种菌产生协同作用，使得混合菌群的降油效果明显提高。

Ba-J1假单胞菌的添加量对混合菌群降解率的影响如图4所示：

由图9可知，当Ba-J1假单胞菌的添加量小于4mL/L时，混合菌群的降解率随添加量的增加而增大。当Ba-J1假单胞菌的添加量为4mL/L时，混合菌群的降解率达到最大为85.24％，而当Ba-J1假单胞菌的添加量大于4mL/L时，混合菌群的降解率呈平缓下降趋势，这是因为超过最适浓度时，抑制了降解菌群中菌的生长，但菌群中菌的数量足以降解原油组分，从而使得混合菌群降解率缓慢降低。

以上举例仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。本发明中未详细描述的菌株及其制备方法和试验过程均为现有技术，本发明中将不再进行进一步的说明。

Claims (10)

1.一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，其特征在于：具体的制备步骤如下：

步骤1、制备培养基

按比例称取硫酸铵、磷酸二氢钾、牛肉膏、硫酸镁、磷酸氢钠和氯化钙并溶解于蒸馏水中，得到pH值为6.5-7.5的培养基；

步骤2、种子菌液制备

将步骤1中制备的培养基分装于四个瓶中，115-125℃下灭菌25-35min后，对四个瓶中的培养基分别接种动胶菌、微球菌、葡萄球菌以及假单胞菌；接着于35-38℃培养20-25h后，得到动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液；

步骤3、菌种培养扩大

将步骤2中得到的动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液按比例混合得到混合种子菌液，接着将混合种子菌液接种至步骤1中制备的培养基上，于35-38℃混合培养45-55h后得到复合液体微生物降解菌剂；

步骤4、制备液体活性乳化剂

将活性乳化剂与酒精按照质量比为4-5:1的比例混合均匀，然后将混合后的液体与蒸馏水按质量比为1-2:1比例进行充分溶解，得到液体活性乳化剂；

步骤5、制备营养盐溶液

按比例称取硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素溶液溶解于蒸馏水中，搅拌均匀，得到营养盐溶液；

步骤6、制备活性辅助剂

将步骤4制备的液体活性乳化剂和步骤5制备的营养盐溶液按照1-1.5:1的体积比混合，得到活性辅助剂；

步骤7、载体吸附

将步骤3中得到的复合液体微生物降解菌剂、步骤6中得到的活性辅助剂、以及载体按照7-10:1:9-12质量比混合，静置吸附反应32-45h后于32-45℃烘干至含水率不高于30％，得到复合活性固体菌剂。

2.根据权利要求1所述的一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤1中，硫酸铵、磷酸二氢钾、牛肉膏、硫酸镁、磷酸氢钠和氯化钙的质量比为1:1:3:0.01:1.2:0.19-0.021。

3.根据权利要求1所述的一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中，动胶菌种子菌液、微球菌种子菌液、葡萄球菌种子菌液以及假单胞菌种子菌液混合质量比为1-1.01:1:1:1-1.01。

4.根据权利要求1所述的一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中，所述的混合种子菌液的质量占培养基质量的8-12％。

5.根据权利要求1所述的一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤4中，活性乳化剂为吐温60、吐温80、斯盘80或斯盘85。

6.根据权利要求1所述的一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤4中，活性乳化剂、酒精和蒸馏水的体积比8-12:1:84-94。

7.根据权利要求1所述的一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，其特征在于：所述的酒精为质量浓度比为75％-95％酒精。

8.根据权利要求1所述的一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤5中硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、酵母膏、磷酸氢钠以及微量元素溶液与蒸馏水的质量比为2.4-2.6:4:4:2:0.5:4:5-5.1:1000；所述的微量元素溶液中Zn²⁺的质量比为2.3-2.4％；Ca²⁺的质量比为0.17-0.8％；Cu²⁺的质量比为2.0％；Fe²⁺的质量比为0.68-0.70％，其余为水溶液质量。

9.根据权利要求1所述的一种处理含油残渣的复合活性菌剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤7中的载体为麸皮或豆粕。

10.根据权利要求1-9所述任意的一种处理含油残渣的复合活性菌剂的应用，其特征在于：所述的复合活性固体菌剂应用于油田措施废液残渣中烃类的降解。

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