CN116103163A

CN116103163A - 镰刀菌及其应用

Info

Publication number: CN116103163A
Application number: CN202211733997.2A
Authority: CN
Inventors: 罗梃楷; 孙超; 刘会川; 孙浩; 丁波; 曾春玲; 刘喜荣
Original assignee: Hunan Chengda Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hunan Chengda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-05-12

Abstract

本申请提供了一株镰刀菌及其应用，所述镰刀菌(Fusarium sp.)已于2022年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 20222093。该镰刀菌能够在仅有橄榄油诱导的条件下产胆固醇酯酶，无需添加有机溶剂和表面活性剂，具有工艺简单、产酶效率高、安全环保、对人体无毒害作用等特点。

Description

镰刀菌及其应用

技术领域

本申请涉及微生物技术领域，特别是涉及一种镰刀菌及其应用。

背景技术

胆固醇酯酶(Cholesterol esterase)是一种重要的甾体酯酶，在食品、医药、造纸等行业具有广泛的用途。甾体或类固醇类化合物广泛的分布于生物界，存在于多种动物组织和微生物细胞中，它们担当着多种多样的功能，参与构成有机体或作为生命体内中重要的活性物质。固醇类(sterols)又称为甾醇类，是类固醇类的一个大类，在植物体内一般不含胆固醇而含有豆固醇(stigmasterol)、谷固醇(sitosterol)，这些甾体不能被动物吸收利用；胆固醇只存在于动物体内，是脊椎动物细胞的重要成分，也是动物体内重要的活性物质或其前体物质。

胆固醇酯酶是催化胆固醇酯水解成胆固醇和脂肪酸的一种酶。近些年的研究表明，很多的人类多发症，如心脑血管疾病、肝胆疾病、肾病、糖尿病等，都与人体的胆固醇代谢异常有关联，测定血浆总胆固醇的含量己经成为临床诊断中的一个重要参考指标。

传统的胆固醇酯酶的制备工艺例如：

中国发明专利申请CN109456953A记载了一种由镰刀菌发酵制备的胆固醇酯酶，由此制备的酶具有良好的水解胆固醇酯的功能；表明使用镰刀菌制备胆固醇酯酶是可行的。

中国发明专利申请CN109971735A记载了一种胆固醇酯酶的制备方法，通过添加有机溶剂和表面活性剂制备耐高温、耐有机溶剂的胆固醇酯酶；其中表面活性剂为曲拉通X-100(Triton X-100)，具有亲水端和疏水端，不易受强电解质无机盐类的影响，能与生物膜中的磷脂等脂质结合形成可溶性复合物；但其具有微毒性，对人体造成一定的损害，在后续步骤中还需除去残留的曲拉通X-100，工艺繁琐复杂。

因此，采用微生物制备胆固醇酯酶是可行的，发掘新的微生物资源至关重要。

发明内容

基于此，本申请实施例的主要目包括提供一株镰刀菌，该菌株能够在仅有橄榄油诱导的条件下产胆固醇酯酶。

根据本申请的一个方面，提供了一种镰刀菌(Fusarium sp.)，所述菌株已于2022年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 20222093。

根据本申请的另一个方面，提供了一种胆固醇酯酶的制备方法，所述制备方法包括使用上述的镰刀菌制备胆固醇酯酶的步骤。

在其中一个实施例中，使用上述的镰刀菌制备胆固醇酯酶的步骤，包括：

将所述镰刀菌接种于发酵培养基中进行发酵培养；和

在发酵培养的产物中添加橄榄油进行诱导培养，制备胆固醇酯酶。

在其中一个实施例中，所述橄榄油的浓度为0.5％(v/v)～1.5％(v/v)。

在其中一个实施例中，所述发酵培养基包含水以及酵母粉、蛋白胨、甘油、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。

在其中一个实施例中，所述酵母粉的质量浓度为2.2％(w/v)～2.6％(w/v)；所述蛋白胨的质量浓度为1.0％(w/v)～1.4％(w/v)；所述甘油的质量浓度为0.4％(w/v)～0.6％(w/v)；所述磷酸二氢钾的质量浓度为0.18％(w/v)～0.22％(w/v)；和，所述磷酸氢二钾的质量浓度为1.6％(w/v)～2.0％(w/v)。

在其中一个实施例中，发酵培养的条件包括：温度为29℃～31℃，培养时间为8h～12h，转速为380rpm～420rpm。

在其中一个实施例中，所述镰刀菌是以种子液的形式接种于所述发酵培养基，所述种子液的制备步骤包括：

将所述镰刀菌接种到平板培养基或斜面培养基上进行培养；和

从所得菌落中挑选单菌落接种到种子培养基中进行培养，制备种子液。

在其中一个实施例中，所述平板培养基或者斜面培养基包含水以及0.8％(v/v)～1.2％(v/v)葡萄糖、0.8％(v/v)～1.2％(v/v)蛋白胨、0.4％(v/v)～0.6％(v/v)酵母粉、0.8％(v/v)～1.2％(v/v)土豆淀粉和0.8％(v/v)～1.2％(v/v)琼脂粉。

在其中一个实施例中，所述种子培养基包含水以及0.8％(v/v)～1.2％(v/v)葡萄糖、0.8％(v/v)～1.2％(v/v)蛋白胨、0.4％(v/v)～0.6％(v/v)酵母粉和0.8％(v/v)～1.2％(v/v)土豆淀粉。

与传统技术相比，本申请至少具有如下有益效果：

本申请提供了一株镰刀菌，使用该镰刀菌能够在仅有橄榄油诱导的条件下产胆固醇酯酶，无需添加有机溶剂和表面活性剂，具有工艺简单、产酶效率高、安全环保、对人体无毒害作用等特点。

此外，本申请的胆固醇酯酶的制备方法工艺简便、安全无毒害作用，适合在工业上推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例1中菌株鉴定的电泳检测图；

图2为本申请实施例2中4种菌株产胆固醇酯酶后的薄层色谱分析图，从左至右依次为根瘤菌、荧光假单胞菌、伯克霍尔德氏菌和本申请的镰刀菌。

本申请提供的镰刀菌DL，已于2022年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 20222093。

具体实施方式

为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

术语

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。

本申请中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本申请中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

本申请中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。

本申请的一些实施方式提供了一株镰刀菌(Fusarium sp.)DL，该镰刀菌已于2022年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 20222093。

中国发明专利申请CN109456953A提供了一种由镰刀菌发酵制备的胆固醇酯酶，由此制备的酶具有良好的水解胆固醇酯的功能；表明使用镰刀菌制备胆固醇酯酶是可行的。本领域技术人员应当知晓，微生物酶的发酵制备是由微生物的生化活动和环境条件相互作用完成，培养基成分、培养条件(即温度、湿度、pH等)都会影响微生物的生长速度和酶的形成能力。

基于此，本申请的一些实施方式还提供了一种胆固醇酯酶的制备方法。

在其中一些实施方式中，该制备方法包括使用如上所述的镰刀菌制备胆固醇酯酶的步骤。

在其中一些实施方式中，上述制备胆固醇酯酶的步骤，包括：

将镰刀菌接种于发酵培养基中进行发酵培养；和

在其中一些实施方式中，上述橄榄油的浓度为0.5％(v/v)～1.5％(v/v)。

可以理解的是，上述橄榄油的浓度是指发酵培养基中添加的橄榄油的体积百分比。

进一步地，上述橄榄油的浓度为0.8％(v/v)～1.2％(v/v)。

更进一步地，上述橄榄油的浓度为1.0％(v/v)。

可以理解的是，橄榄油能够有效地诱导微生物产酶，但是橄榄油浓度过高时会抑制酶的形成，浓度过低时诱导效果不明显；因此，本申请的胆固醇酯酶的制备方法中诱导剂的浓度为0.5％(v/v)～1.5％(v/v)。

在其中一些实施方式中，上述发酵培养基包含水以及酵母粉、蛋白胨、甘油、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或多种。

可以理解的是，酵母粉能够为菌株的生长提供优质蛋白、完整的氨基酸以及必需的前体物质；蛋白胨中含有丰富的氨基酸以及微生物生长所需要的维生素和其他生长因子；甘油可以作为微生物代谢和生长所需的碳源；磷酸二氢钾和磷酸氢二钾可以作为无机盐促进微生物的基础代谢、影响代谢产物的合成，同时对培养基的pH值具有缓冲作用，能够维持微生物生长所需的pH值；

在其中一些具体示例中，上述发酵培养基中，酵母粉的质量浓度为2.2％(w/v)～2.6％(w/v)；蛋白胨的质量浓度为1.0％(w/v)～1.4％(w/v)；甘油的质量浓度为0.4％(w/v)～0.6％(w/v)；磷酸二氢钾的质量浓度为0.18％(w/v)～0.22％(w/v)；磷酸氢二钾的质量浓度为1.6％(w/v)～2.0％(w/v)。

进一步地，酵母粉的质量浓度为2.2％(w/v)～2.5％(w/v)；蛋白胨的质量浓度为1.0％(w/v)～1.2％(w/v)；甘油的质量浓度为0.4％(w/v)～0.5％(w/v)；磷酸二氢钾的质量浓度为0.18％(w/v)～0.20％(w/v)；磷酸氢二钾的质量浓度为1.8％(w/v)～2.0％(w/v)。

更进一步地，酵母粉的质量浓度为2.4％(w/v)～2.5％(w/v)；蛋白胨的质量浓度为1.1％(w/v)～1.2％(w/v)；甘油的质量浓度为0.4％(w/v)～0.5％(w/v)；磷酸二氢钾的质量浓度为0.19％(w/v)～0.20％(w/v)；磷酸氢二钾的质量浓度为1.8％(w/v)～1.9％(w/v)。

在一个具体示例中，酵母粉的质量浓度为2.4％(w/v)；蛋白胨的质量浓度为1.2％(w/v)；甘油的质量浓度为0.5％(w/v)；磷酸二氢钾的质量浓度为0.20％(w/v)；磷酸氢二钾的质量浓度为1.8％(w/v)。

在其中一些实施方式中，上述发酵培养基由水以及酵母粉、蛋白胨、甘油、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾组成。

在其中一些实施方式中，上述胆固醇酯酶的制备方法中，发酵培养的条件包括：温度为29℃～31℃，培养时间为8h～12h，转速为380rpm～420rpm。

进一步地，上述胆固醇酯酶的制备方法中，发酵培养的条件包括：温度为30℃，培养时间为8h～12h，转速为400rpm。

在一个具体示例中，发酵培养的条件包括：温度为30℃，培养时间为8h，转速为400rpm。

在其中一些实施方式中，上述胆固醇酯酶的制备方法中，添加橄榄油进行诱导培养的条件包括：温度为29℃～31℃，pH值为4.5～5.5。

在一个具体示例中，上述胆固醇酯酶的制备方法中，添加橄榄油进行诱导培养的条件包括：温度为30℃，pH值为5.0。

在其中一些实施方式中，上述胆固醇酯酶的制备方法中，镰刀菌是以种子液的形式接种于发酵培养基，种子液的制备步骤包括S10和S20。

步骤S10：将镰刀菌接种到平板培养基或斜面培养基上进行培养；

步骤S20：从所得菌落中挑选单菌落接种到种子培养基中进行培养，制备种子液。

在其中一些实施方式中，平板培养基或斜面培养基包含水以及0.8％(v/v)～1.2％(v/v)葡萄糖、0.8％(v/v)～1.2％(v/v)蛋白胨、0.4％(v/v)～0.6％(v/v)酵母粉、0.8％(v/v)～1.2％(v/v)土豆淀粉和0.8％(v/v)～1.2％(v/v)琼脂粉。

进一步地，平板培养基或斜面培养基中包含水以及0.8％(v/v)～1.0％(v/v)葡萄糖、0.8％(v/v)～1.0％(v/v)蛋白胨、0.4％(v/v)～0.5％(v/v)酵母粉、0.8％(v/v)～1.0％(v/v)土豆淀粉和0.8％(v/v)～1.0％(v/v)琼脂粉。

在一个具体示例中，平板培养基或斜面培养基中包含水以及1.0％(v/v)葡萄糖、1.0％(v/v)蛋白胨、0.5％(v/v)酵母粉、1.0％(v/v)土豆淀粉和1.0％(v/v)琼脂粉。

在其中一些实施方式中，种子培养基包含水以及0.8％(v/v)～1.2％(v/v)葡萄糖、0.8％(v/v)～1.2％(v/v)蛋白胨、0.4％(v/v)～0.6％(v/v)酵母粉和0.8％(v/v)～1.2％(v/v)土豆淀粉。

进一步地，种子培养基中包含水以及0.8％(v/v)～1.0％(v/v)葡萄糖、0.8％(v/v)～1.0％(v/v)蛋白胨、0.4％(v/v)～0.5％(v/v)酵母粉和0.8％(v/v)～1.0％(v/v)土豆淀粉。

在一个具体示例中，种子培养基中包含水以及1.0％(v/v)葡萄糖、1.0％(v/v)蛋白胨、0.5％(v/v)酵母粉和1.0％(v/v)土豆淀粉。

本申请的胆固醇酯酶的制备方法至少具有如下优点：

(1)步骤简单：无需添加有机溶剂和表面活性剂，在后续工作中不需要再进行废水处理；所使用的培养基成分简单、易获取；

(2)安全无毒：使用橄榄油作为诱导剂进行产酶，对人体无毒害作用；适合在实际生产中推广应用。

下面将结合具体实施例和对比例对本申请作进一步说明，但不应将其理解为对本申请保护范围的限制。

实施例1、菌株鉴定

由北京擎科生物科技有限公司湖南分公司进行鉴定。使用如表1所示的引物(SEQID NO.1和SEQ ID NO.2)对一株野生型DL镰刀菌进行检测，图1为PCR扩增产物的电泳检测图；进一步经序列比对发现：该菌株的测序序列与已知的镰刀菌(Fusarium sp.)的序列相似度达99％(537bp/540bp)，因此将该菌株鉴定为镰刀菌。该镰刀菌已于2022年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M20222093。

表1用于菌株鉴定的引物信息

引物名称	序列信息(5’-3’)
		SEQ ID NO.1	TCCGTAGGTGAACCTGCGG
SEQ ID NO.2	TCCTCCGCTTATTGATATGC

实施例2、不同菌株的产酶效率、酶活力比较

(1)培养基配制

平板培养基：按体积百分数计，添加1％(v/v)葡萄糖、1％(v/v)蛋白胨、0.5％(v/v)酵母粉、1％(v/v)土豆淀粉、1％(v/v)琼脂粉、余量水；调节pH至5.0左右，121℃高温高压灭菌20min。

种子培养基：按体积百分数计，添加1％(v/v)葡萄糖、1％(v/v)蛋白胨、0.5％(v/v)酵母粉、1％(v/v)土豆淀粉、余量水；调节pH至5.0左右，121℃高温高压灭菌20min。

发酵培养基：按质量百分数计，添加2.4％(w/v)酵母粉、1.2％(w/v)蛋白胨、0.5％(w/v)甘油、1.8％(w/v)磷酸氢二钾、0.2％(w/v)磷酸二氢钾、余量水；调节pH至5.0左右，121℃高温高压灭菌20min。

(2)菌株培养

从上海嘉楚生物工程有限公司购买获得商品型号为ACCC15067的大豆根瘤菌、商品型号为ATCC13525的荧光假单胞菌以及伯克霍尔德氏菌。

将上述根瘤菌、荧光假单胞菌、伯克霍尔德氏菌以及本申请分离的镰刀菌分别划线接种至平板培养基上，置于温度30℃、湿度50％以上的培养箱中培养48h，观察菌落形态，并在无菌环境中挑选单菌落加入到种子培养基中，于30℃、200rpm恒温摇床中培养48h，观察菌种在液体培养基中的菌落形态；取在种子培养基中活化后的种子液，接种至发酵培养基中，于30℃、400rpm的恒温摇床中培养8h。

(3)在培养好的菌液中加入体积比为1％(v/v)的橄榄油诱导产酶；为了验证产酶效果，在100mL已发酵的菌株培养物中加入如表2所示的转化体系成分(浓度为1％的胆固醇醋酸酯作为底物)，并调节pH至5.0左右，于30℃、200rpm恒温摇床中培养。

表2转化体系

成分	含量
		消泡剂	0.1g
吐温80	0.1g
		胆固醇醋酸酯	1.0g

(4)薄层色谱分析(Thin-Layer Chromatography，TLC)

为了快速检测是否有胆固醇酯酶产出，取100μL步骤(3)的转化反应液，使用二氯甲烷萃取至0.5mL，取萃取液点样至硅胶板中，使用展开剂(二氯甲烷与乙酸乙酯1：1混合)进行跑板形式，最后通过紫外进行显色观察；染色结果如图2所示(从左至右依次为：1、根瘤菌；2、荧光假单胞菌；3、伯克霍尔德氏菌；4、镰刀菌)。

上述TLC显色结果表明，与根瘤菌、荧光假单胞菌和伯克霍尔德氏菌相比，使用本申请的镰刀菌产酶量更多、产酶效率和酶活力更高。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种镰刀菌(Fusarium sp.)，所述镰刀菌已于2022年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 20222093。

2.一种胆固醇酯酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括使用权利要求1所述的镰刀菌制备胆固醇酯酶的步骤。

3.根据权利要求2所述的胆固醇酯酶的制备方法，其特征在于，使用权利要求1所述的镰刀菌制备胆固醇酯酶的步骤，包括：

将所述镰刀菌接种于发酵培养基中进行发酵培养；和

4.根据权利要求3所述的胆固醇酯酶的制备方法，其特征在于，所述橄榄油的浓度为0.5％(v/v)～1.5％(v/v)。

5.根据权利要求3或4所述的胆固醇酯酶的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包含水以及酵母粉、蛋白胨、甘油、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。

6.根据权利要求5所述的胆固醇酯酶的制备方法，其特征在于，所述酵母粉的质量浓度为2.2％(w/v)～2.6％(w/v)；所述蛋白胨的质量浓度为1.0％(w/v)～1.4％(w/v)；所述甘油的质量浓度为0.4％(w/v)～0.6％(w/v)；所述磷酸二氢钾的质量浓度为0.18％(w/v)～0.22％(w/v)；和，所述磷酸氢二钾的质量浓度为1.6％(w/v)～2.0％(w/v)。

7.根据权利要求3、4或6所述的胆固醇酯酶的制备方法，其特征在于，发酵培养的条件包括：温度为29℃～31℃，培养时间为8h～12h，转速为380rpm～420rpm。

8.根据权利要求3、4或6所述的胆固醇酯酶的制备方法，其特征在于，所述镰刀菌是以种子液的形式接种于所述发酵培养基，所述种子液的制备步骤包括：

9.根据权利要求8所述的胆固醇酯酶的制备方法，其特征在于，所述平板培养基或者斜面培养基包含水以及0.8％(v/v)～1.2％(v/v)葡萄糖、0.8％(v/v)～1.2％(v/v)蛋白胨、0.4％(v/v)～0.6％(v/v)酵母粉、0.8％(v/v)～1.2％(v/v)土豆淀粉和0.8％(v/v)～1.2％(v/v)琼脂粉。

10.根据权利要求8所述的胆固醇酯酶的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包含水以及0.8％(v/v)～1.2％(v/v)葡萄糖、0.8％(v/v)～1.2％(v/v)蛋白胨、0.4％(v/v)～0.6％(v/v)酵母粉和0.8％(v/v)～1.2％(v/v)土豆淀粉。