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CN116106544A - 一种牛分枝杆菌抗体检测试剂盒 - Google Patents

一种牛分枝杆菌抗体检测试剂盒 Download PDF

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CN116106544A
CN116106544A CN202310031341.4A CN202310031341A CN116106544A CN 116106544 A CN116106544 A CN 116106544A CN 202310031341 A CN202310031341 A CN 202310031341A CN 116106544 A CN116106544 A CN 116106544A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cfp10
esat6
rv3403c
fusion protein
mycobacterium bovis
Prior art date
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Pending
Application number
CN202310031341.4A
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English (en)
Inventor
薛峰
潘家良
汤芳
单玉平
戴建君
董雨豪
任建鸾
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

本发明提供一种牛分枝杆菌抗体检测试剂盒，涉及兽医学领域。该牛分枝杆菌抗体检测试剂盒，包括包被有融合蛋白Rv3403c‑CFP10‑ESAT6的酶标板，所述融合蛋白Rv3403c‑CFP10‑ESAT6的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明检测试剂盒，具有较高的灵敏度和特异性。

Description

一种牛分枝杆菌抗体检测试剂盒
技术领域
本发明涉及兽医学领域，具体涉及一种牛分枝杆菌抗体检测试剂盒。
背景技术
牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，M.bovis)是一种可引起人类和动物结核病的人畜共患病原体，广泛存在于家畜、人类和野生动物等宿主群体中。牛是该病原体的主要宿主，牛群感染和传播该病原体后引发牛结核病(Bovine tuberculosis,BTB)，造成畜体咳嗽、贫血、消瘦等慢性消耗症状，导致畜牧业经济损失，还会给人类公共卫生安全产生巨大威胁。做好牛结核病的批量化快速检疫、扑杀净化工作对于全球经济发展和人类公共卫生安全具有重大意义。
现有技术中，没有高灵敏度、高特异性检测牛分枝杆菌抗体的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牛分枝杆菌抗体检测试剂盒，具有较高的灵敏度和特异性。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种牛分枝杆菌抗体检测试剂盒，包括包被有融合蛋白
Rv3403c-CFP10-ESAT6的酶标板，所述融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明中，所述融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6通过诱导表达携带融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6编码基因的重组菌得到。
在本发明中，所述融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6编码基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明中，将所述诱导表达后的重组菌裂解后，取裂解液沉淀，采用尿素复性后，得到融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6。
在本发明中，所述融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的包被浓度为0.4-0.6μg/mL。
在本发明中，所述试剂盒还包括HRP标记的羊抗牛IgG。
在本发明中，所述试剂盒还包括PBS缓冲液、PBST缓冲液、TMB显色液和H2SO4水溶液。
本发明还提供所述检测试剂盒在以非诊断为目的的检测牛分枝杆菌抗体中的应用。
有益效果：本发明检测牛分枝杆菌抗体的试剂盒，具有更高的灵敏度、准确性、重复性和特异性，可以显著降低检测成本。
附图说明
图1目的基因Rv3403c、CFP10、ESAT6的PCR扩增产物电泳图。M：DL2000 DNAMarker；泳道1、3、5：阴性对照(模板为双蒸水)；2：Rv3403c基因扩增产物；4：CFP10基因扩增产物；6：ESAT6基因扩增产物。
图2重组表达载体pET-28a-Rv3403c-CFP10-ESAT6双酶切鉴定电泳图。M：DL5000DNA Marker；1：pET-28a-Rv3403c-CFP10-ESAT6双酶切产物；2：pET-28a空载体双酶切产物。
图3重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的原核表达。M：Protein Marker；1：重组菌RCE诱导表达后的裂解液上清；2：重组菌RCE诱导表达后的裂解液沉淀。
图4纯化后的重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的鉴定。M：Protein Marker；1：纯化后的重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。
实施例1：牛分枝杆菌重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的原核表达
1.1融合基因Rv3403c-CFP10-ESAT6的扩增
根据NCBI官网记录的牛分枝杆菌Rv3403c、CFP10和ESAT6的基因序列，设计针对Rv3403c、CFP10和ESAT6全长基因的特异性引物，引物序列如下，引物由南京擎生物科技有限公司合成。
Rv3403c上游引物(下划线为EcoRⅠ识别位点)：5’-TTACGAATTCATGTTAGCCTTCCCTTAT-3’；Rv3403c下游引物(下划线为Hind Ⅲ识别位点和Linker序列)：5’-GTACAAGCTTAGATCCGCCTCCACCTGAACCGCCACCTCCGCATGGGGCCAGTG-3’。
CFP10上游引物(下划线为HindⅢ识别位点)：5’-TCTGAAGCTTGCAGAGATGAAGACCGAT-3’；CFP10下游引物(下划线为Linker序列)：5’-AGAT CCGCCTCCACCTGAACCGCCACCTCCGAAGCCCATTTGCGAGGACAGCGC CT-3’。
ESAT6上游引物(下划线为Linker序列)：5’-GGAGGTGGCGGTTCAGGT GGAGGCGGATCTATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGG-3’；ESAT6下游引物(下划线为NotⅠ识别位点)：5’-AGCAGCGGCCGCCTATGCGAACATCC C-3’。
以牛分枝杆菌TMC 403菌株(购自ATCC，编号Bio-086267)基因组DNA为模板，采用25μLPCR反应体系，分别采用对应的引物扩增Rv3403c、CFP10和ESAT6基因，阴性对照中以ddH2O替代牛分枝杆菌基因组DNA。反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，胶回收PCR产物，得到大小分别为1602bp(Rv3403c基因扩增产物)、303bp(ESAT6基因扩增产物)、288bp(CFP10基因扩增产物)的目的基因条带(图1)。
1.2原核表达质粒的构建
将PCR产物回收后，使用CFP10上游引物和ESAT6下游引物采用重叠延伸PCR方法，以CFP10和ESAT6胶回收产物为模板，扩增出CFP10和ESAT6的融合基因(缩写为CFP10-ESAT6融合基因)，胶回收PCR产物；使用限制性内切酶HindⅢ和NotⅠ双酶切CFP10-ESAT6融合基因和pET-28a空载体，胶回收酶切产物后，使用T4 DNA连接酶连接酶切产物，转化至DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素抗性的LB平板上培养后，挑选阳性克隆，经过菌落PCR鉴定正确后，获得重组表达载体pET-28a-CFP10-ESAT6。
使用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切Rv3403c胶回收产物和重组表达载体pET-28a-CFP10-ESAT6，胶回收酶切产物后，使用T4 DNA连接酶连接酶切产物，转化至大肠杆菌的感受态细胞中，在含有卡那霉素抗性的LB平板上培养后，挑选阳性克隆，经过菌落PCR鉴定正确后，获得重组表达载体pET-28a-Rv3403c-CFP10-ESAT6。融合基因Rv3403c-CFP10-ESAT6的理论片段长度为2264bp，对重组表达载体pET-28a-Rv3403c-CFP10-ESAT6采用限制性内切酶Eco RⅠ、NotⅠ进行双酶切，条带大小与预期符合(图2)。经测序，融合基因Rv3403c-CFP10-ESAT6的序列如SEQ ID NO:1所示，测序结果与序列信息(GenB ank:NC_000962.3)进行比对一致，表明重组表达载体pET-28a-Rv3403c-CFP10-ESAT6构建成功。融合基因Rv3403c-CFP10-ESAT6编码的蛋白命名为融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6，序列如SEQ ID NO:2所示。
1.3重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的诱导表达
将重组表达载体pET-28a-Rv3403c-CFP10-ESAT6转化至BL21(DE3)感受态细胞中，在含有卡那霉素抗性的LB平板上培养后，挑选阳性克隆，经过菌落PCR和测序后正确的，命名为重组菌RCE。将该重组菌采用LB培养基在37℃振荡培养至对数生长期，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，在16℃摇床中振荡培养16小时进行诱导表达，收集菌体。PBS缓冲液洗涤菌体3次后，使用PBS缓冲液进行重悬，并进行超声破碎，然后在4℃、12000rpm离心10min，分离菌体裂解液上清和沉淀，并进行SDS-PAGE电泳。由图3可见，上清中目标蛋白的表达较少，沉淀中目标蛋白的表达较多，目的条带大小是80.2kD,说明了融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6主要以包涵体形式进行表达。
1.4重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的纯化
将重组菌RCE采用LB培养基在37℃摇床中振荡培养至对数生长期，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，在30℃振荡培养12小时进行诱导表达。收获表达菌液2L，离心收集菌体，PBS洗涤3次后重悬，进行超声破碎，在4℃、12000rpm离心10min，弃掉上清，加入200mL含20mM咪唑的包涵体Bing Buff重悬沉淀，置于4度冰箱过夜，使包涵体蛋白在尿素作用下变性溶解。其中，含20mM咪唑的包涵体Bing Buff配制方法如下：称取Na3PO47.6g、NaCl29.22g、咪唑1.36g、甘油100mL、Tween202mL和尿素480g，加水溶解并定容至1L，然后使用0.22μm滤器过滤。
使用0.45mm和0.22mm的滤器依次对变性溶解后的蛋白进行滤过处理，然后上Ni2+亲和层析柱(购自美国GE公司)，采用含0.6M咪唑的包涵体Bing Buff进行洗脱，收集洗脱液，得到纯化后的重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6。其中，含0.6M咪唑的包涵体BingBuff配制方法如下：称取Na3PO47.6g、NaCl29.22g、咪唑0.04g、甘油100mL、Tween202mL和尿素480g，加水溶解并定容至1L，然后使用0.22μm滤器过滤。
采用SDS-PAGE电泳鉴定纯化后的重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6，结果如图4。由图4可见，纯化后的重组融合蛋白符合预期大小，条带单一，说明纯化效果良好。
透析复性：将纯化后的重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6置于截留分子量为30kD的透析袋中，依次进行如下透析过程对重组融合蛋白进行透析复性：在含有6M尿素的PBS缓冲液中透析4h，在含有4M尿素的PBS缓冲液中透析4h，在含有2M尿素的PBS缓冲液中透析2h，在含有1M尿素的PBS缓冲液中透析2h，在PBS缓冲液中透析过夜。将透析结束后的包涵体蛋白溶液转移至超滤管(截留分子量为30kD)中，进行超滤富集，得到复性后的重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒对复性后的重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6进行浓度测定，其蛋白浓度为1.3mg/mL。
实施例2牛分枝杆菌抗体间接ELISA检测方法反应条件的优化
2.1抗原最佳包被浓度、抗原最佳包被时间和血清最佳稀释度的确定
包被液：称取Na2CO30.795g、NaHCO31.465g加入到大量杯中，先加入ddH2O 400mL，使用2M盐酸调整pH值至9.6，最后用ddH2O定容至500mL。
PBS缓冲液：称取NaCl 8g、Na2HPO4·12H2O 2.89g、KCl 0.2g、KH2PO40.2g加入到量杯中，向量杯中加入ddH2O 800mL，搅拌溶解均匀后再加入ddH2O定容至1L。
PBST缓冲液：在1L PBS缓冲液中加入Tween-20500μL，得到PBST缓冲液。
采用ELISA方阵滴定方法，将复性后的重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESA T6用包被液分别稀释至0.25、0.5、1、2、4、6μg/mL，以100μL/孔包被6块96孔酶标板，每块酶标板上每个稀释度做两列重复。6块96孔酶标板共分为3组，每组2块96孔酶标板分别用于与牛结核阳性和阴性血清作用。重组融合蛋白加入后，覆盖好封板膜，置于4℃冰箱中。每组96孔酶标板分别过夜包被12、14、16h后，用PBST缓冲液洗3遍。向每块96孔酶标板中加入含1％(质量百分浓度)鱼明胶的PBST缓冲液，每孔加入200μL，覆盖好封板膜后置于37℃温箱封闭1h后，PBST缓冲液洗涤酶标板。将牛结核阳性血清和阴性血清(来源于中国兽医药品监察所)分别用PBS缓冲液按稀释度为1:50、1:100、1:200、1:300稀释，分别加入每组中1块酶标板上，每个稀释度在每块酶标板上做2排重复，即共4个重复孔，每孔加入100μL。覆盖好封板膜后置于37℃温箱孵育1h后，PBST缓冲液洗涤酶标板。向每块96孔酶标板中加入用PBS缓冲液按照稀释度为1:10000稀释的HRP标记的羊抗牛IgG(购自金克隆北京生物科技有限公司，货号MH0133)，每孔加入100μL。覆盖好封板膜后，置于37℃温箱孵育1h，用PBST缓冲液洗涤酶标板三次。向每块96孔酶标板中加入TMB显色液(购自美国默克Sigma公司，货号T444)，每孔加入100μL。置于37℃温箱避光显色15min。向每块96孔酶标板中加入2mol/L的H2SO4水溶液终止显色，每孔加入50μL。使用酶标仪测定每孔的OD450nm值，牛结核阳性血清的OD450nm值记为P，牛结核阴性血清的OD450nm值记为N。计算相同条件4个重复孔的平均P/N值，选取P/N值最大的孔所对应的条件为抗原最佳包被浓度、抗原最佳包被时间和血清最佳稀释度。
试验结果如下：复性后的重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的最佳包被浓度为0.5μg/mL，4℃条件下抗原最佳包被时间为包被过夜16h，血清最佳稀释度为1:100。
2.2最佳封闭液和封闭时间的确定
采用ELISA方阵滴定方法，在2.1优化的基础上，将复性后的重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6用包被液稀释至0.5μg/mL，以100μL/孔包被6块96孔酶标板，每块酶标板上包被2列酶标条，共12个酶标孔。覆盖好封板膜后置于4℃冰箱中，过夜包被16h后，用PBST洗3遍，每遍每孔均加入200μL，静置5min，甩干孔中液体。向每块96孔酶标板中分别加入含1％(质量百分浓度)鱼明胶的PBST缓溶液、含5％(质量百分浓度)鱼明胶的PBST缓冲液和商品化羊血清封闭液(购自金克隆北京生物科技有限公司，货号MY0038)作为封闭液，每孔加入200μL，每种封闭液在每块酶标板上设4个重复孔。覆盖好封板膜后，将6块酶标板分为3组，每组2块酶标板，分别将每组酶标板置于4℃冰箱封闭过夜，37℃温箱封闭1h，37℃温箱封闭2h，封闭结束后洗涤酶标板。将牛结核阳性血清和阴性血清分别用PBS缓冲液按稀释度为1:100进行稀释，分别加入每组中1块酶标板上，每孔加入100μL。覆盖好封板膜后置于37℃温箱孵育1h后，洗涤酶标板。向每块96孔酶标板中加入用PBS缓冲液按照稀释度为1:10000稀释的HRP标记的羊抗牛IgG(来源同上)，每孔加入100μL。覆盖好封板膜后置于37℃温箱孵育1h后，洗涤酶标板。加入TMB显色液，每孔加入100μL。置于37℃温箱避光显色15min。加入2mol/L的H2SO4水溶液终止显色，每孔加入50μL。使用酶标仪测定每孔的OD450nm值，牛结核阳性血清的OD450nm值记为P，牛结核阴性血清的OD450nm值记为N。计算相同条件4个重复孔的平均P/N值，比较选取P/N值最大的孔所对应的条件为最佳封闭液和最佳封闭条件。
试验结果如下：最佳封闭液为含1％鱼明胶的PBST缓冲液，最佳封闭条件为：在37℃温箱中封闭1h。
2.3酶标二抗最佳稀释度和作用时间的确定
采用ELISA方阵滴定方法，在2.2优化的基础上，将复性后的重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6用包被液稀释至0.5μg/mL，以100μL/孔包被6块96孔酶标板，每块酶标板上包被2列酶标条，共16个酶标孔。6块96孔酶标板分为3组，每组2块酶标板。覆盖好封板膜后置于4℃冰箱中，过夜包被16h。然后，用PBST洗3遍，向每块96孔酶标板中分别加入含1％鱼明胶的PBST缓冲液作为封闭液，每孔加入200μL。覆盖好封板膜后，将酶标板置于37℃温箱封闭1h，封闭结束后洗涤酶标板。将牛结核阳性血清和阴性血清分别用PBS缓冲液按稀释度为1:100的进行稀释，分别加入每组中1块酶标板上，每孔加入100μL。覆盖好封板膜后置于37℃温箱孵育1h后，洗涤酶标板。向每块96孔酶标板中分别加入用PBS缓冲液按照稀释度为1:5000、1:10000、1:15000、1:20000稀释的HRP标记的羊抗牛IgG，每孔加入100μL。每种酶标二抗浓度在每块酶标板上设4个重复孔。覆盖好封板膜后，将3组酶标板分别置于37℃温箱孵育45min、60min、75min。酶标二抗孵育结束后，洗涤酶标板。向每块96孔酶标板中加入TMB显色液，每孔加入100μL。置于37℃温箱避光显色15min。向每块96孔酶标板中加入2mol/L的H2SO4水溶液终止显色，每孔加入50μL。使用酶标仪测定每孔的OD450nm值，牛结核阳性血清的OD450nm值记为P，牛结核阴性血清的OD450nm值记为N。计算相同条件4个重复孔的平均P/N值，选取P/N值最大的孔所对应的条件为酶标二抗最佳稀释度和最佳作用时间。
试验结果如下：酶标二抗的最佳稀释度为1:20000，最佳作用时间为37℃孵育60min。
2.4最佳底物显色时间的确定
采用ELISA方阵滴定方法，在2.3优化的基础上，将复性后的重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6用包被液稀释至0.5μg/mL，以100μL/孔包被6块96孔酶标板，每块酶标板上包被4个酶标孔，6块96孔酶标板分为3组，每组2块酶标板。覆盖好封板膜后置于4℃冰箱中，过夜包被16h。然后，用PBST洗3遍。向每块96孔酶标板中分别加入含有1％鱼明胶的PBST缓冲液作为封闭液，每孔加入200μL。覆盖好封板膜后，将酶标板置于37℃温箱封闭1h，封闭结束后洗涤酶标板。将牛结核阳性血清和阴性血清分别用PBS缓冲液按稀释度为1:100的进行稀释，分别加入每组中1块酶标板上，每孔加入100μL。覆盖好封板膜后置于37℃温箱孵育1h后，洗涤酶标板。向每块96孔酶标板中分别加入用PBS缓冲液按照稀释度为1:20000稀释的HRP标记的羊抗牛IgG，每孔加入100μL。覆盖好封板膜后，将酶标板置于37℃温箱孵育60min。酶标二抗孵育结束后，洗涤酶标板。向每块96孔酶标板中加入TMB显色液，每孔加入100μL。将3组酶标板分别置于37℃温箱中避光显色10min、15min、20min。向每块96孔酶标板中加入2mol/L的H2SO4水溶液终止显色，每孔加入50μL。使用酶标仪测定每孔的OD450nm值，牛结核阳性血清的OD450nm值记为P，牛结核阴性血清的OD450nm值记为N。计算相同条件4个重复孔的平均P/N值，选取P/N值最大的孔所对应的条件为最佳底物显色时间。
试验结果如下：在37℃避光条件下，最佳底物显色时间为15min。
实施例2本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒及检测方法
1.本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒
本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒包括：PBS缓冲液、PBST缓冲液、包被有融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的酶标板、牛结核阳性血清、牛结核阴性血清、HRP标记的羊抗牛IgG、TMB显色液和2mol/L的H2SO4水溶液。
(1)缓冲液
PBS缓冲液：称取NaCl 8g、Na2HPO4·12H2O 2.89g、KCl 0.2g、KH2PO40.2g加入到量杯中，向量杯中加入ddH2O 800mL，搅拌溶解均匀后再加入ddH2O定容至1L。
PBST缓冲液：在1L的PBS缓冲液中加入Tween-20500μL，得到PBST缓冲液。
(2)包被有融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的酶标板
包被液：称取Na2CO30.795g和NaHCO31.465g加入到大量杯中，先加入ddH2O 400mL，使用2M盐酸调整pH值至9.6，最后用ddH2O定容至500mL。
将实施例1所得复性后的重组融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6用包被液稀释至0.5μg/mL，以100μL/孔包被96孔酶标板。覆盖好封板膜后置于4℃冰箱中，过夜包被16h。然后，用PBST缓冲液洗3遍。向96孔酶标板中加入含有1％(质量百分浓度)鱼明胶的PBST缓冲液作为封闭液，每孔加入200μL。覆盖好封板膜后，将酶标板置于37℃温箱封闭1h，封闭结束后用PBST缓冲液洗涤酶标板，得到包被有融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的酶标板。
(3)牛结核阳性血清、牛结核阴性血清
牛结核阳性血清来源于中国兽医药品监察所、牛结核阴性血清来源于江苏省连云港市畜牧兽医站。
(4)HRP标记的羊抗牛IgG
HRP标记的羊抗牛IgG购自金克隆北京生物科技有限公司，货号MY0038。
(5)TMB显色液
TMB显色液购自美国默克Sigma公司，货号T444。
2.本发明试剂盒的检测方法
将待检血清用PBS缓冲液按稀释度为1:100的进行稀释，加入包被有融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的酶标板中，每孔加入100μL。覆盖好封板膜后置于37℃温箱孵育1h后，采用PBST缓冲液洗涤酶标板。向酶标板中加入用PBS缓冲液按照稀释度为1:20000稀释的HRP标记的羊抗牛IgG，每孔加入100μL。覆盖好封板膜后，将酶标板置于37℃温箱孵育60min。酶标二抗孵育结束后，采用PBST缓冲液洗涤酶标板。向酶标板中加入TMB显色液，每孔加入100μL。将酶标板置于37℃温箱中避光显色15min。每孔加入50μL浓度为2mol/L的H2SO4水溶液终止显色。使用酶标仪测定每孔的OD450nm值。
3.阴阳性临界值的确定
采用本实施例标题1试剂盒及标题2中方法，对60份牛结核阴性血清(来源于江苏省连云港市畜牧兽医站)进行检测。计算所有血清样本OD450nm平均值和标准差，使用以下公式计算该检测方法的阴阳性临界值：阴阳性临界值＝平均值(X)+3×标准差(SD)，当待检血清样本OD450nm值≥阴阳性临界值时，则判定为阳性；当待检血清样本OD450nm值<阴阳性临界值时，则判定为阴性。
60份牛结核阴性血清样品检测结果显示，OD450nm平均值(X)为0.127，标准差(SD)为0.02，X+3SD＝0.187，因此当待检牛血清样品OD450nm值≥0.187时，判定为阳性；当待检血清样本OD450nm值<0.187时，则判定为阴性。
实施例3本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒和商品化试剂盒的灵敏性试验
将牛结核阳性血清样本(来源于中国兽医药品监察所)用PBS缓冲液从稀释度为1:50开始倍比稀释，直至稀释度为1:6400。同时采用实施例2中本发明发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒和购买的商品化试剂盒即牛分枝杆菌ELISA抗体检测试剂盒(购自武汉科前生物股份有限公司)对各个稀释度的血清进行检测，每个稀释度设3个重复；同时设阴阳性对照。本发明试剂盒以OD450nm值≥0.187判断最低检测下限，购买的商品化试剂盒以说明书写明的标准判断其最低检测下限，比较分析两者的灵敏性。其中阴性对照中以牛结核阴性血清直接加入包被有融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的酶标板中，阳性对照中将牛结核阳性血清样本1:100稀释后直接加入包被有融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的酶标板中，其他步骤同试剂盒的使用方法。
由表1结果可知，将牛结核阳性血清稀释不同倍数后，用实施例2中本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒进行检测，在稀释倍数为1600时依然为阳性。由表2结果可知，将牛结核阳性血清稀释不同倍数后，用购买的商品化试剂盒进行抗体检测，在稀释倍数为400时依然为阳性。上述结果可知，本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒具有更高的灵敏性。
表1本发明试剂盒灵敏性实验结果
血清稀释度 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400
<![CDATA[OD<sub>450nm</sub>平均值]]> 3.099 2.741 1.629 0.847 0.433 0.256 0.185 0.136
结果判定 + + + + + + — —
表2商品化试剂盒灵敏性实验结果
血清稀释度 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400
结果判定 + + + + — — — —
实施例4：本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒的特异性试验
选取50份牛结核阴性血清(来源于江苏省连云港市畜牧兽医站)，采用实施例2中本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒进行检测，同时设阴阳性对照，比较每份阴性血清OD450nm值和阴阳性临界值大小，评估其特异性。
由表3结果可知，用本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒进行检测，其结果显示检出阴性49份，特异性达到98％。上述结果可知，本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒具有良好的特异性。
表3 50份牛结核阴性血清检测结果
Figure BDA0004047178320000111
实施例5：本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒的交叉反应性试验
采用实施例2中本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒及检测方法对牛传染性鼻气管炎、牛病毒性腹泻病毒阳性血清进行检测，每种血清设3个重复，同时设牛结核阴阳性对照，比较每份血清OD450nm值和阴阳性临界值大小，评估其交叉反应性。
结果(表4)：用本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒对牛分枝杆菌阳性对照检测结果为阳性，对牛传染性鼻气管炎、牛病毒性腹泻病毒阳性血清和牛分枝杆菌阴性性对照进行抗体检测，每孔的OD450nm值都小于0.187，显示为阴性。上述结果可知，本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒与牛其他病原体阳性血清不发生交叉反应。
表4交叉反应性分析结果
Figure BDA0004047178320000121
实施例6本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒的重复性试验
6.1组内重复性试验
用同一批次包被有融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的酶标板，按照实施例2中检测方法，对3份牛结核阳性血清和3份牛结核阴性血清进行间接ELISA检测试验，每份血清设3个重复，测定每孔的OD450nm值，计算平均数、标准差和变异系数。
表5组内重复试验结果
Figure BDA0004047178320000122
6.2组间重复性试验
用3个不同批次包被有融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的酶标板，按照实施例2中方法，对3份牛结核阳性血清和3份牛结核阴性进行间接ELISA检测试验，测定每孔的OD450nm值，计算平均数、标准差和变异系数。
表6组间重复试验结果
Figure BDA0004047178320000123
由表5和表6的结果可知，组内重复性试验结果中变异系数范围为0.65％～6.73％；组间重复性试验结果中变异系数范围为0.88％～8.96％。变异系数均小于9％。上述结果可知，本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒具有良好的重复性。
实施例7本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒与商品化试剂盒比较试验
使用本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒和商品化试剂盒(即牛分枝杆菌ELISA抗体检测试剂盒，购自武汉科前生物股份有限公司)分别对临床采集的206份未知牛血清样品进行检测。
由表7结果可知，本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒的检测结果为阳性血清23份、阴性血清183份；商品化试剂盒的检测结果为阳性血清22份、阴性血清184份。上述结果可知，本发明牛分枝杆菌抗体检测试剂盒和商品化试剂盒的阳性符合率为95.7％(22/23)，阴性符合率99.5％(183/184)，总符合率为(22+183)/206＝99.5％。
表7本发明试剂盒和商品化试剂盒临床检测结果比较
Figure BDA0004047178320000131
序列表
SEQ ID NO.1：
ATGTTAGCCTTCCCTTATTTGATGACTATGATCACTCCACCTACCTTCGACGTTGCGTTCATCGGCAGCGGGGCCGCGTGCTCTATGACTCTGCTGGAAATGGCCGATGCCCTGCTGAGCAGCCCCTCGGCATCGCCCAAGTTGCGCATCGCGGTGGTGGAGCGAGACGAGCAGTTCTGGTGCGGAATCCCCTATGGCCAACGCTCCAGCATCGGATCGCTGGCCATTCAGAAGCTCGACGATTTCGCCGACGAGCCGGAAAAGGCCGCCTACCGGATCTGGCTGGAGCAGAACAAGCAGCGCTGGCTGGCGTTCTTCCAGGCAGAGGGCGGTGCGGCCGCGGCCCGCTGGATCTGCGACAACCGCGACGCATTGGACGGCAACCAGTGGGGGGAGCTCTACCTGCCGCGGTTTCTCTTCGGTGTATTTCTGTCGGAGCAGATGATTGCCGCCATCGCCGCGCTCGGCGAGCGTGACCTGGCCGAAATCGTCACCATCCGCGCTGAGGCCATGAGCGCCCACTCCGCAGACGGCCACTACCGAATCGGCCTCCGCCCGTCTGGAAACGGTCCAACGGCAATTGCTGCAGGCAAAGTGGTTGTGGCCATTGGCAGCCCCCCGACCAAAGCCATCCTTGCGAGCGATTCCGAACCCGCATTCACCTATATCAACGATTTCTACTCCCCCGGCGGGGAGAGCAACGTAGCGCGACTGCGCGATTCGCTCGACCGCGTCGAGTCGTGGGAGAAGCGCAACGTACTGGTCGTGGGTTCCAACGCCACCTCGCTGGAAGCGCTCTACCTAATGCGTCACGACGCGCGCATCCGCGCACGCGTCCGGTCCATCACCGTCATCTCGCGCTCCGGCGTGCTGCCCTACATGATCTGCAATCAGCCGCCGGAGTTTGACTTCCCGCGGCTGCGCACGCTGCTCTGTACGGAAGCGATCGCCGCGGCGGATCTCATGTCCGCGATCCGCGACGATCTCGCGACGGCCGAAGAACGCTCGTTGAACCTGGCCGATTTGTACGACGCCGTTGCCGCCCTGTTTGGGCAGGCGCTGCACAAGATGGATCTCGTGCAGCAGGAAGAGTTCTTCTGCGTGCACGGCATGAACTTCACCAAGTTGGTGCGGCGTGCGGGACGCGATTGCCGCCAGGCATCCGAGGAGCTAGCCGCGGACGGCACGCTGAGCCTGCTCGCCGGCGAAGTACTGCGCGTGGATGCCTGCGCGTCCGGCCAGCCGTTCGCCACCATGACCTACCGAGCCGCGGGAGCCGAGCATACCCACCCCGTCCCCTTCGCTGCGGTGGTGAATTGTGGCGGTTTCGAGGAGCTGGACACGTGTTCCTCGCCGTTCCTGGTCAGCGCGATGCAGAACGGGCTGTGCCGCCCGAACCGCACCAACCGTGGCCTTCTGGTTAACGACGACTTCGAGGCCAGCCCAGGTTTTTGCGTCATCGGGCCCCTAGTCGGCGGCAATTTCACTCCCAAGATCCGTTTTTGGCACGTCGAGAGCGCACCGCGCGTCCGGTCGCTGGCGAAATCGCTGGCGGCCAGCCTGCTTGCTTCGCTCCAGCCCGTCGCACTGGCCCCATGCGGAGGTGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGATCTAAGCTTGCAGAGATGAAGACCGATGCCGCTACCCTCGCGCAGGAGGCAGGTAATTTCGAGCGGATCTCCGGCGACCTGAAAACCCAGATCGACCAGGTGGAGTCGACGGCAGGTTCGTTGCAGGGCCAGTGGCGCGGCGCGGCGGGGACGGCCGCCCAGGCCGCGGTGGTGCGCTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTCGACGAGATCTCGACGAATATTCGTCAGGCCGGCGTCCAATACTCGAGGGCCGACGAGGAGCAGCAGCAGGCGCTGTCCTCGCAAATGGGCTTCGGAGGTGGCGGTTCAGGTGGAGGCGGATCTATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCATAG
SEQ ID NO.2：
MLAFPYLMTMITPPTFDVAFIGSGAACSMTLLEMADALLSSPSASPKLRIAVVERDEQFWCGIPYGQRSSIGSLAIQKLDDFADEPEKAAYRIWLEQNKQRWLAFFQAEGGAAAARWICDNRDALDGNQWGELYLPRFLFGVFLSEQMIAAIAALGERDLAEIVTIRAEAMSAHSADGHYRIGLRPSGNGPTAIAAGKVVVAIGSPPTKAILASDSEPAFTYINDFYSPGGESNVARLRDSLDRVESWEKRNVLVVGSNATSLEALYLMRHDARIRARVRSITVISRSGVLPYMICNQPPEFDFPRLRTLLCTEAIAAADLMSAIRDDLATAEERSLNLADLYDAVAALFGQALHKMDLVQQEEFFCVHGMNFTKLVRRAGRDCRQASEELAADGTLSLLAGEVLRVDACASGQPFATMTYRAAGAEHTHPVPFAAVVNCGGFEELDTCSSPFLVSAMQNGLCRPNRTNRGLLVNDDFEASPGFCVIGPLVGGNFTPKIRFWHVESAPRVRSLAKSLAASLLASLQPVALAPCGGGGSGGGGSKLAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGFGGGGSGGGGSMTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA

Claims (8)

1.一种牛分枝杆菌抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被有融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的酶标板，所述融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述检测试剂盒，其特征在于，所述融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6通过诱导表达携带融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6编码基因的重组菌得到。
3.根据权利要求1或2所述检测试剂盒，其特征在于，所述融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6编码基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于将所述诱导表达后的重组菌裂解后，取裂解液沉淀，采用尿素复性后，得到融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6。
5.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，所述融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6的包被浓度为0.4-0.6μg/mL。
6.根据权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括HRP标记的羊抗牛IgG。
7.根据权利要求6所述检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PBS缓冲液、PBST缓冲液、TMB显色液和H2SO4水溶液。
8.权利要求1所述检测试剂盒在以非诊断为目的的检测牛分枝杆菌抗体中的应用。
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