[go: up one dir, main page]

CN116064911B - 与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记、检测引物及其应用 - Google Patents

与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记、检测引物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116064911B
CN116064911B CN202211404279.0A CN202211404279A CN116064911B CN 116064911 B CN116064911 B CN 116064911B CN 202211404279 A CN202211404279 A CN 202211404279A CN 116064911 B CN116064911 B CN 116064911B
Authority
CN
China
Prior art keywords
thorn
cucumber
dense
few
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211404279.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116064911A (zh
Inventor
陈岳
张微微
佘为为
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Vocational College Of Agriculture And Forestry
Original Assignee
Shanghai Vocational College Of Agriculture And Forestry
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Vocational College Of Agriculture And Forestry filed Critical Shanghai Vocational College Of Agriculture And Forestry
Priority to CN202211404279.0A priority Critical patent/CN116064911B/zh
Publication of CN116064911A publication Critical patent/CN116064911A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116064911B publication Critical patent/CN116064911B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记，检测引物及其应用。与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段，其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段与密刺基因共分离，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段与少刺基因共分离。本发明利用与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记对F2群体中的1600个单株进行基因型鉴定，符合率达到100％。本发明的InDel分子标记具有高稳定性不仅有助于黄瓜少刺单株的鉴别及辅助育种，且为稀刺基因的图位克隆及解析奠定了理论基础，具有广泛的推广价值。

Description

与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记、检测引物及 其应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体地说涉及与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记、检测引物及其应用方法及其应用。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.)属于葫芦科一年生草本植物，是世界十大蔬菜作物之一，在我国已有2000多年的栽培历史。其栽培面积仅次于番茄。黄瓜是我国重要的栽培蔬菜，据2020年联合国粮食及农业组织数据(https://www.fao.org/faostat/zh/#home)统计显示，我国黄瓜栽培面积达128万公顷，总产量7283万公吨，分别占世界总量的56.6％和79.8％。作为重要的蔬菜作物，黄瓜的产量和品质对于种植者和消费者的意义重大。
黄瓜表皮毛属于多细胞类型，广泛分布于黄瓜的茎、枝、叶、卷须、花瓣、萼片及子房(果实)的表面。黄瓜果实的表皮毛形态高度特化，通常称作果刺，由4～9个长形细胞组成，纵向排列成针状，细胞壁角质化，果刺硬而脆。黄瓜果刺是果实重要的外观品质性状，直接影响黄瓜的商品价值。我国的黄瓜类型主要分为华北型和华南型，其中华北型多为密刺型。目前黄瓜生产上农药使用较多，密刺型黄瓜不便于清洗，容易造成农药残留，同时密刺也不利于包装和运输。因此，选育少刺型黄瓜成为黄瓜品质育种的一个重要方向。研究表明，Trichome-less(Tril)基因启动子区域一个812bp片段的替换导致few spines1(fs1)型突变体表现出少刺的表型(图1C)，详细结果可以参看：Zhang等在《Theoretical andApplied Genetics》(理论应用遗传学)2016年第129卷第7期1289-1301页发表的题为《Afragment substitution in the promoter of CsHDZIV11/CsGL3 is responsible forfruit spine density in cucumber(Cucumis sativus L.)》一文。但是，fs1型突变普遍存在于华南型、欧洲温室型和美国加工型黄瓜自交系中，而在我国华北类型黄瓜自交系中很少存在，直接制约了华北型黄瓜少刺品种的选育。
按照传统的黄瓜育种费时费力，需要经过多代回交和少刺表型筛选的过程。由于少刺基因介导的表现为隐性基因的遗传规律，回交育种过程中需要每代自交筛选到纯合子才能确认隐性抗性的渗入。这些因素都增加了育种的周期和难度。随着现代生物技术的发展迅速，利用生物技术培育植物新品种已成为目前的热点。通过开发与目标性状紧密连锁的分子标记，借助分子标记对目标性状基因型进行选择，能够有效缩短育种年限，加快育种进程，提高育种效率。InDel(Insertions and Deletion，InDel)多态性分子标记是基于不同亲本间的插入/缺失位点两侧的序列设计特异引物进行PCR扩增的标记，特点是通用性强，准确性高，稳定性好，大大节约成本。
开发与少刺基因连锁的分子标记，为少刺黄瓜品种(尤其是华北型少刺品种)的分子标记辅助选育提供了重要资源和理论支撑，同时也是黄瓜果刺起始发育调控的分子机制奠定了基础。
发明内容
本发明一方面的目的在于提供一种与黄瓜少刺基因共分离的InDel分子标记，该InDel分子标记可用于黄瓜少刺突变体的筛选以及分子辅助育种，可简便、快速、高通量地应用于育种实践。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的。
一种与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记，命名为InDel-FS2，其包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段与密刺基因共分离，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段与少刺基因共分离。
本发明另一方面提供了上述与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记的制备方法，该制备方法包括利用SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物进行PCR扩增得到所述InDel分子标记。
本发明再一方面提供了上述与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记在鉴别黄瓜密刺和少刺品种中的应用。
本发明的与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记可用于分子标记辅助选择育种。
本发明再一方面提供了与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记的检测引物，其包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物。
本发明再一方面提供了利用与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记的检测引物鉴别黄瓜密刺和少刺品种的方法，所述包括如下步骤：
(1)提取黄瓜品种的基因组总DNA；
(2)利用所述检测引物对黄瓜品种的基因组总DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；
(3)对步骤(1)的PCR产物进行电泳分析；
(4)若电泳条带只出现长度为165bp的DNA片段，则判断黄瓜样品为携带密刺基因的纯合型；若电泳条带只出现长度为125bp的DNA片段，则判断黄瓜样品为携带少刺基因的纯合型；若电泳条带同时出现长度为165bp与125bp的DNA片段，则判断黄瓜样品为携带密刺基因和少刺基因的杂合型。
优选地，上述步骤(1)中PCR扩增的条件为：PCR扩增总体系为12μL，其中PremixTaq为6μL，正反向引物(10μM)分别为0.5μL，DNA(50ng/μL)为2μL，ddH2O为3μL。
PCR扩增程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。
步骤(1)中电泳分析为：电泳分析为聚丙烯酰胺凝胶电泳。
与现有技术相比本发明的主要优点为：本发明的共分离InDel分子标记为共显性，可直接用于黄瓜少刺性状和相对应基因型的鉴定，而且在黄瓜生长发育的任何时期均可进行基因型鉴定，有效的解决了常规育种费时费力的问题。利用该分子标记在黄瓜苗期进行筛选，可以快速筛选到所需的植株，提高了选择的效率和准确性。同时此共分离标记将促进黄瓜稀刺基因的分离，为深入研究黄瓜果刺发育的分子机制奠定基础。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1为黄瓜少刺突变体fs1、fs2和野生型06-1果刺表型观察。图1中A图为少刺突变体fs1黄瓜的照片(fs1指的是已经报道的few spines1少刺突变体，Trichome-less基因启动子区域一个812bp片段的替换导致fs1的表型)，图1中B图为少刺突变体fs2黄瓜的照片，图1中C图为野生型密刺06-1黄瓜的照片，比例尺是1cm。图1中D图表示fs1、fs2和06-1果刺数目的统计。误差线顶部的小写字母代表图基多重比较所得的显著差异(P<0.05)。
图2显示了分子标记InDel-FS2的在两个亲本中PCR扩增产物电泳图；其中，P1均代表密刺黄瓜亲本06-1(其聚丙烯酰胺凝胶电泳条带只出现长度为165bp的DNA片段)，P2均代表少刺黄瓜亲本2-358(其聚丙烯酰胺凝胶电泳条带只出现长度为125bp的DNA片段)。
图3显示了分子标记InDel-FS2的PCR扩增产物电泳图；其中，P1代表密刺黄瓜亲本06-1(其聚丙烯酰胺凝胶电泳条带只出现长度为165bp的DNA片段)，P2代表少刺黄瓜亲本2-358(其聚丙烯酰胺凝胶电泳条带只出现长度为125bp的DNA片段)；F1代表两亲本杂交后代；F2密刺单株和F2少刺单株分别代表在F2群体中随机挑选的15株密刺和15株少刺黄瓜植株。杂合型F2密刺单株同时出现长度为165bp与125bp的DNA片段。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次利用分离体分组混合分析(bulkedsegregant analysis，BSA)定位的方法获得与黄瓜少刺、密刺基因紧密连锁的染色体区域，并在候选区间内开发InDel分子标记，命名为InDel-FS2。利用野生型密刺黄瓜与突变型少刺黄瓜材料构建了F2群体，利用该InDel分子标记对F2群体中的1600个单株进行基因型鉴定，符合率达到100％。本发明的InDel分子标记具有高稳定性，不仅有助于黄瓜少刺单株的鉴别及辅助育种，且为稀刺基因的图位克隆及解析奠定了理论基础，具有广泛的推广价值。在此基础上，完成了本发明。
SEQ ID NO.1为InDel-FS2在野生型密刺亲本扩增的序列，由165个核苷酸组成，具体如下：
TCTTTACCATCCAGATCAGCCACCTCCCTCTGATCTCCGACCTCTATCTACCAACGCCATTGTACCGTATACCGGTGGGAGATATCGACATTCAGGTCGACGGCACCGGCGGAGCCGGAGAAAGGGAGACCCGAATCATCCAAAACCGAATAGAAGTGGGTACAA。
SEQ ID NO.2为InDel-FS2在少刺亲本扩增的序列，由125个核苷酸组成，具体如下：
TCTTTACCATCCAGATCAGCCATCTCCCTCTGATGTGGGAGATATCGACATTCAGGTCGACGGCACCGGCGGAGCCGGAGAAAGGGAGACCCGAATCATCCAAAACCGAATAGAAGTGGGTACAA。
SEQ ID NO.3所示的上游引物的核苷酸序列为：TCTTTACCATCCAGATCAGCC。
SEQ ID NO.4所示的下游引物的核苷酸序列为：TTGTACCCACTTCTATTCGG。
在本发明的一个优选实施例中，与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记，由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列构成。
本发明在对少刺基因精细定位的基础上，利用BSA方法，筛选与黄瓜少刺基因连锁的分子标记，最终将少刺基因定位在黄瓜3号染色体区间内，在该区间内开发与少刺性状连锁的分子标记，其中InDel-FS2为与少刺性状共分离的共显性InDel分子标记。该标记可应用于黄瓜苗期密刺单株和少刺单株的辅助筛选判断中。
本发明通过F2分离群体分析，利用InDel标记中的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段与密刺基因共分离，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段与少刺基因共分离，鉴定和筛选黄瓜少刺，可简便、快速、高通量地应用于少刺黄瓜品种的选育。
下面结合实施例进一步阐明本发明，但本发明并不局限于这些实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
InDel-FS2分子标记开发与鉴定
1.1黄瓜群体构建
针对黄瓜果刺密度这一性状，发现了一个华北型黄瓜少刺突变体(参见，图1中B图)，分析发现突变位点不同于已经报道的少刺突变体few spines1(fs1)(参见，图1中A图)，因此将其命名few spine 2(fs2)。选择华北型少刺突变体fs2和密刺野生型黄瓜06-1(参见，图1中C图)，取它们授粉后一周的果实(至少6个)，对果实上所有果刺数目进行统计(参见，图1中D图)，发现果刺数目有明显差异。接下来利用两个亲本构建了F2(06-1×fs2)群体和BC1P2((06-1×fs2)×fs2)回交群体，用于定位。
1.2黄瓜果刺数目统计
在黄瓜果实开花授粉后一周，取果实统计所有果刺的数目，自交系统计6个果实，少刺定位群体株系统计2～3个果实。在123株黄瓜F2(06-1×fs2)群体中，密刺单株数目是90，稀刺单株数目是33；在104株黄瓜BC1P2群体中，密刺单株数目是53，稀刺单株数目是51。卡方检验显示，F2群体中密刺类型与少刺类型的株系数目均符合3:1的分离比例，BC1P2群体中的密刺类型和少刺类型株系数目符合1:1的分离比。这些结果表明，fs2突变体的少刺表型是由隐性单基因控制的。
1.3分子标记开发
由于fs2突变体和野生型亲本06-1均属于华北类型黄瓜，遗传背景比较相似，可用于基因定位的标记较少。根据它们的重测序数据，找出两个亲本之间差异较大的插入缺失(InDel)变异位点，设计InDel引物，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行基因分型。同时找出两个亲本之间的单核苷酸差异(SNP)位点，在初步定位区间内均匀地选择SNP位点，开发SNP标记；对fs2突变体与06-1后代分离群体进行基因型分析。
1.4初定位
采用BSA法进行fs2位点的初步定位，在06-1×fs2的F2群体中，根据果刺的表型构建了少刺池和多刺池，每个池包含10个株系的DNA。利用亲本间的50对多态标记对这些混池DNA进行筛选，发现4号染色体上发现多个多态性InDel分子标记，表明少刺基因位于4号染色体上。
根据BSA分析结果，利用BSA分析获得的池间多态标记，利用06-1×fs2 F2群体的123个单株和BC1的104个单株，将fs2位点初步定位在标记InDel4-13-1(上游序列：GATATCGTCTGTTGTTTAGT；下游序列：GATCTTTAATTTGGTCGAAC)和InDel4-14-1(上游序列：CTGTCATAAATTATTCGAATTCG；下游序列：GCGTTAATCATCAAACTTGC)之间的944kb区域内。
1.5精细定位
根据初定位结果，利用标记InDel4-13-1和InDel4-14-1对06-1×fs2的另外1802个F2代单株和420个BC1代单株进行基因分型，找到185株在两个标记间存在交换的株系；将这些单株进行定植，观察它们的果刺表型。同时根据两亲本的重测数据，在标记InDel4-13-1和InDel4-14-1之间设计SNP标记。对185个交换单株进行基因型鉴定，结合这些单株的果刺表型，将fs2位点精细定位在SNP11(上游序列：CCAACAACCAGTGAGTATTGTAC；下游序列：CCATTCTTCACTTTCTTATCTTCG)和SNP12(上游序列：CCCACCACCCAAATCTCCTG；下游序列：GGATTCTATTTCCATCGGTTAG)之间11kb的区间内。在fs2定位区间内存在一个40bp的InDel，针对该Indel开发分子标记InDel-FS2。
利用primer 5.0引物设计软件在突变的两侧设计正反向引物。上游引物为SEQ IDNO.3所示，下游引物为SEQ ID NO.4所示，利用该引物通过PCR扩增fs2突变体和野生型亲本06-1的基因组DNA，得到密刺黄瓜的扩增条带为165bp，少刺黄瓜的扩增条带为125bp。本发明经上游引物与下游引物扩增得到与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记，命名为InDel-FS2，InDel-FS2由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段组成；其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段与密刺基因共分离，SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列片段与少刺基因共分离。
fs2突变体和野生型亲本06-1的基因组DNA可通过本领域常用的方法提取，参见下面的1.6。上述PCR扩增条件为94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。扩增总体系为12μL，其中Premix Taq为6μL，正反向引物(10μM)分别为0.5μL，DNA(50ng/μL)为2μL，ddH2O为3μL。扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压为180V，电泳时间2h。电泳结束后用硝酸银(0.5g AgNO3+500mL ddH2O)溶液进行染色20min，然后用氢氧化钠溶液(10g NaOH+2mL甲醛+500mL ddH2O)进行显色，结果如图2所示，密刺亲本06-1扩增后只出现长度为165bp的DNA片段，少刺亲本2-358只出现长度为125bp的DNA片段，电泳条带清晰稳定，说明InDel-FS2可用于后续群体共分离验证。
1.6群体共分离验证
为了证明标记InDel-FS2与稀刺基因的连锁关系，利用1600株的F2(06-1×fs2)群体对此标记进行群体连锁分析验证。
采用CTAB法提取黄瓜亲本和分离群体基因组DNA。将幼嫩叶片放入2mL离心管，加入钢珠和500μL CTAB提取液，将离心管摆放在高通量组织研磨仪专用盒子中，两边配平，调节振幅50Hz，时间2min进行研磨；研磨结束后，将离心管放入65℃烘箱中30～60min，中间每隔10min取出来上下摇动几次；加入500μL的氯仿，上下颠倒混匀，12000r/min离心10min；取上清液200μL，转移至1.5mL离心管；向上清液中加入2.5倍上清体积的预冷无水乙醇，充分混匀，12000r/min离心10min，倒掉上清液，将离心管开盖晾干，加入200μL ddH2O，在-20℃存储备用。
PCR扩增总体系为12μL，其中Premix Taq为6μL，正反向引物(10μM)分别为0.5μL，DNA(50ng/μL)为2μL，ddH2O为3μL。
其中正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，反向引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.4。
PCR扩增程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压为180V，电泳时间2h。电泳结束后用硝酸银(0.5g AgNO3+500mL ddH2O)溶液进行染色20min，然后用氢氧化钠溶液(10g NaOH+2mL甲醛+500mL ddH2O)进行显色，显色后统计条带。如图3所示，电泳条带清晰稳定。图3的结果显示在群体中与亲本06-1有一致带型的单株表现为密刺，与稀刺亲本fs2有一致带型的植株为少刺，杂合带型的植株也为密刺，符合率达到了100％。以上结果充分说明，InDel-FS2标记具有通用性和准确性，可以应用于黄瓜稀刺植株的预测、鉴定和筛选。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记，其特征在于，其包括SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列片段和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段，其中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列片段与密刺基因共分离，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列片段与少刺基因共分离。
2.权利要求1所述的与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括利用SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物进行PCR扩增得到所述InDel分子标记。
3.权利要求1所述的与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记在鉴别黄瓜密刺和少刺品种的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记用于分子标记辅助选择育种。
5.利用与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记的检测引物鉴别黄瓜密刺和少刺品种的方法，其中，所述与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记的检测引物包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)提取黄瓜品种的基因组总DNA；
(2)利用所述检测引物对黄瓜品种的基因组总DNA进行PCR扩增，得到PCR产物；
(3)对步骤(2)的PCR产物进行电泳分析；
(4)若电泳条带只出现长度为165bp的DNA片段，则判断黄瓜样品为携带密刺基因的纯合型；若电泳条带只出现长度为125bp的DNA片段，则判断黄瓜样品为携带少刺基因的纯合型；若电泳条带同时出现长度为165bp与125bp的DNA片段，则判断黄瓜样品为携带密刺基因和少刺基因的杂合型。
6.根据权利要求5所述的鉴别黄瓜密刺和少刺品种的方法，其特征在于，步骤(2)中，
PCR扩增总体系为12μL，其中Premix Taq为6μL，10μM的上游引物和下游引物分别为0.5μL，50ng/μL DNA为2μL，ddH2O为3μL，
PCR扩增程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。
7.根据权利要求5所述的鉴别黄瓜密刺和少刺品种的方法，其特征在于，步骤(3)中电泳分析为聚丙烯酰胺凝胶电泳。
CN202211404279.0A 2022-11-10 2022-11-10 与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记、检测引物及其应用 Active CN116064911B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211404279.0A CN116064911B (zh) 2022-11-10 2022-11-10 与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记、检测引物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211404279.0A CN116064911B (zh) 2022-11-10 2022-11-10 与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记、检测引物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116064911A CN116064911A (zh) 2023-05-05
CN116064911B true CN116064911B (zh) 2024-07-23

Family

ID=86170690

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211404279.0A Active CN116064911B (zh) 2022-11-10 2022-11-10 与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记、检测引物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116064911B (zh)

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101481737A (zh) * 2009-01-08 2009-07-15 上海交通大学 与黄瓜果瘤基因Tu紧密连锁的分子标记
CN104313018B (zh) * 2014-09-24 2017-04-05 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 黄瓜果实多刺基因ns的Indel标记及其应用
WO2016177696A1 (en) * 2015-05-07 2016-11-10 Nunhems B.V. Introgression of a yield qtl in cucumis sativus plants
CN104805216B (zh) * 2015-05-21 2017-07-11 山东农业大学 一种快速鉴定黄瓜品系刺瘤稀密的分子标记、鉴定方法及应用
MX391761B (es) * 2016-04-15 2025-03-21 Nunhems Bv Introgresión de dos loci de caracteres cuantitativos de rendimiento en plantas cucumis sativus.
CN106939352A (zh) * 2017-05-03 2017-07-11 江苏师范大学 快速筛选黄瓜硬刺/软刺果实类型的InDel分子标记
CN107586870A (zh) * 2017-09-21 2018-01-16 上海交通大学 与黄瓜果实软刺基因Ts紧密连锁的InDel分子标记及其应用
CN107586869A (zh) * 2017-09-21 2018-01-16 上海交通大学 与黄瓜果实软刺基因Ts共分离的InDel‑Ts3分子标记及其应用
CN109234438B (zh) * 2018-10-31 2021-08-03 上海交通大学 与黄瓜无限生长型基因共分离的分子标记Indel-De3
CN109762920B (zh) * 2019-01-28 2022-04-08 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 黄瓜果实多刺基因ns紧密连锁的SNP标记及其应用
CN112458200B (zh) * 2021-01-13 2023-01-13 河南农业大学 与黄瓜果刺基座大小基因紧密连锁的InDel分子标记及其应用
CN113913548B (zh) * 2021-11-12 2022-12-27 上海交通大学 与黄瓜白粉病抗病和感病主效基因共分离的InDel分子标记及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Csa4G652850.1;佚名;Cucurbit Genomics Database;20190828;1-7 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116064911A (zh) 2023-05-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bauchet et al. Genetic diversity in tomato (Solanum lycopersicum) and its wild relatives
KR101388281B1 (ko) 질병 내성 오이 식물체
JP6059979B2 (ja) 稔性のカプシクム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）植物
CN111996209B (zh) 孤雌生殖单倍体诱导基因dmp及其应用
US20210195859A1 (en) Resistance to tolcndv in melons
JP6389295B2 (ja) ポティウイルスに耐性のカボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）植物
CN105695478B (zh) 调节植物株型和产量的基因及其应用
CN111197101B (zh) 一种与烟草多叶基因mLN紧密连锁的共显性SSR标记及其应用
CN117069814A (zh) 孤雌生殖单倍体诱导基因GhDMP及其应用
EP3238533A1 (en) Begomovirus-resistant melon plants
Hemaprabha et al. Sugarcane genetic diversity and major germplasm collections
CN109152346B (zh) 西瓜中赋予对马铃薯y病毒属抗性的qtl
EP3107372B1 (en) Resistance to geminiviruses in watermelons
CN116064911B (zh) 与黄瓜密刺和少刺基因共分离的InDel分子标记、检测引物及其应用
Yu et al. Development of a 50K SNP array for whole-genome analysis and its application in the genetic localization of eggplant (Solanum melongena L.) fruit shape
CN116769950B (zh) 与玉米穗长主效qtl紧密连锁的分子标记及应用
CN108588261B (zh) 一种鉴定位于萝卜R02染色体上的晚抽薹QTL的InDel引物及其应用
Ming et al. Genomics of papaya a common source of vitamins in the tropics
CN111374041A (zh) 一种分子标记辅助选择高抗稻瘟病水稻材料的方法
Hoarau et al. Sugarcane, a tropical crop with a highly complex genome
Sanghera et al. Sugarcane improvement in genomic era: opportunities and complexities
CN111961742A (zh) 重组核苷酸片段RecS5-1和RecS5-2及其检测引物与应用
CN116640768B (zh) 小麦抗白粉病基因PmTR1及其应用
US12144310B2 (en) Tobacco plant resistant to spotted wilt disease without linkage drag and method for breeding the same
CN108707690A (zh) 与白肋烟控制基因共分离的分子标记及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
OL01 Intention to license declared
OL01 Intention to license declared