CN116064411A - 杂交瘤细胞株及其分泌的抗赛洛西宾单克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗赛洛西宾单克隆抗体和应用。所述杂交瘤细胞株命名为PLCB‑5.2.1，保藏编号为CCTCCNo.C2022364；所述抗赛洛西宾单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生，该抗体为IgG1型，轻链为kappa型。上述抗赛洛西宾单克隆抗体能够用于制备赛洛西宾检测试剂盒或用于制备检测赛洛西宾的胶体金免疫检测试纸条。本发明抗赛洛西宾单克隆抗体效价高，特异性强，可用于对赛洛西宾进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

Description

杂交瘤细胞株及其分泌的抗赛洛西宾单克隆抗体和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种杂交瘤细胞株及其分泌的抗赛洛西宾单克隆抗体和应用。

背景技术

赛洛西宾(psilocybin)，又名裸盖菇素、光盖菇素、裸头草碱，化学式为C₁₂H₁₇N₂O₄P，是一种具有神经致幻作用的神经毒素。

研究发现赛洛西宾这种天然存在的致幻剂能通过增加大脑功能网络的链接，让难治性抑郁症患者产生治疗反应。抑郁症患者经常表现出“负性认知偏向”，其特征为悲观、认知灵活性差、僵硬的思维方式，以及对“自我”和未来的消极性固着，难治性抑郁症是指多个抗抑郁药物疗程也无法改善抑郁症状的重性抑郁障碍。多项临床试验报道了经赛洛西宾治疗后抑郁症状有所改善的试验结果，但是，赛洛西宾和相关致幻剂的治疗机制一直没有得到充分解释。赛洛西宾疗法具有快速、可观、持久的抗抑郁效果，疗效显著超过艾司西酞普兰。抑郁症状的缓解与大脑功能网络的连接增加显著相关。这些大脑模块结构的显著变化提示了赛洛西宾的迅速作用对脑功能具有一种“留存”效应。在使用艾司西酞普兰的患者身上没有观察到这种变化。由此说明，赛洛西宾(可能还有其他致幻剂)具有有别于传统抗抑郁药物的新的作用机制。具体而言，赛洛西宾疗法或能通过解放僵化的脑网络并刺激对心理健康有益的协调灵活的脑功能，起到缓解抑郁症状的作用。

非正常使用赛洛西宾危害较大，首先进入血液循环，再到达神经系统，然后激活5-羟色胺受体，而引起神经兴奋作用。主要作用于自主神经，引起神经兴奋、致幻，对时间和空间产生错觉，直至出现自我歪曲，妄想和思维分裂等症状，严重的出现心动过速，瞳孔放大，排尿困难，但一般不会危及生命。

赛洛西宾也广泛存在于野生蘑菇中，很容易发生蘑菇中毒，且赛洛西宾是第一类精神药品，滥用其属于吸毒行为。

通过杂交瘤技术可以制备抗赛洛西宾杂交瘤细胞株。通过此杂交瘤细胞株制备出的抗体能用于制备胶体金免疫检测试纸条，实现了在现场对人员快速检测的要求。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了一种分泌抗赛洛西宾单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能产生高效价的抗赛洛西宾单克隆抗体。

一种分泌抗赛洛西宾的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株PLCB-5.2.1，已于保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.C2022364；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。

本发明采用小剂量肌肉注射免疫方法和尾静脉免疫相结合的方法，用人工合成的赛洛西宾抗原注射小鼠，获得免疫的小鼠脾细胞，进而将免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，用赛洛西宾标准品进行筛选，从而获得所述杂交瘤细胞株。

赛洛西宾本身的分子量太小，其不具有免疫原性，即缺乏T细胞表位而无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，因此本发明对赛洛西宾进行化学修饰，偶联BGG(牛血清丙种球蛋白)获得能诱导B细胞的增殖和分化继而产生特异性抗体的人工抗原(PLCB-BGG)。所述的赛洛西宾分子结构式(I)所示：

每次注射时，赛洛西宾人工抗原的使用量为25μg。

采用小剂量肌肉注射免疫方法和腹腔免疫相结合的方法免疫小鼠，免疫效价高。

本发明还提供了所述杂交瘤细胞株在制备用于检测赛洛西宾的试纸条中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种抗赛洛西宾单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株PLCB-5.2.1或其传代细胞株分泌产生。该抗体为IgG1型，轻链为kappa型。

本发明的第三个目的是提供上述抗赛洛西宾单克隆抗体在制备赛洛西宾检测试剂盒中的应用。

本发明所述的检测试剂盒为竞争抑制ELISA检测试剂盒；其内还含有赛洛西宾标准品和酶标二抗。由于赛洛西宾本身分子结构的限制，本发明的检测试剂盒是以竞争抑制ELISA原理制备的。使用时，先包被赛洛西宾标准品，再加入待测样品，然后依次加入所述抗抗赛洛西宾单克隆抗体、酶标二抗，进行反应，检测OD₄₅₀值，计算竞争抑制率。赛洛西宾标准品的包被量以所述抗赛洛西宾单克隆抗体对赛洛西宾的检测阈值为宜。所述酶标二抗可选用羊抗鼠IgG-HRP。

本发明所述的检测试剂盒为竞争型酶联免疫试剂盒；其内含有包被有抗赛洛西宾单克隆抗体的酶标板、赛洛西宾标准品、酶标抗原、底物和终止液。使用时，待检测样品和酶标记的赛洛西宾抗原一起加入酶标板反应，若样品中残留有赛洛西宾，则会与酶标赛洛西宾抗原竞争结合板上的抗体，再加入底物反应，终止显色。显色强度与样品中残留的赛洛西宾量成反比。根据赛洛西宾标准品做出的标准曲线，计算出样品中的赛洛西宾的含量。

本发明的第四个目的是提供上述抗赛洛西宾单克隆抗体在制备检测赛洛西宾的胶体金免疫检测试纸条中的应用。

本发明所述的用于检测赛洛西宾的胶体金免疫检测试纸条，包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫；所述标记物垫包被有胶体金标记的所述抗赛洛西宾单克隆抗体，所述反应膜的检测线(T线)处包被有赛洛西宾-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线(C线)处包被有二抗。

本发明的试纸条也是以竞争抑制ELISA原理制备的，赛洛西宾-牛血清白蛋白复合物的包被量也是以所述抗赛洛西宾单克隆抗体对赛洛西宾的检测阈值为宜。检测时，若只有C线显色，表示待测样品中含有赛洛西宾且检测赛洛西宾的含量高于检测限；若C线和T线均显色，表示待测样品中检测赛洛西宾的含量低于检测阈值，或待测样品中无赛洛西宾；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明利用PLCB-BGG免疫小鼠，利用免疫的小鼠脾细胞制备获得杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌的抗赛洛西宾单克隆抗体效价高，特异性强，可用于对赛洛西宾进行快速、准确的免疫检测和免疫分析。

杂交瘤细胞株PLCB-5.2.1，已于2020年6月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCCNo.C2022364；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。

附图说明

图1为本发明一种赛洛西宾胶体金检测试纸条的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。

实施例1赛洛西宾人工抗原的制备

(1)将10mg赛洛西宾人工半抗原、20mg N-羟基琥珀酰亚胺、15mg二环已基碳酰亚胺溶解于2ml N,N-甲基甲酰胺中，25℃水浴中搅拌24h，记为A液。

(2)将10mg牛血清丙种球蛋白(BGG)溶于0.01mol/LPBS溶液中，记为B液。

(3)将A液缓慢滴加入搅拌中的B液中，然后室温搅拌反应2h。将混合溶液至于PBS溶液中透析3次，每次时长超过6h，即可得人工抗原PLCB-BGG。

实施例2杂交瘤细胞株的制备

(1)小鼠免疫

选择6周龄的BALB/c雌鼠用PLCB-BGG抗原25μg与quick antibody-5w佐剂等体积混合成100μl，注射小鼠后小腿肌肉；所述的后小腿肌肉部位为小鼠腿部暴露在外部有大块肌肉的地方，而小鼠的大腿大部分被腹部皮肤包裹，也可找到膝关节区分小腿大腿；两周后同样方式注射第2针；再2周后，用25μg抗原进行腹腔注射。

(2)制备脾脏细胞

取经步骤(1)处理的BALB/c雌鼠的脾脏，研磨脾脏细胞至悬液；脾脏细胞悬液离心，取沉淀；在沉淀中加入含有15％胎牛血清的IMDM培养基，调整脾脏细胞至10ml。

(3)脾脏细胞与骨髓瘤细胞的融合：

(3-1)饲养细胞制备：小鼠摘眼球处死，浸泡于75％酒精中消毒10min，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，用无菌注射器注入8mL 37℃预热的IMDM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；1500rpm下离心3min，沉淀物用1×HAT的IMDM培养液重悬，得到饲养细胞悬液。

(3-2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为10％的FBS的IMDM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代，以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长状态良好用于细胞融合。

(3-3)脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合：将调整浓度后的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞个数比为4：1混合均匀，1500rpm下离心洗涤细胞1次，去除上清液，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀松动，置于37℃水浴，在90s内缓缓加入1mL 37℃预温的1mL PEG1500，边加边轻微摇动；加入25ml 37℃预温的IMDM无血清培养基终止PEG作用；1000rpm下离心5min，取沉淀；然后在沉淀中加入步骤(3-1)制备的饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(4)杂交瘤细胞的融合筛选

(4-1)初筛：

步骤(3-3)中融合细胞在5％CO₂培养箱中培养3天后，换用1×HT的IMDM培养液，继续培养4天后，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇(在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小以占满1/3视野为宜)时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。

间接ELISA方法的操作步骤是：

①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释PLCB-BGG抗原至1μg/mL，96孔酶标板每孔中分别加入100μl稀释后的抗原，4℃包被过夜，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；

②将PBS缓冲液加入到融合细胞培养上清液稀释至25倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的融合细胞培养上清液，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；

③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；

④每孔加入50μl底物TMB，37℃下反应5分钟；

⑤加入50μl浓度为1M HCL终止反应，在紫外波长450nm下测定其OD值，以融合细胞培养上清液OD₄₅₀值/阴性对照OD₄₅₀值>2.5为阳性克隆，将筛选到的阳性克隆进一步地用竞争抑制ELISA方法进行复筛。

(4-2)复筛：

竞争抑制ELISA方法的操作步骤是：

①先将50μl浓度为100ng/ml的赛洛西宾标准品加入酶标孔中，再加入50ul阳性克隆培养上清液，同时设计空白对照，即50μl PBS缓冲液和50μl阳性克隆培养上清液混合加入到酶标孔中，37℃孵育60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；

②将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃下孵育30分钟，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；

③每孔加入50μl底物TMB，37℃下反应5分钟；

④加入50μl浓度为1M HCL终止反应，在紫外波长450nm下测定其OD值，计算竞争抑制率，结果如表1所示。

竞争抑制率的计算式为：

表1各杂交瘤细胞株的竞争抑制ELISA结果

由表1可见，杂交瘤细胞株PLCB-5的竞争抑制率最高，故挑取杂交瘤细胞株PLCB-5做克隆培养。

(4-3)杂交瘤细胞株PLCB-5的克隆化

杂交瘤细胞株PLCB-5的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含体积分数为15％的FBS的IMDM培养基稀释成4个/mL的细胞悬液，然后以每孔200μl接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况，并检测细胞培养板中细胞培养上清液的抗体水平，选择3个抗体效价最高的单克隆，再次做克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率达到100％；然后挑取单克隆细胞，命名为PLCB-5.2.1，扩大培养后进行抗赛洛西宾单克隆抗体纯化。

(5)抗赛洛西宾单克隆抗体纯化

取扩大培养后的杂交瘤细胞株PLCB-5.2.1，接种1×10⁶细胞于小鼠腹腔，10天后采集腹水。取10ml腹水，用2倍体积的PBS稀释，再加入3倍体积的饱和硫酸铵，将得到混合液离心，取沉淀。沉淀用pH7.4的PBS溶解，然后用pH7.4的PBS透析过夜4次。收集抗体溶液，过滤。用OD₂₈₀测定蛋白含量,蛋白浓度为3.56mg/ml。

实施例3抗赛洛西宾单克隆抗体的反应活性测试

采用间接ELISA方法检测实施例1制备的抗赛洛西宾单克隆抗体的反应活性，检测步骤包括：

①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释PLCB-BGG抗原至50ng/mL，然后在96孔酶标板中分别加入100μl/每孔稀释后的抗原，4℃包被过夜；

②用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后加入100μl浓度为0.3μg/ml的抗赛洛西宾单克隆抗体溶液，做1:3稀释，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；

③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中加入100μl/每孔稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后每孔加入50μl底物TMB 37℃反应5分钟后，浓度为1M HCL终止反应，450nm测定其OD值，以抗赛洛西宾单克隆抗体溶液OD₄₅₀值/阴性对照OD₄₅₀值>2.5为阳性值；检测结果见表2。

表2不同浓度下抗赛洛西宾单克隆抗体的OD₄₅₀值

抗赛洛西宾单克隆抗体浓度	OD450值
		0.3μg/ml	2.382
0.1μg/ml	2.312
		0.03μg/ml	2.086
0.01μg/ml	1.634
		0.003μg/ml	1.036
0.001μg/ml	0.434
		0.0003μg/ml	0.263
0.0001μg/ml	0.082
		PBS(空白对照)	0.098

由表2可见，实施例1制备的抗赛洛西宾单克隆抗体反应活性可以到达0.001μg/ml。

实施例4抗赛洛西宾单克隆抗体的最低检测线测试

采用间接ELISA方法检测实施例1制备的抗赛洛西宾单克隆抗体的反应活性，检测步骤包括：

①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释，PD-BGG抗原至1μg/mL，然后在96孔酶标板中分别加入100μl/每孔稀释后的抗原，4℃包被过夜；

②用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后分别将50μl浓度为50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、20ng/ml、10ng/ml的赛洛西宾标准品加入酶标孔中，再加入加入100μl浓度为0.3μg/ml的抗赛洛西宾单克隆抗体溶液同时设计空白对照，即先加入50μl PBS缓冲液再加入50μl阳性克隆培养上清液到酶标孔中，37℃孵育60分钟后，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板1次；

③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中加入100μl/每孔稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟，用含0.05％tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后每孔加入50μl底物TMB 37℃反应8分钟后，浓度为1M HCL终止反应，450nm测定其OD值，以抗赛洛西宾单克隆抗体溶液OD₄₅₀值/阴性对照OD₄₅₀值>2.5为阳性值；检测结果见表3。

表3抗赛洛西宾单克隆抗体对不同浓度标准品的竞争抑制ELISA结果

由表3可见，实施例1制备的抗赛洛西宾单克隆抗体能检测到赛洛西宾的最低浓度为500ng/ml。

应用例1赛洛西宾胶体金检测试纸条

如图1所示，本实施例一种赛洛西宾胶体金检测试纸条，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾搭接在底板上。其中，胶体金垫上包被有胶体金标记的实施例1制备的抗赛洛西宾单克隆抗体，硝酸纤维素膜的检测线(T)处包被有赛洛西宾-牛血清白蛋白复合物，质控线(C)处包被有羊抗鼠IgG。试纸条的制备方法为本领域的常规方法。

检测时，室温下将试纸条样品垫的一端插入待测样品中，注意待测样品的液面不要超过试纸条上的MAX线；肉眼观察，并记录C线和T线的显色情况。

若只有C线显色，表示待测样品中含赛洛西宾且赛洛西宾的含量高于500ng/ml；若C线和T线均显色，表示待测样品中检测赛洛西宾的含量低于500ng/ml；若C线和T线均不显色，表示试纸条已经失效。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种分泌抗赛洛西宾的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株PLCB-5.2.1，保藏编号为CCTCC No.C2022364。

2.权利要求1所述的分泌抗赛洛西宾的杂交瘤细胞株在制备用于检测赛洛西宾的试纸条中的应用。

3.一种抗赛洛西宾单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。

4.根据权利要求3所述的一种抗赛洛西宾单克隆抗体，其特征在于，所述抗体为IgG1型，轻链为kappa型。

5.权利要求3所述的抗赛洛西宾单克隆抗体在制备赛洛西宾检测试剂盒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒包括竞争抑制ELISA检测试剂盒和竞争型酶联免疫试剂盒。

7.权利要求3所述的抗赛洛西宾单克隆抗体在制备检测赛洛西宾的胶体金免疫检测试纸条中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测赛洛西宾的胶体金免疫检测试纸条包括样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫；所述标记物垫包被有胶体金标记的所述抗赛洛西宾单克隆抗体。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述反应膜的检测线处包被有赛洛西宾-牛血清白蛋白复合物，所述反应膜的质控线处包被有二抗。

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