CN116036356A - 一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术及增材制造领域，具体涉及一种糖基化姜黄素伤口愈合水凝胶敷料的制备方法及其应用。通过将来源于Bacillus subtilis 168的糖基转移酶基因构建到表达载体上，在NdeI和XhoI酶切位点插入，构成共表达重组质粒为pET_YjiC，将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中得到重组菌株，此重组菌株进行诱导表达后可以用于转化姜黄素为糖基化产物，所得产物糖基化姜黄素的水溶解度可达到49.60mg/L和15.31mg/L。将糖基化姜黄素与酶改木质素、聚己内酯、聚乙二醇、角蛋白制备得到水凝胶敷料，具有免疫调节功能、可完全降解的优势，其用途适用于皮肤外伤屏障受损皮肤的无菌维护和术后住院病人的伤口愈合。

Description

一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术及增材制造领域，具体涉及一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料的制备方法及其应用。

背景技术

意外创伤、肿瘤手术和糖尿病引起的慢性创伤是临床关注的主要问题。慢性伤口难以愈合的主要原因是由于血液循环不良导致氧气和营养供应不足，增加了免疫细胞活性氧的生成，导致细胞外基质的降解和皮肤组织的损伤。临床处理患者伤口，一般需在伤口出处覆盖敷料，防止细菌侵入并保持创面湿润环境。纱布、棉垫等传统敷料虽有保护作用，但不具备治疗和修复伤口的性能，且传统敷料生物可降解性差，易粘连伤口组织，造成二次损伤。水凝胶类敷料作为一种新型的创伤敷料，是以聚丙烯酸、聚乙烯醇等高分子聚合材料为基材形成的一种具有三维网状结构且不溶于水的胶状物质，拥有多种表面官能团，具有一定的缓释功效，已广泛应用于生物医学工程领域。

但多数的水凝胶都是以石油基化学品作为原材料，制作成本昂贵，对环境产生不利影响。木质素的结构中含有大量的官能团和化学反应活性位点，可进行化学改性和接枝共聚制备木质素复合水凝胶。将木质素引入到水凝胶中，可以提高水凝胶的强度，且该水凝胶在水环境中很容易降解，其高含水量、良好的生物相容性和特殊的表面特性使其成为生物、医学与环境应用中最受欢迎的材料之一。由于其良好的生物相容性，水凝胶敷料能吸收伤口渗出液防止伤口感染，短时间内不必频繁更换敷料；但吸收大量渗出物的敷料胶体会与伤口分离，无法有效阻挡细菌的侵入。因此在实际应用过程中常根据需要，将不同抗菌剂、生物活性成分等药物包埋在水凝胶内，药物可持续通过体液交换释放到病变区，从而减少细菌生长，防止创面感染，促进伤口的愈合。

姜黄素是从姜科植物根茎中提取的多酚类化合物，是一种绿色、安全、无毒的天然抗菌剂，具有良好的生物活性，同时具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗癌、创伤修复等药理活性，广泛应用于医疗、化妆品领域。但由于姜黄素分子量大、结构不稳定、水溶性差，且其分子两端具有羟基，在碱性条件下，容易发生共轭效应，易溶于冰醋酸和碱性溶液，这导致姜黄素生物利用度低，从而限制了其在创面敷料上的应用。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明旨在解决所述问题之一；提供一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料，能够改善姜黄素的水溶性，提高其生物利用度，并稳定负载姜黄素，起到长效消炎杀菌的作用，可防止创面细菌感染，帮助伤口愈合。

本发明首先提供了一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料，包括以下质量百分比的组分：碱木质素或者酶改性碱木质素，0.1-15％；

糖基化姜黄素，0.01-5％；

聚乙二醇(PEG)，0.1-2％；

聚己内酯(PCL)，0.1-10％；

角蛋白，0.1-20％；

甘油0.01-1％；

余量为水。

所述酶改性木质素的制备方法，包括以下步骤：

(1)首先配制酶解体系，然后将酶解体系在120r/min的水浴摇床中于37℃反应12-24h，得到反应液；

其中酶解体系由漆酶或染料脱色过氧化物酶、Tris-HCl缓冲液、2,2-联氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)和木质素组成，所述漆酶或染料脱色过氧化物酶、Tris-HCl缓冲液和木质素的用量关系为5mL：20mL：1g；所述ABTS在酶解体系中的终浓度为0.2mM；所述漆酶或染料脱色过氧化物酶在酶解体系中的浓度10000U/L；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，pH值为7；所述的木质素包括但不限于木质素磺酸盐、碱木质素、磨木木质素或溶剂型醇解木质素。

(2)将步骤(1)得到的反应液通过离心去除溶液中的不溶性木质素，然后收集上清液，经煮沸10-15min后离心去除蛋白，再通过HCl将上清液的pH调为3，离心收集沉淀；

(3)将收集的沉淀经真空冷冻干燥48h后，得到终产物，即为酶改碱木质素，备用。

所述角蛋白的制备方法，包括以下步骤：

将角蛋白原料用清水清洗干净，加入乙醇处理一段时间，过滤后在沉淀物中再加入稀HCl处理，处理后加入巯基乙醇还原反应；反应后经离心得到沉淀，再经冷冻干燥得到角蛋白；所述角蛋白原料、乙醇、稀HCl、巯基乙醇为的质量比为1:2:2:1；

优选的，所述角蛋白原料包括但不限于动物毛、禽类羽毛或人的毛发。

优选的，所述乙醇的质量分数为50％；所述稀HCl的质量分数为5％；所述加入乙醇处理一段时间为30min，加入稀HCl处理的时间为1h；所述还原反应的时间为1h。

所述糖基化姜黄素的生物制备方法，包括以下步骤：

(1)首先配制酶解体系，然后将酶解体系经水浴反应后得到反应液；其中酶解体系由纯化蛋白、Tris-HCl缓冲液、尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)和姜黄素组成；所述纯化蛋白、Tris-HCl缓冲液、姜黄素的用量关系为5μg：300μL：2μL；所述UDP-Glc在酶解体系中的终浓度为1.37mM；所述姜黄素的浓度20mg/mL；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，pH值为7；

所述纯化蛋白为来源于Bacillus subtilits 168的葡萄糖基转移酶(将其命名为Bs-YjiC)，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将步骤(1)得到的反应液加入乙酸乙酯萃取，得到混合反应液，进行水浴蒸发，蒸发至混合反应液体积的1％-5％，然后在蒸发后的混合反应液中加入的色谱纯乙醇，得到糖基化姜黄素，低温避光保存；所述反应液、乙酸乙酯和色谱纯乙醇的体积比为3：6：2。

优选的，步骤(1)中所述水浴反应的温度为37℃，反时间为1h。

优选的，步骤(2)中所述水浴蒸发的温度为55℃。

本发明还提供了一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将聚己内酯(PCL)、聚乙二醇(PEG)和辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)混合后，在通入氮气条件下进行反应，反应后待降至一定温度后再加入角蛋白和糖基化姜黄素继续进行第二次反应，反应后加入去离子水和甘油，搅拌使其分散均匀，得到水性乳液；

(2)在室温条件下，以步骤(1)得到的水性乳液与碱木质素或者酶改性碱木质素混合得到混合物，首先对其进行预冷冻处理，然后经冷冻干燥得到糖基化姜黄素水凝胶敷料。

优选的，步骤(1)中所述PCL、PEG、Sn(Oct)₂、角蛋白、糖基化姜黄素、去离子水和甘油的用量关系为10g：3g：0.1g：4.5g：1g：36g：0.21g；所述反应的温度为75℃，反应时间为3h；所述降至一定温度为50℃，所述第二次反应的时间为1h。

优选的，步骤(2)中所述预冷冻处理的温度为-20℃，时间为24h；所述碱木质素或者酶改性碱木质素与水性乳液的用量关系为2g:1.7mL。

与现有技术相比较，本发明的有益效果如下：

本发明的糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料，具有良好的抗菌性和药物缓释功效，能持续作用于伤患处，可应用于外伤、烧伤、烫伤、溃疡、褥疮等伤口。

(1)本发明选用的木质素含有大量的官能团和化学反应活性位点，具有良好的生物相容性，可增加水凝胶的强度，且该水凝胶在水环境中容易降解，具有低毒性、环境友好等优点。经漆酶或染料脱色过氧化物酶处理后的酶改性木质素色度变浅，更加美观。

(2)本发明将聚己内酯、聚乙二醇、角蛋白和糖基化姜黄素等溶解于去离子水中得到水性乳液，后与碱木质素或者酶改性碱木质素进行聚合反应后即可制得稳定负载姜黄素的酶改性木质素水凝胶敷料，制备方法简单，原料来源广泛、价格便宜，成本可控，可实现工业化生产。

(3)本发明所使用的糖基化姜黄素，与天然姜黄素对比，姜黄素葡萄糖苷产物的水溶解度分别可达到49.60mg/L和15.31mg/L，显著提高了水凝胶敷料中姜黄素的水溶性，有利于提高姜黄素生物利用度及缓释作用。

(4)本发明的糖基化姜黄素水凝胶敷料具有良好的力学性能，柔韧性和弹性好，能够与皮肤形成良好粘合，适用于身体不同部位的创面，特别是手肘、手腕、膝盖、脚腕等经常性活动部位。

附图说明

图1为蛋白镍柱纯化凝胶电泳结果图，其中A：Marker，B:阴性对照，C:0mM的咪唑洗脱，D:250mM的咪唑洗脱。

图2为糖基化姜黄素制备条件测试图，其中A为反应前后HPLC图；B为反应时间对姜黄素转化效果的影响；C为pH对姜黄素转化效果的影响；D为反应温度对姜黄素转化效果的影响。

图3为凝胶样品贴于皮肤表面的照片。

图4为凝胶样品中的姜黄素体外释放测试曲线图。

图5为凝胶样品对大肠杆菌的抗菌效果图，图中的1和2分别对应对照样品和凝胶样品。

具体实施方式

根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的发明。

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

菌种说明：所述纯化蛋白为来源于Bacillus subtilits 168的葡萄糖基转移酶(命名为Bs-YjiC(NP_389104.1))，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述Bacillus subtilis 168来源自中国普通微生物菌种保藏中心，其保藏编号为：CGMCCNO.1.1391。

方案说明：本发明首先提供了一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料，包括以下质量百分比的组分：碱木质素或者酶改性碱木质素，0.1-15％；

糖基化姜黄素，0.01-5％；

聚乙二醇(PEG)，0.1-2％；

聚己内酯(PCL)，0.1-10％；

角蛋白，0.1-20％；

甘油0.01-1％；

余量为水。

所述酶改性木质素的制备方法，包括以下步骤：

(1)首先配制酶解体系，然后将酶解体系在120r/min的水浴摇床中37℃反应12-24h，得到反应液；

其中酶解体系由漆酶或染料脱色过氧化物酶、Tris-HCl缓冲液、2,2-联氨-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)和碱木质素组成，所述漆酶或染料脱色过氧化物酶、Tris-HCl缓冲液和碱木质素的用量关系为5mL：20mL：1g；所述ABTS在酶解体系中的终浓度为0.2mM；所述漆酶或染料脱色过氧化物酶在酶解体系中的浓度10000U/L；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，pH值为7。

(2)将步骤(1)得到的反应液通过离心去除溶液中的不溶性木质素，然后收集上清液，经煮沸10-15min后离心去除蛋白，然后通过HCl将上清液调pH为3，离心收集沉淀；

(3)将收集的沉淀经真空冷冻干燥48h后，得到终产物，即为酶改性碱木质素备用。

所述角蛋白的处理方法，包括以下步骤：

将角蛋白原料用清水清洗干净，加入质量分数为50％的乙醇处理30min，过滤后在沉淀物中再加入稀HCl(质量分数5％)处理1h，然后加入巯基乙醇还原1h；最后离心后得到沉淀，再经冷冻干燥(-20℃)得到角蛋白；其中角蛋白原料、乙醇、稀HCl、巯基乙醇为的质量比为1:2:2:1；所述角蛋白原料包括但不限于：动物毛，禽类羽毛和人的毛发。

所述糖基化姜黄素的生物制备方法，包括以下步骤：

(1)首先配制酶解体系，然后将酶解体系在水浴锅中37℃反应1h，得到反应液；其中酶解体系由纯化蛋白、Tris-HCl缓冲液、尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)和姜黄素组成，所述纯化蛋白、Tris-HCl缓冲液、姜黄素的用量关系为5μg：300μL：2μL；所述UDP-Glc在酶解体系中的终浓度为1.37mM；所述姜黄素的浓度20mg/mL；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，pH值为7；其中纯化蛋白为来源于Bacillus subtilits 168的葡萄糖基转移酶(将其命名为Bs-YjiC)，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

(2)将步骤(1)得到的反应液加入乙酸乙酯萃取，得到混合反应液，在55℃的水浴锅中蒸发至混合反应液体积的1％-5％，然后在蒸发后的混合反应液中加入的色谱纯乙醇，得到糖基化姜黄素，低温避光保存；所述反应液、乙酸乙酯和色谱纯乙醇的体积比为3：6：2。

一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将聚己内酯(PCL)、聚乙二醇(PEG)和辛酸亚锡(Sn(Oct)₂)混合后，在通入氮气条件下进行反应，反应的温度为75℃，反应时间为3h；反应后待降50℃后再加入角蛋白和糖基化姜黄素继续进行第二次反应，反应的时间为1h；反应后加入去离子水和甘油，搅拌使其分散均匀，得到水性乳液。

(2)在室温条件下，以步骤(1)得到的水性乳液与碱木质素或者酶改性碱木质素混合得到混合物，首先对其进行预冷冻处理，温度为-20℃，时间为24h；然后经冷冻干燥得到糖基化姜黄素水凝胶敷料；所述碱木质素或者酶改性碱木质素与水性乳液的用量关系为2g:1.7mL。

实施例1：糖基化姜黄素的生物制备及其溶解度测试

1、糖基转移酶(Bs-YjiC)工程菌的构建

(1)糖基转移酶(Bs-YjiC)基因合成

利用体外全基因合成方法合成糖基转移酶Bs-YjiC的全长基因(苏州泓讯生物科技股份有限公司合成)，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)糖基转移酶(Bs-YjiC)基因的处理与连接

将步骤(1)合成的糖基转移酶(Bs-YjiC)基因的片段用T₄DNA Polymerase处理后，与质粒pET-28a(+)(苏州泓讯生物科技股份有限公司)在室温条件下连接20min，得到连接后的质粒pET-YjiC.

(3)重组质粒在E.coli BL21(DE3)的转化

将0.5uL步骤(2)的质粒pET-YjiC加入100uL E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，至于冰上20min，然后在42℃热激90s后再冰浴2min，冰浴后加入250μL的LB培养基，在37℃下培养30min后得到培养液；随后取150μL培养液涂布于含有50μg/mL硫酸卡那霉素(Kan)的LB平板，37℃倒置过夜培养，得到含有糖基转移酶(Bs-YjiC)基因的工程菌。

(4)重组工程菌小量诱导表达

挑取步骤(3)中平板上重组后含有糖基转移酶(Bs-YjiC)基因的工程菌接种于含50μg/mL硫酸卡那霉素(Kan)的1mL LB培养液的试管中，在37℃、220rpm振摇培养至OD₆₀₀为0.8时，取出500μL培养菌液，加入IPTG至终浓度为1mM，在220rpm、37℃条件下继续培养3h；经10000rpm，2min离心去上清收集菌体，在菌体中加入50μL Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 7)重悬菌体，得到菌悬液，电泳检测蛋白表达。

2、蛋白的纯化

将糖基转移酶(Bs-YjiC)基因的工程菌接种于含有50μg/mL Kan的600mL LB培养液中(接种量为1％)，在37℃、220rpm振摇至菌体OD₆₀₀为0.8-1.0，然后加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，于37℃、220rpm条件下继续培养4h，培养后经5000rpm、4℃离心5min收集菌体，超声破碎，破碎后的菌体在12000rpm、4℃条件下离心10min，离心后收集上清进行镍柱纯化，填料类型为Smart-Ni；其中平衡液为：Tris-HCl缓冲液，pH为7.4，洗脱液：Tris-HCl缓冲液，pH 7.4；按20mM、50mM、250mM咪唑梯度分别进行梯度洗脱，得到纯化蛋白，结果如图1所示。

3、糖基转移酶Bs-YjiC酶活测试

以姜黄素为底物，测定体系为300μL，体系中含有50mM pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液，5μg纯化蛋白，1.37mM的UDP-Glc，检测波长为425nm。1μmol底物转化为产物所需的酶量为一个国际制酶活单位，最大比活力为144.77±0.53U/mg。

4、糖基转移酶(Bs-YjiC)转化姜黄素最佳条件测试

测定体系为300μL，体系中含有5μg纯化蛋白，50mM Tris-HCl，1.37mM的UDP-Glc和2μL的姜黄素。反应后加入600μL的乙酸乙酯萃取，取500μL在55℃的水浴挥发，加入200μL的色谱纯乙醇用于HPLC检测，分析检测波长为425nm。结果如图2所示，图A为反应前后HPLC图；图B、C、D分别为反应时间、pH和反应温度对姜黄素转化效果的影响。图2中A说明经糖基转移酶转化后产生了两种新产物，图2B-2D说明在pH为8，温度为40℃，反应时间为30min时，转化效果最好。

5、糖基化姜黄素溶解度测定

将糖基化姜黄素溶解于1mL的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中搅拌30min后，12000r/min离心15min，0.45μm滤膜过滤，加入等体积的甲醇，以天然姜黄素为对照，HPLC测定糖基化姜黄素溶解度，经测定姜黄素葡萄糖苷产物的水溶解度分别可达到49.60mg/L和15.31mg/L。

实施例2：糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料的制备

糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料，包括以下质量百分比的组分：

15％的木质素，5％糖基化姜黄素，0.1％聚乙二醇(PEG)，10％聚己内酯(PCL)，20％角蛋白，甘油1％，余量为水；

针对组分原料说明如下：

(1)改性木质素的制备

酶解体系为500mL，体系含有10000U/L的漆酶100mL，pH为7的Tris-HCl缓冲液400mL，终浓度为0.2mM的ABTS和20g的碱木质素，在120r/min的水浴摇床中37℃反应12-24h得到反应液；

将反应液通过离心去除溶液中的不溶性木质素，然后收集上清液，经煮沸10min后离心去除蛋白，然后通过HCl将上清液调pH为3，离心收集沉淀；将收集的沉淀经真空冷冻干燥48h后，得到终产物，即为酶改性碱木质素。

(2)角蛋白的预处理

选择动物毛作为角蛋白原料，具体为羊毛；

用清水清洗干净，然后加入质量分数为50％的乙醇处理30min，过滤后再加入稀HCl(质量分数5％)处理1h，然后使用巯基乙醇还原1h；离心后冷冻干燥(-20℃)得到角蛋白；所述角蛋白原料、乙醇、稀HCl、巯基乙醇为的质量比为1:2:2:1。

糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料的制备，具体步骤如下：

10g的聚己内酯(PCL)、3g聚乙二醇(PEG)与0.1g辛酸亚锡Sn(Oct)₂混合后，通入氮气在75℃条件下反应3h；随后温度降至50℃再加入4.5g角蛋白和1g糖基化姜黄素继续反应1h，反应后再加入36g去离子水和0.21g甘油，搅拌使其分散均匀，得到水性乳液；

最后，在室温条件下，将2g酶改性碱木质素与1.7mL水性乳液混合得到混合物，将其放置在-20℃条件下预冷冻24h，再经冷冻干燥，得到糖基化姜黄素水凝胶敷料。

实施例3：糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料的性能验证

(1)粘合性测试：

将凝胶样品贴在手臂上，如图3所示。从图可以观察到凝胶样品能够与皮肤形成良好粘合，不易脱落。

(2)姜黄素体外释放测试：

将凝胶样品裁成直径25mm、厚度2mm的圆形样片，称重记为m₀，置于50mL的50mMTris-HCl缓冲液(pH为7.2)中，37℃下进行姜黄素体外释放测试。每间隔12h吸取适量缓冲液，用无水乙醇稀释后，425nm处测定吸光度，计算姜黄素的释放量m₁。以凝胶样品中姜黄素的平均负载量536μg/g为基准，按照公式计算姜黄素随时间延长的累积释放率R(％)，结果如图4所示。凝胶样品负载的姜黄素在初始24h释放较快，24h后释放速率逐渐减慢，但直至96h基本保持不变，释放率达到了50％以上。说明本发明的糖基化姜黄素水凝胶敷料能够长效缓释姜黄素，并保持药效作用。

(3)抗菌性测试：

将1mL的大肠杆菌悬浮液(OD₆₀₀为1.0)涂布于LB琼脂平板，将水凝胶样品覆盖在LB琼脂平板的表面，在37℃下培养48h后，观察LB平板是否存在明显的抑菌区。选择凝胶样品和对照样品(未添加糖基化姜黄素)进行抑菌试验，实验结果如图5所示。从图中可以看处，培养48h后，对照样品对大肠杆菌无明显的抑制区，说明对照样品对大肠杆菌无抗菌活性；而凝胶样品对大肠杆菌产生了3.1+9.7mm的抑菌圈，说明本发明的负载糖基化姜黄素的水凝胶敷料对大肠杆菌具有明显的抗菌活性。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

SEQ ID NO.1基因序列(DNA)：

AAAAAGTATCATATTAGCATGATTAACATTCCGGCGTACGGCCATGTGAACCCGACCCTGGCGCTGGTTGAAAAACTGTGCGAAAAAGGCCATCGCGTGACCTATGCGACCACTGAAGAATTTGCGCCGGCGGTGCAGCAAGCGGGTGGTGAAGCGCTGATCTACCATACTAGCCTGAACATTGATCCGAAACAGATTCGCGAAATGATGGAAAAGAACGATGCGCCGCTGAGCCTGCTGAAAGAAAGCCTGAGCATTCTGCCGCAGCTGGAGGAGCTGTATAAAGATGATCAGCCGGATCTGATTATTTATGACTTTGTGGCGCTGGCGGGCAAACTGTTTGCGGAAAAACTGAACGTGCCGGTGATTAAACTGTGCAGCAGCTATGCGCAGAACGAAAGCTTTCAGCTGGGCAACGAAGATATGCTGAAAAAGATTCGCGAAGCGGAAGCCGAATTTAAAGCGTATCTGGAACAGGAAAAACTGCCGGCGGTGAGCTTTGAACAGCTGGCGGTGCCGGAAGCGCTGAATATTGTGTTTATGCCGAAAAGCTTTCAGATTCAGCATGAAACCTTCGATGATCGCTTTTGCTTTGTGGGCCCGAGCCTGGGCGAACGCAAGGAAAAAGAAAGCCTGCTGATTGATAAAGATGATCGCCCGTTAATGCTGATTAGCCTGGGCACCGCGTTTAACGCGTGGCCGGAATTTTATAAAATGTGCATCAAGGCGTTTCGCGATAGCAGCTGGCAGGTGATTATGAGCGTGGGCAAAACCATTGATCCGGAAAGCCTGGAAGATATTCCGGCGAACTTTACCATTCGCCAGAGCGTGCCGCAGCTGGAAGTGCTGGAAAAAGCGGATCTGTTTATTAGCCATGGCGGCATGAACAGCACCATGGAAGCGATGAACGCGGGTGTGCCGCTGGTGGTGATTCCGCAGATGTATGAACAGGAACTGACCGCGAACCGCGTGGATGAACTGGGCTTAGGCGTGTATCTGCCGAAAGAAGAAGTGACCGTGAGCAGCCTGCAGGAAGCGGTGCAGGCGGTTAGCAGTGATCAAGAACTGCTGAGCCGCGTGAAAAACATGCAGAAAGATGTGAAAGAAGCGGGCGGCGCGGAACGCGCGGCAGCAGAAATTGAAGCGTTTATGAAAAAGAGCGCGGTGCCGCAGTAA

SEQ ID NO.2氨基酸序列：

MKKYHISMINIPAYGHVNPTLALVEKLCEKGHRVTYATTEEFAPAVQQAGGEALIYHTSLNIDPKQIREMMEKNDAPLSLLKESLSILPQLEELYKDDQPDLIIYDFVALAGKLFAEKLNVPVIKLCSSYAQNESFQLGNEDMLKKIREAEAEFKAYLEQEKLPAVSFEQLAVPEALNIVFMPKSFQIQHETFDDRFCFVGPSLGERKEKESLLIDKDDRPLMLISLGTAFNAWPEFYKMCIKAFRDSSWQVIMSVGKTIDPESLEDIPANFTIRQSVPQLEVLEKADLFISHGGMNSTMEAMNAGVPLVVIPQMYEQELTANRVDELGLGVYLPKEEVTVSSLQEAVQAVSSDQELLSRVKNMQKDVKEAGGAERAAAEIEAFMKKSAVPQ

Claims (10)

1.一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料，其特征在于，包括以下质量百分比的组分：碱木质素或者酶改性碱木质素，0.1-15％；

糖基化姜黄素，0.01-5％；

聚乙二醇，0.1-2％；

聚己内酯，0.1-10％；

角蛋白，0.1-20％；

甘油0.01-1％；

余量为水。

2.根据权利要求1所述的一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料，其特征在于，所述酶改性木质素由制备方法获得，制备步骤如下：

(1)首先配制酶解体系，然后将酶解体系在120r/min的水浴摇床中于37℃反应12-24h，得到反应液；

其中酶解体系由漆酶或染料脱色过氧化物酶、Tris-HCl缓冲液、ABTS和木质素组成，所述漆酶或染料脱色过氧化物酶、Tris-HCl缓冲液和木质素的用量关系为5mL：20mL：1g；所述ABTS在酶解体系中的终浓度为0.2mM；所述漆酶或染料脱色过氧化物酶在酶解体系中的浓度10000U/L；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，pH值为7；所述的木质素包括但不限于木质素磺酸盐、碱性木质素、磨木木质素或溶剂型醇解木质素；

(2)将步骤(1)得到的反应液通过离心去除溶液中的不溶性木质素，然后收集上清液，经煮沸10-15min后离心去除蛋白，再通过HCl将上清液的pH调为3，离心收集沉淀；

(3)将收集的沉淀经真空冷冻干燥48h后，得到终产物，即为酶改性碱木质素。

3.根据权利要求1所述的一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料，其特征在于，所述角蛋白由制备方法获得，制备步骤如下：

将角蛋白原料用清水清洗干净，加入乙醇处理一段时间，过滤后在沉淀物中再加入稀HCl处理，处理后加入巯基乙醇还原反应；反应后经离心得到沉淀，再经冷冻干燥得到角蛋白；所述角蛋白原料、乙醇、稀HCl、巯基乙醇为的质量比为1:2:2:1。

4.根据权利要求3所述的一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料，其特征在于，所述角蛋白原料包括但不限于动物毛、禽类羽毛或人的毛发。

5.根据权利要求3所述的一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料，其特征在于，所述乙醇的质量分数为50％；所述稀HCl的质量分数为5％；所述加入乙醇处理一段时间为30min，加入稀HCl处理的时间为1h；所述还原反应的时间为1h。

6.根据权利要求1所述的一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料，其特征在于，所述糖基化姜黄素由制备方法获得，制备步骤如下：

(1)首先配制酶解体系，然后将酶解体系经水浴反应后得到反应液；其中酶解体系由纯化蛋白、Tris-HCl缓冲液、UDP-Glc和姜黄素组成，所述纯化蛋白、Tris-HCl缓冲液、姜黄素的用量关系为5μg：300μL：2μL；所述UDP-Glc在酶解体系中的终浓度为1.37mM；所述姜黄素的浓度20mg/mL；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，pH值为7；

所述纯化蛋白为来源于Bacillus subtilits 168的葡萄糖基转移酶，其DNA序列如SEQIDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将步骤(1)得到的反应液加入乙酸乙酯萃取，得到混合反应液，进行水浴蒸发，蒸发至混合反应液体积的1％-5％，然后在蒸发后的混合反应液中加入的色谱纯乙醇，得到糖基化姜黄素，低温避光保存；所述反应液、乙酸乙酯和色谱纯乙醇的体积比为3：6：2。

7.根据权利要求6所述的一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料，其特征在于，步骤(1)中所述水浴反应的温度为37℃，反应时间为1h；步骤(2)中所述水浴蒸发的温度为55℃。

8.根据权利要求1-7任一项所述的一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将PCL、PEG和Sn(Oct)₂混合后，在通入氮气条件下进行反应，反应后待降至一定温度后再加入角蛋白和糖基化姜黄素继续进行第二次反应，反应后加入去离子水和甘油，搅拌使其分散均匀，得到水性乳液；

(2)在室温条件下，以步骤(1)得到的水性乳液与碱木质素或者酶改性碱木质素混合得到混合物，首先对其进行预冷冻处理，然后经冷冻干燥得到糖基化姜黄素水凝胶敷料。

9.根据权利要求8所述的一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCL、PEG、Sn(Oct)₂、角蛋白、糖基化姜黄素、去离子水和甘油的用量关系为10g：3g：0.1g：4.5g：1g：36g：0.21g；所述反应的温度为75℃，反应时间为3h；所述降至一定温度为50℃，所述第二次反应的时间为1h。

10.根据权利要求8所述的一种糖基化姜黄素促进伤口愈合水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述预冷冻处理的温度为-20℃，时间为24h；所述碱木质素或者酶改性碱木质素与水性乳液的用量关系为2g:1.7mL。

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