CN116035187A - 一种使用植物乳杆菌发酵降低苦杏仁蛋白致敏性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种使用植物乳杆菌发酵降低苦杏仁蛋白致敏性的方法，属于食品加工领域。本发明使用苦杏仁为原料，使用活化并扩大培养的植物乳杆菌FSB7进行发酵，发酵后样品游离氨基酸含量上升4倍以上，水解度达到82％。发酵最佳条件为：苦杏仁：水＝1:20(w/v)，接菌液量为菌液：苦杏仁＝0.1％(v/w)，发酵初始pH为6.5，发酵时间为36h。在这种条件下，苦杏仁蛋白可被有效水解，致敏原被破坏，降低苦杏仁蛋白致敏原性，用酶联免疫吸附测定(ELISA)验证苦杏仁乳免疫原性的降低，结果显示发酵后的苦杏仁乳免疫原性降低为原来的29％左右。

Description

一种使用植物乳杆菌发酵降低苦杏仁蛋白致敏性的方法

技术领域

本发明涉及一种使用植物乳杆菌发酵降低苦杏仁蛋白致敏性的方法，属于食品加工领域。

背景技术

苦杏仁(apricot kernels)又称北杏仁，为蔷薇科植物山杏的种子，味苦，因具有止咳平喘、润肠通便的功效而常被用作中药材。在中国饮料消费市场中，全国最大的杏仁露生产企业，年生产能力达50多万吨，而杏仁露的原料就是经过脱苦等处理的苦杏仁，未进行脱敏处理。在西方苦杏仁也可被用于烘焙食物调味中，也可榨油被用于化妆品和治疗溃疡和哮喘等疾病。苦杏仁中重要的功效性成分苦杏仁苷具有抗炎抗溃疡、镇痛、防止动脉硬化等多种生理活性作用。

食品过敏是指某些人在吃了某种食物之后，引起身体某一组织、某一器官甚至全身的强烈反应，以致出现各种各样的功能障碍或组织损伤。蛋白质是引发食物过敏的主要成分，随着蛋白质过敏人群的逐年增加，联合国粮食及农业组织(Food and AgricultureOrganization of the United Nations，FAO)宣布了八大致敏食物，核果类就在其中。有相关统计反映致命性过敏反应有80％是由树坚果引起的。坚果核类种子中的水溶性蛋白多为六聚体11S球蛋白，也是植物种子中的致敏蛋白，分子量大小为50-60kDa。有相关研究表明苦杏仁致敏原蛋白与杏仁致敏原蛋白Amandin具有高度同源性，是由相似亚基组成的11S球蛋白。蛋白中的致敏表位与抗原受体特异性结合，会引起免疫应答反应，使人体出现腹泻、呕吐、哮喘或皮炎等多种症状，严重时会发生休克甚至危及生命。

在食品工业产业中，常使用物理、化学、生物或者多种手段相结合等方法处理来降低食品的致敏性，如热加工、超声处理、高压处理、酶水解和发酵等多种方法。虽然已有相当多的研究证明多种脱敏手段均可达到降低目标蛋白抗原性的目的，但是在食品工业生产中，使用物理处理方法，通常需要添加更多附带加工条件，如热处理机械、超高压机械等，成本会大大提高，且不能完全实现对致敏原的分解，与此相比，酶解处理与微生物发酵就更适宜被应用于食品加工产业，这种方法可改变蛋白质的空间结构并断裂肽键，使抗原被分解成小分子，从而实现降低致敏性的目的。

食品发酵工业常用霉菌、酵母菌、细菌来发酵原料，如枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母等多种微生物。其中乳酸菌是一种大规模被应用于牛奶发酵的菌种，关于乳酸菌发酵可降低乳清蛋白致敏性的事实有大量研究可佐证，但是使用乳酸菌发酵脱敏苦杏仁蛋白的相关研究还没有。乳酸菌的生长依赖于对原料基中蛋白质的水解获得氮源，这种水解反应使其能改变蛋白质的感官特性，以及其致敏表位，从而降低食物的致敏性。另一方面，乳酸菌作为一种益生菌，可以直接或间接影响人体微生物系统来提高人体免疫力，所以发酵食品除了降低致敏性外，还能提供一些额外的健康益处。

目前，苦杏仁加工企业集中度低，精深加工与综合利用较少，多为初加工，对于降低苦杏仁致敏性的相关研究也较少，故本发明在苦杏仁脱敏方面具有很好的创新性与应用价值。

发明内容

本发明要解决苦杏仁具有致敏性的问题，如何使用安全、利于生产加工利用的方法降低苦杏仁蛋白的致敏性。因此本发明选用益生菌以及多种乳酸菌对苦杏仁进行发酵。比起之前使用酶法处理苦杏仁降低其致敏性的专利方法(公开号为CN109619381A)，本发明使用发酵法的原料成本更低，且发酵法技术成熟，不需要灭酶处理，减少加工生产过程中的能耗成本。且在发酵过程中，蛋白质被水解成肽和游离氨基酸，从而产生一些生物活性肽，如抗氧化肽、抗高血压肽、抗肿瘤肽和抗糖尿病肽等【左玲玲.乳酸菌发酵豆奶的蛋白结构表征及其致敏性的细胞学评估[D].南昌大学,2019.】，对人体有健康益处。

目前在植物蛋白的脱敏相关研究中，多是将原料脱脂后提取蛋白，对其蛋白粉进行发酵等加工处理再测定其免疫反应性【周阳.微生物发酵对花生蛋白中致敏因子的影响研究[D].河南工业大学,2014.】，本发明测定的是发酵苦杏仁乳的致敏性变化，未经脱脂磨粉提取蛋白等工序处理，也能达到显著的脱敏效果，且相比起脱脂提取蛋白后再处理测定致敏原性的方法，本研究能更加方便地应用于生产。

且目前使用发酵方法降低植物蛋白致敏性的相关研究中，发酵时间达到了60-72h【刘少伟,周定鹏,娜音图,苏复工.一种高压蒸汽和微生物发酵制备低敏性花生蛋白粉的方法[P].上海市：CN113317388A,2021-08-31.；程友飞.微生物固态发酵豆粕及其致敏性研究[D].南昌大学,2016.】，本发明发酵时间为36h，相比起其他研究，时间大大缩短，更加利于应用在生产当中，且节约成本。

本发明提供一种利用发酵的方法降低苦杏仁蛋白致敏原性的方法，通过植物乳杆菌FSB7发酵杏仁蛋白，将杏仁蛋白水解成短肽，破坏其致敏表位，从而达到降低其免疫原性的效果。

本发明一种降低含有苦杏仁蛋白的产品的致敏性的方法，所述方法为，将植物乳杆菌FSB7或其发酵液，添加至含有苦杏仁蛋白的产品的反应体系中进行发酵，以降低产品中杏仁蛋白的致敏性。

所述植物乳杆菌FSB7公开于【Zhu W,et al.Effect of Microbial Fermentationon the Fishy-Odor Compounds in Kelp(Laminaria japonica).Foods,2021,10(11),2532.；Xiang L,et al.Volatile compounds analysis and biodegradation strategyof beany flavor in pea protein.Food Chemistry,402,134275.doi:10.1016/j.foodchem.2022.134275】，申请人承诺自申请日起，二十年内向公众发放。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品或保健品。

在本发明的一种实施方式中，所述产品包括但不限于，苦杏仁乳、苦杏仁粉、以及包含此杏仁成分的其他食品和饮料。

在本发明的一种实施方式中，所述苦杏仁乳的制备方法包括如下步骤：将去皮干燥后的苦杏仁加去离子水以1：20(w/v)的比例浸泡12h后使用破壁机破碎，充分破碎后使用八层纱布过滤，得到苦杏仁乳。

在本发明的一种实施方式中，所述苦杏仁粉的制备方法包括如下步骤：将苦杏仁浸泡后脱皮，在50℃下烘干12h，磨粉过筛。

在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌FSB7发酵液的制备方法为：将植物乳杆菌FSB7接种至种子培养基中，在37℃条件下培养10-12h。

在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌FSB7发酵液的制备方法为：将植物乳杆菌FSB7接种至种子培养基中，在37℃条件下培养12h。

在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌FSB7的接种量为：0.1％-0.15％(v/w)；所述反应体系中初始pH为：6.4-6.6。

在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌FSB7的接种量为：0.1％(v/w)；所述反应体系中初始pH为：6.5。

本发明还提供了植物乳杆菌在制备降低苦杏仁蛋白致敏性的产品中的应用，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌FSB7，或植物乳杆菌FSB7微生物菌剂，或植物乳杆菌FSB7发酵液。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品添加剂。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，植物乳杆菌FSB7的添加量至少为：0.1％(v/w)。

本发明还提供了一种苦杏仁蛋白，所述苦杏仁蛋白是按照下述步骤得到的：

(1)将植物乳杆菌FSB7活化、扩大培养，分别接入苦杏仁乳和苦杏仁粉的液态发酵样品中，于37℃静置发酵。

(2)将发酵后的苦杏仁样品冻干脱脂得到发酵后的苦杏仁脱脂粉。

(3)苦杏仁发酵后的苦杏仁脱脂粉用碱溶酸沉法提取蛋白，得到经过植物乳杆菌FSB7发酵的苦杏仁蛋白。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，苦杏仁粉的发酵：使用液态发酵的条件，在苦杏仁粉中加入灭菌的去离子水，接入植物乳杆菌菌悬液，于37℃恒温培养箱发酵。

步骤(1)中，苦杏仁乳的发酵：在灭菌的苦杏仁乳中接入植物乳杆菌菌悬液，于37℃恒温培养箱发酵。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)优化得到的发酵条件是：苦杏仁液态发酵样品固体：液体＝1:20(w/v)，接菌液量为菌液：苦杏仁粉＝0.1％(v/w)，发酵初始pH为6.5，发酵时间为36h。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中，植物乳杆菌FSB7活化、扩大培养方法为：将保藏的菌种分别于MRS平板划线接种，于37℃恒温培养箱中培养12 -18h复壮，用10uL的枪头挑取挑取与目标菌种一致的单菌落，接种于装有MRS液态培养基的试管中，于37℃培养12h，吸取1mL菌液转入50mL MRS液体培养基中，于37℃培养10h。将种子液于4000g离心10min，倾去上清，加入10mL无菌生理盐水混匀得到目的菌悬液，用平板计数法确定菌悬液中菌的数量约为1×10⁹个/mL。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中：所述苦杏仁粗蛋白的碱溶酸沉制备方法包括如下步骤：在苦杏仁粉中以固：液＝1:15(w/v)的比例加入pH 8.1的20mM Tris-HCl提取蛋白质，在50℃条件下磁力搅拌1h，离心取上清液，重复两次将上清液合并，用0.1mol/L的HCl调节pH至4.5，离心丢弃上清液，将沉淀用去离子水溶解用NaOH将pH调到7.0，过0.45μm滤膜。将过滤后蛋白质溶液在2L去离子水中透析24h，期间换3-4次透析液。将苦杏仁蛋白溶液冻干得到苦杏仁蛋白粉。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中：所述苦杏仁粉的脱脂方法包括如下步骤：将苦杏仁粉按照1:10(w/v)的比例加入丙酮，磁力搅拌2h后，弃去有机溶剂，将得到的沉淀按照上述过程重复三次，置于通风橱过夜，挥发残留的丙酮，研磨得到脱脂苦杏仁粉。

有益效果

(1)本发明使用苦杏仁为原料，使用活化并扩大培养的植物乳杆菌进行发酵，并确定了一种苦杏仁粉的液态发酵条件为：苦杏仁粉末：水＝1:20(w/v)，接菌液量为菌液：苦杏仁粉＝0.1％(v/w)，发酵初始pH为6.5，发酵时间为36h。在这种条件下，苦杏仁蛋白可被有效水解，致敏原被破坏，降低苦杏仁蛋白致敏原性。

(2)本发明对发酵后的苦杏仁样品进行游离氨基酸含量和水解度的测定，验证发酵后苦杏仁样品游离氨基酸含量提高4.06倍，水解度达到82％。

(3)本发明使用上述发酵条件发酵苦杏仁乳，用酶联免疫吸附测定(ELISA)验证苦杏仁免疫原性的降低，结果显示发酵后的苦杏仁乳免疫原性降低为原来的29％左右。

(4)本发明使用植物乳杆菌FSB7发酵，有效降低的苦杏仁蛋白致敏性，且相比超高压、超声或酶解等方法成本较低，有成熟的机械设备与技术支持，产物不会出现酶解产生的苦味肽，感官更易于接受，适合应用于生产。本发明使用乳酸菌这种益生菌发酵，不仅可以降低苦杏仁蛋白致敏性，还有利于未来低致敏性苦杏仁乳制品的开发。

附图说明

图1是本发明制备的使用不同菌种发酵苦杏仁蛋白溶液中游离氨基酸的含量。

图2是本发明提取的使用不同菌种发酵12h苦杏仁蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中a为未发酵的苦杏仁蛋白的SDS-PAGE电泳图；b为发酵的苦杏仁蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图3是本发明使用不同菌种发酵12h后苦杏仁蛋白的水解度以及苦杏仁乳的稳定性系数。

图4是本发明制备的苦杏仁脱脂粉与水的混合物在不同条件下的发酵过程中pH变化。

图5是本发明制备的植物乳杆菌FSB7发酵前后的苦杏仁脱脂粉的小肽含量。

图6是本发明提取的发酵前后苦杏仁蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中a为发酵后苦杏仁蛋白；b为发酵前苦杏仁蛋白。

图7是本发明制备的植物乳杆菌FSB7发酵前后的苦杏仁乳的ELISA测定结果。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的嗜热乳杆菌、双歧杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌分别为：短双歧杆菌M-16V、植物乳杆菌ACCC 11095、短乳杆菌CICC 6239，购自：泰斯诺生物；嗜热乳杆菌HH-ST08、保加利亚乳杆菌HH-IB57、植物乳杆菌FSB7，为实验室保藏菌种。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

MRS固态培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸取物(牛肉膏)10.0g，酵母提取液(酵母膏或酵母粉)5.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二胺2.0g，吐温-80 1.0ml，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，七水硫酸锰0.05g，琼脂15g，蒸馏水1.0L，调节pH为6.2～6.4。

MRS液态培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸取物(牛肉膏)10.0g，酵母提取液(酵母膏或酵母粉)5.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二胺2.0g，吐温-80 1.0ml，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，七水硫酸锰0.05g，蒸馏水1.0L，调节pH为6.2～6.4。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

OPA法测定苦杏仁蛋白水解度的检测：

OPA配制：

(1)将7.620g四硼酸钠和200mg SDS溶于150mL去离子水中，必须待完全溶解后加入其他试剂；

(2)用4mL乙醇溶解160mg苯甲醛(OPA)，将此OPA溶液全部转移到步骤1中，用去离子水冲洗；

(3)在1中加入176mg DTT，用去离子水冲洗；

(4)定容至200mL。

丝氨酸标准溶液：50mg丝氨酸溶解于500ml去离子水中(0.9516mmol/L)。

实验步骤：在340nm下测定吸光度值，以去离子水作参比。A.每个试管中分别加入3mL OPA、400uL样品，振荡混匀，精确反应2min后在340nm下测定其吸光度。在测定空白和样品之前测定两次标准样品的吸光度，在所有空白和样品测定之后再测定两次标样的吸光度，计算时取四次测定的平均值。使用以下公式计算DH值：

式中：

SerineNH₂：毫摩serineNH₂/g蛋白；

X：样品重量；

P：样品中的蛋白含量；

0.1：样品体积转换成L；

h＝(SerineNH₂-β)/α·mmol/gprotein；

对杏仁蛋白而言，h_tot＝7.58mmol/g。

杏仁乳中的致敏原分析：

使用杏仁Elisa试剂盒分析杏仁乳中的致敏原。按照说明书，取1mL杏仁乳与20mL提取缓冲液混合，60℃下磁力搅拌10min，提取苦杏仁蛋白。在4℃，2500g下离心10min，收集上清液。每孔加入100μL稀释的标准品或样品待测液，室温下孵育20min。按如下步骤洗板：每孔加入300μL稀释洗涤液，翻转板子倒掉，用板子快速拍击纸巾，重复以上步骤三次。每孔加入100μL酶标物(抗杏仁蛋白-过氧化物酶)，室温下孵育20min。再次洗板，每孔加入100μL显色液，室温下暗处反应20min，每孔添加100μL终止液(0.5M H2SO4)终止酶反应，孔液由蓝色变为黄色。轻轻震荡酶标板，充分混匀后，用酶标仪450nm处测吸光度(参考波长630nm)。孔液颜色会稳定30min。

实施例1：菌种的培养与定量

具体步骤如下：

(1)分别将嗜热乳杆菌HH-ST08、短双歧杆菌M-16V、短乳杆菌CICC 6239、保加利亚乳杆菌HH-IB57、植物乳杆菌ACCC 11095、植物乳杆菌FSB7的保藏菌种于MRS平板划线接种，于37℃恒温培养箱中培养12～18h，以进行菌种的复壮，然后根据菌落形态、颜色选择挑取与目标菌种一致的平板上的单菌落；

(2)分别用10uL的枪头挑取步骤(1)得到的单菌落，接种于装有MRS液态培养基的试管中，于37℃恒温培养箱培养12h，试管中培养基出现浑浊，然后吸取1mL菌液转入新的MRS液体培养基中，于37℃培养10h，分别制备得到种子液。

(3)在无菌条件下，分别将制备得到的种子液于4000g离心10min，倾去上清，用无菌生理盐水冲洗沉淀两次，分别得到：嗜热乳杆菌HH-ST08菌悬液、短双歧杆菌M-16V菌悬液、短乳杆菌CICC 6239菌悬液、保加利亚乳杆菌HH-IB57菌悬液、植物乳杆菌ACCC 11095菌悬液、植物乳杆菌FSB7菌悬液，经检测，菌悬液中菌浓均为：1×10⁹个/mL。

实施例2：苦杏仁产品的制备

(1)苦杏仁乳的制备

将去皮干燥后的苦杏仁加去离子水以1：20(w/v)的比例浸泡12h后使用破壁机破碎，充分破碎后使用八层纱布过滤，得到苦杏仁乳。

(2)苦杏仁粉制备

将苦杏仁浸泡脱皮，用50℃烘箱干燥12h，磨粉过筛，获得干燥苦杏仁粉。

实施例3：苦杏仁液态发酵

具体步骤如下：

称取2g实施例2制备得到的苦杏仁粉于250mL锥形瓶中，再加入40mL pH 7.0的去离子水，接入0.2mL浓度为1×10⁹个/mL的菌悬液，于37℃恒温培养箱发酵(用塑料纸封住瓶口)，发酵时间为36h。发酵完成后对产品进行脱脂、提取粗蛋白、冷冻干燥，以用于后续检测。

发酵条件的优化：

分别将不同发酵菌种、发酵时间、固水比、初始pH和接菌量作为单因素变量对苦杏仁发酵条件进行优化。

(1)发酵菌种的选择：

将2g苦杏仁粉与20mL去离子水混合，将pH调整为6.0，分别接入0.2mL浓度为1×10⁹个/mL的嗜热乳杆菌HH-ST08菌悬液、短双歧杆菌M-16V菌悬液、短乳杆菌CICC 6239菌悬液、保加利亚乳杆菌HH-IB57菌悬液、植物乳杆菌ACCC 11095菌悬液、植物乳杆菌FSB7菌悬液，发酵24h。

结果显示：植物乳杆菌FSB7发酵效果最好，可以在同样的发酵时间下获得更高的水解度、游离氨基酸。

(2)发酵时间的优化：

将2g苦杏仁粉与20mL去离子水混合，将pH调整为6.0，接入0.2mL浓度为1×10⁹个/mL的植物乳杆菌FSB7菌悬液，重复多组，分别发酵4h、8h、12h、18h、24h、36h、48h。

结果显示：发酵36h发酵效果最好，样品pH不再发生变化，小肽含量达到最高，蛋白质完成水解。

(3)发酵固液比的优化：

将2g苦杏仁粉分别与10mL、20mL、30mL、40mL、50mL去离子水混合，将pH调整为6.0，接入0.2mL浓度为1×10⁹个/mL的植物乳杆菌FSB7菌悬液，发酵36h。

结果显示：发酵固液比为1：20(40mL)发酵效果最好，pH下降显著，蛋白质水解效果好。

(4)发酵初始pH的优化：

乳酸菌发酵过程中产生乳酸，使发酵样品pH降低，因此pH可以用来衡量乳酸菌发酵效果，在发酵过程中测定样品pH变化以反映发酵进程。

将2g苦杏仁粉分别与40mL去离子水混合，1mol/L的NaOH将pH分别调整为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，接入0.2mL浓度为1×10⁹个/mL的植物乳杆菌FSB7菌悬液，发酵36h。

结果显示：初始pH为6.5时发酵效果最好。

由图4可见，测量了发酵过程中脱脂苦杏仁粉液态发酵样品的pH变化，在36h后不再降低，又分别改变了发酵的接菌量、苦杏仁粉与水的料液比、发酵开始时样品的pH，进行单因素实验，比较这些条件下样品的pH变化。

(5)发酵接菌量的优化：

将2g苦杏仁粉与40mL去离子水混合，将pH调整为6.5，分别接入0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL浓度为1×10⁹个/mL的植物乳杆菌FSB7菌悬液，发酵36h。

结果显示：接菌量为0.1％(v/w)最合适。

实施例4：游离氨基酸含量的测定

将实施例3步骤(1)中接入不同菌种发酵得到的苦杏仁液态发酵样品，取1mL加入1mL10％三氯乙酸，混匀后超声20min，8000g离心10min，上清液用0.22μm滤膜过滤，通过Agilent 1100氨基酸专用高效液相色谱仪分析发酵处理前后样品中17种常见氨基酸的含量如表1所示。

表1：不同乳酸菌发酵之后的氨基酸的含量

由图1和表1可见，经过发酵的苦杏仁样品中游离氨基酸含量均有不同程度的增加，同时，随着发酵时间的延长，游离氨基酸含量也在不断增加。说明在发酵过程中，大分子的苦杏仁蛋白被水解成了小分子肽，小分子肽又继续被水解成更小分子的氨基酸。大分子蛋白质被水解成小分子氨基酸，会更容易被人体吸收，具有更好的营养价值，且致敏蛋白被破坏，能够降低其致敏性。

结果显示，未发酵的苦杏仁粉溶液中游离氨基酸总量为0.17mg/mL，经过12h发酵后，游离氨基酸含量大多增长到0.23mg/mL-0.3mg/mL不等；

经过植物乳杆菌FSB7发酵的样品游离氨基酸含量明显高于其他菌种发酵样品，达到0.43mg/mL。经过24h发酵后所有样品的游离氨基酸含量均显著增加，达到0.42mg/mL-0.69mg/mL不等，植物乳杆菌FSB7发酵样品游离氨基酸含量依旧明显高于其它组。其中天冬氨酸、谷氨酸这样的风味氨基酸的含量明显增加，而呈苦味的精氨酸含量减少。

由上可知，使用乳酸菌与双歧杆菌发酵苦杏仁蛋白，可以显著增加游离氨基酸的含量，其中植物乳杆菌FSB7相比于使用的另外五种菌种，将蛋白质水解成小分子的氨基酸的能力更强。

在发酵过程中，乳酸菌产生的蛋白水解酶将蛋白质水解成肽和游离氨基酸，从而产生一些生物活性肽。在使用乳酸菌发酵核桃乳的相关研究中【斯梦.核桃发酵乳的制备及其品质影响因素的研究[D].江南大学,2022.】，发酵后样品的游离氨基酸含量要少于发酵前，使用酶法和发酵法复合水解样品后，游离氨基酸含量可以提高57.5％。而在本研究中使用植物乳杆菌FSB7发酵24h后游离氨基酸可上升为发酵前的4.06倍，说明这种方法可以有效水解苦杏仁原料，还能产生大量的营养物质。

实施例5：SDS-PAGE分析：

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对实施例3步骤(1)得到的苦杏仁蛋白进行分析。图2(a)使用的电泳分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为4％。图2(b)使用的电泳分离胶为15.5％tris-glycine SDS-PAGE胶。将样品与上样缓冲液以4:1(v/v)的比例混合，沸水中加热10min后，10000g离心10min，取上清液上样10μL，电压为120V。电泳完毕，采用考马斯亮蓝染色液G-250染色2h，过夜脱色后进行凝胶成像。

结果如图2所示，样品(1)～(7)分别是未发酵苦杏仁蛋白、使用植物乳杆菌ACCC11095、嗜热乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、植物乳杆菌FSB7、短乳杆菌发酵12h后的苦杏仁蛋白。

结果显示，在图2(a)中可看出，未发酵的苦杏仁蛋白在36kDa、38kDa、22kDa和20kDa处出现明显条带，经过植物乳杆菌、嗜热乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌FSB7发酵的蛋白条带变浅，并且在15kDa的位置出现条带，使用双歧杆菌发酵的样品条带没有发生明显变化，短乳杆菌发酵样品条带有变浅的趋势但是效果明显不如其他菌种。

在图2(b)中可看出，使用植物乳杆菌、嗜热乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌FSB7发酵的样品在26kDa、23kDa和14kDa的位置出现的新的条带，说明苦杏仁的大分子蛋白被水解成了小分子的肽链，使用保加利亚乳杆菌发酵的样品在14kDa位置出现的条带颜色最深，而用植物乳杆菌FSB7发酵的样品不仅在14kDa的位置出现了条带，在9kDa的位置也出现了条带。

该结果与游离氨基酸测定结果一致，发酵12h后，植物乳杆菌ACCC 11095、嗜热乳杆菌、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌FSB7对样品的水解效果较好，双歧杆菌和短乳杆菌效果较差。

实施例6：OPA法测定苦杏仁蛋白水解度

在340nm下测定吸光度值，以去离子水作参比。A.每个试管中分别加入3mL OPA、400uL实施例3步骤(1)发酵后提取的蛋白质样品，振荡混匀，精确反应2min后在340nm下测定其吸光度。在测定空白和样品之前测定两次标准样品的吸光度，在所有空白和样品测定之后再测定两次标样的吸光度，计算时取四次测定的平均值。

结果如图3所示，植物乳杆菌ACCC 11095、嗜热乳杆菌和保加利亚乳杆菌对样品的水解效果较好，能达到60％左右，植物乳杆菌FSB7对苦杏仁蛋白的水解度最高，能达到82％，但双歧杆菌和短乳杆菌水解效果较差。该结果与凝胶电泳结果一致。

实施例7：发酵前后苦杏仁乳稳定性系数的测定

具体步骤如下：

(1)在实施例2制备得到的苦杏仁乳中分别接入实施例1制备得到的嗜热乳杆菌HH-ST08菌悬液、短双歧杆菌M-16V菌悬液、短乳杆菌CICC 6239菌悬液、保加利亚乳杆菌HH-IB57菌悬液、植物乳杆菌ACCC 11095菌悬液、植物乳杆菌FSB7菌悬液发酵12h，制备得到发酵后的苦杏仁乳；

(2)将制备好的发酵后的苦杏仁乳摇匀，取10mL样品于3500r/min离心15min后，吸取苦杏仁乳中间的乳清相0.5mL，用纯水按体积比1：10进行稀释，在其最大吸收波长下测定吸光值。摇匀后，吸取乳液同上述方法稀释，测定吸光值。通过下式计算稳定性系数，稳定性系数越大，稳定性越好。

稳定性系数＝A₀/A₁×100％；

式中：A₀为摇匀后豆乳最大吸收波长吸光值；A₁为离心后乳清相最大吸收波长下吸光值。

将离心前和离心后的苦杏仁乳进行全波长扫描，摇匀的苦杏仁乳最大吸收波长在400nm处，离心后的最大吸收波长在320nm处。

结果显示，由图3所示，经过发酵短乳杆菌后的苦杏仁乳的稳定性均发生了不同程度的降低，未发酵苦杏仁乳的稳定性系数为64.4％，使用双歧杆菌发酵的苦杏仁乳在六种发酵杏仁乳中稳定性系数最高，为55.4％，其次是，再次是植物乳杆菌FSB7。

结合这几种菌种在发酵12h时对苦杏仁蛋白的水解效果分析，双歧杆菌和短乳杆菌发酵乳的稳定性显著高于其它菌种的原因是由于没有进行充分的发酵水解。在对苦杏仁蛋白水解程度高的四种菌种当中，植物乳杆菌FSB7发酵苦杏仁乳的稳定性要高于其它三种。

综上所述，植物乳杆菌FSB7发酵苦杏仁蛋白水解效果好，可以产生更多的游离氨基酸，且对苦杏仁乳稳定性的影响小，故选用植物乳杆菌FSB7。

实施例8：苦杏仁发酵过程中pH变化

按实施例3步骤(2)-(5)条件优化，测量样品pH发生的变化。乳酸菌发酵过程中产生乳酸，使发酵样品pH降低，因此pH可以用来衡量乳酸菌发酵效果，在发酵过程中测定样品pH变化以反映发酵进程。

结果如图4所示，随着发酵的进行，样品的pH不断下降，大约在发酵20h后趋于稳定，发酵的固液比、接菌量、以及初始pH都对发酵过程中样品的pH变化趋势产生影响，使用实施例3步骤(5)条件发酵的样品pH可以下降到3.47左右。

实施例9：小肽含量测定

蛋白质经发酵被水解后，变成短链的小肽，经过三氯乙酸的沉降，大分子蛋白质及长链的肽被沉淀，小分子肽被溶解，测量小分子肽含量可衡量乳酸菌的酶解效果。

称量1g实施例3步骤(2)-(5)中不同发酵条件的脱脂杏仁粉，加20mL浓度为10％的三氯乙酸沉降大分子蛋白质，混匀后静置10min，8000rps离心10min后取上清液，用Lowry法测上清液中的小分子肽含量。

结果如图5所示，比较发酵后的样品与未发酵的样品，小肽含量发生了显著增长，说明经过乳酸菌发酵，有部分大分子蛋白质被水解成了短链，乳酸菌对苦杏仁蛋白有酶解效果，可能会破坏苦杏仁蛋白的致敏表位。

不同发酵条件下的小肽含量有所不同，结合pH测定的结果，选择合适的发酵条件为：苦杏仁粉：水＝1:20(w/v)，接菌量为0.1％(v/w)，初始pH为6.5的液态发酵36h，可以使苦杏仁蛋白被有效水解。

实施例10：SDS-PAGE分析：

采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对苦杏仁蛋白进行分析。图6(a)使用的电泳分离胶浓度为12.5％，浓缩胶浓度为4％。图6(b)使用的电泳分离胶为15.5％tris-glycine SDS-PAGE胶。将样品与上样缓冲液以4:1(v/v)的比例混合，沸水中加热10min后，10000g离心10min，取上清液上样10μL，电压为120V。电泳完毕，采用考马斯亮蓝染色液G-250染色2h，过夜脱色后进行凝胶成像。

结果如图3所示，样品(1)为苦杏仁蛋白，样品(2)为实施例3步骤(5)发酵后的苦杏仁蛋白，二者浓度均为10mg/mL。

由图6(a)可见苦杏仁致敏蛋白最标志性的36kDa、38kDa、22kDa和23kDa处的条带均明显减轻甚至消失，在小分子量位置还保留有条带印记，说明苦杏仁致敏蛋白经过乳酸菌发酵被分解成了小分子氨基酸。

图6(b)为小分子胶，可更加直观地观察被水解的蛋白质分子大小，发酵前的苦杏仁蛋白在小分子胶的上补大量聚集，说明主要为蛋白质大分子成分；

而发酵后的样品中蛋白质小分子在胶上出现地更加清晰，在9.5kDa、14.5kDa的部分都出现了未发酵的蛋白没有的条带。发酵后的蛋白在8kDa的分子量以下的部分也出现了染色，也说明蛋白质发生了降解。

实施例11：ELISA检测

使用杏仁Elisa试剂盒分析实施例2步骤(1)的杏仁乳以及按照实施例3步骤(5)条件发酵获得的杏仁乳的致敏原。

结果如图7所示，固液比1：20、初始pH6.5、发酵时间36h、接入植物乳杆菌FSB7量为0.1％条件下发酵的杏仁乳的免疫反应性约为未发酵杏仁乳的29％，说明苦杏仁致敏表位被部分破坏，结合上文结果，蛋白质被部分水解为短链，因此推测乳酸菌发酵破坏了苦杏仁蛋白的线性表位，使苦杏仁致敏原性降低。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种降低含有苦杏仁蛋白的产品的致敏性的方法，其特征在于，所述方法为，将植物乳杆菌FSB7或其发酵液，添加至含有苦杏仁蛋白的产品的反应体系中进行发酵，以降低产品中杏仁蛋白的致敏性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产品为食品或保健品。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述产品包括苦杏仁乳、苦杏仁粉。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌FSB7发酵液的制备方法为：将植物乳杆菌FSB7接种至种子培养基中，在37℃条件下培养10-12h。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌FSB7的接种量为：0.1％-0.15％(v/w)；所述反应体系中初始pH为：6.4-6.6。

6.植物乳杆菌在制备降低苦杏仁蛋白致敏性的产品中的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌FSB7，或植物乳杆菌FSB7微生物菌剂，或植物乳杆菌FSB7发酵液。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为食品添加剂。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品中，植物乳杆菌FSB7的添加量至少为：0.1％(v/w)。

9.一种低敏苦杏仁蛋白，其特征在于，所述苦杏仁蛋白是按照下述步骤得到的：

(1)将植物乳杆菌FSB7活化、扩大培养，分别接入苦杏仁乳、苦杏仁粉的液态发酵样品中，于37℃静置发酵；

(2)将发酵后的苦杏仁样品冻干脱脂得到发酵后的苦杏仁脱脂粉；

(3)苦杏仁发酵后的苦杏仁脱脂粉用碱溶酸沉法提取蛋白，得到经过植物乳杆菌FSB7发酵的苦杏仁蛋白。

10.如权利要求9所述的低敏苦杏仁蛋白，其特征在于，接入苦杏仁乳、苦杏仁粉的液态发酵样品中的植物乳杆菌FSB7的菌浓为1×10⁹个/mL。

Images