CN116019939A - 靶向msln的分子探针以及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子检测领域，更具体地，涉及靶向MSLN的分子探针。本发明请求保护一种靶向MSLN的分子探针，所述分子探针是具有以下序列的化合物，或其药学上可接受的盐或脂：(QVHLVESGGGSVQTGGSLRLSCTASGLSFSTYTVAWFRQAPGKEREGVAAI PYTSQHMVYTDSVKGRFTISRDNTKNM VYLQMNSLKPEDTAMYYCATDRRPGTSMLAINGYNRWGQGTQVTVSS)_m‑R_n，其中，R选自由连接基团，螯合剂，放射性核素，另一个靶向多肽或者单抗、单抗片段，以及小分子抑制剂组成的组；其中，n代表R的数量，n＝0‑4；其中，m不为0。该探针体外稳定性好，在肿瘤中显影清晰，具有很好的特异性。

Description

靶向MSLN的分子探针以及用途

技术领域

本发明涉及分子检测领域，更具体地，涉及靶向MSLN的分子探针。

背景技术

间皮素是一种细胞表面的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，最初由Chang等人在间皮瘤和卵巢癌中使用单克隆抗体K1表征，因发现其由间皮细胞产生而被命名为“间皮素”。间皮素正常表达仅限于胸膜、心包、腹膜和男性鞘膜的上皮细胞，在卵巢、输卵管和睾丸的上皮内膜中也观察到极微量的表达。与正常生理条件下的有限表达相反，已发现MSLN在广泛实体瘤中的过度表达，使其成为有吸引力的肿瘤靶点。虽然MSLN的生物学功能尚不清楚，但越来越多的研究证实其参与了癌症发生和发展的多种机制。异常MSLN表达通过促进肿瘤增殖，局部侵袭和转移，并赋予肿瘤对细胞毒性药物诱导的细胞凋亡的抵抗力，在肿瘤的恶性转化和侵袭转移中发挥了积极作用。MSLN的表达升高还被发现与癌症患者较差的预后相关。

MSLN在多种实体瘤中的过表达和促癌作用已得到证明，特别是对于胰腺癌。MSLN在大多数胰腺癌中表达，独立研究显示几乎100％胰腺癌的MSLN表达呈阳性，而其在正常胰腺组织不表达。鉴于MSLN在正常组织中几乎不表达而在多种肿瘤中异常表达的特点，其已成为开发具有低“非肿瘤靶向毒性”抗肿瘤疗法非常有吸引力以及应用较多的靶点。基于MSLN已经开发出了各种类型的抗癌疗法，包括：抗体、抗体-药物偶联物、免疫毒素、放射性核素治疗，癌症疫苗和嵌合抗原受体T细胞疗法等。

因此，开发无创示踪机体MSLN的分子探针，有助于早期实时动态发现和检测MSLN高表达的组织，如胰腺癌组织等，在MSLN高表达疾病的诊断、分期、疗效评估等方面具有很高的临床意义。

因此，本领域仍然需求一种特异性高、具备更优在体药代动力学表现的靶向MSLN的分子探针。其能够用于MSLN高表达，特别地，MSLN高表达实体瘤等的疾病的诊断和治疗。

发明内容

第一方面，本发明提供了一种靶向MSLN的分子探针，所述分子探针是具有以下序列的化合物，或其药学上可接受的盐或脂：

(QVHLVESGGGSVQTGGSLRLSCTASGLSFSTYTVAWFRQAPGKEREG VAAIPYTSQHMVYTDSVKGRFTISRDNTKNMVYLQMNSLKPEDTAMYYCAT DRRPGTSMLAINGYNRWGQGTQVTVSS)_m-R_n，

其中，R选自由连接基团，螯合剂，放射性核素，另一个靶向多肽或者单抗、单抗片段，以及小分子抑制剂组成的组；

其中，n代表R的数量，n＝0-4；

其中，m不为0。

在一些具体的实施方案中，m＝1-4。

在一些具体的实施方案中，所述分子探针的具体序列为：

QVHLVESGGGSVQTGGSLRLSCTASGLSFSTYTVAWFRQAPGKEREGVA AIPYTSQHMVYTDSVKGRFTISRDNTKNMVYLQMNSLKPEDTAMYYCATD RRPGTSMLAINGYNRWGQGTQVTVSS。

在一些具体的实施方案中，所述分子探针的具体序列为上述序列抗体的二聚体或多聚体。

在一些具体的实施方案中，所述连接基团可以调整分子探针在体内的药代动力学性质，改善其在体内的分布与代谢水平，所述连接基团可以是PEGn或者Glyn，其中，n代表数量，即聚合度，n可以为0-10个。所述连接基团也可以是其余氨基酸或多肽。

在一些具体的实施方案中，所述螯合剂可以与功能金属配位，所述螯合剂可以是DOTA、NOTA、NETA、AATZA，或者Hynic及它们的衍生物。

在一些具体的实施方案中，所述放射性核酸可以是用于PET显像的正电子核，例如⁶⁸Ga、¹⁸F-Al(¹⁸氟铝)、⁶⁴Cu、⁸⁹Zr；也可以是用于SPECT显像的单光子核素，例如^99mTc、¹¹¹In；也可以是顺磁性金属用于MRI显像，例如Gd、Mn等,还可以是用于核素靶向治疗的β或者α核素，例如¹⁸⁸Re、¹⁸⁶Re、¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、²²³Ra等。

在一些具体的实施方案中，所述小分子抑制剂可以是小分子药物。

在一些具体的实施方案中，所述小分子抑制剂可以是治疗癌症的药物。

在一些具体的实施方案中，所述小分子抑制剂可以是阿霉素，顺铂、长春碱、喜树碱、紫杉醇等。

在一些具体的实施方案中，所述小分子抑制剂可以是MK-0429、索拉非尼、伊马替尼、吉非替尼等。

本发明的靶向MSLN的分子探针体外稳定性好，在肿瘤中显影清晰，具有很好的特异性。

第二方面，本发明提供上述分子探针在制备用于分子成像试剂盒中的用途。

本发明提供了上述分子探针在制备用于癌症诊断试剂盒中的用途。

本发明提供了上述分子探针在制备用于癌症治疗试剂中的用途。

进一步地，所述癌症为MSLN高表达的癌症。

在一些具体的实施方案中，所述癌症为间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、胆管癌、胃癌、结肠癌、胸腺癌、食管癌、乳腺癌以及子宫内膜癌等。

在一个具体的实施方案中，所述癌症为胰腺癌。

附图说明

图1为(A)68Ga-NOTA-MS3的radio-HPLC图谱；(B)1h体外PBS稳定性；(C)2h体外PBS稳定性；(D)1h体外FBS稳定性；(E)2h体外FBS稳定性；

图2为(A)Western blot分析BxPC-3，HuH-7和BxPC-3ko细胞中MSLN的表达情况(β-actin作为内参)。(B)在0.5，1和2h时间点，BxPC-3，HuH-7和BxPC-3ko细胞对⁶⁸Ga-NOTA-MS3的摄取。(数据均表示为均数±标准差，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)；

图3为(A)尾静脉注射⁶⁸Ga-NOTA-MS3 30min，1h和2h时间点BxPC-3荷瘤鼠的PET/CT图像(冠状位)。(B)尾静脉注射⁶⁸Ga-NOTA-MS3 30min，1h和2h时间点HuH-7荷瘤鼠的PET/CT图像(冠状位)。(C)BxPC-3及HuH-7肿瘤对⁶⁸Ga-NOTA-MS3摄取的ROI定量分析(n＝4)。(D,E)BxPC-3及HuH-7肿瘤模型中⁶⁸Ga-NOTA-MS3的T/M和T/B的定量分析(n＝4)。(数据均表示为均数±标准差，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)；

图4为(A)尾静脉注射⁶⁸Ga-NOTA-MS3 30min，1h，2h，3h和4h时间点BxPC-3和BxPC-3ko双侧肿瘤模型的PET/CT图像。(B)BxPC-3和BxPC-3ko肿瘤对⁶⁸Ga-NOTA-MS3摄取的半定量分析(n＝4)。(数据均表示为％ID/g均数±标准差，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)；

图5为(A)⁶⁸Ga-NOTA-MS3注射4h后的BxPC-3和HuH-7荷瘤鼠的生物分布研究。(B)BxPC-3和HuH-7肿瘤的⁶⁸Ga-NOTA-MS3摄取、T/M和T/B。(C)⁶⁸Ga-NOTA-MS3注射4h后的BxPC-3及BxPC-3ko双侧肿瘤模型的生物分布研究。(数据均表示为均数±标准差，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、分子探针制备

1.1、NOTA-MS3的偶联

重组蛋白MS3是被开发用于靶向间皮素(mesothelin,MSLN)的单域抗体(sdAb)，分子量15kDa左右。将MS3与螯合剂p-SCN-Bn-NOTA按照下述方法缀合。简而言之，纳米抗体经PD-10脱盐柱(PD-10Desalting Columns)纯化去除储存液并超滤浓缩后，用0.1M Na₂CO₃溶液调抗体溶液pH至9-10。将螯合剂溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，并立即按照螯合剂和sdAb10：1的摩尔比将螯合剂添加至抗体溶液。室温孵育反应2h后用PD-10脱盐柱纯化产物并超滤浓缩。浓缩抗体溶液在4℃下可稳定保存至少3个月。

1.2、⁶⁸Ga-NOTA-MS3的放射性标记及鉴定

将1mL ⁶⁸Ga淋洗液(0.05M HCI,370-555MBq)与300μL乙酸钠缓冲液(0.25M,pH6.8)混合，取100-200μg NOTA-sdAb添加到放射性金属溶液中。混合物在37℃,600rpm条件下恒温震荡反应5-10min，使用PD-10脱盐柱纯化最终放射性药物。通过分析型radio-HPLC测定标记率及放射化学纯度。赛分Zenix-C SEC-300体积排阻色谱柱的洗脱条件：温度25℃，流速1mL/min，检测波长260nm、280nm，流动相150mM PBS(Phosphate BufferedSaline)。

实施例2、⁶⁸Ga-NOTA-MS3的放射化学表征及体外稳定性

分别取3.70MBq ⁶⁸Ga-NOTA-MS3加入到100μL PBS和100μL胎牛血清(Fetal BovineSerum,FBS)中，室温孵育1h和2h。直接取PBS和FBS样品进行radio-HPLC鉴定放化纯，洗脱条件同实施例1。

所制备的⁶⁸Ga-NOTA-MS3用分析型radio-HPLC进行鉴定和表征。⁶⁸Ga-NOTA-MS3的非衰变校正标记率为0.47±0.02(n＝4)，放射化学纯度大于98％(图1A)。⁶⁸Ga-NOTA-MS3分别与PBS和FBS孵育1h和2h后用radio-HPLC鉴定，如图1B-E所示，探针的放射化学纯度仍然大于95％，证明⁶⁸Ga-NOTA-MS3在体外非常稳定。

实施例3、分子探针的体外细胞摄取

人胰腺癌细胞系BxPC-3及对应MSLN基因敲除细胞系BxPC-3ko由华中科技大学基础医学院免疫学系惠赠，人肝癌细胞系HuH-7购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。BxPC-3，BxPC-3ko和HuH-7细胞用含10％胎牛血清和1％青霉素(100U/mL)、链霉素(0.1mg/mL)混合液的普通高糖DMEM培养基，在37℃，含5％ CO₂条件下培养。将BxPC-3，BxPC-3ko和HuH-7细胞培养于细胞培养皿中，待细胞处于对数增长期，长至75％-85％时，提取总蛋白。用BCA试剂盒测定蛋白浓度，按照常规比例配制SDS-PAGE浓缩胶和分离胶。将制备好的待测蛋白样品和Marker加入上样孔中，每个样品总蛋白加样量40μg，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，转膜并封闭PVDF膜。将一抗兔anti-Mesothelin antibody单克隆抗体按1:1000稀释，然后与PVDF膜4℃孵育过夜。再与二抗常温摇床孵育1h后进行显影。用Image J软件测定条带的灰度值。

取对数增长期的BxPC-3，BxPC-3ko和HuH-7细胞，计数，然后以每孔2×10⁵个细胞接种在24孔板中，培养过夜。弃去培养液，每孔加入800μL不含血清和双抗的DMEM培养基继续培养1h。随后每孔分别加入50μL，74kBq的⁶⁸Ga-NOTA-MS3，在37℃培养箱中孵育1h和2h(每个时间点设置4个复孔)。孵育结束时，收集上清于试管中，每个孔用预冷的PBS洗一遍并收集于同一试管中。随后，每孔加入800μL NaOH溶液(1M)作用5min裂解细胞，收集细胞裂解液于另一试管中，每孔用PBS洗一遍，并收集于同一试管中。用全自动γ计数仪测量每管的放射性计数。细胞摂取率表示为：细胞放射性计数/(上清放射性计数+细胞放射性计数)×100％。

通过Western blot评估细胞靶蛋白表达情况，如图2A所示，BxPC-3细胞相对高表达MSLN，HuH-7和BxPC-3ko细胞相对低表达MSLN。

通过比较BxPC-3，HuH-7和BxPC-3ko细胞对⁶⁸Ga-NOTA-MS3的摄取评价其在细胞水平上的靶向效率。如图2B所示，在1h和2h时，BxPC-3对⁶⁸Ga-NOTA-MS3的摄取分别为0.69±0.15％和0.71±0.13％，显著高于HuH-7的摄取0.34±0.04％(p<0.05)，0.43±0.01％(p<0.05)和BxPC-3ko的摄取0.46±0.03％(1h,p<0.05)。

实施例4、分子探针的PET/CT显像

所有动物研究均遵循华中科技大学同济医学院实验动物使用和管理委员会的指南进行。雌性Balb/c裸鼠(4～5周龄)购自北京华阜康生物科技股份有限公司，并饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心SPF级环境中。

收集对数期增长的BxPC-3，BxPC-3ko和HuH-7细胞，常规胰酶消化，收集细胞沉淀并计数。随后，用预冷的PBS洗两遍，离心收集细胞沉淀。按照100μL/只的接种体积用PBS重悬细胞，充分吹打细胞，然后接种于小鼠右或左侧上肢靠近腋窝处的皮下，每只小鼠接种1×10⁷个细胞。待肿瘤直径长至8mm-10mm时，用作后续实验。

选取MSLN高表达的BxPC-3细胞及低表达的HuH-7细胞，并构建了BxPC-3ko细胞制备了肿瘤模型以评价探针⁶⁸Ga-NOTA-MS3的体内靶向特异性。每组小鼠(n＝4)经尾静脉注射⁶⁸Ga-NOTA-MS3(～5.55MBq,150μL)，30min、1h及2h后进行PET/CT扫描(10min PET扫描+2min CT扫描)。扫描结束后经衰减校正重建PET图像和CT图像，勾画感兴趣区(Region ofinterest,ROI)计算相应摄取值(percentages of the injected dose per gram oftissue,％ID/g)。

为了评价⁶⁸Ga-NOTA-MS3的体内靶向特异性，应用BxPC-3，HuH-7荷瘤鼠及BxPC-3与BxPC-3ko的双侧肿瘤模型进行PET/CT静态显像。经尾静脉注射⁶⁸Ga-NOTA-MS3 30min、1h及2h后分别进行PET/CT静态扫描。如图3A所示，注射⁶⁸Ga-NOTA-MS3仅30min后BxPC-3肿瘤已清晰显影；1h和2h点时本底组织的摄取明显下降，肿瘤摄取也有所降低，但肿瘤与背景比(tumor-to-background ratio,TBR)在逐渐增加，肿瘤轮廓更加清晰。HuH-7肿瘤在注射⁶⁸Ga-NOTA-MS3 30min后表现出较低的摄取；随着时间的延长，肿瘤与本底组织内的显像剂均快速廓清，肿瘤摄取接近背景摄取(图3B)。注射⁶⁸Ga-NOTA-MS3后放射性主要积聚在肾脏和膀胱，说明该探针主要经肾脏代谢(图3A和B)。通过断层图像对肿瘤组织区域进行ROI勾画和定量分析。如图3C-E所示，BxPC-3对⁶⁸Ga-NOTA-MS3的肿瘤摄取(tumor uptake)及肿瘤与背景比包括肿瘤与肌肉比(tumor-to-muscle，T/M)和肿瘤与血液比(tumor-to-blood，T/B)均显著高于HuH-7肿瘤(表1)。

表1、⁶⁸Ga-NOTA-MS3注射30min，1h和2h时间点BxPC-3和HuH-7荷瘤鼠PET/CT图像的半定量分析。

数据均表示为均数±标准差(n＝4)。

为进一步证实⁶⁸Ga-NOTA-MS3的体内特异性靶向能力，利用BxPC-3及对应的MSLN基因敲除细胞BxPC-3ko构建双侧肿瘤模型进行PET/CT成像。如图4A所示，注射⁶⁸Ga-NOTA-MS330min后BxPC-3及BxPC-3ko肿瘤均显影，轮廓较为清晰。随着探针的代谢，至1，2h时BxPC-3肿瘤轮廓仍十分清晰，BxPC-3ko肿瘤摄取降低，显影不清。注射探针3，4h后，BxPC-3肿瘤摄取降低但轮廓仍可见，而BxPC-3ko肿瘤摄取接近于整体背景。通过断层图像对肿瘤区域进行了ROI勾画和半定量分析，如图4B所示，BxPC-3肿瘤对⁶⁸Ga-NOTA-MS3的摄取在30min、1h、2h、3h和4h时分别为1.10±0.21％ID/g、1.09±0.13％ID/g、0.93±0.14％ID/g、0.88±0.17％ID/g和0.86±0.18％ID/g，均明显高于BxPC-3ko肿瘤(0.65±0.13％ID/g p<0.05、0.54±0.08％ID/g p<0.001、0.43±0.05％ID/g p<0.001、0.37±0.15％ID/g p<0.01和0.35±0.15％ID/gp<0.01)(每组n＝4)。

实施例5、分子探针的生物分布

生物分布研究分组与PET/CT显像分组一致。每组模型鼠(n＝4)经尾静脉单独注射探针或探针+阻断剂，探针剂量为5.55-7.4MBq(150μL)，阻断剂剂量为10mg/kg，90min后，颈椎脱臼处死小鼠，收集感兴趣组织或器官：血液、脑组织、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、胃、小肠、大肠、肌肉、骨、全尾、肿瘤组织及胰腺。清洗、称重，并用全自动γ计数仪测量这些组织或器官的放射性计数(counts per minute,CPM)。进行衰减校正之后，每个组织或器官的摄取值表示为：每克组织注射剂量百分比(％ID/g)＝

生物分布研究分组与PET/CT显像一致。用BxPC-3、HuH-7荷瘤鼠模型和应用BxPC-3ko构建的双侧肿瘤模型进行⁶⁸Ga-NOTA-MS3探针的生物分布研究并进行比较。每只荷瘤鼠经尾静脉注射⁶⁸Ga-NOTA-MS3(～5.55MBq)4h后处死小鼠进行生物分布研究(每组n＝3)。如图5A和B所示，BxPC-3肿瘤对⁶⁸Ga-NOTA-MS3的摄取(0.68±0.16％ID/g vs 0.24±0.01％ID/g,p<0.05)及对应的T/M(9.13±1.04vs 6.44±1.20,p<0.05)和T/B(3.48±0.45vs1.12±0.12,p<0.001)均显著高于HuH-7肿瘤。在双侧肿瘤模型的生物分布研究中，BxPC-3肿瘤对⁶⁸Ga-NOTA-MS3的摄取也高于BxPC-3ko肿瘤(0.67±0.19％ID/g vs 0.41±0.11％ID/g)。⁶⁸Ga-NOTA-MS3在肾脏中的摄取最高，与显像结果一致，进一步说明⁶⁸Ga-NOTA-MS3主要经肾脏代谢(图5A和C)。

Claims (10)

1.一种靶向MSLN的分子探针，所述分子探针是具有以下序列的化合物，或其药学上可接受的盐或脂：

(QVHLVESGGGSVQTGGSLRLSCTASGLSFSTYTVAWFRQAPGKEREG VAAIPYTSQHMVYTDSVKGRFTISRDNTKNMVYLQMNSLKPEDTAMYYCAT DRRPGTSMLAINGYNRWGQGTQVTVSS)_m-R_n，

其中，R选自由连接基团，螯合剂，放射性核素，另一个靶向多肽或者单抗、单抗片段，以及小分子抑制剂组成的组；

其中，n代表R的数量，n＝0-4；

其中，m不为0。

2.根据权利要求1所述的靶向MSLN的分子探针，其中，所述分子探针的具体序列为：

QVHLVESGGGSVQTGGSLRLSCTASGLSFSTYTVAWFRQAPGKEREGVA AIPYTSQHMVYTDSVKGRFTISRDNTKNMVYLQMNSLKPEDTAMYYCATD RRPGTSMLAINGYNRWGQGTQVTVSS。

3.根据权利要求1所述的靶向MSLN的分子探针，其中，所述连接基团是PEGn、Glyn，或者其余氨基酸或多肽，其中，n为0-10。

4.根据权利要求1所述的靶向MSLN的分子探针，其中，所述螯合剂是DOTA、NOTA、NETA、AATZA，或者Hynic。

5.根据权利要求1所述的靶向MSLN的分子探针，其中，所述放射性核素是正电子核素、单光子核素，或顺磁性金属。

6.根据权利要求1所述的靶向MSLN的分子探针，其中，所述放射性核素是释放β或者α粒子的核素。

7.根据权利要求1所述的靶向MSLN的分子探针，其中，所述放射性核素是⁶⁸Ga、¹⁸F-Al、⁶⁴Cu、⁸⁹Zr；^99mTc、¹¹¹In；Gd、Mn；¹⁸⁸Re、¹⁸⁶Re、¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、²²³Ra。

8.权利要求1-7中任一项所述的靶向MSLN的分子探针在制备用于分子成像试剂盒中的用途。

9.权利要求1-7中任一项所述的靶向MSLN的分子探针在制备用于癌症诊断试剂盒中的用途。

10.权利要求1-7中任一项所述的靶向MSLN的分子探针在制备用于癌症治疗试剂中的用途。

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